Summary
Hier präsentieren wir eine Methode mit durchlässigen Membranstützen, um die Untersuchung der berührungslosen Parakrinsignalisierung zu erleichtern, die von Tumorzellen verwendet wird, um die Immunantwort zu unterdrücken. Das System ist für die Untersuchung der Rolle von tumorsezerseten Faktoren bei der Dämpfung der Makrophagenaktivierung geeignet.
Abstract
Die tumorabgeleitete Parakrinsignalisierung ist eine übersehene Komponente der lokalen Immunsuppression und kann zu einer freizügigen Umgebung für anhaltendes Krebswachstum und Metastasierung führen. Parakrine Signale können Zell-Zell-Kontakt zwischen verschiedenen Zelltypen beinhalten, wie PD-L1 auf der Oberfläche von Tumoren, die direkt mit PD-1 auf der Oberfläche von T-Zellen interagieren, oder die Sekretion von Liganden durch eine Tumorzelle, um eine Immunzelle zu beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur-Methode, um die Auswirkungen von tumorsezerseligierten Liganden auf die Aktivierung von Immunzellen (Makrophagen) abzufragen. Dieses einfache Verfahren verwendet handelsübliche 0,4 m Polycarbonat-Membran-permeable Stützen und Standard-Gewebekulturplatten. Dabei werden Makrophagen in der oberen Kammer und Tumorzellen in der unteren Kammer kultiviert. Das Vorhandensein der 0,4-mm-Barriere ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Signalisierung ohne die verwirrende Variable des physikalischen Kontakts, da die beiden Zelltypen das gleiche Medium und die Exposition gegenüber parakrinen Liganden aufweisen. Dieser Ansatz kann mit anderen kombiniert werden, wie genetische Veränderungen der Makrophagen (z. B. Isolierung von genetischen Knock-out-Mäusen) oder Tumor (z. B. CRISPR-vermittelte Veränderungen), um die Rolle bestimmter abgesonderter Faktoren und Rezeptoren zu untersuchen. Der Ansatz eignet sich auch für molekularbiologische Standardanalysen wie quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Western Blot-Analyse, ohne dass eine Flusssortierung erforderlich ist, um die beiden Zellpopulationen zu trennen. Enzymgebundene Immunsorbent-Assays (ELISAs) können ebenfalls verwendet werden, um abgesonderte Liganden zu messen, um die dynamische Wechselwirkung der Zellsignalisierung im Kontext des Multiple-Zell-Typs besser zu verstehen. Die Dauer der Kokultur kann auch für das Studium zeitlich regulierter Ereignisse variiert werden. Diese Co-Kultur-Methode ist ein robustes Werkzeug, das das Studium von tumorseften Signalen im Immunkontext erleichtert.
Introduction
Jüngste Studien haben sich auf die Fähigkeit von Krebszellen konzentriert, den Nachweis durch Immunzellen zu vermeiden, die lokale Immunaktivierung zu unterdrücken oder ein tolerogenes tumorpermissives Milieu in der Tumormikroumgebung zu produzieren. Es wurden zwei große Klassen von Tumor- und Immunzellinteraktionen beschrieben, die diese Effekte erleichtern: kontaktvermittelte Wechselwirkungen oder tumorsekrete Liganden. Einer der am besten untersuchten und klinisch traktierbaren Mechanismen der kontaktvermittelten Immunhemmung, die von Tumoren genutzt werden, ist die Expression von PD-L1, die mit PD-1 auf T-Zellen interagiert, um ihre Aktivierung und Funktion zu hemmen1,2. Als Reaktion auf Interferon-Gamma (IFN), das durch eine Reihe von aktivierten Immunzellen exprimiert wird, können Tumorzellen die Expression von PD-L1 erhöhen, um die Erschöpfung von PD-1-exprimierenden aktivierten T-Zellen zu induzieren, wodurch sie daran gehindert werden, Tumorzellen effektiv auszurotten3. Die Verwendung von Antikörpern, um die Wechselwirkung zwischen PD-L1 und PD-1 zu blockieren, wird derzeit zur Behandlung mehrerer Krebsarten beim Menschen verwendet4. Angesichts dieses klinischen Erfolgs und anderer, die Identifizierung und Ausrichtung von Tumor-abgeleiteten immunsuppressiven Mechanismen hat zunehmende Aufmerksamkeit erhalten.
