Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

एकाधिकार ी माइटोटिक स्पिंडल में कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी द्वारा माइक्रोट्यूब्यूल डायनेमिक्स का मापन

Published: November 15, 2019 doi: 10.3791/60478
Automatic Translation
1,2, 1
1AG Oncophysiology, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

Summary

यहां हम लाइव-सेल स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और मैटलैब-आधारित छवि प्रसंस्करण का उपयोग करके प्रोमेटफेज में सिंक्रोनाइज्ड कोशिकाओं में माइक्रोट्यूबबुल गतिशीलता विश्लेषण की एक मजबूत और विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

हम जीवित कोशिकाओं में माइक्रोट्यूबबुल गतिशीलता निर्धारित करने के लिए एक स्थापित विधि के संशोधन का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल माइक्रोट्यूब्यूल्स (टीडीटोमेटो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किए गए EB3) और हाई-स्पीड, हाई-रेजोल्यूशन, कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लाइव-सेल इमेजिंग के सकारात्मक सिरों के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड मार्कर की अभिव्यक्ति पर आधारित है। सेल साइकिल सिंक्रोनाइजेशन और माइक्रोट्यूब्यूल के बढ़ते घनत्व को माइटोटिक कोशिकाओं में सेंट्रोसोमल अलगाव को बाधित करके प्राप्त किया जाता है, और ओपन-सोर्स यू-ट्रैक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विकास का विश्लेषण किया जाता है। कम लेजर पावर के संयोजन में एक उज्ज्वल और लाल-स्थानांतरित फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग और डिस्क माइक्रोस्कोपी कताई के लिए आवश्यक कम एक्सपोजर समय फोटोटॉक्सिकिटी और प्रकाश-प्रेरित कलाकृतियों की संभावना को कम करता है। यह मानक संस्कृति की स्थिति के तहत एक विकास माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखते हुए एक ही तैयारी में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । क्योंकि विश्लेषण एक पर्यवेक्षित स्वचालित फैशन में किया जाता है, परिणाम सांख्यिकीय मजबूत और प्रजनन योग्य हैं ।

Introduction

माइक्रोट्यूबबुल (एमटी) अत्यधिक गतिशील संरचनाएं हैं जो लगभग सभी यूकेरियोटिक कोशिकाओं में और कुछ बैक्टीरिया1में पाई जाती हैं। ऐक्टिन और इंटरमीडिएट फिलामेंट्स के साथ मिलकर वे साइटोस्केलेटन2,3को मूर्तिकला देते हैं । सेल डिवीजन4, अणु परिवहन5,फ्लैगेलर बीटिंग6,प्राइमरी सिलियम7के माध्यम से आसपास के वातावरण की अनुभूति, श्रवण (किनोसिलियम),8,9, भ्रूणजनजी10,11,12,आक्रमण और मेटाटैसिस13,14,और यहां तक कि स्मृति गठन15,16,17,18, और कई अन्य प्रक्रियाएं मुख्य रूप से एमटी पर भरोसा करती हैं। इन सभी घटनाओं में एमटी की भागीदारी विकास (बहुलककरण) और सिकुड़न (डिपॉलीमराइजेशन) के बीच तेजी से स्विच करने की उनकी उल्लेखनीय क्षमता के बिना असंभव होगी। इस संपत्ति को गतिशील अस्थिरता19बताया गया है । एमटी गतिशीलता कई रोग स्थितियों में बदल जाती है20,21,22. इसलिए, इस संपत्ति की प्रकृति का निर्धारण रोग तंत्र और बाद में उनके उपचार को समझने में मदद कर सकता है।

एमटी गतिशीलता विश्लेषण के लिए तरीकों की एक लंबी सूची विकसित की गई है, जिनमें से अधिकांश इमेजिंगतकनीक23पर आधारित हैं। प्रारंभ में, विट्रो24में ट्यूबलिन पॉलिमर के गठन को देखने के लिए व्यापक क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। अंत बाध्यकारी (ईबी) की खोज- प्रोटीन जो एमटी प्लस-सिरों पर एकत्र होते हैं और प्रोटीन को फ्लोरोसेंटी लेबल करने के तरीकों के विकास ने व्यापक क्षेत्र और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप25,26,27के साथ जीवित कोशिकाओं में सीधे एमटी के व्यवहार का पालन करना संभव बनाया। एक ईबी-प्रोटीन एंड-बाइंडिंग प्रोटीन 3 (ईबी3)28है; अतिव्यक्त करने और ट्रैकिंग EB3 एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े द्वारा, मीट्रिक टन प्लस अंत विधानसभा दरों29,30निर्धारित किया जा सकता है ।

कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) का उपयोग अक्सर एमटी गतिशीलता का पालन करने के लिए किया जाता है। हालांकि, यह इमेजिंग तकनीक फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग, लाइव सेल और मंद नमूना इमेजिंग31के लिए दो अवांछनीय प्रक्रियाओं का उच्च जोखिम बन गई है। आदेश में एक बेहतर संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए, लेजर शक्ति और जोखिम अवधि काफी उच्च होना चाहिए, जबकि नमूनों को नुकसान नहीं है, और यह गति के बदले में संकल्प त्याग की आवश्यकता है । सीएलएसएम का एक उपयुक्त विकल्प डिस्क माइक्रोस्कोपी32कताई है। यह इमेजिंग मोडलिटी एक निको डिस्क33के उपयोग पर आधारित है, जिसमें पिनहोल की एक सरणी वाले एक चलती डिस्क होती है, और एक ही नमूने को एक साथ34इमेजिंग करने वाले कई सीएलएस माइक्रोस्कोप के समान रूप से काम करती है। इसलिए, लेजर से प्रकाश नमूने में कई क्षेत्रों को एक साथ रोशन करेगा लेकिन कॉन्फोकल प्रकृति को बनाए रखेगा। निकोडिस्क, इसलिए, सीएलएसएम के समान छवियों को प्राप्त करने और तेजी से और कम लेजर शक्ति का उपयोग करने की अनुमति देता है। निकोवा डिस्क को योकोगावा इलेक्ट्रिक द्वारा और बेहतर किया गया था, जिसने उस पर माइक्रोलेंस की एक सरणी के साथ एक दूसरी डिस्क पेश की जो व्यक्तिगत रूप से एक संबंधित पिनहोल में प्रत्यक्ष प्रकाश, फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग35को कम करती है। इस प्रकार, कताई डिस्क लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी लाइव सेल इमेजिंग के लिए पसंद की एक विधि बन गई, और यह उच्च गति31,36पर उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ छवियों को प्राप्त करना संभव बनाता है, जो तेजी से बढ़ते मीट्रिक सिरों से संकेतों को हल करने के लिए महत्वपूर्ण है।

