Summary
Rottekarotisarterieballongskaden etterligner den kliniske angioplastikkprosedyren som utføres for å gjenopprette blodstrømmen i aterosklerotiske kar. Denne modellen induserer arteriell skaderespons ved å distending arteriell vegg, og denuding det intimale laget av endotelceller, til slutt forårsaker ombygging og en intimal hyperplastisk respons.
Abstract
Kardiovaskulær sykdom er fortsatt den ledende dødsårsaken og funksjonshemming over hele verden, delvis på grunn av aterosklerose. Aterosklerotisk plakk begrenser luminaloverflaten i arteriene og reduserer dermed tilstrekkelig blodstrøm til organer og distale vev. Klinisk tar revaskulariseringsprosedyrer som ballongangoplastikk med eller uten stentplassering sikte på å gjenopprette blodstrømmen. Selv om disse prosedyrene gjenoppretter blodstrømmen ved å redusere plakkbyrden, skader de karveggen, som initierer arteriell helbredende respons. Den langvarige helbredende responsen forårsaker arteriell restenose, eller re-innsnevring, til slutt begrense den langsiktige suksessen til disse revaskularisering prosedyrer. Derfor er prekliniske dyremodeller integrert for å analysere de patofysilogiske mekanismene som driver restenose, og gir mulighet til å teste nye terapeutiske strategier. Murine modeller er billigere og enklere å operere på enn store dyremodeller. Ballong- eller trådskader er de to allment aksepterte skademodalitetene som brukes i murine-modeller. Ballongskademodeller etterligner spesielt den kliniske angioplastikkprosedyren og forårsaker tilstrekkelig skade på arterien for utvikling av restenose. Her beskriver vi de kirurgiske detaljene for å utføre og histologisk analysere den modifiserte, trykkstyrte rottekarotisarterieballongskademodellen. I tillegg fremhever denne protokollen hvordan lokal periadventitial anvendelse av terapeutiske midler kan brukes til å hemme neointimal hyperplasi. Til slutt presenterer vi lysarkfluorescensmikroskopi som en ny tilnærming for avbildning og visualisering av arteriell skade i tredimensjoner.
Introduction
Kardiovaskulær sykdom (CVD) er fortsatt den ledende dødsårsaken over heleverden 1. Aterosklerose er den underliggende årsaken til de fleste CVD-relaterte sykelighet og dødelighet. Aterosklerose er oppbyggingen av plakk inne i arteriene som resulterer i en innsnevret lumen, hindrer riktig blodperfusjon til organer og distale vev2. Kliniske inngrep for behandling av alvorlig aterosklerose inkluderer ballongangoplastikk med eller uten stentplassering. Denne intervensjonen innebærer å fremme et ballongkateter til plakkstedet, og blåse opp ballongen for å komprimere plakk til arteriell vegg, utvide luminalområdet. Denne prosedyren skader arterien, men initierer arteriell skaderespons3. Langvarig aktivering av denne skaderesponsen fører til arteriell restenose, eller re-innsnevring, sekundært til neointimal hyperplasi og fartøy remodeling. Under angioplastikk er det intimale laget benektet endotelceller som fører til umiddelbar blodplaterekruttering og lokal betennelse. Lokal signalisering induserer fenotypiske endringer i vaskulære glatte muskelceller (VSMC) og adventitial fibroblaster. Dette fører til migrasjon og spredning av VSMC og fibroblaster innover til lumen, noe som fører til neointimal hyperplasi4,5. Sirkulerende stamceller og immunceller bidrar også til det totale volumet av restenose6. Der det er aktuelt, er legemiddeluttårne (DES) den nåværende standarden for hemming av restenosis7. DES hemmer arteriell re-endotelialisering, men dermed skape et pro-trombotisk miljø som kan resultere i sen stent trombose8. Derfor er dyremodeller integrerte for både å forstå patofysiologien til restenose, og for å utvikle bedre terapeutiske strategier for å forlenge effekten av revaskulariseringsprosedyrer.
Flere store og smådyremodeller 9 benyttes til å studere denne patologien. Disse inkluderer ballongskade3,10 eller wire-skade11 av luminalsiden av en arterie, samt delvis ligation12 eller mansjett plassering13 rundt arterien. Ballong- og trådskaden både denude endotellaget av arterien, etterligne hva som skjer klinisk etter angioplastikk. Spesielt bruker ballongskademodeller lignende verktøy som i klinisk setting (f.eks. ballongkateter). Ballongskaden utføres best i rottemodeller, da rottearterier er en passende størrelse for kommersielt tilgjengelige ballongkateter. Her beskriver vi en trykkkontrollert segmental arteriell skade, en veletablert, modifisert versjon av rottekarotisarterieballongskade. Denne trykkkontrollerte tilnærmingen etterligner nøye den kliniske angioplastikkprosedyren, og muliggjør reproduserbar neointimal hyperplasidannelse to uker etter skade14,15. I tillegg resulterer denne trykkkontrollerte arterielle skaden i fullstendig endotellagrestaurering med 2 uker etter operasjonen16. Dette kontrasterer direkte den opprinnelige ballongskademodellen, beskrevet av Clowes, hvor endeotellaget aldri går tilbake til full dekning3.