Über die Unterdrückung der adaptiven Immunität hinaus sind Tumore auch dafür bekannt, Faktoren zu sezernieren, die die entzündungshemmenden Reaktionen angeborener Immunzellen unterdrücken. Tumor-abgeleitete oder tumorinduzierte Sekrete, einschließlich IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, und Kolonie stimulierende Faktor (CSF-1), haben gezeigt, antitumor-Antworten von natürlichen Killer (NK) Zellen, Granulozyten, und dendritischen Zellen in der Tumor-Mikroumgebung5,6,7hemmen. Tumorzellen können auch Faktoren absondern, die die Rekrutierung und Differenzierung von myeloiden Zellen in der Tumormikroumgebung verzerren, um die Unterdrückung der T-Zellaktivierung zu fördern8,9.
Eine Art von angeborenen Immunzelle, die eine tiefgreifende Wirkung auf die Tumorprogression hat, ist die Makrophagen. Seit vielen Jahren wird das Vorhandensein von tumorassoziierten Makrophagen (TAMs) als negative Prognose für das Überleben des Patienten10verwendet. Das Konzept, dass immunsuppressive TAMs die immunzellvermittelte Clearance von Tumoren dämpfen, wurde vor mehr als 40 Jahren eingeführt11. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass die Makrophagen-Pro-Entzündungsreaktion herunterreguliert werden kann, während ein Pro-Tumor-Phänotyp in der Tumormikroumgebung induziert werden kann. Diese immunsuppressiven Makrophagen können zu einer tolerogenen Reaktion beitragen, die die Tumorprogression und Die Resistenz gegen Chemo- und Immuntherapie12antreibt. Angesichts der Tatsache, dass Makrophagen oft eine der häufigsten Leukozyten mit dem Tumor sind, stellt die Wiederherstellung ihrer tumorspezifischen Immunaktivität ein potenzielles Ziel für Krebstherapeutikadar 13.
Während kontaktvermittelte Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Makrophagen durch direkte Kokultur modelliert werden können, kann der Einsatz durchlässiger Membranstützen aufklären, welche tumorsekretierten Faktoren immunmodulatorisch sind, ohne den potenziell verwirrenden Einfluss des Tumor-Immunzell-Zellkontakts. Mit etwas ähnlichen Methoden haben andere das Potenzial der Identifizierung von sezernierten Faktoren in Mikroglia/neuronalen Wechselwirkungen14 sowie Tumorzellen mit Mesothelzellen15gezeigt. Wir haben diese Co-Kultur-Technik auch erfolgreich eingesetzt, um die Rolle eines tumorsekretierten Proteins, Pros1, als Unterdrücker der pro-inflammatorischen Genexpression nach der Stimulation von peritonealen Makrophagen mit LPS und Interferon-gamma16zu charakterisieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die verwendet werden kann, um zu hinterfragt, wie tumorsekrete Faktoren die Makrophagenaktivierung beeinflussen können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren im Zusammenhang mit der Ernte und Verwendung von murinen Peritonealmakrophagen wurden an der University of North Carolina at Chapel Hill (UNC) durchgeführt und vom UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
1. Makrophagenkultur
HINWEIS: Bei diesem Verfahren können primäre peritoneale Makrophagen (siehe unten im Detail), knochenmarkabgeleitete Makrophagen oder Makrophagenzelllinien wie J774 (ATCC) oder RAW264 (ATCC) verwendet werden.
- Ernte peritoneale Makrophagen wie zuvor beschrieben16,17 und Platte direkt in die obere Kammer(n) einer 0,4 m Polyestermembran einfügen Co-Kultur 6 WellPlatte (Abbildung 1A).
ANMERKUNG: Die ungefähre Ausbeute von Makrophagen aus jeder Isolierung beträgt 1 x 106 Zellen insgesamt, so dass die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Bohrkörper 1,5–1,6 x 105 Zellen in einer 6-Well-Platte beträgt. - Kultur die geernteten Makrophagen in Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1x Penicillin/Streptomycin, 20 ng/mL Makrophagenkolonie stimulierender Faktor (M-CSF) für 3 Tage bei 37 °C, 5% CO2.
ANMERKUNG: Die obere Kammer enthält 1 ml Kulturmedium, während die untere Kammer mit 1,5 ml gefüllt ist. Das Medium muss jeder Kammer hinzugefügt werden.
2. Kokultur von Tumorzellen mit Makrophagen
- Vor der Anwendung, Kultur kommerziell erhältlich Tumorzellen in ihrem jeweiligen Medium nach ATCC-empfohlenen Gewebekultur-Methoden.
- Anhängsige Tumorzellen einmal mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) waschen, 0,05% Trypsin + Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzufügen und bei 37 °C brüten, bis sich die Zellen lösen. Setzen Sie die Zellen in FBS, die medium enthalten, wieder aus, quantitieren Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder Zellzähler und zentrieren Sie dann für 5 min bei 220 x g pellet.
- Während der Zentrifugation das Medium aus den oberen und unteren Kammern der makrophagenhaltigen durchlässigen Membranträgerplatten ansaugen und durch frisches Medium ersetzen.
- Für niedrigere Kammern, in denen Tumorzellen plattiert werden, füllen Sie mit 1 ml Medium statt 1,5 ml, um ein ausreichendes Volumen für die Zellzugabe zu ermöglichen.
- Aspirieren Sie Daseinspirieren von pelletierten Tumorzellen und Resuspendzellen in DMEM/F12 mit 10% FBS, 1x Penicillin/Streptomycin und 20 ng/ml M-CSF in einer Konzentration von 3 x 105 Zellen/ml.
- Fügen Sie 0,5 ml von 3 x 105 Zellen/ml Tumorzellen in die untere Kammer der gewünschten Brunnen ein (Abbildung 1B).
HINWEIS: Zellen können sofort behandelt werden.
3. Behandlung von ko-kultivierten Zellen
- Um die pro-inflammatorische Genexpression der Makrophagen zu induzieren, behandeln Sie singly oder co-cultured Makrophagen, indem Sie 100 ng/mL IFN und 50 ng/ml LPS hinzufügen.
- Variieren Sie die Dauer der Behandlungszeiten in der Kultur nach Bedarf. Die Makrophagenaktivierung erfolgt innerhalb von 2 h und einige tumorvermittelte Unterdrückung enden durch 8 h. Co-Kultur für 24 h ergibt eine robuste und konsistente tumorabgeleitete Unterdrückung.
HINWEIS: Alternativ können Makrophagen durch Zugabe von Faktoren wie Interleukin-10 (IL10) und der Wirkung des tumorseften Liganden zur Annahme eines pro-wundheilenden Phänotyps induziert werden.
- Variieren Sie die Dauer der Behandlungszeiten in der Kultur nach Bedarf. Die Makrophagenaktivierung erfolgt innerhalb von 2 h und einige tumorvermittelte Unterdrückung enden durch 8 h. Co-Kultur für 24 h ergibt eine robuste und konsistente tumorabgeleitete Unterdrückung.
- Als negativer Kontrolle, Kultur Makrophagen singly und lassen unbehandelt. Behandeln Sie als Positivkontrolle singly kultivierte Makrophagen mit 100 ng/mL IFN und 50 ng/ml LPS.
4. Nachgelagerte Analyse von ko-kultivierten Zellen
- Nachdem die gewünschte Inkubationszeit verstrichen ist, isolieren Sie das Zelllysat oder konditionierte Kulturmedium je nach Testbedarf nach Belieben.