मीट्रिक टन गतिशीलता अस्थायी रूप से भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, माइटोटिक एमटी इंटरफेज वाले37,38की तुलना में अधिक गतिशील होते हैं। इसी प्रकार, विकास दर और सिकुड़न में अंतर एक ही सेल चक्र चरण के भीतर भी देखा गया है, जैसे माइटोसिस39,40। इसलिए, झूठे डेटा संग्रह से बचने के लिए, एमटी गतिशीलता का माप सेल चक्र के दौरान एक संकीर्ण समय-खिड़की तक सीमित होना चाहिए। उदाहरण के लिए, प्रोमेथेराफेज में एमटी गतिशीलता का माप नप डायमेथिलेंस्ट्रॉन (डीएमई) के साथ कोशिकाओं का इलाज करके प्राप्त किया जा सकता है, एक मोनोस्ट्रोल एनालॉग जो मोटर किनेसिन Eg541 को रोकता है और द्विध्रुवी माइटोटिक स्पिंडल42के गठन को रोकता है। Eg5 अवरोधक डीएमई और अन्य मोनोस्ट्रोल डेरिवेटिव के साथ प्रोमेटाफेज में कोशिकाओं का अवरोध एमटी गतिशीलता43,44,45को प्रभावित नहीं करता है, जो डीएमई को निश्चित और जीवित कोशिकाओंदोनोंमें एमटी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण बनाता है ।

यहां हम ड्यूल कताई डिस्क इमेजिंग के साथ एर्टिच एट अल44 द्वारा वर्णित प्रोमेटाफेज कोशिकाओं में एमटी गतिशीलता विश्लेषण की विधि को जोड़ते हैं। यह विधि उच्च इमेजिंग दर के साथ एक ही फोकल प्लेन से एकत्र की गई प्रोमेटाफेज कोशिकाओं में एमटी गतिशीलता की माप की अनुमति देती है, फिर भी फोटोब्लीचिंग और न्यूनतम फोटोटॉक्सिकिटी के बिना। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के रूप में, हम मिलकर डामर टोमैटो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (टीडीटमाटर) का उपयोग करते हैं जिसने हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) की तुलना में चमक और फोटोस्थिरता में सुधार किया है और कम ऊर्जा प्रकाश46से उत्साहित है। इसलिए, टीडीमैटो को उत्तेजना के लिए कम लेजर पावर की आवश्यकता होती है और यह कम फोटोटॉक्सिक है। कुल मिलाकर, हम फोटोटॉक्सिकिटी को कम करके और एमटी गतिशीलता विश्लेषण के लिए आवश्यक संकल्प और पोस्टप्रोसेसिंग में सुधार करके विधि में और सुधार करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम अन्य सिंक्रोनाइजेशन तकनीकों के साथ इसे जोड़कर विधि के भविष्य के संशोधनों के लिए एक आधार बनाते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. हेला कोशिकाओं की सीडिंग

  1. फॉस्फेट बफर्ड लवलाइन (पीबीएस) में 5 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन समाधान के 2 mL तैयार करें और इसके बारे में 450 माइक्रोन को 4 अच्छी तरह से चैम्बर कवरस्लिप (#1.5) के प्रत्येक कुएं में जोड़ें। स्लाइड में 15 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट ।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 न्यूनतम के लिए डुल्बेकको के फॉस्फेट बफर्ड लवइन (डीपीबीएस) के साथ और ट्राइप्सिन-ईडीटीए (0.05%: 0.02%; w:v) के साथ एसिंक्रोनसली रूप से बढ़ती वाघेला कोशिकाओं को कुल्ला करें। रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 मीडियम के अलावा 3:1 (v:v) अतिरिक्त ट्राइप्सिन-ईटीए के अनुपात में 10% हीट-इनएक्टिवेटेड भ्रूण बछड़े सीरम (एफसीएस) के साथ पूरक के अलावा एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को रोकें।
    नोट: आरपीएमआई 1640 मीडियम में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 10% हीट-इनएक्टिवेटेड एफसीएस के साथ हेला कोशिकाओं को बनाए रखा गया था और ऊपर वर्णित 80-90% संबल ता्मकता तक पहुंचने के बाद नियमित रूप से पारित किया गया था।
  3. एक Neubauer कक्ष का उपयोग कर सेल एकाग्रता निर्धारित करें। 1:1 (v:v) अनुपात पर ट्राइपैन नीले रंग के साथ सेल निलंबन का 50 माइक्रोन ल्युनकोट मिलाएं, फिर से निलंबित करें, और निलंबन के 10 माइक्रोन को कक्ष में स्थानांतरित करें। चार बड़े वर्गों के अंदर केवल ट्राइपैन नीली-नकारात्मक कोशिकाओं की गणना करें (विवरण के लिए फेलन एट अल47देखें)। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके गिने गए सेल नंबर से सेल एकाग्रता प्राप्त करें:
    Equation 1
  4. 2 मिन के लिए 300 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को गोली मार ें। 1 x 106 कोशिकाओं/mL प्राप्त करने के लिए ताजा आरपीएमआई 1640 के साथ फिर से निलंबित करें।
  5. कक्षकवरस्लिप से फाइब्रोनेक्टिन निकालें, कुओं को डीपीबीएस के साथ दो बार धोएं, और बीज 50,000 कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से।
  6. कक्ष कवरस्लिप को कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेटर पर लौटाएं और उन्हें 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर विकसित करें।