Etter operasjonen kan terapeutiske midler brukes på eller rettes mot den skadede arterien gjennom flere tilnærminger. Metoden som er beskrevet her, bruker periadventitial bruk av et lite molekyl innebygd i en pluronisk gelløsning. Spesielt bruker vi en løsning på 100 μM cinnamisk aldehyd i 25% Pluronic-F127 gel til arterien umiddelbart etter skade for å hemme neointimal hyperplasidannelse15. Pluronic-F127 er en giftfri, termo-reversibel gel i stand til å levere legemidler lokalt på en kontrollert måte17. I mellomtiden er arteriell skade lokal, derfor tillater lokal administrasjon å teste et aktivt prinsipp samtidig som off-target effekter minimeres. Likevel vil effektiv levering av en terapeutisk ved hjelp av denne metoden avhenge av kjemien til det lille molekylet eller biologiske som brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina på Chapel Hill.
1. Preoperative prosedyrer
- Steriliser kirurgiske instrumenter. Autoklav alle kirurgiske instrumenter før operasjonen. Hvis du utfører flere operasjoner på samme dag, steriliser instrumenter mellom operasjoner ved hjelp av en tørr perlesterilisator.
- Forbered terapeutisk i 25% Pluronic-127 gel (fortynnet i sterilt destillert vann).
- Sett opp et 2F Fogarty ballongkateter til insufflatoren og plasser ballongenden av kateteret i en 1 ml sprøyte fylt med saltvannsoppløsning.
- Indusere anestesi ved å plassere rotten i et kammer med 5% isofluran.
- Fjern rotten fra kammeret og registrer rottens vekt. Bruk hårklippere til å barbere pels på ventral halsområdet.
- Plasser rotten tilbake i kammeret med 5% isofluran for å sikre induksjon av anestesi.
- Plasser rotteliggende på en kirurgisk plattform, sett ansiktet inn i nesekjeglen slik at rotteansikten er mot kirurgen.
- Reduser inhalasjonsanestesi til 1,5% isofluran. Kontroller dybden av anestesi med en tå-klemmerefleks på alle fire føtter.
- Tape alle fire beina ned til den kirurgiske plattformen.
- Slå på varmelampen.
- Injiser Atropin (0,01 mg/kg) subkutant for å redusere luftveienes sekreter.
- Injiser Carprofen (5 mg/kg) subkutant for profylaktisk smertebehandling. Hvis antiinflammatoriske legemidler ikke er akseptable for forsøket, se trinn 3.2.2 og 3.2.3.
- Påfør smøremiddel øye salve til begge øynene ved hjelp av en steril bomullspinne for å hindre hornhinnen fra tørking under operasjonen.
- Vattpinne halsen tre ganger i en sirkulær bevegelse vekslende mellom 70% etylalkohol etterfulgt av Betadine fra midten av den barberte regionen utover for å sterilisere snittstedet.
- Infiltrer snittlinjen s.c. med 0,25% bupivacaine.
- Ta på deg sterile kirurgiske hansker før du håndterer sterile kirurgiske instrumenter og forsyninger.
- Legg ut alle autoklaverde kirurgiske instrumenter på et sterilt kirurgisk ark.
- Klipp tre uavhengige 1 tommers tråder av steril 7-0 Prolene sutur.
- Legg bomullspinner og gasbind på kirurgisk ark.
- Draper rotten med et sterilt kirurgisk ark som bare eksponerer den steriliserte nakkeregionen.
- Klipp en ekstra liten åpning i ark som eksponerer en del av nesekjeglen. Dette vil være stedet for å teipe ned ballongkateteret under skade.
2. Operative prosedyrer
- Under hele kirurgisk prosedyre, vurdere dybden av anestesi ved å overvåke respirasjonsfrekvensen (frekvensen skal være konsekvent og anses normal) samt ved tå klemme hver 15 min. Hvis respirasjonsfrekvensen øker eller det er et svar på tåklemmen, må du sette kirurgisk manipulasjon på pause og øke isofluranen opptil 2,5 %.
- Utsett den vanlige halspulsåren (CCA).
- Lag et overfladisk, rett, langsgående hals snitt mellom kjevebeinene til rotten. Snittet vil være ca 1,5-2 cm i lengde.
- Lag et snitt gjennom bindevevet under huden til muskellaget er utsatt. Fortrenge spyttkjertlene under huden for å få tilgang til muskelvevet.
- Skille bindevevet fra muskelen rett ut ved å sette inn lukket saks mellom muskellaget og bindevevet og forsiktig åpne saksen mens du trekker huden oppover.
- Dissekere de to synlige musklene (sternohyoid og sternomastoid) langs venstre side av luftrøret til en tredje muskel (omohyoid) som går vinkelrett på de to overfladiske musklene observeres.
- Bruk tang til å lage et vindu som skiller denne vinkelrett muskelen (omohyoid) fra langsgående muskel (sternohyoid) kjører på toppen av luftrøret. Utfør forsiktig denne separasjonen for å forhindre sløv traumer til luftrøret.
- Nå tang under vinkelmuskelen og kutt for å skille de to langsgående musklene og utsette CCA.
- Dissekere CCA.
- Dissekere CCA nær bifurcation til den indre halspulsåren (ICA) og ekstern halspulsåren (ECA) er utsatt.
- Dissekere overlegen skjoldbruskarterie (STA), som grener fra ECA.
