Summary
Кораллы создают биоразнообразные экосистемы, важные как для человека, так и для морских организмов. Тем не менее, мы до сих пор не понимаем весь потенциал и функции многих коралловых клеток. Здесь мы представляем протокол, разработанный для изоляции, маркировки и разделения популяций каменистых коралловых клеток.
Abstract
Коралловые рифы находятся под угрозой из-за антропогенных стрессов. Биологическая реакция кораллов на эти стрессоры может происходить на клеточном уровне, но механизмы не очень хорошо изучены. Для изучения реакции кораллов на стрессоры нам нужны инструменты для анализа клеточных реакций. В частности, нам нужны инструменты, которые облегчают применение функциональных анализов, чтобы лучше понять, как популяции клеток реагируют на стресс. В текущем исследовании мы используем флуоресцентную сортировку клеток (FACS) для изоляции и разделения различных популяций клеток в каменистых кораллах. Этот протокол включает в себя: (1) отделение коралловых тканей от скелета, (2) создание одноклеточной подвески, (3) маркировка коралловых клеток с использованием различных маркеров для цитометрии потока, и (4) gating и стратегии сортировки клеток. Этот метод позволит исследователям работать на кораллах на клеточном уровне для анализа, функциональных анализов и исследований экспрессии генов различных популяций клеток.
Introduction
Коралловые рифы являются одной из самых важных экосистем на Земле. Они облегчают биоразнообразие, обеспечивая критически ежимест для рыб и беспозвоночных и имеют решающее значение для поддержания антропогенных сообществ путем обеспечения продовольствием и экономическими средствами к существованию через туризм1. Как ключевой строитель коралловых рифов, коралловые животные (Phylum: Cnidaria) также помогает прибрежных общин, создавая большие карбонат кальция рамки, которые смягчают волны и шторм повреждения2.
Кораллы, как взрослые sessile животных, которые принимают широкий спектр эндосимбиотических партнеров, в том числе вирусов, археи, бактерий, протеистов, грибов, и, прежде всего, члены водорослей dinoflagellate семьи Symbiodiniaceae3. Изменения в окружающей среде могут вызвать дисбаланс в этом сообществе, часто приводит к вспышкам болезней и обесцвечивания кораллов, в которых симбиотические Symbiodiniaceae изгнаны из коралловой колонии, тем самым устраняя основной источник питания для кораллов. Оба этих сценария часто приводят к гибели кораллового хозяина4,,5,,6. Воздействие антропогенных индуцированных стрессоров, таких как быстрое изменение климата, ускоряют массовые явления смерти кораллов, что приводит к глобальному упадку коралловых рифов7.
В последнее время было разработано множество различных методов, чтобы помочь смягчить потерю коралловых рифов. Эти методы включают в себявысадкю кораллов на существующих рифах, генетическое пересечение с использованием термически толерантных генотипов, а также клеточные манипуляции микробных и симбиотических сообществ, размещенных в кораллах8,9. Несмотря на эти усилия, многое остается неизвестным о разнообразии коралловых клеток и функции клеток10,11,,12,13. Для понимания того, как ведет себя коралловый организм в нормативных и стрессовых условиях, необходимо глубокое понимание разнообразия типа коралловых клеток и функции клеток. Усилия по максимальному восстановлению и эффективности сохранения выиграют от более глубокого понимания того, как разнообразие клеток и функции генов связаны между собой.
Предыдущая работа по разнообразию и функции клеток в первую очередь была сосредоточена на гистологических исследованиях и целую ткань РНК выборки14,15,,16,17. Для получения более подробной информации о конкретных функциях типа клеток в кораллах должны быть методы изоляции конкретных популяций живых коралловых клеток. Это было сделано успешно в неклассических модель организмов с помощью флуоресценции активированных клеток сортировки (FACS) поток цитометрии технологии18. FACS использует комбинацию лазеров, настроенных на различные длины волн для измерения различных эндогенных клеточных свойств на уровне одной клетки, таких как относительный размер клеток, детализация клеток и автофлуоресценция. Кроме того, клетки могут быть отмечены флуоресцентно маркированных соединений для измерения конкретных, желаемых свойств18,19.