2. हेला कोशिकाओं में pEB3-tdTomato की अभिव्यक्ति

  1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब तैयार करें। प्रत्येक ट्यूब के लिए, 396 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में ट्रांसफेक्शन बफर (जलीय समाधान में सिंथेटिक उत्पाद) के साथ pEB3-tdTomato48 के 2 μg को पतला करें।
  2. पहली ट्यूब में ट्रांसफेक्शन रिएजेंट (नॉन-लिपिकिक, जिसमें पॉलीथीनमाइन युक्त) का 4 माइक्रोन जोड़ें, और मिश्रण को तुरंत 10 एस के लिए भंवर करें।
  3. संक्षेप में एक माइक्रोसेंटिफ्यूज के साथ ट्यूब नीचे स्पिन और कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 min के लिए इनक्यूबेट ।
  4. इनक्यूबेटर से हेला कोशिकाओं को हटा दें। ड्रॉपवाइज, 4 अच्छी तरह से चैम्बर कवरस्लिप के प्रत्येक कुएं में ट्रांसफेक्शन मिश्रण के 100 माइक्रोन जोड़ें, और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस करें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 4 घंटे के ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को ताजा विकास माध्यम के साथ पूरक करें और कम से कम 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें ।
    नोट: प्रत्येक सेल प्रकार के लिए ट्रांसफेक्शन शर्तों को अनुकूलित करना आवश्यक है। एकल मीट्रिक टन वृद्धि समाप्त होने की पहचान की अनुमति देने के लिए अभिव्यक्ति के स्तर को काफी कम करने की आवश्यकता है । वैकल्पिक रूप से, प्रयोगों में EB3-tdTomato को व्यक्त करने वाली सेल लाइन का उपयोग किया जा सकता है; यह EB3 के अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तनशीलता को कम करेगा-तैयारी के बीच टीडीटमाटर और एक ही तैयारी49से कोशिकाओं के बीच .

3. pEB3-tdTomato-हेटला कोशिकाओं को व्यक्त करने के सिंक्रोनाइजेशन और लाइव-सेल इमेजिंग

  1. फिनॉल-रेड फ्री डुल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) में डाइमेथिलेंस्ट्रॉन (डीएमई) का 2.5 माइक्रोन समाधान तैयार करें जो 10% एफसीएस और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन या एक वैकल्पिक ग्लूटामाइन आपूर्ति के साथ पूरक है।
  2. चैंबर कवरस्लिप में विकास माध्यम को 2.5 माइक्रोएम डीएमई वाले विकास माध्यम के 500 माइक्रोन के साथ बदलें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।
  3. डीएमई के साथ 3.5 घंटे के ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को माइक्रोस्कोप पर स्थानांतरित करें, कक्ष कवरस्लिप को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इमेजिंग के लिए अंधेरे पैनलों के साथ एक पर्यावरण कक्ष में माउंट करें, और कुल ऊष्मायन समय 4 घंटे होने तक आगे इनक्यूबेट करें।
    नोट: बिना उतार-चढ़ाव के तापमान का रखरखाव प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है।
  4. 100x 1.49 ए. तेल विसर्जन उद्देश्य, एक दोहरी कताई डिस्क कॉन्फोकल सिस्टम, और फोकल प्लेन के निरंतर रखरखाव के लिए एक विश्वसनीय ऑटोफोकस सिस्टम से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर समय-चूक इमेजिंग करें। इमेजिंग मापदंडों को इस प्रकार परिभाषित करें।
    नोट: हम इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा (ईएम-सीसीडी) का उपयोग करते हैं।
    1. EB3-tdTomato उत्तेजना के लिए, 200 एमएस एक्सपोजर समय के साथ एक 561 एनएम लेजर लाइन का उपयोग करें। एक चौगुनी बैंडपास (405, 488, 561, 640 एनएम) डिक्रोइक मिरर और 600/52 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के माध्यम से उत्सर्जित प्रकाश को एकत्र करें।
      नोट: इमेज सैचुरेशन को रोकने के लिए प्रत्येक इमेज्ड सेल के लिए लेजर पावर को समायोजित किया जा सकता है। सभी समय चूक यहां दिया फिल्मों में लेजर शक्ति ५.३ mW के लिए सेट किया गया था ।
    2. प्रोफेज में एक सेल का पता लगाएं और एकाधिकार ी माइटोटिक धुरी के केंद्र के अनुरूप जेड-प्लेन में ध्यान केंद्रित करें। कोई बिनिंग और एक्सपोजर के बीच कोई रोशनी के साथ 1 मिन की कुल पर हर 0.5 एस छवियों को प्राप्त करें।