- Ved hjelp av de forhåndskuttede Prolene-suturene, ligate STA og ECA i nærheten av deres respektive bifurcation. La mesteparten av suturen til den ene siden av knuten og ta hver sutur med en buet hemostat.
- Fullfør disseksjon rundt ICA, nå tang under og rundt ICA, og bruk en ikke-knusende vaskulær klemme for å oppnå distal kontroll. Klem sammen occipital arterien sammen med ICA.
- Disseker CCA proksimal til bifurcation, slik at du kan skille vagusnerven fra CCA.
- Nå tang under og rundt CCA og bruk en ikke-knusende vaskulær klemme for å oppnå proksimal kontroll. Plasser klemmen minst 5 mm fra bifurcation.
- Utfør ballongskade.
- Manøvrer de buede hemostats holder hver ligated arterie gren for å avsløre bifurcation mellom ECA og overlegen gren.
- Forsiktig dissekere vev ved bifurcation og deretter gjøre en arteriotomi snitt mellom ECA og overlegen gren ved hjelp av microdissection saks.
- Bruk en bomullspinne til å skyve alt blod ut av CCA og rydde opp i arterien.
- Sett det lite oppblåste ballongkateteret gjennom arterien og gå inn i CCA til den proksimale enden av ballongen er forbi bifurcation.
- Tapekateteret til nesekjeglen slik at ballongen ikke glir ut av arterien under inflasjonen.
- Blås ballongen langsomt opp til 5 atmosfærer av trykk og la i CCA i 5 min for å indusere arteriell skade. Sørg for at trykket holder seg konstant i hele 5 min.
- Etter 5 min, deflate ballong og forsiktig fjerne fra CCA gjennom arteriotomi.
- Skyll CCA ved å klemme forsiktig på klemmen ved CCA. Ikke fjern klemmen.
- Ligate ECA proksimal til arteriotomi og deretter fjerne klemmene fra CCA og ICA for å gjenopprette blodstrømmen gjennom CCA til ICA. Sørg for at det ikke er synlig blødning rundt arterien og at CCA pulserer.
- Påfør 100 μL terapeutisk eller pluronisk gelkjøretøy alene periadventitialt langs den skadede CCA. Gjør dette ved å påføre 50 μL på venstre side av CCA og deretter 50 μL til høyre side av CCA for å sikre jevn belegg av den skadede arterien.
- Lukk sårstedet.
- Kutt overflødig Prolene suturer.
- Lukk såret med avbrutte 4-0 eller 6-0 vikryllag langs bindevevet.
- Avslutt lukke såret ved hjelp av kjører 4-0 nylon sutur langs huden.
3. Postoperative prosedyrer
- Plasser rotten alene i et rent bur med halvparten av buret under en varmelampe og overvåk til rotte gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Hold rotten i et eget bur til dyret er fullt våken og mobil før du overfører tilbake til sitt opprinnelige bur.
- Overvåk rotten daglig de neste tre dagene og deretter tre ganger per uke til eutanasi. Euthanize ved bruk av isofluran overdose etterfulgt av bilateral thoracotomi som beskrevet nedenfor.
- Bruk National Centre for the Replacement Refinement & Reduction of Animals in Research (NC3Rs) grimaseskala for å identifisere postoperative smertenivåer. Hvis et dyr ser ut til å oppleve smerte eller utvikle et nevrologisk kompromiss, offer umiddelbart.
- For dyr som ikke får carprofen, administrer paracetamol 6 mg/ml i drikkevannet 24 timer før operasjonen gjennom 48 timer etter operasjonen. Paracetamol gir analgesi med minimale antiinflammatoriske effekter.
- Alternativt kan andre analgesistrategier med minimale antiinflammatoriske effekter brukes, for eksempel buprenorfin eller buprenorfin utvidet frigjøring. Ta kontakt med veterinærteamet på institusjonen din.
4. Vev høsting og avbildning
- To uker etter operasjonen, euthanize rotte ved overdose av anestesi (5% isofluran). Alternativt euthanize rotter på et tidligere tidspunkt for å analysere de ulike aspektene av arteriell skaderespons.
- Når pusten stopper utføre bilateral thoracotomy som en sekundær metode for eutanasi.
- Lag et lateralt snitt gjennom magen, og kutt deretter oppover, gjennom membranen og ribbeina, og eksponerer thoraxhulen.
- Perfuse og fikse arteriene.
- Sett inn en 18 G kanyle festet til et gravitasjonsperfusjonsfikseringssystem gjennom venstre ventrikkel. Opprettholde tilsvarende trykk mellom rotter ved å markere høyden på perfusjonssystemet i forhold til benkeplaten (120 cm høyde, tilsvarende 91 ± 3 mmHg).
- Klem kanylen sammen med ventrikkelen ved hjelp av en buet hemostat.
- Lag et kutt i høyre atrium, åpne vaskulær krets, og begynne perfusjon med PBS etterfulgt av 2-4% paraformaldehyd (ca 250 ml hver).
- Forbered paraformaldehyd fortynnet i PBS offerdagen, eller på det meste natten før offer. Hvis du forbereder på offerdagen, sørg for at paraformaldehyd har avkjølt til romtemperatur før du begynner perfusjonen. Oppbevar paraformaldehyd ved 4 °C.
- Etter fiksering, trekk ut venstre og høyre halspulsårer og oppbevar ved 4 °C i 2 timer i 2-4% paraformaldehyd.