- Um das Zelllysat für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu isolieren, die Medien aus beiden Kammern des Brunnens zu aspirieren und einmal mit 2 ml PBS zu waschen. Tragen Sie den RNA-Lysepuffer auf die obere Kammer auf, die die Makrophagen enthält. Kratzen Sie die Membran vorsichtig, um das Zelllysat freizusetzen, und übertragen Sie es zur Weiterverarbeitung gemäß dem Protokoll des Herstellers des RNA-Isolationskits in ein Sammelrohr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um die Wirkung von tumorsezerseten Liganden auf die Makrophagenpolarisation zu bestimmen, wurde das beschriebene Verfahren verwendet. Peritoneale Makrophagen, die in Abwesenheit von Tumorzellen kultiviert wurden, wurden als negative (unbehandelt = ganz links) und positive (IFN- und LPS-stimulierte =2. von links) Kontrollen verwendet (Abbildung 2A). Alternativ wurden peritoneale Makrophagen mit B16F10 Melanom-Tumorzellen (ATCC) kokultiviert (Abbildung 1A). Unmittelbar nach der Beschichtung wurden die Zellen entweder mit IFN und LPS behandelt oder unbehandelt. Nach 24 h Kultur wurden Makrophagen geerntet, RNA-vorbereitet und qRT-PCR durchgeführt, um die Expression von pro-inflammatorischen Genen zu messen. Anhand des hier beschriebenen Co-Kultur-Systems zeigen wir, dass peritoneale Makrophagen, die in Gegenwart von B16F10-Tumorzellen mitkultiviert werden, aber ohne aktivierungsreize (LPS + IFN) nicht die Expression von pro-inflammatorischen Genen erhöht haben (Abbildung 2A, B16F10 Membran/unbehandelt). Dies impliziert, dass tumorsekretierte Liganden 1) allein nicht ausreichen, um eine pro-inflammatorische Genexpression zu induzieren, oder 2) wenn es eine Immunaktivierung durch Tumorsekrete gibt, sind parakrine Liganden ausreichend, um sie auf naive Niveaus zu unterdrücken. Diese Co-Kultur-Methode veranschaulicht, dass, wenn Makrophagen, die durch IFN und LPS polarisiert werden, in Gegenwart von Tumorzellen kultiviert werden, die Unterdrückung der entzündungsassoziierten Genexpression um bis zu 60 % reduziert wurde(Abbildung 2A, B16F10 Membrane/IFN+LPS). Ein vergleichbares Niveau der makrophagen pro-inflammatorischen Gensuppression wurde beobachtet, als die murine Makrophagenzelllinie J774 durch peritoneale Makrophagen ersetzt wurde (Abbildung 2B).
Unsere bisherige Arbeit identifizierte Pros1 als einen tumorsezerseten Faktor, der die Makrophagenaktivierung hemmen kann16. Mit dem durchlässigen Membranunterstützungs-Cokulturmodell in Verbindung mit ELISA haben wir die Konzentration von Pros1 im konditionierten Medium nach 24 h assayed. Wir beobachteten, dass in konditioniertem Medium aus IFN und LPS behandeltE B16F10 Melanomzellen Pros1 bei 475 ng/ml bei 120 ng/mL exprimiert wurde (Abbildung 3). Peritoneale Makrophagen, die unter den gleichen Bedingungen behandelt wurden, ausgedrückt Pros1 bei 61 ng/ml bei 5 ng/mL (Abbildung 3). Interessanterweise war das Pros1 innerhalb des IFNs und LPS, wenn es mit kultiviert wurde, 86 ng/ml bei 15 ng/ml. Dies deutet darauf hin, dass 1) Makrophagen tumorsezerse Pros1 oder 2) die Menge an Pros1, die von B16F10-Zellen sezerniert wird, erheblich verringert wird, wenn sie in Gegenwart von Makrophagen auftritt. Die Ergebnisse sowohl aus Abbildung 2 als auch aus Abbildung 3 zeigen tiefgreifende Veränderungen der Makrophagenaktivierung und der parakrinen Signalisierung, wenn Makrophagen mit Tumorzellen kokultiviert werden.
