Summary
在这里，我们提出了一种使用渗透膜支架的方法，以促进肿瘤细胞用于抑制免疫反应的非接触性对羟基苯甲酰二甲苯信号的研究。该系统有助于研究肿瘤分泌因子在抑制巨噬菌体活化中的作用。
Abstract
肿瘤衍生的副苯并发信号是局部免疫抑制的一个被忽视的成分，可以导致一个允许的环境，持续癌症生长和转移。Paracrine 信号可能涉及不同细胞类型之间的细胞-细胞接触，例如 PD-L1 在肿瘤表面与 T 细胞表面的 PD-1 直接相互作用，或肿瘤细胞分泌配体以影响免疫细胞。在这里，我们描述了一种共培养方法，用于询问肿瘤分泌配体对免疫细胞（巨噬细胞）激活的影响。这种简单的程序利用市售的0.4μm聚碳酸酯膜渗透支架和标准组织培养板。在所述过程中，巨噬细胞在上腔培养，肿瘤细胞在下腔培养。0.4 μm 屏障的存在允许研究细胞间信号，而不会造成物理接触的混淆变量，因为两种细胞类型共享相同的介质，并暴露于副体配体。这种方法可以与其他方法相结合，例如巨噬细胞的基因改变（例如，从基因敲除小鼠分离）或肿瘤（例如，CRISPR介导的改变），以研究特定分泌因子和受体的作用。该方法还适用于标准分子生物学分析，如定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）或西方斑点分析，无需进行流动分拣来分离两个细胞群。酶相关免疫吸附测定（ELISAs）同样可用于测量分泌配体，以更好地了解多细胞类型上下文中细胞信号的动态相互作用。共同文化的时间也可以因研究时间调节事件而不同。这种共培养方法是一个强大的工具，有助于研究免疫环境中的肿瘤分泌信号。
Introduction
最近的研究集中在癌细胞避免被免疫细胞检测、抑制局部免疫活化或在肿瘤微环境中产生耐受性肿瘤适应环境的能力。两大类肿瘤和免疫细胞相互作用已被描述，促进这些影响：接触介导相互作用或肿瘤分泌配体。肿瘤利用的接触介导免疫抑制的一个研究最充分和临床可治愈的机制是PD-L1的表达，它与T细胞上的PD-1相互作用，以抑制其激活和功能1，2。对由多种活化免疫细胞表达的干扰素伽马（IFN®）作出反应，肿瘤细胞可以增加PD-L1的表达，导致PD-1表达活性T细胞的耗尽，从而阻止它们有效消灭肿瘤细胞3。使用抗体来阻止PD-L1和PD-1之间的相互作用，目前用于治疗人类多种癌症类型4。鉴于这一临床成功和其他，肿瘤衍生免疫抑制机制的鉴定和靶向越来越受到重视。
除了抑制适应性免疫外，肿瘤还已知会分泌抑制先天免疫细胞的亲炎反应的因素。肿瘤衍生或肿瘤诱导的分泌物，包括IL-6、IL-10、VEGF、IL-23和菌群刺激因子（CSF-1），已被证明能抑制肿瘤微环境中自然杀伤细胞（NK）、粒细胞和树突状细胞的抗肿瘤反应5、6、7。肿瘤细胞也可以分泌因子，扭曲肿瘤微环境中骨髓衍生细胞的招募和分化，促进抑制T细胞活化8，9。
对肿瘤进展有深远影响的一种先天免疫细胞是巨噬细胞。多年来，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的存在一直被用作患者生存的负预后10。免疫抑制性TAM抑制肿瘤免疫细胞介导清除的概念是在40多年前提出的。最近，已经表明，巨噬菌体促进炎症反应可以降低调节，而亲肿瘤表型可以在肿瘤微环境中诱导。这些免疫抑制巨噬细胞有助于耐原反应，推动肿瘤进展和耐化学和免疫治疗12。鉴于巨噬细胞往往是肿瘤最丰富的白细胞之一，恢复其肿瘤特异性免疫活性是抗癌治疗物13的潜在靶点。
虽然肿瘤细胞和巨噬细胞之间的接触介导相互作用可以通过直接共培养进行建模，但使用渗透膜支持可以阐明哪些肿瘤分泌因子是免疫调节，而不会产生肿瘤-免疫细胞-细胞接触的潜在混淆影响。使用某种类似的方法，其他人已经证明了识别微胶质/神经元相互作用14以及肿瘤细胞与中皮细胞15分泌因子的潜力。我们还成功地利用这种共培养技术来描述肿瘤分泌蛋白Pros1的作用，这种蛋白质在用LPS和干扰素伽马16刺激围层巨噬细胞后，作为促进炎症基因表达的抑制者的作用。在这里，我们描述了一个简单明了的方法，可以用来询问肿瘤分泌因子如何影响巨噬菌体活化。