- Overfør arterier til 30% sukrose og oppbevares over natten ved 4 °C.
- Etter 16-24 timer, bygge arteriene i optimal skjæretemperatur (OCT) sammensatte og fryse OCT-innebygd arterie blokker.
- Tilstand arterier i OCT ved romtemperatur i 10 min. Plasser arterien parallelt med kryomoldens plan fylt med OCT, som markerer siden av kryomold som arteriell bifurcation vender mot. Snap-fryse i flytende nitrogen.
- Oppbevar frosne blokker på lang sikt ved -80 °C.
- Seksjon frosne blokker ved hjelp av en kryostat.
- Samle seks 5 μm tykke arterielle tverrsnitt per lysbilde, med lysbilde 1 starter ved bifurcation.
- Seksjon frosne blokker til hyperplasi ikke lenger synlig (rundt 100 lysbilder).
- Hematoksylin og eosin (H&E) flekkerlysbilder 18
- Finn skadeområdet ved å fargelegge ett av ti lysbilder langs hele arterien fra bifurcation (f.eks. lysbilder 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 og 100).
- Flekk flere lysbilder rundt skadestedet for å finne lysbildet med topp okklusjon (f.eks lysbilder 20, 30 og 40 hadde synlig hyperplasi, og dermed flekk lysbilder 15, 25, 35 og 45).
- Beis og kvantifisere lysbildet med topp okklusjon og like langt sklier før og etter toppen okklusjon lysbilde (f.eks peak okklusjon funnet på lysbilde 35, deretter flekk og kvantifisere lysbilder 25, 45, etc.) for totalt 3-10 lysbilder per rotte.
- For lysarkfluorescensmikroskopiavbildning, oppbevar arteriene over natten ved 4 °C etter fiksering i trinn 4.4.
- Sondearterie med 1:500 fortynning av kaninanti-CD31 primært antistoff i fortynningsmiddel (pH 7,4) i 3 dager. Deretter motvirke arterie med 1:500 fortynning av anti-kanin Alexa Fluor 647 sekundære antistoff i 2 dager19.
- Tøm arterien ved hjelp av iDISCO+20.
- Bilde arterien ved hjelp av et lysark fluorescens mikroskop21. Gjengi bilder ved hjelp av programvare (f.eks. Imaris)19.
- Kvantifisere neointimal hyperplasi. Utfør kvantifisering på en blindet måte hvis mulig.
- Bruk ImageJ-programvaren til å spore omkretsen av intima, intern elastisk lamina (IEL) og ekstern elastisk lamina (EEL) av en arterie på hver av de 3-10 lysbildene som bestemmes ovenfor (trinn 4.8.3).
- Kvantifisere området for hvert sporede område i ImageJ og eksportere disse verdiene. Intima-sporet gir lumenområdet, IEL-sporet gir IEL-området, og EEL-sporet gir EEL-området.
- Gjennomsnittlig verdiene hentet fra 3-10 lysbildene for å få gjennomsnittlig skade (% okklusjon, intima: media (I: M) ratio, neointimal hyperplasi) per rotte halspulsåren.
Neointimal Hyperplasi = IEL-området - Lumen-området
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser alle materialer og kirurgiske verktøy som brukes til å utføre denne operasjonen. Hematoksylin & eosin (H&E) farging av to ukers skadet arteriell tverrsnitt gir klar visualisering av neointimal hyperplasi. Figur 2 viser representative bilder av H&E-farget arterielle tverrsnitt av en sunn, skadet og behandlet arterie. Figur 2 skisserer også hvordan man kvantifiserer nivået av neointimal hyperplasi i en skadet arterie ved hjelp av ImageJ, en mye brukt bildebehandlingsprogramvare. Ved hjelp av denne tilnærmingen spores omkretsen av neointima, samt den interne og eksterne elastiske laminaen for å kvantifisere de respektive områdene. Den trykkkontrollerte segmentalskademetoden beskriver vi resulterer i et intima-til-medieforhold på 0,80 med et standardavvik på 0,29 (2 forskjellige kirurger og n=11 rotter). Behandling med periadventitial anvendelse av CA i Pluronic resulterer i en hemming av neointimal hyperplasi, som vi har vist før (61% reduksjon i prosent okklusjon)15.
Figur 3 gir en illustrasjon for å lage en optimal arteriotomi ved bifurcation av ECA og STA. Til slutt viser figur 4 hvordan lysarkfluorescensmikroskopi kan brukes til å visualisere hele skadeområdet langs arteriens lengde. CD31 farging for å visualisere endotelceller fôr intimal laget kan utføres på faste arterier. Arterier kan deretter bygges inn i 1% agarose og ryddes ved hjelp av iDISCO + metoden for å homogenisere brytningsindeksen for prøven20. Deretter kan arteriene avbildes i et lysark fluorescensmikroskop, og bildene kan gjengis ved hjelp av programvare for å kvantifisere I:M-forholdet. Ved hjelp av denne tilnærmingen fikk vi et I:M-forhold på 0,86, som er i samsvar med H&E-resultatene.
| Seksjonsnummer | Referanse |
| 10 seksjoner | 27 |
| 8 seksjoner | 28 |
| 6-10 seksjoner | 29 |
| 6 seksjoner | 30 |
| 5 seksjoner | 31 |
| 3 seksjoner | 32 |
Tabell 1. Vanlig brukt antall arterielle tverrsnitt for hyperplasi analyse.