До сих пор применение цитометрии потока к коралловым клеткам в основном было для анализа симбиотических Symbiodiniaceae и других бактериальных популяций, используя их сильные, естественные автофлюоресценции20,21,22. FACS также был использован для оценки размера генома кораллов с помощью флуоресцентного сигнала маркера ДНК по сравнению с эталонной моделью клеток организма23,24. Эффективное применение FACS предоставляет три различных инструмента, которые полезны для исследований клеточной биологии: 1) морфологическое и функциональное описание одиночных клеток; 2) идентификация, разделение и изоляция конкретных популяций клеток для исследований ниже по течению; и 3) анализ функциональных анализов на уровне одной клетки.
Разработка и применение различных экзогенных флуоресцентных маркеров для изучения коралловых клеток остается практически неизученной. Такие маркеры могут включать помеченные белки, помеченные субстраты для ферментов или флуоресцентные реакции на другие соединения. Эти маркеры могут быть использованы для определения типов клеток, которые имеют уникальные свойства, такие как выделение клеток, которые производят различное количество конкретной функции клеточного отсека, как лисосомы. Дополнительным примером является использование флуоресцентно помеченных бусинок для функциональной идентификации клеток, компетентных для фагоцитоза, или поглощения целевого патогена25. Популяции клеток, активных в иммунных реакциях, могут быть легко идентифицированы FACS после поглощения этих экзогенно применяемых бусинок. В то время как традиционные гистологические методы требуют сохранения ткани и много часов, чтобы приблизить процент клеток, положительных для биса поглощения, на основе FACS функциональный анализ для патогена поглощения может быть выполнена относительно быстро на изолированных живых клеток. В дополнение к изучению клеточных ответов на стресс, эта технология имеет потенциал для уточнения генно-специфической экспрессии и осветить эволюционную и историю развития типов клеток, полностью уникальных для книдарян, таких как каликобласты и cnidocytes.
Недавно мы провели интенсивный скрининг более 30 клеточных маркеров, что привело к выявлению 24, которые способны маркировки коралловых клеток, 16 из которых полезны для различения уникальных популяций18, что делает их кластеров дифференциации (CD). Здесь мы описываем процесс изоляции коралловых клеток в Pocillopora damicornis от удаления клеток из карбоната кальция скелета для идентификации и изоляции конкретных популяций клеток с FACS (Рисунок 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Диссоциация тканей из кораллового скелета через аэрограф и компрессор
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги на льду и защитите руки перчатками.
- Соберите комплект аэрографа, подключив воздушный компрессор, шланг и аэрограф(рисунок 2). Установите датчик давления между 276-483 кПа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый компрессор и воздушный шланг, используемый для этого исследования, был предустановлен до максимального давления 393 кПа. Использование вне этого диапазона 276-483 kPa может привести либо к неадекватному удалению клеток из скелета, либо к разрыву клеточных мембран. Этот диапазон может отличаться для каждого вида и может потребовать проверки жизнеспособности. Испытание жизнеспособности может быть выполнено с подмножеством суспензии клетки с простым гемоцитометром и 4',6-diamidino-2-penylindole (DAPI) анализ исключения красителя, визуализированный на сложном микроскопе. - Подготовка 100 мл клеточных окрашивающих носителей в автоклавированных, стерильный стеклянный контейнер, добавляя 33 мл 10-кратного фосфатно-буферного солей (PBS; без кальция и магния) до конечной концентрации 3,3x, 2 мл сыворотки плода (FCS; тепло инактивировано при температуре 56 градусов по Цельсию в течение 30 мин) до 2% от общего объема и 2 мл 1 М HEPES буфера до конечной концентрации 20 м. Затем довершение на 100 мл со стерильной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация 3.3x PBS была выбрана для имитации солености морской воды, как показано в Rosental et al.18. Эта концентрация должна быть скорректирована для видов, найденных в других средах, чтобы имитировать их засолинность. - Передача 10 мл клеточных средств окрашивания в бутылку аэрографа (помечены "F" на рисунке 2) и прикрепить крышку адаптера для разъема аэрографа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большие фрагменты и виды с более толстыми слоями ткани могут потребовать больше средств массовой информации для адекватного удаления тканей. - Для разветвления коралловых видов, продемонстрированных здесь, используйте костяной резак, чтобы обрезать или вырезать коралловый фрагмент примерно 3'5 см в длину или 4 см2 в области.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагмент должен быть очищен от макроводорослей и других многоклеточных организмов, потому что они не могут быть удалены из образца вниз по течению и загрязнят образец во время анализа FACS и процессов сортировки. 1 см фрагмент P. damicornis дает примерно 2'10 х 106 клеток после фильтрации, окрашивания и мытья. - Поместите коралловый фрагмент внутри пластикового пакета сбора и использовать аэрограф для распыления клеток окрашивания средств массовой информации на кораллы (Рисунок 2). Продолжайте этот процесс до тех пор, пока большая часть скелета не будет выставлена. Удалите оставшийся скелет из коллекционной сумки.