Abbildung 1. Schematisch für durchlässige Membran unterstützen Kokultur von Tumorzellen mit Makrophagen. Positive und negative Behandlungskontrollen können auf singly kultivierte Makrophagenbrunnen (A)angewendet werden. Um die Auswirkungen von tumorseften Signalen auf die Makrophagenaktivierung zu bestimmen, werden Makrophagen in der oberen Kammer der durchlässigen Membran unterstützung Co-Kulturplatten und Tumorzellen kultiviert in der unteren Kammer (B)kultiviert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Tumorparakrinsignale unterdrücken die pro-inflammatorische Polarisation der Makrophagen. Die Makrophagenexpression von entzündungsassoziierten Genen wurde von qRT-PCR in unbehandelten oder IFN- und LPS-stimulierten Makrophagen in Gegenwart oder Abwesenheit von Tumorzellen untersucht. Die Expression von pro-inflammatorischen Genen wurde in peritonealen Makrophagen (A) oder J774 Makrophagenzelllinie (B) verringert, wenn sie in Gegenwart von Tumorzellen kultiviert wurde, die durch eine durchlässige Membranunterstützung getrennt wurden, so dass der Effekt durch einen paracrine löslichen Liganden übertragen wurde. *p < 0,05 relativ zu unbehandelt, - p < 0,05 relativ zu IFN und LPS stimuliert. Die Daten sind mittelwert - SEM; p-Werte, die durch den t-Test des zweischwanzigen Schülers berechnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Die Kokultur von Tumorzellen und Makrophagen führt zu Veränderungen in der Menge an tumorsezerse parakrinen Liganden, die in konditionierten Medien gefunden werden. ELISA wurde verwendet, um die Konzentration von Pros1 allein im Tumor, Makrophagen allein oder co-kultiviertes konditioniertes Medium nach 24 h zu bestimmen. Co-Kultur führt zu einer Abnahme der Pros1-Menge im Vergleich zu Tumorzellkontrollen. *p < 0,05 relativ zu unbehandelt. p-Werte, die durch den t-Test des zweischwanzigen Schülers berechnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der hier vorgestellte Co-Kultur-Assay ist eine Modifikation von zuvor etablierten Assays, die die Untersuchung von tumorsekretierten Faktoren bei der Aktivierung von Immunzellen ermöglicht. Während Zell-Zell-Kontakt bekannt ist, Veränderungen in der Immunaktivität zu induzieren, ist die Fähigkeit von tumor-sezertierten Liganden, die Immunaktivierung zu modulieren, weniger gut verstanden. Wir beschreiben eine Methode, die im Gegensatz zur direkten Co-Kultur verwendet werden kann, um zu hinterfragt, wie tumorabgeleitete abgesonderte Faktoren die Immunzellaktivierung beeinflussen, ohne die verwirrende Natur der kontaktvermittelten Signalisierung. Angesichts der potenziellen klinischen Bedeutung von tumorsezerseten Liganden bei der Immunsuppression bietet diese Methode ein einfach zu bedienendes Werkzeug, um diese Mechanismen auf eine Weise zu untersuchen, die nicht durch direkte Co-Kultur angegangen wird.
Im Wesentlichen beinhaltet die hier beschriebene Kokulturmethode die Kultur von Makrophagen (Primärzellen: Resident, Knochenmark abgeleitet oder eine Makrophagenzelllinie) mit Tumorzellen (Zelllinie oder Primärzellen) ohne physischen Kontakt. Es ist entscheidend, dass die Makrophagen auf einem 0,4 m porengroßen Polyestermembraneinsatz kultiviert werden, um eine freie Durchlässigkeit von tumorseften Liganden zu ermöglichen und gleichzeitig eine mögliche Makrophagenzellmigration durch den Filter zu verhindern. Es ist auch wichtig, die beschriebene Menge an Kulturmedium zu den oberen und unteren Kammern hinzuzufügen, um eine ordnungsgemäße Zellabdeckung zu gewährleisten. Experimentelles Design, wie die Einbeziehung nur von Steuerelementen eines Zelltyps, ist ein weiterer Schlüsselfaktor bei der Planung von Co-Kultur-Experimenten. Mehrere andere Faktoren, die später ausführlicher beschrieben werden, können auch Auswirkungen auf die Ergebnisse des Assays haben, und es ist wichtig, jeden während des Studiendesigns im Auge zu behalten.
Zwei nützliche Änderungen am skizzierten Protokoll, die berücksichtigt werden sollen, sind die Dauer der Kokultur oder das relative Verhältnis von Tumorzellen zu Makrophagen. Bei der beschriebenen Methode werden Makrophagen und Tumorzellen in etwa gleichen Konzentrationen plattiert. Ein wichtiger Punkt zu berücksichtigen ist der relative Anteil der Makrophagen zu Tumorzellen, die natürlicherweise in der Tumormikroumgebung auftritt. Um die Tumormikroumgebung besser nachzuahmen, könnte der relative Anteil der Makrophagen verändert werden, um das zu spiegeln, was innerhalb des Tumors in vivo gefunden wird, obwohl Vorarbeiten notwendig sein können, um das richtige Verhältnis zu bestimmen.