Figur 1. Kirurgiske instrumenter og verktøy. Med klokken starter i øvre venstre hjørne av bildet: (A) Bomull vattpinner; (B) Betadin løsning; (C) Gasbind; (D) 70% etylalkohol løsning; (E) 1cc sprøyter med nål; Atropin; (G) Retractors; bøyde binders som brukes her; (H) Rimadyl; (I)Mikro-serrefin klemme bruke tang; (J) Nålholder; (K) 4-0 nylon sutur; (L) 4-0 vikryl sutur; (M) Sterile gardiner; Mayosaks; (O) Standard tang; (P) Fine buede tang; (Q) Microdissection saks; (R)Mikro serrefine klemmer; Finsaks; (T) T-pinner; (U) Buede hemostater; (V) Tre 7-0 Prolene suturer kuttet til ca 1-tommers; (W) 100 μL av 25% pluronic-127 gel; (X) Smøre øye salve; (Y) 2 fransk ballong embolectomy kateter i steril saltvannsløsning; Insufflator. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Hematoksylin & Eosin (H&E) farging og analyse av rottekarotisarterie tverrsnitt. (A)Tverrsnitt av sunn, uskadet høyre halspulsåren. IEL = Intern Elastisk Lamina, EEL = Ekstern Elastisk Lamina. (B) Tverrsnitt av to ukers skadet venstre halspulsåren behandlet med Pluronic-F127 kjøretøy. (C) Tverrsnitt av to ukers skadet venstre halspulsåren behandlet med 100 μM cinnamic aldehyd. Vektstangen = 100 μm. (D) Snitting skjematisk av frosne arterier for kvantifisering av skader. Lysbilde 1 starter ved bifurcation og seks arterielle seksjoner 5 μm i bredde er tatt per lysbilde. Inndeling fortsetter vanligvis å skyve 70, siden skaden vanligvis oppstår før dette lysbildet. (E)Tverrsnitt av skadet venstre halspulsåren behandlet med Pluronic kjøretøy (B). Den innerste svarte linjen sporer neointima og avgrenser luminalområdet. Den midterste gule linjen avgrenser området av den interne elastiske lamina, eller tunika intima. Den ytre blå linjen avgrenser området av den ytre elastiske lamina, eller tunika adventitia. Vektstangen = 100 μm. (F) Beregninger som brukes til måling av prosentbeholderens okklusjon og intima:media (I:M) forhold basert på målinger hentet fra (E). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Arteriotomi skapelse. Illustrasjon av trinnene for å lage en riktig arteriotomi, og unngå en falsk traktat. CCA = Vanlig halspulsåren, ECA = Ekstern halspulsåren, ICA = Indre halspulsåren, OA = Occipital Arterie, STA = Overlegen skjoldbruskkjertelarterie. Isoler bifurcation mellom ECA og STA grener. Disseker denne bifurcation til området endres til en lysere farge, noe som indikerer tynning av arteriell vegg, og deretter skape en arterieiotomi ved hjelp av mikrodisseksjon saks. Løft arteriotomi ved hjelp av fine tang for å hjelpe i ballonginnsetting. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Lys ark fluorescens mikroskopi for å visualisere arteriell skade. Langsgående tverrsnitt langs lengden av den vanlige halspulsåren fra en 14 uker gammel Sprague Dawley rotte med en representativ tverrgående seksjon nedenfor. Arteriene er farget med CD31 og motvirket med AF647. (A)Tverrsnitt av sunn, uskadet høyre halspulsåren. Hvit = CD31, Grønn = Elastisk Lamina, L = Lumen, Scale bar = 200-500 μm. (B) Tverrsnitt av skadet, venstre halspulsåren behandlet med Pluronic-F127 kjøretøy. Pilspisser indikerer regioner av neointimal hyperplasi. (C) Intima til media (I:M) forholdet mellom uskadet og skadet halspulsåren, med nøyaktig verdi kjent for hver gruppe (n = 1). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rottekarotisarterieballongskaden er en av de mest brukte og studerte restenosis dyremodeller. Både den opprinnelige ballongskademodellen3 og den modifiserte trykkkontrollerte segmentalskadevariasjonen10 har informert mange aspekter ved arteriell skaderespons som også forekommer hos mennesker, med de få begrensningene er at fibrinrike trombe sjelden utvikler seg og lokal betennelse er minimal sammenlignet med andre skademodeller som i hyperkolesterololiske kanin- eller svinemodeller9,22. Rottene kan også ofres på forskjellige tidspunkter for å kvantifisere og analysere de forskjellige aspektene ved arteriell skaderespons. For eksempel, tidligere tidspunkter kan brukes til å studere aspekter av tidlig respons på skade som celle spredning, fenotypisk bryter av vaskulære glatte muskelceller, og tidlig immunrespons. Vi har tidligere vist at leukocyttinfiltrasjon og cellespredning er maksimalt mellom 3 dager og 1 uke16. Mellomliggende tidspunkter kan brukes til å vurdere frekvensen av re-endotelialisering. Det to-ukers tidspunktet er det tidligste foreslåtte tidspunktet for måling av neointimal hyperplasi, da arterien for det meste er re-endotelialisert på dettepunktet 16. En stor begrensning for å oversette denne modellen er at skaden utføres i en sunn arterie, mens denne prosedyren forekommer hos pasienter med aterosklerotisk sykdom. Denne begrensningen finnes delvis på grunn av tidligere mangel på tilgjengelig rotte aterosklerose modeller23,24. Fremskritt innen genredigeringsteknologi har imidlertid gjort det mulig å utvikle pålitelige aterosklerotiske rottemodeller24, noe som kan gi ny innsikt i å studere patofysiologien til restenose.