4. यू-ट्रैक v2.2.0 का उपयोग करएमटी गतिशीलता का विश्लेषण

  1. एमटी गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक संख्यात्मक कंप्यूटिंग पर्यावरण सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, MATLAB)।
    नोट: सॉफ्टवेयर की बुनियादी समझ विश्लेषण के लिए पर्याप्त है। डेवलपर की वेबसाइट (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html) पर व्यापक सहायता सामग्री और ट्यूटोरियल उपलब्ध हैं।
  2. डाउनलोड (https://github.com/DanuserLab/u-track) और "Readme_u-track.pdf" फ़ाइल50,51,52में दिए गए विस्तृत निर्देशों के बाद ओपन-सोर्स यू-ट्रैक v2.2.0 सॉफ्टवेयर स्थापित करें।
  3. न्यूमेरिकल-एनालिसिस सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और सॉफ्टवेयर सर्च पाथ में सबफोल्डर्स के साथ यू-ट्रैक v2.2.0 फोल्डर जोड़ें।
  4. कमांड विंडो कॉल से"movieSelectorGUI"। यह एक संवाद खिड़की खोलता है जिसमें से माइक्रोस्कोप पर छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न कच्ची फाइलों का आयात किया जा सकता है(अनुपूरक चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4)।
    नोट: यू-ट्रैक सॉफ्टवेयर अन्य छवि डेटा प्रारूपों के साथ संगत है। यह जैव प्रारूपों का उपयोग करता है, जो विभिन्न जीवन विज्ञान डेटा प्रारूपों५३पहचानता है ।
  5. प्रत्येक छवि का आकार मेटाडेटा से स्वचालित रूप से पढ़ा जाता है। मैन्युअल रूप से उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर (इस मामले में 1.49) और इमेजिंग(पूरक चित्रा 1 बी)के लिए उपयोग किए जाने वाले समय अंतराल (0.5 एस) को मैन्युअल रूप से दर्ज करें। इसके अतिरिक्त, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य, फ्लोरोफोर, और एक्सपोजर समय के बारे में जानकारी भी प्रदान की जा सकती है, लेकिन वे आगे के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण नहीं हैं।
  6. एक बार जब सभी छवियां लोड हो जाती हैं, तो'सेव इन मूवी लिस्ट"का चयन करके फिल्म सूची के रूप में प्रवेश समय-चूक श्रृंखला को सहेजें। संवाद खिड़की के दाईं ओर'यू-ट्रैक'विकल्प का चयन करें और द प्रेस'जारी रखें'(सप्लीमेंट्री फिगर 1सी)।
    नोट: मूल्यों को हेला कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जाता है। यदि एक अलग सेल लाइन पर स्विच करना, तो मूल्यों को फिर से परिभाषित किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, सॉफ्टवेयर डेवलपर्स द्वारा अनुशंसित सेटिंग्स का उपयोग करें। प्रत्येक पैरामीटर का विस्तृत विवरण और उन्हें कैसे परिभाषित किया जाना चाहिए, सॉफ्टवेयर के पिछले संस्करण, प्लसटिपट्रैकर50के साथ प्रदान की गई तकनीकी रिपोर्ट में पाया जा सकता है।
  7. पॉप-अप विंडो से चुनें"माइक्रोट्यूब्यूल प्लस-एंड्स"और प्रेस'ओके'(सप्लीमेंट्री फिगर 1C)। नई संवाद खिड़की विश्लेषण के तीन चरणों(अनुपूरक चित्र1D),जो पता लगाने, ट्रैकिंग, और ट्रैक विश्लेषण कर रहे है के लिए मापदंडों का निर्धारण करने की अनुमति देता है ।
  8. चरण 1 में "सेटिंग्स" चुनें और ड्रॉप-डाउन मेनू से "धूमकेतु डिटेक्शन" को डिटेक्शन विधि(सप्लीमेंट्री फिगर 2बी)के रूप में चुनें।
    1. नई संवाद खिड़की से गॉसियन फिल्टर के अंतर के लिए मापदंडों को परिभाषित करता है और इस प्रकार के रूप में वाटरशेड विभाजन(अनुपूरक चित्रा 2C):मुखौटा प्रक्रिया का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा = कोई नहीं; कम पास गॉसियन मानक विचलन = 1 पिक्सेल; उच्च पास गॉसियन मानक विचलन = 3 पिक्सल; न्यूनतम सीमा = 3 मानक विचलन; दहलीज कदम आकार = 0.25 मानक विचलन। 'सभी फिल्मों के लिए सेटिंग्स लागू करें"और'लागू करें'चुनें।
  9. चरण 2 में, लिंकिंग, गैप क्लोजिंग, विलय और बंटवारे के मापदंडों और कलमन फ़िल्टर कार्यों को गुलाबी, हरे और नीले रंग में हाइलाइट किए गए तीन चरणों में परिभाषित किया गया है, तदनुसार(अनुपूरक चित्र3B)। इन चरणों के लिए, "माइक्रोट्यूब्यूल प्लस-एंड डायनेमिक्स" का चयन करें और "सेटिंग" विकल्प से क्रमशः अनुपूरक चित्र 3C-Eमें इंगित मूल्यों को परिभाषित करें।
    1. आयामीता वाली समस्याओं के लिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से "2" चुनें। = 5 फ्रेम बंद करने के लिए अधिकतम गैप का उपयोग करें; पहले चरण = 3 फ्रेम से ट्रैक सेगमेंट की न्यूनतम लंबाई। पहले की तरह'सभी फिल्मों में सेटिंग्स लगाएं' काचयन करें और'अप्लाईकरें' पर क्लिक करें।
  10. विश्लेषण के चरण 3 में, पता चला एमटी पटरियों वर्गीकृत कर रहे है(अनुपूरक चित्रा 4)। एक ट्रैक विश्लेषण विधि के रूप में,"माइक्रोट्यूब्यूल डायनेमिक्स वर्गीकरण"चुनें और पूरक चित्रा 4B, Cमें इंगित'सेटिंग'बटन के माध्यम से मापदंडों को परिभाषित करें। इसके बाद'सभी मूवीज'बॉक्स में सेटिंग्स को अप्लाई करें और'अप्लाई'पर क्लिक करें।
  11. एक बार सभी पैरामीटर तय हो जाने के बाद'कंट्रोल पैनल-यू-ट्रैक'विंडो(सप्लीमेंट्री फिगर 1डी)से'सभी मूवीज के लिए अप्लाई चेक/अनचेक'और'रन ऑल मूवीज'बॉक्स और प्रेस'रन'का चयन करें। इससे टाइम लैप्स सीरीज का एमटी एनालिसिस शुरू होगा।
  12. एक बार फिल्म प्रसंस्करण पूरा हो जाने के बाद, एक संदेश "आपकी फिल्म (एस) को सफलतापूर्वक संसाधित किया गया है" प्रदर्शित किया जाता है। प्रेस"ठीक है",तो"बचाओ"।
  13. अब न्यूमेरिकल-एनालिसिस सॉफ्टवेयर छोड़ना सुरक्षित है। फिल्म प्रसंस्करण से परिणाम फ़ोल्डर में एम-फाइलके रूप में सबफोल्डर संरचनाओं में संग्रहीत किए जाते हैं जहां कच्ची फाइलें संग्रहीत होती हैं।