2. Диссоциация клеток из коралловых тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги на льду и защитить руки перчатками.
- Фильтр ячейки суспензии через 40 мкм нейлоновой клетки ситечко в 50 мл центрифуги трубки для того, чтобы получить одну ячейку подвески.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные размеры сетки ситечко клетки могут быть более подходящими для различных видов. Тем не менее, большие размеры могут привести к недостаточной диссоциации тканей из-за прохождения мусора и клеточных скоплений.- Для образцов с более толстыми слоями слизи, используйте стерилизованный поршень из 1 мл пластикового шприца и аккуратно измельчить его против фильтра, чтобы разбить комки и помочь клеткам пройти через ситечко. Промыть ситечко и поршень с клеточной окрашивания средств массовой информации в центрифуги трубки.
- Пеллетклетки центрифугированиеприжая при 4 c при 450 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и resuspend клетки в 1 мл клеточных окрашивающих средств массовой информации.
3. Окрашивание клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги на льду и защитить руки перчатками. Пятна, представленные в этом протоколе, предназначены для целей представительства. Альтернативные пятна потребуют разных концентраций и времени инкубации.
- Передача 500 л перепровисаемых ячеек в трубку с круглым дном мощностью 5 мл и отложите в качестве контрольного образца. Не добавляйте пятно к этому aliquot.
- К оставшейся суспензии клеток добавьте 0,42 л из 12 мМ DAPI viability красителя(Таблица материалов), 1 зЛ 5 мКм реактивных видов кислорода (ROS) пятно(таблица материалов), и 0,1 л 0,2 мм lysosome пятно(Таблица материалов). Пипетка хорошо смешивать и инкубировать на льду в течение 30 минут в темноте, чтобы предотвратить фотоотбеление.
ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI используется в этом примере для работы в качестве пятна ДНК и жизнеспособности красителя для дифференциального gating мертвых клеток на машине FACS. Это предполагает, что DAPI проникает в умирающие клетки из-за целостности мембраны. Пятно ROS излучает свет в диапазоне 520 нм (зеленый), в то время как лисосомальный маркер излучает свет примерно на 668 нм (красный). - Пеллет 500 л окрашенных клеток центрифугированием при 4 кв с при 450 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и приостановите гранулы в 500 л клеточных окрашивающих носителей. Перенесите на новую 5 мл круглого дна трубку и храните на льду.
4. Запуск FACS
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги могут варьироваться в зависимости от модели цитометра из-за различий в лазерах и каналах. Для этого протокола был использован цитометр с лазерами длиной волны 405, 488, 535 и 640 нм. Фильтры, представленные в этом протоколе, предназначены для целей представительства. Альтернативные пятна клеток может потребовать различных набор фильтров и лазеров.
- Начните создавать новый шаблон проекта на программном обеспечении сортировки и выберите лазерную панель. Для представленного сочетания пятен и естественной флуоресценции выберите все четыре лазера (405, 488, 535 и 640 нм).
- Выберите соответствующие фильтры для каждого ожидаемого цвета, представленного в эксперименте.
- Для обнаружения выбросов DAPI и помощи при разделении живых и мертвых клеток используйте фильтр с диапазоном диапазона 450/50 (диапазон 425–475 нм), например фильтр DAPI, Hoeschst или Pacific Blue.
- Для обнаружения света, испускаемого зеленым сигналом ROS, используйте фильтр с вр 530/30 (диапазон длины волны 515-545 нм), например флуоресцентизный изотиоциат (FITC) или зеленый флуоресцентный белок (GFP). Этот фильтр будет измерять концентрацию ROS в каждой ячейке.
- Добавьте дополнительный фильтр с BP 670/30 (диапазон 655-685 нм), например, фильтр аллофикокианина (APC) для обнаружения лизосомального пятна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Канал APC позволит для измерения фагоцитной активности. Этот канал также обнаружит автофлуоресценцию, порожденную коралловыми симбиотические водоросли из семейства Symbiodiniaceae. Однако этот сигнал можно отделить с помощью дополнительного канала, который имеет более длинную длину волны, чем фильтр APC. - Включите фильтр, который имеет ВР 780/60 (750-810 нм диапазона), таких как наиболее часто используемый фикоритрин, цианин фильтр (APC-Cy7), который обнаруживает выбросы далеко-красный автофлюоресценции от Symbiodiniaceae и помогает в изоляции апосимбиотических клеток.
5. Установка FACS gating
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги могут варьироваться в зависимости от изготовления и модели цитометра и программы приобретения в сочетании с цитометром.
- На экспериментальном экране проекта программного обеспечения цитометрии создайте участок рассеяния и выберите передний рассеяние (FCS) в качестве метрики для X-оси и бокового рассеяния (SSC) для Y-оси.
ПРИМЕЧАНИЕ: FCS коррелирует с размером ячейки и SSC коррелирует с детализацией. Это позволит удалить большинство мусора, так как большинство будет меньше по размеру, чем нетронутые клетки. - Установите оси либо логарифмические или двухэкспоненциальные весы, так как размеры клеток и детализация могут варьироваться на несколько порядков величины(рисунок 3А),особенно в кораллах.
6. Анализ FACS и изоляция клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги могут варьироваться в зависимости от модели и модели цитометра и программы совместного приобретения.
- Поместите элемент управления (т.е. подмножество неокрашенных ячеек) в камеру образца цитометра и начните процесс чтения. Когда компьютер начинает получать данные из каждой ячейки или события, точки начнут появляться на участке рассеяния. Чтобы очистить любой мусор, оставшийся в цитометрических камерах от предыдущих экспериментов, позвольте примерно 30 с пройти до начала анализа.
- В рассеивании сюжета отрегулируйте напряжение трубки фотомультипликатора (PMT), чтобы центрировать точки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение PMT используется для усиления силы сигнала фотонов, измеряемых; если напряжение PMT слишком слабое, меньше ячеек будет прочитано, и если напряжение PMT слишком сильно, то клетки будут измерены около максимального значения и различные типы клетки будут неотличимы от одина другого. Адекватное напряжение PMT гарантирует, что независимо различимые события будут заполнять участок рассеяния. Разделение событий легче визуализировать, проецируя логарифмические или двухэкспоненциальные весы на участках рассеяния FSC и SSC. - Начните записывать события. Чтобы сохранить образец, приостановите получение данных после прочтения примерно 15 000 событий. В большинстве случаев этого будет достаточно для визуализации общей структуры популяции клеток. Запись больше событий при анализе и изоляции небольших специализированных популяций клеток.