Til sammenligning gir hannrotter en mer robust skade enn hunnrotter, som vanligvis utvikler mindre neointimal hyperplasi muligens på grunn av en beskyttende effekt av østrogen25. Den beskrevne modellen er imidlertid fortsatt hensiktsmessig å studere arteriell helbredelse hos kvinner. Hannrotter aldring 12-16 uker, mellom 300-400 g gir den mest robuste og reproduserbare neointimale formasjonen. Rotter yngre enn 12 uker kan brukes; Imidlertid kan arteriene til disse yngre rotter være for små for 2F ballongen å lett komme inn i arterien avhengig av rottestammen. Rotter som veier under 200 gram bør ikke brukes på med denne modellen, da ballongen ikke lett passer gjennom arterien og kan faktisk rive arterien hvis den tvinges. I tillegg kan bruk av rotter eldre enn 16 ukers alder gi en variabel respons ved neointimal dannelse. Ulike rottestammer kan brukes til å utføre denne skademodellen, med Sprague Dawley rotter som den mest brukte gjennom hele litteraturen26. For å starte operasjonen, først få riktig justering og orientering av snittet området i nakken ved å føle for kjeven bein og bruke rotte nesen for å finne midtlinjen. Etter det første snittet, dissekere vevet til to langsgående muskler (sternohyoid og sternomastoid) kjører parallelt med hverandre er visualisert. Bruk nakkemuskelen (masser) som den nedre grensen for operasjonsvinduet, mot hodet. Skill de parallelle musklene, som går mot kroppen, fra hverandre til en muskel som går vinkelrett på disse to visualiseres. Kutte vinkelrett muskel vil tillate enkel tilbaketrekking av de to parallelle musklene, utsette halspulsåren. Siden anatomien kan variere noe fra hvert dyr, sammen med deres posisjonering, kan det være en mindre arteriell gren som hviler på toppen av ICA. Denne mindre grenen kan klemmes sammen med ICA; Men når denne lille grenen ikke er klemt, bør det ikke være noen problemer med å utføre prosedyren. I tillegg må du sørge for å dissekere bort vagusnerven fra både ICA og CCA før noen klemming og suturing finner sted. Det er viktig å være forsiktig og for å unngå nerveskader på dette punktet. Hvis dyret rykker etter å ha satt på en klemme som kan være et svar på vagusnerven som kommer i kontakt med metallklemmen; vurdere å justere klemmen på nytt.
Uten tvil er det vanskeligste trinnet i hele prosedyren å gjøre arteriotomien. Dette er fordi det er mulig å lage en "falsk" arteriotomi, og sette inn en ballong gjennom denne "falske" arteriotomi vil føre ballongen til å faktisk kjøre over arterien, snarere enn inne i arterien. Hvis dette skjer, så gjør en ny arteriotomi nærmere bifurcation på CCA er en mulig løsning, men hvis ballongen ble tvunget inn i arterien, så operasjonen kan ikke være redningbar. For å forhindre en "falsk" arteriotomi (figur 3), dissekere adventitiallaget ved ECA og STA bifurcation ved hjelp av fine tang til utseendet er betydelig rødere enn nærliggende regioner, og den delen av arterien ser ut til å stikke ut. Etterpå bruker du mikrosaksen til å lage arteriotomien ved raskt å sette inn en spiss av saksen i det ryddet området ved bifurcation og deretter kutte. Etter å ha gjort arterien, bruk de fine tangene til å løfte åpningen av arterien og skyv ballongen inn i lumen. Ballongen skal gli lett gjennom arteriotomien og inn i CCA. Avhengig av rotteposisjonering kan det være nyttig å lede ballongen inn i CCA ved hjelp av fine tang for å forsiktig trekke oppover på utsiden av CCA mens du fører ballongkateteret inn i CCA. Etter at ballongen er satt inn i CCA, tape kateteret ned slik at ballongen ikke går ut av arterien som det blir oppblåst.
Periadventitial anvendelse av terapeutisk tillater lokal og rettet legemiddellevering bare på skadestedet. Denne tilnærmingen begrenser potensielle off-target effekter samt dosering begrensninger sammenlignet med noe levert systemisk av muntlig, intraperitoneal, eller intravenøs administrasjon. Pluronic-F127 er termo-reversibel, noe som betyr at den er flytende ved kald temperatur og geler ved romtemperatur. Dette gjør det mulig for terapeutisk å lett fremstilles i en flytende løsning før pluroniske geler, mens gelen kan påføres jevnt på arterien umiddelbart etter skade. Mens toppen av CCA er lett tilgjengelig for å effektivt dekke hele skadeområdet, bør CCA forsiktig løftes for å belegge den nederste delen av CCA. Forskerne må imidlertid sørge for å drive studien på riktig måte for å ta høyde for potensiell variasjon mellom behandlede dyr. Det er viktig å ha en estimering av forventet effektstørrelse og standardavviket av utfallet for å drive studien på riktig måte. Begrensningen av den periadventitiale leveringsmetoden er at det ikke er en klinisk relevant tilnærming siden pasientens arterie ikke eksponeres under en angioplastikk, som utføres som en perkutan prosedyre. Likevel, periadventitial søknad gjør det mulig for foreløpig testing av molekyler og biologer levert lokalt til stedet for skade15,27,28,29,30.
Den nåværende standardmetoden for kvantifisering av neointimal hyperplasi er basert på morfometrisk analyse av H&E-fargede lysbilder. Den skadede halspulsåren er fysisk delt på lysbilder i 5 μm skiver. Disse lysbildene blir deretter farget ved hjelp av H&E og bilder tas ved hjelp av et lett mikroskop. ImageJ-programvaren brukes deretter til å måle områdene og omkretsene avgrenset av intima, intern lamina og ekstern lamina. Selv om vi har rapportert økt presisjon ved hjelp av 10 lysbilder for å kvantifisere hyperplasi19, finnes det ingen konsensus i litteraturen om hvor mange lysbilder å måle, med rapportert metodikk som varierer fra 3 til 10 jevnt fordelte seksjoner (Tabell 1)31,32,33,34,35,36. Et I:M-forhold på 0,8 med et standardavvik på 0,29 (n=11) kan forventes ved hjelp av denne metodikken (Område: 0,54-1,51). Vi og andre har tidligere rapportert lysark fluorescens mikroskopi (LSFM) gir en ny tilnærming til visualisering arteriell skade19,37. LSFM gjør det mulig å avbilde hele halspulsåren i x, y og z-flyet. LSFM tillater optisk kutting å generere arterielle tverrsnitt for analyse, noe som gir mer presise estimater av hyperplasi (variasjonskoeffisient: 28% av LSFM vs 41% av histologi) enn tradisjonelle histologiske tilnærminger19,37. Som vist i figur 4kan I:M-forholdet oppnådd av LSFM (0,86, n=1) sammenlignes med resultatene vi oppnådde gjennom klassisk histologisk analyse (0,8 ± 0,29).
Til slutt rekabilerer den trykkkontrollerte segmentalskaden den arterielle skaderesponsen som oppstår etter kliniske revaskulariseringsprosedyrer, noe som gjør den til en ideell modell for å studere patofysiologien til restenose. Periadventitial narkotika søknad er en nyttig bevis-of-concept leveringsmetode for å analysere den terapeutiske effekten av lokal narkotika levering, og kan informere utviklingen av målrettede systemiske narkotika levering tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter angående utgivelsen av dette manuskriptet.
Acknowledgments
N.E.B. ble støttet av et opplæringsstipend fra National Institute of Environmental Health Sciences (5T32ES007126-35, 2018), og en American Heart Association pre-doktorgradsfellesskap (20PRE35120321). E.S.M.B. var en KL2-forsker delvis støttet av UNC Clinical and Translational Science Award-K12 Scholars Program (KL2TR002490, 2018) og National Heart, Lung, and Blood Institute (K01HL145354). Forfatterne takker Dr. Pablo Ariel fra UNC Microscopy Services Laboratory for å ha hjulpet til med LSFM. Lysarkfluoresceni ble utført ved Microscopy Services Laboratory. Microscopy Services Laboratory, Institutt for patologi og laboratoriemedisin, støttes delvis av P30 CA016086 Cancer Center Core Support Grant til UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | Fisher | 14955450 | |
| 1 mL Syringe with needle | BD | 309626 | |
| 2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter | Edwards LifeSciences | 120602F | |
| 4-0 Ethilon (Nylon) Suture | Ethicon Inc | 662H | |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon Inc | J214H | |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Inc | 8800H | |
| 70% ethyl alcohol | |||
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21245 | |
| Atropine Sulfate | Vedco Inc | for veterinary use | |
| Cotton Swabs | Puritan | 806-WC | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Gauze | Covidien | 2252 | |
| IHC-Tek Diluent (pH 7.4) | IHC World | IW-1000 | |
| Insufflator | Merit Medical | IN4130 | |
| Iodine solution | |||
| Lubricating Eye Ointment | Dechra | for veterinary use | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12003-15 | |
| Pluronic-127 (diluted in sterile water) | Sigma-Aldrich | P2443 | 25% prepared |
| Rabbit Anti-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Retractor | Bent paper clips work well | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc | for veterinary use | |
| Saline solution | |||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Sterile Drape | Dynarex | 4410 | |
| T-Pins |
References
- American Heart Association. Cardiovascular Disease: A Costly Burden for America, Projections Through 2035. American Heart Association CVD Burden Report. , (2017).
- Singh, R. B., Mengi, S. A., Xu, Y. J., Arneja, A. S., Dhalla, N. S. Pathogenesis of atherosclerosis: A multifactorial process. Experimental and Clinical Cardiology. 7 (1), 40-53 (2002).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Laboratory Investigation. 49 (2), 208-215 (1983).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Laboratory Investigation. 49 (3), 327-333 (1983).
- Sartore, S., et al. Contribution of adventitial fibroblasts to neointima formation and vascular remodeling: from innocent bystander to active participant. Circulation Research. 89 (12), 1111-1121 (2001).