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Protocol
与采集和使用鼠腹巨噬细胞有关的所有程序在北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC）进行，并经联合国哥伦比亚联合国委员会机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 巨噬菌体文化
注：本程序可以利用原发性围周巨噬细胞（如下所述）、骨髓衍生巨噬细胞或巨噬细胞系，如J774（ATCC）或RAW264（ATCC）。
- 收获围膜巨噬细胞如前所述16，17和板直接进入上腔0.4μm聚酯膜插入共培养6孔板（图1A）。
注：每次分离的巨噬细胞的近似收率为1 x 106个细胞，因此每孔的平均细胞数为±1.5±1.6 x 105个细胞，在6孔板中。 - 培养在Dulbeco的改性鹰培养基（DMEM）/F12，10%胎儿牛血清（FBS），1x青霉素/链霉素，20纳克/mL巨噬细胞菌群刺激因子（M-CSF）3天在37°C，5%CO2。
注：上腔室包含1 mL培养基，下腔室填充1.5 mL。介质必须添加到每个腔室中。
2. 巨噬细胞肿瘤细胞的共培养
- 在使用之前，按照ATCC推荐的组织培养方法，在各自的培养基培养上培养商用肿瘤细胞。
- 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗粘附性肿瘤细胞一次，加入0.05%胰蛋白酶+乙烯二胺四乙酸（EDTA），并在37°C孵育，直到细胞分离。在含有培养基的FBS中重新悬浮细胞，使用血细胞计或细胞计数器定量化细胞总数，然后以220 x g向颗粒离心5分钟。
- 在离心过程中，从含大噬细胞的可渗透膜支撑板的上下室吸气培养基，用新鲜的介质代替。
- 对于将镀肿瘤细胞的下腔，用1mL的培养基而不是1.5 mL填充，以允许增加细胞的足够体积。
- 从DMEM/F12中的颗粒肿瘤细胞中吸收培养基，使用10%FBS、1x青霉素/链霉素和20纳克/mL M-CSF，浓度为3 x 105细胞/mL。
- 将0.5 mL的3 x 105细胞/mL肿瘤细胞添加到所需井的下腔（图1B）。
注：细胞可以立即治疗。
3. 共培养细胞的治疗
- 为了诱导巨噬细胞亲炎基因表达，通过添加100纳克/mL IFN+和50纳克/mL LPS来单独或共同培养的巨噬细胞。
- 根据需要改变培养中治疗时间的持续时间。巨噬菌体活化发生在2小时内，一些肿瘤介导抑制发生8小时共培养24小时产生强健和一致的肿瘤衍生抑制。
注：或者，通过添加白细胞介素-10（IL10）等因子，以及评估肿瘤分泌配体的效果，可以诱导巨噬细胞采用亲伤口愈合表型。
- 根据需要改变培养中治疗时间的持续时间。巨噬菌体活化发生在2小时内，一些肿瘤介导抑制发生8小时共培养24小时产生强健和一致的肿瘤衍生抑制。
- 作为一种负控制，文化巨噬细胞单独和离开未经治疗。作为一种正对照，使用100纳克/mL IFN+和50纳克/mL LPS单独培养的巨噬细胞。
4. 共培养细胞的下游分析
- 所需孵育时间过后，根据需要分离细胞莱沙或条件培养基。
- 为了分离细胞液化酶进行定量聚合酶链反应（qPCR）分析，从井的两腔中吸出介质，用2 mL的PBS清洗一次。将RNA液核酸缓冲液涂抹在含有巨噬细胞的顶室。轻轻刮擦膜以释放细胞解结，然后转移到收集管，以便根据RNA分离试剂盒制造商的协议进行进一步处理。
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Representative Results
为了确定肿瘤分泌配体对巨噬菌体极化的影响，采用了所述程序。在没有肿瘤细胞的情况下培养的食管巨噬细胞被用作阴性（未经治疗=最左侧）和阳性（IFN+和LPS刺激=从左至左为2）对照（图2A）。或者，围肠巨噬细胞与B16F10黑色素瘤肿瘤细胞（ATCC）共同培养（图1A）。电镀后立即，细胞要么使用IFN®和LPS进行治疗，要么不进行治疗。在24小时培养后，采集巨噬细胞，制备RNA，并执行qRT-PCR，以测量亲炎基因的表达。使用此处描述的共同培养系统，我们表明，在B16F10肿瘤细胞存在的情况下共同培养的围膜巨噬细胞，但没有激活刺激（LPS + IFN®），不会增加亲炎相关基因的表达（图2A，B16F10膜/未经治疗）。这意味着肿瘤分泌配体本身不足以诱导亲炎基因表达，或者2）如果肿瘤分泌物有免疫活化，副体配体足以将其抑制到天真的水平。这种共培养方法表明，当由IFN®和LPS极化的巨噬细胞在肿瘤细胞存在的情况下培养时，对炎症相关基因表达的抑制减少多达60%（图2A，B16F10膜/IFN_LPS）。当鼠巨噬细胞系J774被取代围肠巨噬细胞时，观察到了相当水平的巨噬细胞亲炎基因抑制（图2B）。
我们以前的工作确定Pros1是一种肿瘤分泌因子，可以抑制巨噬菌体活化16。利用透膜支持共培养模型与ELISA结合使用，我们测定了24小时后在条件介质中的Pros1浓度。我们观察到，在IFN®和LPS治疗的条件介质中，B16F10黑色素瘤细胞Pros1在475纳克/mL= 120纳克/mL（图3）下表示。在相同条件下处理的食管巨噬细胞在61纳克/mL = 5纳克/mL时表示Pros1（图3）。有趣的是，当共同培养时，IFN+ 和 LPS 中处理良好的 Pros1 为 86 纳克/mL = 15 纳克/mL。这表明，1） 巨噬细胞消耗肿瘤分泌的Pros1或2）B16F10细胞分泌的Pros1量在巨噬细胞存在时大幅减少。图2和图3的结果都突出表明，当巨噬细胞与肿瘤细胞共同培养时，巨噬细胞活化和对羟基苯甲酰当谈到信号发生了深刻的变化。
图 1.渗透膜的架构支持肿瘤细胞与巨噬细胞的共同培养。正、负治疗控制可应用于单独培养的巨噬菌体井（A）。为了确定肿瘤分泌信号对巨噬细胞活化的影响，在渗透膜支持共培养板的上腔培养巨噬细胞，在下腔（B）培养的肿瘤细胞中培养。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.肿瘤副体信号抑制巨噬菌体亲炎极化。炎症相关基因的巨噬细胞表达在未治疗或IFN+中通过qRT-PCR检测，LPS在肿瘤细胞存在或不存在的情况下刺激巨噬细胞。在通过渗透膜支持分离的肿瘤细胞存在时，在围膜巨噬细胞（A）或J774巨噬细胞系（B）中培养的亲炎基因的表达减少，从而通过副克原体可溶性配体传递该效应。*p < 0.05 相对于未经治疗， = p < 0.05 相对于 IFN+ 和 LPS 刺激。数据是均值 = SEM;p值由双尾学生考试计算。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.肿瘤细胞和巨噬细胞的共培养导致在条件介质中发现的肿瘤分泌的副体配体量的变化。ELISA用于确定Pros1在肿瘤中单独、单独宏噬细胞或共培养的调节介质的浓度在24小时后。•p < 0.05 相对于未经治疗。p值由双尾学生考试计算。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这里介绍的共同培养测定是先前建立的测定的一种修改，允许研究免疫细胞激活的肿瘤分泌因子。虽然细胞-细胞接触已知能诱导免疫活动的变化，但肿瘤分泌配体调节免疫活化的能力却不太了解。我们描述了一种方法，与直接共培养不同，它可以用来询问肿瘤衍生的分泌因子如何影响免疫细胞激活，而不会混淆接触介导信号的性质。鉴于肿瘤分泌配体在免疫抑制中的潜在临床重要性，这种方法提供了一个易于使用的工具，以直接共培养的方式研究这些机制。