5. एमटी गतिशीलता का सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. एम-फाइलों को एक पसंदीदा सांख्यिकीविश्लेषण कार्यक्रम में आयात करना।
    नोट: हमारे मामले में, हम पहले फाइलों को एक मानक स्प्रेडशीट में आयात करते हैं ताकि उन्हें पठनीय बनाया जा सके। एम-फाइलों में विभिन्न मापदंडों (जैसे, विकास की गति, एमटी गतिशीलता) पर सांख्यिकीय जानकारी (औसत, मतलब और मानक विचलन) होती है। पैरामीटर्स की विस्तृत सूची सॉफ्टवेयर के पिछले संस्करण, प्लसटिपट्रैकर50,52के साथ प्रदान की गई तकनीकी रिपोर्ट में दी गई है। जेनरेटेड एम-फाइल्स को अन्य डाटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में भी आयात किया जा सकता है।
  2. "विकास की गति मतलब" पैरामीटर चुनें और इसे आंकड़ों और प्रदर्शन के लिए एक तालिका में आयात करें। अन्य मापदंडों के बारे में जानकारी दर्ज करें, (उदाहरण के लिए, "गतिशीलता") या तो एक नई तालिका में या एक ही समूहीकृत तालिका और साजिश के एक नए कॉलम में।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 1एमें उल्लिखित दिए गए प्रोटोकॉल के बाद, pEB3-tdTomato प्लाज्मिड क्षणिक रूप से अतुल्यकालिक रूप से बढ़ती वाघेला कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था। डीएमई उपचार(चित्रा 1B)के माध्यम से प्रोमेटफेज में ट्रांसफेक्शन के बाद कोशिकाओं को 48 घंटे सिंक्रोनाइज्ड किया गया था। इस कदम ने यह सुनिश्चित किया कि एमटी गतिशीलता का माप हमेशा सेल चक्र के एक ही चरण में किया गया था। टाइम-लैप्स फिल्मों को यू-ट्रैक v2.2.0 के साथ और संसाधित और विश्लेषण किया गया जैसा कि इसके अनुपूरक दस्तावेज50,51,52में वर्णित है। यद्यपि प्लस-एंड बाध्यकारी प्रोटीन केवल एमटी विकास चरणों का पता लगाते हैं, यू-ट्रैक v2.2.0 अनुक्रमिक विकास चरणों को जोड़कर और पूर्ण प्रक्षेप पथ26,50के पुनर्निर्माण द्वारा ठहराव और सिकुड़न की घटनाओं के बारे में जानकारी को एक्सट्रपलेशन करता है। एल्गोरिदम जकामान एट अल51द्वारा वर्णित स्थानिक और अस्थायी वैश्विक ट्रैकिंग फ्रेमवर्क पर आधारित है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विश्लेषण की संवेदनशीलता और सटीकता कई विश्लेषण मापदंडों पर दृढ़ता से निर्भर है। एक उदाहरण के रूप में, समय-चूक फिल्मों का विश्लेषण प्रोटोकॉल(चित्रा 1C,वीडियो 1 "पहले" और वीडियो 2 "विश्लेषण के बाद" में वर्णित किया गया था, और जिसके परिणामस्वरूप विकास की गति और गतिशीलता (उनके पूरे जीवनकाल में अंतराल युक्त पटरियों का सामूहिक विस्थापन) क्रमशः चित्रा 1ई, एफ,क्रमशः (काले घेरे) में साजिश रची जाती है। फिर विश्लेषण50को बहुत प्रभावित करने के लिए वर्णित पैरामीटर, जैसे "अधिकतम गैप लेंथ" और "अधिकतम सिकुड़न कारक" को समय-चूक फिल्मों (वीडियो 3 और 4, क्रमशः) के एक ही सेट के लिए संशोधित किया गया था। विकास की गति और गतिशीलता के संबंधित मूल्य क्रमशः लाल वर्गों और नीले त्रिकोण के रूप में चित्रा 1ई, एफ में दिए जाते हैं। परिणामस्वरूप विकास की गति गहरा प्रभावित नहीं हुई । हालांकि, गतिशीलता के लिए प्राप्त मूल्य काफी अलग थे जब "अधिकतम गैप लेंथ" को संशोधित किया गया था, जबकि यह "अधिकतम सिकुड़न कारक" में फेरबदल करने पर अपरिवर्तित रहा। जैसा कि चित्र 1 डीमें दिखाया गया है, सभी तीन मामलों में एमटी उपपटरियों का पता लगाना इसी तरह मजबूत था। फिर भी, पूर्ण मीट्रिक टन प्रक्षेप पथ का पुनर्निर्माण ज्यादातर प्रभावित हुआ जब "अधिकतम गैप लेंथ" को 15(चित्रा 1डी,इनसेट छवियों) के लिए सेट किया गया था। इसके अलावा, यह आकलन करने के लिए कि क्या इमेजिंग स्थितियां एमटी व्यवहार में हस्तक्षेप करती हैं, पहले (1-61 फ्रेम) और समय-चूक श्रृंखला के दूसरे (61-121 फ्रेम) हिस्सों का अलग से विश्लेषण किया गया था और इसी विकास की गति और गतिशीलता मूल्यों की तुलना की गई थी(क्रमशः चित्रा 1जी, एच)। जैसा कि उम्मीद थी, समय-चूक श्रृंखला के दो भागों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया । वीडियो में प्रोफेज में सिंक्रोनाइज्ड माइटोटिक सेल की 1-8 समय-चूक छवियां दी जाती हैं और EB3-tdTomato को व्यक्त किया जाता है (अवधि = 1 मिनट; अंतराल = 0.5 एस)।