- Tanaka, K., et al. Circulating progenitor cells contribute to neointimal formation in nonirradiated chimeric mice. The FASEB Journal. 22 (2), 428-436 (2008).
- Henry, M., et al. Carotid angioplasty and stenting under protection. Techniques, results and limitations. The Journal of Cardiovascular Surgery. 47 (5), Torino. 519-546 (2006).
- Kounis, N. G., et al. Thrombotic responses to coronary stents, bioresorbable scaffolds and the Kounis hypersensitivity-associated acute thrombotic syndrome. Journal of Thoracic Disease. 9 (4), 1155-1164 (2017).
- Jackson, C. L.
- Shears, L. L., et al. Efficient inhibition of intimal hyperplasia by adenovirus-mediated inducible nitric oxide synthase gene transfer to rats and pigs in vivo. Journal of the American College of Surgeons. 187 (3), 295-306 (1998).
- Takayama, T., et al. A murine model of arterial restenosis: technical aspects of femoral wire injury. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Zhang, L. N., Parkinson, J. F., Haskell, C., Wang, Y. X. Mechanisms of intimal hyperplasia learned from a murine carotid artery ligation model. Current Vascular Pharmacology. 6 (1), 37-43 (2008).
- Jahnke, T., et al. Characterization of a new double-injury restenosis model in the rat aorta. Journal of Endovascular Therapy. 12 (3), 318-331 (2005).
- Gregory, E. K., et al. Periadventitial atRA citrate-based polyester membranes reduce neointimal hyperplasia and restenosis after carotid injury in rats. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (10), 1419-1429 (2014).
- Buglak, N. E., Jiang, W., Bahnson, E. S. M. Cinnamic aldehyde inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia in Zucker Diabetic Fatty rats. Redox Biology. 19, 166-178 (2018).
- Bahnson, E. S., et al. Long-term effect of PROLI/NO on cellular proliferation and phenotype after arterial injury. Free Radical Biology and Medicine. 90, 272-286 (2016).
- Gilbert, J. C. W., Davies, M. C., Hadgraft, J. The behaviour of Pluronic F127 in aqueous solution studied using fluorescent probes. International Journal of Pharmaceutics. 40 (1-2), 93-99 (1987).
- Tulis, D. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 31-66 (2007).
- Buglak, N. E., et al. Light Sheet Fluorescence Microscopy as a New Method for Unbiased Three-Dimensional Analysis of Vascular Injury. Cardiovascular Research. , (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. , (2018).
- Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
- Xiangdong, L., et al. Animal models for the atherosclerosis research: a review. Protein Cell. 2 (3), 189-201 (2011).
- Chen, H., Li, D., Liu, M. Novel Rat Models for Atherosclerosis. Journal of Cardiology and Cardiovascular Sceinces. 2 (2), 29-33 (2018).
- Xing, D., Nozell, S., Chen, Y. F., Hage, F., Oparil, S. Estrogen and mechanisms of vascular protection. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (3), 289-295 (2009).
- Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 1-30 (2007).
- Pellet-Many, C., et al. Neuropilins 1 and 2 mediate neointimal hyperplasia and re-endothelialization following arterial injury. Cardiovascular Research. 108 (2), 288-298 (2015).
- Wu, B., et al. Perivascular delivery of resolvin D1 inhibits neointimal hyperplasia in a rat model of arterial injury. Journal of Vascular Surgery. 65 (1), 207-217 (2017).
- Tan, J., Yang, L., Liu, C., Yan, Z. MicroRNA-26a targets MAPK6 to inhibit smooth muscle cell proliferation and vein graft neointimal hyperplasia. Scientific Reports. 7, 46602 (2017).
- Pearce, C. G., et al. Beneficial effect of a short-acting NO donor for the prevention of neointimal hyperplasia. Free Radical Biology and Medicine. 44 (1), 73-81 (2008).
- Cao, T., et al. S100B promotes injury-induced vascular remodeling through modulating smooth muscle phenotype. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (11), 2772-2782 (2017).
- Madigan, M., Entabi, F., Zuckerbraun, B., Loughran, P., Tzeng, E. Delayed inhaled carbon monoxide mediates the regression of established neointimal lesions. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1026-1033 (2015).
- Khurana, R., et al. Angiogenesis-dependent and independent phases of intimal hyperplasia. Circulation. 110 (16), 2436-2443 (2004).
- Tsihlis, N. D., Vavra, A. K., Martinez, J., Lee, V. R., Kibbe, M. R. Nitric oxide is less effective at inhibiting neointimal hyperplasia in spontaneously hypertensive rats. Nitric Oxide. 35, 165-174 (2013).
- Chen, J., et al. Inhibition of neointimal hyperplasia in the rat carotid artery injury model by a HMGB1 inhibitor. Atherosclerosis. 224 (2), 332-339 (2012).
- Mano, T., Luo, Z., Malendowicz, S. L., Evans, T., Walsh, K. Reversal of GATA-6 downregulation promotes smooth muscle differentiation and inhibits intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation Research. 84 (6), 647-654 (1999).
- Becher, T., et al. Three-Dimensional Imaging Provides Detailed Atherosclerotic Plaque Morphology and Reveals Angiogenesis after Carotid Artery Ligation. Circulation Research. 126 (5), 619-632 (2020).