基本上，此处描述的共培养方法涉及巨噬细胞（原细胞：居民细胞、骨髓衍生物或巨噬细胞系）的培养，具有肿瘤细胞（细胞系或原细胞），无需物理接触。宏噬细胞必须在0.4 μm孔径聚酯膜插入件上培养，以便肿瘤分泌配体具有自由渗透性，同时防止可能通过过滤器的巨噬细胞迁移。在上下腔中添加所述培养基的量也很重要，以确保适当的细胞覆盖。实验设计（如仅包含一个细胞类型控制）是规划共培养实验时的另一个关键因素。其他几个因素，稍后将更详细地描述，也会对测定结果产生影响，在研究设计过程中记住每个因素非常重要。
要考虑的对所述协议的两个有用的修改是共培养的持续时间或肿瘤细胞与巨噬细胞的相对比率。在所述方法中，巨噬细胞和肿瘤细胞的镀层浓度大致相等。需要考虑的一点是巨噬细胞与肿瘤细胞的相对比例，这种比例在肿瘤微环境中自然发生。为了更好地模拟肿瘤微环境，可以改变巨噬细胞的相对比例，以反映肿瘤在体内发现的情况，但可能需要进行初步工作才能确定正确的比例。
另一个关键点，以及系统的可能限制，是用于刺激测定中一种细胞类型的治疗可能对另一种细胞类型产生意外或意外的影响。如上所述，添加LPS和IFN®旨在刺激巨噬细胞中的亲炎基因表达。然而，在Ubil等人中，我们发现IFN®也诱导免疫抑制Pros116的表达和分泌，其他则表明LPS对肿瘤细胞18的作用。因此，必须包括适当的控制措施，以监测对其他细胞类型的潜在偏离目标或意外影响，以验证实验结果。实现这一目的的一种方法是使用感兴趣的制剂处理单个细胞类型，并使用标准分子生物学测定进行监测效果。
在设计透膜支持实验时，考虑分泌配体可能的扩散梯度也很重要。配体分泌的相对速率、共培养的持续时间以及培养板是否保持在静止位置，都可能对结果产生影响。此外，一些分泌的配体可能粘附在培养板的表面。
虽然显示的代表性结果具有此系统的特点，但当共同培育其他肿瘤线时观察到的亲炎基因抑制程度可能有很大差异。在Ubil等人中，我们发现一些人类肿瘤系几乎可以完全抑制人类巨噬细胞系16的亲炎基因表达。相反，其他肿瘤细胞类型或细胞系的免疫抑制能力可能有很大差异。这些差异的原因尚不清楚，但尚有进一步研究。
渗透膜支持共培养是一种强大的方法，可以很容易地修改，以解决各种问题，并可以适应一系列分子生物学读出，包括qRT-PCR，西印体和ELISA。当基因删除小鼠的基因改变或CRISPR编辑对巨噬细胞或肿瘤细胞进行基因改变时，该系统可用于查询单个基因功能，如配体或受体。该系统还适用于药理活化剂或抑制剂及其对副苯基信号的作用的研究。此外，虽然这里没有讨论，该系统可用于研究免疫活化对肿瘤细胞基因表达的影响。
该方法已成功应用于免疫抑制、肿瘤分泌配体新功能的发现和表征。这个强大的工具可以用来询问非接触性肿瘤/免疫相互作用的更广泛子集，以期发现新的治疗目标。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
埃里克·乌比尔部分由美国癌症协会博士后奖学金（128770-PF-15-216-01-LIB）资助。这项工作得到了NIH（R01-CA205398）的资助和乳腺癌研究基金会（BCRF-18-041）对HSE的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
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