Ein weiterer kritischer Punkt und eine mögliche Einschränkung des Systems ist, dass Behandlungen, die angewendet werden, um einen Zelltyp im Test zu stimulieren, unerwartete oder unbeabsichtigte Auswirkungen auf den anderen Zelltyp haben können. Wie hier beschrieben, soll die Zugabe von LPS und IFN die pro-inflammatorische Genexpression in Makrophagen stimulieren. Jedoch, in Ubil et al. wir zeigten, dass IFN auch die Expression und Sekretion von immunsuppressiven Pros116induziert, und andere haben die Auswirkungen von LPS auf Tumorzellengezeigt 18. Daher ist es wichtig, die geeigneten Kontrollen zur Überwachung potenzieller außerhalb des Ziels oder unbeabsichtigter Auswirkungen auf den anderen Zelltyp zur Überprüfung der experimentellen Ergebnisse zu überwachen. Eine Methode, mit der dies erreicht werden kann, ist die Behandlung einzelner Zelltypen mit den Voninteresseen und die Überwachung von Effekten mit Standard-molekularbiologischen Assays.
Bei der Entwicklung durchlässiger Membranunterstützungsexperimente ist es auch wichtig, mögliche Diffusionsgradienten von abgesonderten Liganden zu berücksichtigen. Die relative Rate der Ligandensekretion, die Dauer der Kokultur und ob die Kulturplatte in einer stationären Position gehalten wird, können alle Auswirkungen auf die Ergebnisse haben. Darüber hinaus ist es möglich, dass einige abgesonderte Liganden an der Oberfläche von Kulturplatten haften.
Während die gezeigten repräsentativen Ergebnisse charakteristisch für dieses System sind, kann der Grad der pro-inflammatorischen Gensuppression, der beobachtet wird, wenn andere Tumorlinien mittragen, dramatisch variieren. In Ubil et al. zeigen wir, dass einige menschliche Tumorlinien die pro-inflammatorische Genexpression einer menschlichen Makrophagenzelllinie16fast vollständig unterdrücken können. Umgekehrt können andere Tumorzelltypen oder Zelllinien in ihren immunsuppressiven Fähigkeiten erheblich variieren. Die Ursache für diese Abweichungen ist unklar, ist aber ein Bereich für weitere Untersuchungen.
Permeable Membranunterstützung Co-Kultur ist eine robuste Methode, die leicht geändert werden kann, um eine Vielzahl von Fragen zu adressieren und kann an eine Reihe von molekularbiologischen Auslesungen einschließlich qRT-PCR, Western Blot und ELISA angepasst werden. Das System kann verwendet werden, um einzelne Genfunktionen wie Liganden oder Rezeptoren zu hinterfragt, wenn genetische Veränderungen wie die von gengelöschten Mäusen oder CRISPR-Bearbeitungen entweder an Makrophagen oder an tumorzellen vorgenommen werden. Das System ist auch für die Untersuchung von pharmakologischen Aktivatoren oder Inhibitoren und deren Auswirkungen auf die Parakrinsignalisierung zugänglich. Auch, während hier nicht diskutiert, das System kann verwendet werden, um die Auswirkungen der Immunaktivierung auf die Tumorzellgenexpression zu studieren.
Diese Methode wurde erfolgreich bei der Entdeckung und Charakterisierung einer neuartigen Funktion für einen immunsuppressiven, tumorsezerseligen Ligand eingesetzt. Dieses robuste Tool kann verwendet werden, um die viel breitere Teilmenge der berührungslosen Tumor-/Immuninteraktionen zu begutigen, in der Hoffnung, neue therapeutische Ziele zu entdecken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Eric Ubil wurde zum Teil vom American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB) finanziert. Die Arbeit wurde durch ein Stipendium des NIH (R01-CA205398) und einen Breast Cancer Research Foundation Award (BCRF-18-041) an DIE HSE unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