Figure 1
चित्रा 1: वाघेला कोशिकाओं में एमटी गतिशीलता का विश्लेषण प्रोमेटाफेज में सिंक्रोनाइज्ड। (क)प्रोटोकॉल के चरणों की रूपरेखा। (ख)डीएमई के तंत्र का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व एक एकाधिकारी माइटोटिक धुरी के गठन में मध्यस्थता करता है । (ग)हर दूसरे फ्रेम के साथ यू-ट्रैक सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित समय-चूक फिल्म के पहले 10 फ्रेम का एक असेंबल दिखाया गया है । एमटी विकास के प्रक्षेप पथ का पता लाल रंग से चिह्नित किया गया है। (घ)कच्चे छवि फ़ाइल के समय श्रृंखला प्रक्षेपण और प्रोटोकॉल ("इष्टतम") में वर्णित सेटिंग्स का उपयोग करएमटी ट्रैकिंग के बाद, और जब या तो "अधिकतम अंतर लंबाई" या "अधिकतम सिकुड़न कारक" बदल रहे हैं । इनसेट पूर्ण मीट्रिक टन प्रक्षेप पथ का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें विकास (लाल), ठहराव (हल्का नीला), सिकुड़न (पीला), एफगैप विकास (हरा) और बीगैप के रूप में पुनर्वर्गीकृत होता है। विकास की गति का मतलब है(ई)और गतिशीलता(एफ)मूल्यों को दिखाया गया है, और सुझाए गए इष्टतम मानदंडों (काले घेरे) में से किसी का उपयोग करके परिणाम, अधिकतम अंतर लंबाई 15 (लाल वर्गों) के लिए सेट की जाती है, या अधिकतम सिकुड़न कारक 1.0 (नीले त्रिकोण) के लिए सेट किया जाता है (एन = 45 कोशिकाओं; मतलब ± एसईएम; कई तुलना के लिए तुकी पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA विश्लेषण)। विकास की गति का अर्थ है(जी)और गतिशीलता(एच)मूल्यों को पहले (1-61 फ्रेम) और दूसरा (61-121 फ्रेम) समय-चूक फिल्मों (एन = 45 कोशिकाओं; मतलब ± एसईएम; वेल्च के सुधार के साथ अपेयर टी-टेस्ट) के हिस्सों के लिए दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: विश्लेषण से पहले एक प्रोमेटफेज सेल की एक प्रतिनिधि समय-चूक कच्ची छवि। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

वीडियो 2: यू-ट्रैक सॉफ्टवेयर के लिए सुझाई गई सेटिंग्स का उपयोग करके वीडियो 1 में एक सेल में एमटी का पता लगाना और ट्रैकिंग। वीडियो 1 में एक ही समय चूक छवि वर्णित सेटिंग्स का उपयोग कर यू-ट्रैक v2.2.0 सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित, और पता चला विकास पटरियों लाल रंग में चिह्नित कर रहे हैं । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

वीडियो 3: "अधिकतम गैप लेंथ" के लिए एक गैर-इष्टतम मूल्य का उपयोग करके वीडियो 1 में एक सेल में एमटी का पता लगाना और ट्रैकिंग। वीडियो 1 में एक ही समय-चूक छवि यू-ट्रैक v2.2.0 सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित पहले की तरह एक ही सेटिंग्स का उपयोग कर, लेकिन "अधिकतम गैप लंबाई" के साथ 15 सेट । बाकी मापदंडों में बदलाव नहीं किया गया। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

वीडियो 4: "अधिकतम सिकुड़न कारक" के लिए एक गैर-इष्टतम मूल्य का उपयोग करके वीडियो 1 में एक सेल में एमटी का पता लगाना और ट्रैकिंग। वीडियो 1 में एक ही समय-चूक छवि यू-ट्रैक v2.2.0 सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित पहले की तरह एक ही सेटिंग्स का उपयोग कर, लेकिन "अधिकतम सिकुड़न कारक" के साथ 1 सेट । बाकी मापदंडों में बदलाव नहीं किया गया। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

वीडियो 5: सेल मलबे के साथ एक सेल की एक समय चूक श्रृंखला का एक उदाहरण। विश्लेषण के बाद, एमटी ट्रैकिंग के दौरान सॉफ्टवेयर द्वारा कुछ सेल मलबे का भी पता चला। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

वीडियो 6: वीडियो 5 के अनुरूप कच्चे डेटा। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