- На первом графике FSC и SSC создайте выделение или ворота ячеек вокруг отметки 102 и выше на оси FSC X. Все, что ниже этого порога, вероятно, сотовый мусор. Нарисуйте прямоугольные ворота, который является регулярным вариантом на поток цитометрии программ программного обеспечения и хорошо для ясной, различных популяций клеток. Для популяций клеток, которые принимают более неправильную форму на участках рассеяния, используйте опцию полигональных gating.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное отсечение 102 на переднем рассеянии должно выбрать для самых маленьких коралловых клеток, но может позволить загрязнения мусора. Чтобы изменить это, увеличить нижний предел gating быть более консервативным. - Создайте новый участок рассеяния, выражающий фильтр DAPI на X-оси и aPC-Cy7 фильтр на y-оси. Для этого выберите ворота для неповрежденных ячеек, созданных в шаге 6.4, нажмите правой кнопкой мыши, и выберите опцию для создания нового участка рассеяния. Отрегулируйте оси либо на логарифмические, либо двухэкспоненциальные масштабы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, необходимые для создания нового участка могут варьироваться с различными программами. - Теперь удалите контрольный образец из цитометркамеры и замените окрашенными клетками. Разрешить 30 с пройти до начала анализа и записи данных. Запишите около 15 000 ячеек перед приостановкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные населения (ы) на более высоком конце шкалы APC-Cy7 являются те, с высоким красным автофлюоресценции от Symbiodiniaceae. Нет пятна не требуется, чтобы визуализировать эти демографические перерывы, и они также могут быть просмотрены на записи контрольного образца(Рисунок 3C). Выберите для коралловых только популяций, те, ниже на Y-оси, для дальнейшей дифференциации. - Создайте новый участок рассеяния апосимбиотических клеток, чтобы визуализировать концентрации ROS (fitC фильтр) и клетки, положительные на лизосомы (aPC фильтр), снова используя логарифмические или биэкспонеционные весы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если Есть несколько различных популяций клеток, которые являются апосимбиотическими, каждый из них может быть еще более отличается в своем собственном участке рассеяния (Рисунок 3C,D). - Сравните окрашенные группы образца с контролем, неокрашенные подмножество либо с помощью первой записи контрольного образца или повторного и повторного запуска контрольной группы. Ворота событий, которые являются уникальными для окрашенных образцов группы.
7. Сортировка и сбор FACS
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги могут варьироваться в зависимости от изготовления и модели цитометра и программы приобретения в сочетании с цитометром.
- С выбором клеток, выбранных для сбора, поместите микроцентрифугные трубки (содержащие 250-500 л клеточных носителей или буфер амизи на основе количества собранных ячеек и метода хранения) в камере сбора цитометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный цитометр потока способен сортировать четыре различные популяции одновременно, и машина может быть настроена для хранения различных устройств сбора, включая различные центрифуги труб и 96 скважинных пластин. - Как только цитометр начинает читать образец и соответствующее количество времени прошло, чтобы избавиться от мусора, начать сортировку желаемых популяций и собрать от 20000 клеток до нескольких миллионов.
- Для более чем 500 000 ячеек отрегулируйте объем медиамедиа или буфера лиза, а также объем устройства сбора.
- Для исследования in vitro храните клетки на льду до тех пор, пока они не поместясь в инкубатор или стерилизуемую среду.
- Для молекулярных исследований, либо немедленно начать процесс изоляции ДНК / РНК / белка или флэш заморозить и хранить на -80 градусов по Цельсию до экстракции.
- Каждый раз, когда используется новое пятно, вид или сортировка, выполнять проверку чистоты на популяцию интересов путем сортировки по крайней мере 20000 клеток, представляющих интерес в 500 Л окрашивания средств массовой информации, а затем повторно анализа отсортированных клеток и подтверждения того, что клетки читаются в ворота, используемые для первоначального сортировки (Рисунок 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В целом, этот протокол полезен, поскольку он облегчает идентификацию и сбор популяций живых коралловых клеток, которые могут быть использованы для функционального анализа. Рабочий процесс начался с механического отделения коралловых тканей от основного карбоната кальция скелета(рисунок 1). Это один из самых важных начальных шагов, потому что неправильная техника приводит к высокой смертности клеток и может создать большое количество мусора. Ферментативное разделение не рекомендуется, поскольку это может привести к увеличению стрижки тканей и высокой смертности клеток. Механическое разделение с помощью аэрографа уменьшает эти проблемы(рисунок 2), снижение средней смертности клеток до 10% (данные не показаны). После аэрографа опосредованное механическое отделение тканей от скелета, в результате шлам был отфильтрован в клеточной подвески путем фильтрации через клеточный ситечко. Суспензия клетки была затем окрашена ДНК (DAPI), ROS, и лисососомы маркеров и читать цитометры FACS. Затем была разработана стратегия gating для изоляции конкретных популяций клеток на основе используемых маркеров клеток. Популяции gated клеток затем были отсортированы в трубки для сбора(рисунок 1).
При анализе образцов на цитометре FACS было принято несколько шагов для удаления мусора и омертвечных клеток из образца. Клетки Symbiodiniaceae могут быть выборочно удалены при желании из-за их автофлюоресценции. Во-первых, мусор и другие неклеточные частицы, которые не имеют той же формы или детализации, как коралловые клетки были удалены из анализа, создавая gating выбор на вперед (размер) и стороны (гранулирование) рассеяния (Рисунок 3A). Далее, мертвые клетки были исключены путем сравнения неокрашенных суспензии ячейки управления против DAPI окрашенных образца и далеко-красный канал, а затем gating из положительных клеток для высокого DAPI окрашивания в окрашенных образца (Рисунок 3B, популяция клеток P6). Параллельно, клетки хостинг аутофлуоресцентных Symbiodiniaceae были удалены gating против клеток с высоким сигналом в дальнем красном канале(Рисунок 3B, APC-Cy7). После этого процесса итеративных gating, остальные клетки для анализа представляют нетронутыми живых популяций коралловых клеток не хватает Symbiodiniaceae.
Эти клетки могут быть классифицированы в различные субпопуляции клеток, сравнивая контроль и окрашенные образцы, добавляя экзогенные пятна для таких функций, как активность ROS и / или изсосомного содержания (Рисунок 3C). Например, изучение данных о фильтрах для окрашивания РОС- и изсосомы выявило четыре различные субпопуляции коралловых клеток. Популяция одной клетки имела относительно низкий сигнал для лизосомального содержимого (aPC фильтр), а остальные три имели высокий сигнал в лисосомальном содержании и диапазоне активности ROS (фильтр FITC) (Рисунок 3C). Каждая из этих субпопуляций может быть индивидуально отсортирована для анализа вниз по течению или дополнительно проанализирована и разобрана на более дискретные субпопуляции по пересечению размера, детализации, автофлюоресценции и/или содержания ДНК. В этом исследовании, ДНК, активность ROS, и лисосомное содержание были использованы для выявления широких характеристик коралловых клеток. Важно отметить, что этот общий протокол может быть адаптирован к ряду флуоресцентных маркеров, а также конкретных зондов антител, которые могут быть использованы в сочетании для изоляции специализированных популяций клеток, представляющих интерес, таких как стволовые клетки.
Рисунок 1: Общий рабочий процесс сортировки коралловых ячеек. Рекомендуемый протокол позволяет удалить клетки кораллов из скелета для окрашивания, которые затем проходят через цитометр FACS, измеряется, анализируется и изолированы в популяции клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Удаление тканей и клеток из кораллового скелета. Воздушный компрессор (A) силы воздуха и клеток окрашивания средств (F) из аэрографа (E) и работает, чтобы взорвать ткани от кораллового скелета (C) и создает ячейки шлам в сумке (D). Максимальное давление воздуха контролируется датчиком давления(B)на воздушном компрессоре(A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Выбор живых коралловых клеток. (A) живые клетки были изолированы от мусора, используя минимальное значение переднего рассеяния 102. (B) APC-Cy7 фильтр был использован для выявления красной аутофлуоресценции, эффективно отделяя симбионт-хостинга клеток, в то время как DAPI был использован для выявления клеток очень положительный для окрашивания ДНК. Те, весьма позитивным для DAPI были свидетельствующими о мертвых и умирающих клеток. (C,D) Дополнительные маркеры для активности ROS и содержания лисосомы были использованы для дальнейшего дифференциации различных популяций коралловых клеток. Позже все данные были повторно проанализированы на FlowJo (v10) для генерации этих графиков. Вставленная метка популяции и процент соответствует микроскопическим фотографиям, сделанным каждой отсортированной популяции(E). Проценты, отображаемые на каждом участке, от общего количества ячеек в этом участке. Нижняя правая панель шкалы 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Проверка чистоты ассоциированных клеток, связанных с симбиодиниацей. (A) Клетки, положительные для флуоресценции на фильтре APC-Cy7 из неокрашенного контрольного образца были отсортированы. (B) Эта отсортированная группа клеток затем была повторно запущена на цитометр и повторно проанализирована в тех же условиях, показывая 94% чистоты. Передний разброс (X-оси, FSC) использовался для оси крепления, но взаимозаменяем с любым из других параметров. Такой же процесс можно выполнить на запятнанных образцах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол был адаптирован из Rosental et al.18 и разработан для идентификации и изоляции клеток P. damicornis. Методология фокусируется на процессе фильтрации образцов для удаления мусора, нежизнеспособных клеток и клеток Symbiodiniaceae путем изучения внутренних факторов клеток, включая относительный размер клеток, относительную детализацию клеток, аутофлуоресценцию клеток и наличие нетронутых клеточных мембран. Эти методы могут быть применены к другим коралловым видам. Тем не менее, faCS gating стратегии могут варьироваться из-за видов конкретных различий в характеристиках популяции клеток.
Полезность FACS для понимания здоровья кораллов заключается в его способности использовать различные клеточные факторы для дифференциативной идентификации и изоляции клеток. Кроме того, этот протокол описывает дополнительное использование экзогенного клеточного окрашивания для дифференциации коралловых клеток на основе жизнеспособности, концентрации реактивных видов кислорода и содержания лизосомы. Из 30 коммерческих маркеров, которые ранее были протестированы в Rosental et al.18, 24 помечены P. damicornis клеток, из которых 16 производится дифференциальный сигнал, кластеры дифференциации, что позволит для выбора клеточных субпопуляций.
Одним из важнейших шагов этого протокола является правильное удаление тканей и фильтрация, чтобы убедиться, что сгустки тканей разобщены и не блокируют ламинарный поток цитометра потока. Правильная регулировка напряжения PMT имеет решающее значение для точного обнаружения и анализа независимых событий обнаружения клеток. По сравнению с предыдущей работой18, процесс изоляции коралловых клеток от основного скелета через аэрограф механические нарушения значительно улучшает традиционные методы соскабливания за счет сокращения мусора и максимизации жизнеспособности клеток (90%, Рисунок 2 и Рисунок 3A), тем самым улучшая последующие анализы за счет снижения ложных срабатываний из-за шума.
Методология, описанная в настоящем документе, облегчает разделение популяций коралловых клеток путем дифференциального отбора на пересечении морфологических и функциональных характеристик на уровне, который ранее не был возможен. С развитием методологий FACS для коралловых клеток, теперь можно выбрать конкретные субпопуляции клеток для создания определенных клеточных культур, а также для зондирования транскриптомических и эпигенетических профилей, связанных с конкретными субпопуляциями клеток. Применение этой тонкой информации позволит получить представление о типе, поведении и функции клеток и может выявить характеристики, связанные с эволюцией книдарических типов клеток, таких как каликобласты и cnidocytes. Кроме того, применение технологии FACS для разработки улучшенных стрессовых анализов и биомаркеров может оказаться полезным для защиты сильно угрожаемых коралловых рифов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
NTK хотел бы отметить Университет Майами исследований Награды в области естественных наук и техники для финансирования этого исследования. BR хотел бы поблагодарить Алекса и Энн Лаутербах за финансирование Сравнительной и Эволюционной Иммунологической Лаборатории. Работа BR была поддержана номерами Израильского научного фонда (ISF): 1416/19 и 2841/19, и Грантом hFSP Research Grant, RGY0085/2019. Мы хотели бы поблагодарить за техническую помощь за техническую помощь. Мы также хотели бы поблагодарить Университет Майами, Миллер школы медицины потока цитометрии Общий ресурс в Сильвестр Всеобъемлющего онкологического центра для доступа к цитометру FACS и Шеннон Сай для технической поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C. Anatomy. Diseases of Coral. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