वीडियो 7: EB3-tdTomato की एक उच्च अभिव्यक्ति के साथ एक सेल की एक समय चूक श्रृंखला का एक उदाहरण बढ़ती युक्तियों की खराब परिभाषा में जिसके परिणामस्वरूप । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

वीडियो 8: 7 वीडियो के अनुरूप कच्चे डेटा। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Supplementary Figure 1
पूरक चित्रा 1: यू-ट्रैक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण का कार्यप्रवाह। (क)सॉफ्टवेयर द्वारा नियोजित चरणों का एक योजनाबद्ध। (ख)जैव-प्रारूपों के आयातक का एक स्क्रीनशॉट जिसमें यह दर्शाया गया है कि समय-चूक फाइलों का आयात कैसे किया जाए । (ग)फाइलों को अपलोड करने के बाद एमटी प्लस एंड्स मॉड्यूल के साथ यू-ट्रैक का चयन किया जाता है। (घ)यू-ट्रैक के नियंत्रण कक्ष का स्क्रीनशॉट जहां धूमकेतु का पता लगाने, ट्रैकिंग और ट्रैक विश्लेषण के लिए सेटिंग्स को परिभाषित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 2
अनुपूरक चित्रा 2: विश्लेषण के पहले चरण का विवरण, धूमकेतु का पता लगाना। (क)एल्गोरिदम द्वारा किए गए प्रमुख घटनाओं की एक रूपरेखा। (B, C) सॉफ्टवेयर से स्क्रीनशॉट इष्टतम मूल्यों के संकेत के साथ दिए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 3
अनुपूरक चित्रा 3: विश्लेषण के दूसरे चरण का विवरण, धूमकेतु ट्रैकिंग। (A)एल्गोरिदम द्वारा किए गए मुख्य चरणों को रेखांकित किया गया है। (ख)"ट्रैकिंग" पैनल का स्क्रीनशॉट दिया गया है। अधिकतम गैप क्लोज अधिकतम गैप लेंथ से मेल खाता है और 5 से सेट है। लाल, हरे और नीले आयतों के साथ हाइलाइट किए गए तीन उप-चरणों की ट्रैकिंग। (C,D,E) प्रत्येक उपचरण के लिए आवश्यक संख्यात्मक मूल्ययहां दर्ज किए जाते हैं। अधिकतम सिकुड़न कारक 1.5 के रूप में संकेत दिया है(डी)के लिए निर्धारित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 4
अनुपूरक चित्र4: विश्लेषण, ट्रैक विश्लेषण के अंतिम चरण का विवरण। (A)इस चरण के दौरान यौगिक पटरियों का एमटी गतिशीलता वर्गीकरण और पुनर्वर्गीकरण किया जाता है। (बी, सी) ट्रैक विश्लेषण और संबंधित सेटिंग्स के स्क्रीनशॉट दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां, हम पहले एर्टिच एट अल44द्वारा स्थापित विधि के संशोधन का वर्णन करते हैं। कई अन्य संशोधनों के साथ, हम एमटी गतिशीलता विश्लेषण की इस तकनीक को दोहरी कताई डिस्क कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ जोड़ते हैं। डुअल कताई डिस्क के उपयोग से फोटोटॉक्सिकिटी36को कम करते हुए एमटी बढ़ने के संकल्प में सुधार होता है . हम आगे एक लंबी तरंगदैर्ध्य फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए स्विचन द्वारा कोशिकाओं के फोटोब्लीचिंग और लेजर प्रकाश प्रेरित क्षति को कम । टीडीमैटो फ्लोरोसेंट प्रोटीन में ईजीएफपी46की तुलना में फोटोस्थिरता और चमक का गुणांक अधिक होता है। अंत में, यू-ट्रैक के साथ अनुवर्ती विश्लेषण की सीमाओं के कारण एमटी गतिशीलता का माप केवल एक जेड-विमान तक सीमित है। यू-ट्रैक सॉफ्टवेयर को XYZ-एक्सिस50,51में फ्लोरोसेंट-लेबल वाले एमटी टिप्स का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसलिए, जेड-स्टैक टाइम-लैप्स श्रृंखला लेना और अधिकतम प्रक्षेपण समय-चूक श्रृंखला बनाना झूठे परिणाम उत्पन्न करने का खतरा है। विभिन्न जेड-विमानों में पाए गए संकेत और एक ही बढ़ते मीट्रिक टन से संबंधित नहीं अधिकतम प्रक्षेपण में एक साथ लाए जाते हैं, इस प्रकार एमटी विकास का एक झूठा प्रक्षेपवक्र पैदा होता है।

यहां उपयोग किया जाने वाला सिंक्रोनाइजेशन प्रोटोकॉल माइटोटिक स्पिंडल को एकाधिकार संरचना तक सीमित करके एमटी के उच्च घनत्व को प्रेरित करता है। माइटोटिक एमटी विकास और सिकुड़न के चरणों के साथ अत्यधिक गतिशील संरचनाएं हैं, जिनमें19,54,55के बीच संक्रमण पर विराम लगाया गया है। बढ़ते एमटी के उच्च घनत्व के कारण, या तो सिकुड़न या विकास के बाद ठहराव की घटनाओं का पता लगाने से झूठे परिणामों की संभावना है यदि ट्रैकिंग पैरामीटर गलत तरीके से सेट किए जाते हैं। यू-ट्रैक सॉफ्टवेयर ट्रैकिंग मॉड्यूल तथाकथित सबट्रैक (निरंतर विकास के एपिसोड) का पता लगाते हैं और फिर उन्हें "अंतराल" नामक ठहराव घटनाओं के साथ यौगिक पटरियों के रूप में वर्गीकृत करते हैं। Applegate एट अल ट्रैकिंग और५०को जोड़ने सबट्रैक के लिए महत्वपूर्ण दो मापदंडों पर चर्चा करें । ये "अधिकतम गैप लेंथ" और "अधिकतम सिकुड़न कारक" हैं। यदि बाद के समय-चरणों में एमटी की बढ़ती दिशा में सबट्रैक का पालन किया जा रहा है, तो इसे आगे के अंतर के रूप में वर्गीकृत किया गया है । दूसरी ओर, यदि उपट्रैक विकास की दिशा के विपरीत दिखाई देता है, तो इसे पिछड़े अंतर के रूप में वर्गीकृत किया जाएगा । अधिकतम गैप लंबाई आगे और पिछड़े अंतराल के लिए खोज की जाने वाली फ्रेम की संख्या को परिभाषित करती है। जैसा कि उल्लेख किया गया है, उच्च घनत्व और प्रकृति द्वारा माइटोटिक एमटी की उच्च गतिशीलता सीमा निर्धारित करती है, और छोटे मूल्यों को परिभाषित किया जाना चाहिए। जैसा कि चित्र 1E में दिखाया गया है गतिशीलता सबसे अधिक प्रभावित होती है। गतिशीलता की गणना उनके वैश्विक जीवन काल में सभी अंतर युक्त पटरियों के सामूहिक विस्थापन के रूप में की जाती है । दूसरा पैरामीटर, अधिकतम सिकुड़न कारक, या तो गतिशीलता या विकास की गति(चित्रा 1डी, ई)पर कोई प्रभाव नहीं है ।

सामान्य तौर पर, एमटी विकास गुणों का अध्ययन करते समय, इमेजिंग स्थितियों पर सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, एमटी तापमान के प्रति बहुत संवेदनशील होते हैं और ठंड के माध्यम से56, 57 ,58,59के संपर्क में आने पर डिपॉलीमराइज करते हैं । इसलिए, झूठे परिणामों के संग्रह से बचने के लिए, पूरे प्रयोग में तापमान को सख्ती से नियंत्रित किया जाना चाहिए। दूसरा, प्रयोगों के दौरान उपयोग किए जाने वाले माध्यम की आयनिक संरचना एमटी विकास58,60को प्रभावित कर सकती है। उदाहरण के लिए, कैल्शियम आयनों के संपर्क में आने से एमटी गतिशीलता विभिन्न तरीकों से61,62को प्रभावित करती है। इसलिए, सभी प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले विकास माध्यम की संरचना एक ही होनी चाहिए। इसी तरह, विश्लेषण के मापदंडों को एक बार परिभाषित किया जाना चाहिए और सभी पुनरावृत्तिके लिए स्थिर बनाए रखा जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, विश्लेषण के बाद उत्पन्न समय-चूक फिल्मों का नेत्रहीन निरीक्षण किया जाना चाहिए, और पृष्ठभूमि शोर के साथ किसी भी फिल्म ने झूठी सकारात्मक (वीडियो 5 और 6) को जन्म दिया या टीडीटमाटर की उच्च अभिव्यक्ति के साथ एमटी बढ़ते सुझावों (वीडियो 7 और 8) के खराब समाधान को आगे सांख्यिकीय विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।

हाल ही में, सबसेकंड अंतराल पर माइटोटिक स्पिंडल की जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का संयोजन, परिष्कृत छवि प्रसंस्करण के साथ तीन आयामों63,64में एमटी असेंबली दरों के विश्लेषण की अनुमति देता है। सीएलएसएम पर इसके स्पष्ट फायदे हैं, लेकिन विधि सामान्य उपयोग से पहले और सुधार की आवश्यकता होगी, जैसे कि यू-ट्रैक में उपयोग की जाने वाली रणनीतियों का विस्तार26,50,63तक।

एमटी गतिशीलता का पता लगाने के प्रोटोकॉल हम यहां वर्णन दवा स्क्रीनिंग के लिए पसंद की एक विधि हो सकती है । विधि मजबूत है, और यह मैन्युअल रूप से किए गए विश्लेषण की तुलना में मानव पूर्वाग्रह को सफलतापूर्वक हटा देती है। फिल्म प्रसंस्करण का स्वचालन प्रत्येक कोशिका के भीतर हजारों मीट्रिक टन पटरियों के विश्लेषण की अनुमति देता है, इस प्रकार विश्लेषण की सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि होती है। इसके अलावा, विधि को बदलकर संशोधित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, सिंक्रोनाइजेशन प्रोटोकॉल और सेल चक्र के विभिन्न चरणों से कोशिकाओं को प्राप्त करना। उदाहरण के लिए, यह एमटी की स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है, जब इंटरफेज और विभाजित कोशिकाओं पर प्रभाव को प्रतिष्ठित किया जाना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रकाश माइक्रोस्कोपी सुविधा, मैक्स-प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ एक्सपेरिमेंटल मेडिसिन के सदस्यों को उनकी विशेषज्ञ सलाह और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05%/0.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100xC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647 nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, temperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4 (2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343 (2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153 (2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39 (2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
  33. Elektrisches teleskop. Germany patent. Nipkow, P. , (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
  35. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. Tanaami, T., Kenta, M. , EP92114750A (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3 (1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138 (2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).

Tags

जीव विज्ञान अंक 153 माइक्रोट्यूबबुल डायनेमिक्स माइक्रोट्यूबबुल ग्रोथ प्लस-एंड माइक्रोट्यूबबुल ट्रैकिंग प्रोमेटाफेज लाइव-सेल इमेजिंग कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
एकाधिकार ी माइटोटिक स्पिंडल में कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी द्वारा माइक्रोट्यूब्यूल डायनेमिक्स का मापन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Movsisyan, N., Pardo, L. A.… More

Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter