Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling af dynamik i Mikrotubulen ved spinding af Diskmikroskopi i monopolære mitotiske spindler

Published: November 15, 2019 doi: 10.3791/60478
Automatic Translation
1,2, 1
1AG Oncophysiology, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

Summary

Her præsenterer vi en robust og detaljeret metode til mikrotubule Dynamics analyse i celler synkroniseret i prometaphase ved hjælp af Live-Cell spinning disk confokal mikroskopi og MATLAB-baserede billedbehandling.

Abstract

Vi beskriver en ændring af en etableret metode til at bestemme mikrotubulus dynamik i levende celler. Protokollen er baseret på et udtryk for en genetisk kodet markør for de positive ender af microtubuler (EB3 mærket med tdTomato fluorescerende protein) og høj hastighed, høj opløsning, levende celle Imaging ved hjælp af spinning disk Konfokal mikroskopi. Celle cyklus synkronisering og øget tæthed af microtubuler opnås ved at hæmme centrosomal separation i mitotiske celler, og analyse af vækst udføres ved hjælp af open-source U-track software. Brugen af en lys og rød-skiftede fluorescerende protein, i kombination med den lavere laser effekt og reduceret eksponeringstid kræves for spinning disk mikroskopi reducere fototoksicitet og sandsynligheden for lys-induceret artefakter. Dette giver mulighed for at afbilde et større antal celler i det samme præparat og samtidig opretholde cellerne i et vækstmedium under standard dyrkningsbetingelser. Da analysen udføres på en overvåget automatisk måde, er resultaterne statistisk robuste og reproducerbare.

Introduction

Mikrotubuler (MTs) er meget dynamiske strukturer, der findes i næsten alle eukaryotiske celler og i nogle bakterier1. Sammen med actin og mellemliggende filamenter, de Sculpt cytoskelet2,3. Celle division4, molekyle transport5, flagellar slå6, fornemmelsen af det omgivende miljø gennem primær cilium7, hørelse (kinocilium)8,9, embryoGenesis 10,11,12, invasion og metastase13,14, og endda hukommelse dannelse15,16,17,18, og mange andre processer primært stole på MTs. deltagelse af MTs i alle disse begivenheder ville være umuligt uden deres bemærkelsesværdige evne til hurtigt at skifte mellem vækst (polymerisering) og svind (depolymerisering). Denne egenskab beskrives som dynamisk ustabilitet19. MT dynamicity er ændret i mange patologiske tilstande20,21,22. Derfor, bestemme karakteren af denne egenskab kan bidrage til at forstå sygdomsmekanismer og efterfølgende deres behandling.

En lang liste af metoder er blevet udviklet til MT Dynamics analyse, hvoraf de fleste er baseret på billeddiagnostiske teknikker23. I første omgang, bred felt lys mikroskoper blev brugt til at observere dannelsen af Tubulin polymerer in vitro24. Opdagelsen af end-binding (EB)-proteiner, der samler på Mt plus-Ends og udviklingen af metoder til fluorescently label proteiner gjorde det muligt at observere opførsel af MTs direkte i levende celler med bred felt og confokale fluorescens mikroskoper25,26,27. Et EB-protein er bindende protein 3 (EB3)28; ved at over udtrykke og spore EB3 smeltet til et fluorescerende protein kan MT plus-end-samlings hastigheder bestemmes29,30.

Confokal Laserscanning Fluorescens mikroskopi (CLSM) bruges ofte til at følge MT Dynamics. Men denne billeddiagnostiske teknik udgør en høj risiko for fototoksicitet og foto blegning, to uønskede processer for levende celle og Dim prøve billeddannelse31. For at opnå et bedre signal-til-støj-forhold, bør laser effekten og eksponeringsvarigheden være høj nok, mens den ikke beskadiger prøverne, og dette kræver at ofre opløsningen i bytte for hastighed. Et egnet alternativ til CLSM er spinning disk mikroskopi32. Denne billedbehandlings modalitet er baseret på brugen af en Nipkow disk33, som består af en bevægende disk med en række pinholes, og fungerer ækvivalent til mange CLS mikroskoper, der afbilder den samme prøve samtidig34. Derfor lyser lyset fra laseren flere regioner i prøven samtidig, men bevarer den konfokale natur. Nipkow disk giver derfor mulighed for at få billeder, der ligner CLSM, men hurtigere og bruge mindre laser kraft. Nipkow disken blev yderligere forbedret af Yokogawa Electric, som introducerede en anden disk med en række mikrolinser på den, der individuelt direkte lys ind i et respektive hul, yderligere reducere fototoksicitet og foto blegning35. Således, spinning disk Laserscanning mikroskopi blev en metode til valg for levende celle Imaging, og det gør det muligt at opnå billeder med høj signal-til-støj-forhold ved en høj hastighed31,36, som er afgørende for at løse signaler som dem fra den hurtigtvoksende MT ender.

MT Dynamics varierer midlertidigt. For eksempel, den mitotiske MTs er mere dynamisk end Interphase dem37,38. Tilsvarende er forskelle i vækstraten og svind blevet observeret selv inden for den samme celle cyklus fase, såsom mitose39,40. For at undgå falsk dataindsamling bør målingen af MT Dynamics derfor begrænses til et snævert tidsvindue under cellecyklussen. For eksempel kan måling af MT dynamik i prometaphase opnås ved at behandle cellerne med dimethylenastron (DME), en monastrol analog, der hæmmer motorens kinesin Eg541 og forhindrer dannelsen af den bipolære mitotiske spindel42. Hæmning af cellerne i prometaphase med Eg5-hæmmer DME og andre monastrol-derivater påvirker ikke MT Dynamics43,44,45, hvilket gør DME til et nyttigt værktøj til at studere MT Dynamics både i faste og levende celler44.

Her kombinerer vi metoden til MT Dynamics Analysis i prometaphase celler beskrevet af Ertych et al.44 med Dual spinning disk imaging. Denne metode gør det muligt at måle MT dynamikken i prometaphase celler indsamlet fra et enkelt brændplan med en højere billedhastighed, men uden foto blegning og minimal fototoksicitet. Desuden bruger vi som fluorescerende reporter tandem dimer tomat fluorescerende protein (tdTomato), som har forbedret lysstyrke og foto stabilitet i forhold til det grønne fluorescerende protein (EGFP) og er spændt med lavere energi lys46. Derfor tdTomato kræver mindre laser effekt for excitation og er mindre fototoksisk. I alt forbedrer vi yderligere metoden ved at reducere foto toksiciteten og forbedre den opløsning og efter behandling, der kræves til MT Dynamics-analysen. Derudover skaber vi et grundlag for fremtidige ændringer af metoden ved at kombinere den med andre synkroniserings teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. såning af HeLa celler

  1. Der forberedes 2 ml 5 μg/ml fibronektin opløsning i fosfat bufferet saltvand (PBS) og tilsættes 450 μl af det i hver brønd af en 4 brøndkammer dækseddel (#1.5). Inkubaten i 15 min ved 37 °C og 5% CO2.
  2. Skyl de asynkront voksende HeLa-celler med Dulbecco's fosfat bufferet saltvand (DPBS) og Inkuber med trypsin-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) i 5 min ved 37 °C. Stop den enzymatiske reaktion ved tilsætning af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 10% varme inaktiveret føtal lægserum (FCS) ved 3:1 (v:v) ratio af tilsat trypsin-EDTA.
    Bemærk: Hela-cellerne blev vedligeholdt i rpmi 1640 medium suppleret med 10% varme inaktiverede FCS ved 37 °c og 5% Co2 og blev rutinemæssigt urerne, når de nåede 80 – 90% konfluency som beskrevet ovenfor.
  3. Bestem celle koncentrationen ved hjælp af et Neubauer kammer. Bland en 50 μL alikvot af cellesuspensionen med trypan og et Blue ved 1:1 (v:v) ratio, resuspension, og Overfør 10 μL af suspensionen til kammeret. Tæl kun trypan og et blå-negative celler inde i de fire store firkanter (for detaljer se Phelan et al.47). Udlede celle koncentrationen fra det optalte celle nummer ved hjælp af følgende formel:
    Equation 1
  4. Pellet cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 2 min. resuspension med frisk rpmi 1640 for at opnå 1 x 106 celler/ml.
  5. Fjern fibronektin fra Chambered coverslip, vask brøndene to gange med dpbs, og frø 50.000 celler pr. brønd.
  6. Returner den Chambered dækglas med cellerne til inkubator og dyrker dem i 24 timer ved 37 °c og 5% Co2.

2. ekspression af pEB3-tdTomato i HeLa celler

  1. Klargør et 1,5 mL mikrocentrifuge glas. For hvert rør fortyndes 2 μg pEB3-tdtomato48 med transfektering buffer (syntetisk produkt i vandig opløsning) til et endeligt volumen på 396 μl.
  2. Der tilsættes 4 μl transfektering reagens (ikke-lipidisk, indeholdende polyethylenimin) til det første rør, og blandingen vortex straks for præcis 10 s.
  3. Drej kortvarigt ned i røret med en mikrocentrifuge, og Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 10 minutter.
  4. Fjern HeLa-cellerne fra inkubator. Dropwise, Tilsæt 100 μl af transfektering blandingen til hver brønd af en 4 brønd Chambered Cover seddel, og returnere cellerne til inkubator.
  5. Efter 4 timers inkubation ved 37 °C og 5% CO2suppleres cellerne med frisk vækstmedium og Inkuber i mindst 24 timer ved 37 °c og 5% Co2.
    Bemærk: Det er nødvendigt at optimere transfektering betingelser for hver celletype. Udtryks niveauerne skal være lave nok til at gøre det muligt at identificere enkelt MT-vækst ender. Alternativt kan en cellelinje, der udtrykker EB3-tdTomato, anvendes i forsøgene; Dette vil reducere variabiliteten i ekspressions niveauerne for EB3-Tdtomat mellem præparater og mellem celler fra samme præparat49.

3. synkronisering og live-Cell Imaging af pEB3-tdTomato – udtrykker HeLa celler

  1. Forbered en 2,5 μM opløsning af dimethylenastron (DME) i Phenol-rød fri Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% FCS og 2 mM L-glutamin eller en alternativ glutamin forsyning.
  2. Udskift vækstmediet i kammer coveret med 500 μL af vækstmediet, der indeholder 2,5 μM DME, og Inkuber cellerne ved 37 °C og 5% CO2.
  3. Efter 3,5 h inkubation med DME, Overfør cellerne til mikroskopet, Monter den kammer beklædninger i et miljøkammer med mørke paneler til billeddannelse ved 37 °C og 5% CO2, og yderligere Inkubér, indtil den samlede inkubattid er 4 h.
    Bemærk: Opretholdelse af temperatur ved 37 °C uden udsving er afgørende for forsøget.
  4. Udfør tidsforskudt billeddannelse på et inverteret mikroskop udstyret med et 100x 1,49 N.A. Oil Immersion-mål, et dual spinning disk konfokale system og et pålideligt autofokus system til kontinuerlig vedligeholdelse af brændplanet. Definer billedbehandlings parametrene på følgende måde.
    Bemærk: Vi bruger en elektron multiplikations opladning-koblet enhed kamera (EM-CCD).
    1. For EB3-tdTomato excitation, brug en 561 nm laser linje med 200 MS eksponeringstid. Saml det udsendte lys gennem et 4-dobbelt bandpas (405, 488, 561, 640 nm) koldtlysreflektorlamper-spejl og et 600/52 nm-emissions filter.
      Bemærk: Laser effekt kan justeres for hver afbildet celle for at forhindre billed mætning. I alle time-lapse film givet her laser effekt blev sat til 5,3 mW.
    2. Find en celle i prophase og Fokuser i Z-planet, der svarer til midten af den monopolære mitotiske spindel. Erhverve billeder hver 0,5 s over i alt 1 min uden Binning og ingen belysning mellem eksponeringerne.

4. analyse af MT-dynamikken ved hjælp af U-track v 2.2.0

  1. For at analysere MT-dynamikken kræves der en numerisk computermiljø software (f. eks. MATLAB).
    Bemærk: Grundlæggende forståelse af softwaren er tilstrækkelig til analysen. Omfattende hjælpemateriale og tutorials er tilgængelige på udviklerens hjemmeside (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).
  2. Download (https://github.com/DanuserLab/u-track), og Installer den åbne u-track v 2.2.0-software ved at følge de detaljerede anvisninger i filen "Readme_u-track. pdf"50,51,52.
  3. Start den numeriske analyse software og Tilføj U-track v 2.2.0 mappe med undermapper i software søgesti.
  4. Fra kommandovinduet kalder "Movieselectorgui". Dette åbner et dialogvindue, hvorfra de RAW-filer, der genereres af billed anskaffelsesoftwaren i mikroskop, kan importeres (supplerende figur 1, figur 2, figur 3, figur 4).
    Bemærk: U-track-softwaren er kompatibel med andre billeddata formater. Det bruger Bio-formater, som genkender forskellige Life Science dataformater53.
  5. Størrelsen på hvert billede læses automatisk fra metadataene. Indtast manuelt den numeriske blænde for målet (i dette tilfælde 1,49) og det tidsinterval (0,5 s), der bruges til billeddannelse (supplerende figur 1b). Derudover kan der også gives oplysninger om excitation bølgelængde, fluorophore, og eksponeringstid, men de er ikke afgørende for yderligere analyse.
  6. Når alle billederne er indlæst, gemme den indtastede time-lapse-serien som en filmliste ved at vælge "Gem som filmliste". I højre side af dialogvinduet skal du vælge indstillingen "U-track" og trykke på "Continue" (supplerende figur 1c).
    Bemærk: Værdierne er optimeret til HeLa-celler. Hvis du skifter til en anden cellelinje, skal værdierne defineres igen. Alternativt kan du bruge de indstillinger, som softwareudviklerne anbefaler. Den detaljerede forklaring af hver af parametrene, og hvordan de skal defineres, kan findes i den tekniske rapport, der leveres med den tidligere version af softwaren, plusTipTracker50.
  7. I pop op-vinduet skal du vælge "Microtubule plus-Ends" og trykke på "OK" (supplerende figur 1c). Det nye dialogvindue gør det muligt at bestemme parametrene for de tre trin i analysen (supplerende figur 1d), som er registrering, sporing og analyse af spor.
  8. I trin 1 skal du vælge "indstillinger" og fra en rullemenu vælge "Comet Detection" som en detekterings metode (supplerende figur 2b).
    1. Fra den nye dialogvindue definere parametrene for forskellen i Gaussians filter og vandskel segmentering som følger (supplerende figur 2c): maske proces, der skal anvendes til påvisning = ingen; Lav-pass gaussiske standardafvigelse = 1 pixel; Høj-pass gaussiske standardafvigelse = 3 pixels; Minimumstærskel = 3 standardafvigelser; Tærskel trin størrelse = 0,25 standardafvigelser. Vælg "Anvend indstillinger på alle film" og "Anvend".
  9. I trin 2 er parametrene for sammenkædning, Gap-lukning, fletning og opdeling og Kalman-filterfunktioner defineret i tre trin som fremhævet med pink, grøn og blå i overensstemmelse hermed (supplerende figur 3b). For disse trin, skal du vælge "Micro tubule plus-end dynamik" og fra indstillingen "indstilling" definere værdierne som angivet i supplerende figur 3c-E, hhv.
    1. For problemer med dimensionalitet, Vælg "2" fra drop-down menuen. Brug maksimum mellemrum til at lukke = 5 rammer; Mindste længde af spor segmenter fra første trin = 3 billeder. Som før skal du vælge "Anvend indstillinger på alle film" og klikke på "Anvend".
  10. I trin 3 i analysen klassificeres de fundne MT-spor (supplerende figur 4). Som en track analysemetode, vælge "Microtubule Dynamics klassifikation" og definere parametrene gennem "Setting" knappen som angivet i supplerende figur 4b, C. Derefter skal du vælge "Anvend indstillinger til alle film" boks og klik på "Anvend".
  11. Når alle parametre er defineret, fra "kontrol panel – U-track" vindue (supplerende figur 1d) Vælg "Anvend check/uncheck til alle film" og "Kør alle film" bokse og tryk på "Kør". Dette vil indlede MT-analysen af time-lapse-serien.
  12. Når film behandlingen er fuldført, vises en meddelelse om, at "dine film (er) er blevet behandlet korrekt". Tryk på "OK" og derefter på "Save".
  13. Nu er det sikkert at forlade den numeriske analyse software. Resultaterne fra filmen behandling gemmes i undermapper strukturer som m-filer i den mappe, hvor RAW-filer er gemt.

5. statistisk analyse af MT-dynamikken

  1. Importer m-filerne til et foretrukket statistisk analyseprogram.
    Bemærk: I vores tilfælde importerer vi først filerne i et standard regneark for at gøre dem læsbare. M-filerne indeholder statistiske oplysninger (median, middelværdi og standardafvigelse) på forskellige parametre (f. eks. væksthastighed, MT dynamicitet). Den detaljerede liste over parametrene er angivet i den tekniske rapport, der leveres med den tidligere version af softwaren, plustiptracker50,52. De genererede m-filer kan også importeres til anden databehandlingssoftware.
  2. Vælg parameteren "vækst hastigheds middelværdi", og Importer den til en tabel til statistik og visning. Indtast oplysningerne om andre parametre (f. eks. "dynamicitet") enten i en ny tabel eller i en ny kolonne i samme grupperede tabel og plot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter den givne protokol, som er skitseret i figur 1a, blev PEB3-tdTomato plasmid transitivt udtrykt i asynkront voksende Hela-celler. Cellerne blev synkroniseret 48 h efter transfektering ved prometaphase gennem DME-behandling (figur 1b). Dette trin sikrede, at målingen af MT Dynamics altid blev udført i samme fase af cellecyklussen. Time-lapse-filmene blev yderligere behandlet og analyseret med U-track v 2.2.0 som beskrevet i den supplerende dokumentation50,51,52. Selv om plus-end-bindings proteinerne kun sporer MT-vækst faserne, ekstrapolerer U-track v 2.2.0 oplysningerne om pause-og krympning af hændelser ved at forbinde sekventielle vækstfaser og rekonstruere de fulde forløb26,50. Algoritmen er baseret på den rumligt og tidsmæssigt globale sporings ramme, der er beskrevet af Jaqaman et al.51.

Det er vigtigt at bemærke, at følsomheden og nøjagtigheden af analysen er stærkt afhængig af flere analyseparametre. Som et eksempel, tidsforskudt film blev analyseret som beskrevet i protokollen (figur 1c, video 1 "før", og video 2 "efter" analysen), og den resulterende væksthastighed og dynamitet (kollektiv forskydning af Gap-holdige spor i hele deres levetid) er afbildet i figur 1E, F, henholdsvis (sorte cirkler). Så de parametre, der er beskrevet i høj grad påvirke analysen50, såsom "maksimal Gap længde" og "maksimal krympning faktor" blev ændret for det samme sæt af time-lapse-film (henholdsvis videoer 3 og 4). De tilsvarende værdier for væksthastighed og dynamitet er angivet i figur 1E, f som henholdsvis røde firkanter og blå trekanter. Den resulterende væksthastighed var ikke dybt påvirket. De værdier, der blev opnået for dynamiteten, var imidlertid betydeligt forskellige, når "maksimal Gap length" blev ændret, mens den forblev uændret ved at ændre den "maksimale krympning faktor". Som vist i figur 1dvar påvisning af MT-under sporene i alle tre tilfælde ligeledes robust. Men genopbygningen af de fulde MT-baner blev for det meste påvirket, når "maksimum Mellemrumslængde" blev sat til 15 (figur 1d, indsatte billeder). For at vurdere, om billedbehandlings betingelserne forstyrrede MT-adfærden, blev den første (1 – 61 frames) og den anden (61 – 121 frames) halvdele af timelapse-serien analyseret separat, og de tilsvarende værdier for væksthastighed og dynamitet blev sammenlignet (henholdsvisfigur 1G, H). Som forventet blev der ikke påvist signifikante forskelle mellem de to dele af time-lapse-serien. I videoer 1-8 tidsforskudt billeder af en mitotisk celle synkroniseret i prophase og udtrykker EB3-tdTomato er givet (varighed = 1 min; interval = 0,5 s).

Figure 1
Figur 1: analyse af MT-dynamikken i Hela-cellerne synkroniseret i prometaphase. A) en skitse til protokollens trin. B) skematisk gengivelse af mekanismen for DME-medieret dannelse af en monopolær mitotisk spindel. (C) en montage af de første 10 billeder af time-lapse-filmen behandlet med U-track software med hver anden ramme vist. De fundne forløbskurver for MT-væksten er markeret med rødt. (D) tidsserie projektion af RAW billedfil og efter MT tracking ved hjælp af de indstillinger, der er beskrevet i protokollen ("optimal"), og når du ændrer enten "maksimal Gap længde" eller "maksimal krympning faktor" er givet. Insættene repræsenterer de fulde MT-forløbskurver, som består af væksten (rød), pause (lyseblå), svind (gul), fgap omklassificeret som vækst (grøn) og bgap omklassificeret som pause (mørkeblå) begivenheder. Væksthastigheden (E) og dynamitetsværdierne (F) vises og resultaterne ved hjælp af en af de foreslåede optimale kriterier (sorte cirkler), maksimal Gap længde indstillet til 15 (røde firkanter), eller den maksimale krympnings faktor indstillet til 1,0 (blå trekanter) er afbildet (n = 45 celler; gennemsnit ± SEM; envejs ANOVA-analyse med Tukey post hoc-test til flere sammenligninger). Væksthastigheden (G) og dynamicitetsværdierne (H) vises for de første (1 – 61 billeder) og for det andet (61 – 121 billeder) halvdele af timelapse-filmene (n = 45 celler; gennemsnitlig ± SEM; ikke-parret t-test med welchs korrektion). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: et repræsentativt tidsforskudt RAW-billede af en prometaphase-celle før analysen. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Video 2: detektering og sporing af MTs i en celle i video 1 ved hjælp af de foreslåede indstillinger for U-track software. Det samme tidsforskudt billede i video 1 behandlet med U-track v 2.2.0 software ved hjælp af de beskrevne indstillinger, og de fundne vækstspor er markeret med rødt. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Video 3: detektering og sporing af MTs i en celle i video 1 ved hjælp af en ikke-optimal værdi for den "maksimale mellemrumslængde". Det samme tidsforskudt billede i video 1 behandlet med U-track v 2.2.0 software ved hjælp af de samme indstillinger som før, men med den "maksimale Mellemrumslængde" indstillet til 15. Resten af parametrene blev ikke ændret. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Video 4: detektering og sporing af MTs i en celle i video 1 ved hjælp af en ikke-optimal værdi for den "maksimale krympning faktor". Det samme tidsforskudt billede i video 1 behandlet med U-track v 2.2.0 software ved hjælp af de samme indstillinger som før, men med den "maksimale krympning faktor" indstillet til 1. Resten af parametrene blev ikke ændret. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Video 5: et eksempel på en tidsforskudt serie af en celle med cellerester. Efter analysen, nogle cellerester blev også opdaget af softwaren under MT tracking. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Video 6: rå data svarende til video 5. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Video 7: et eksempel på en time-lapse serie af en celle med et højt ekspression af EB3-tdTomato resulterer i dårlig definition af voksende tips. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Video 8: rå data svarende til video 7. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: arbejdsprocessen af analysen ved hjælp af U-track software. A) en skematisk gennemgang af de trin, der er anvendt af softwaren. (B) et screenshot af bio-formater importør viser, hvordan du importerer time-lapse-filer. (C) når du har uploadet filerne, vælges U-track med MT plus-Ends-modulet. (D) et skærmbillede af kontrolpanelet i U-track, hvor indstillingerne for undersøgelse af Comet-registrering, sporing og spor er defineret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2: Beskrivelse af det første trin i analysen, kometen afsløring. A) en skitse over de vigtigste begivenheder, der udføres af algoritmen. (B, C) Screenshots fra softwaren er givet med de optimale værdier angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 3
Supplerende figur 3: Beskrivelse af det andet trin i analysen, kometen tracking. (A) de vigtigste trin, der udføres af algoritmen, er skitseret. (B) et skærmbillede af "tracking" panelet er givet. Den maksimale afstand tæt svarer til den maksimale Mellemrumslængde og er indstillet til 5. Sporing af tre under trin fremhævet med røde, grønne og blå rektangler. (C,D,E) De numeriske værdier, der er nødvendige for hvert under trin, indtastes her. Den maksimale krympende faktor er indstillet til 1,5 som angivet i (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 4
Supplerende figur 4: Beskrivelse af det sidste trin i analysen, sporanalyse. A) MT Dynamics-klassifikationen og omklassificeringen af de sammensatte spor udføres i dette trin. (B, C) Skærmbilleder af spor analysen og de tilsvarende indstillinger vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en ændring af en metode, der først blev fastlagt af Ertych et al.44. Sammen med flere andre modifikationer kombinerer vi denne teknik med MT Dynamics Analysis med Dual spinning disk konfokale Imaging. Brugen af Dual spinning disk forbedrer opløsningen af voksende MTs samtidig reducere fototoksicitet36. Vi reducerer yderligere foto blegning og laser lys-induceret beskadigelse af cellerne ved at skifte til en længere bølgelængde fluorescerende reporter. TdTomato fluorescerende protein har en højere koefficient for foto stabilitet og lysstyrke i forhold til en EGFP46. Endelig er målingen af MT Dynamics begrænset til kun ét Z-plan på grund af begrænsningerne i opfølgnings analysen med U-track. U-track softwaren er designet til at detektere de fluorescently-mærkede MT-spidser i en XYZ-akse50,51. Derfor, at tage en Z-stack time-lapse-serien og skabe maksimal projektion time-lapse-serien er tilbøjelige til at generere falske resultater. Signaler detekteret i forskellige Z-fly og ikke tilhører samme voksende MT er bragt sammen i den maksimale projektion, og dermed skabe en falsk bane af MT vækst.

Den synkroniserings protokol, der anvendes her inducerer en høj tæthed af MTs ved at begrænse mitotisk spindel til en monopolære struktur. Den mitotiske MTs er meget dynamiske strukturer med faser af vækst og svind, med en pause ved overgangen mellem dem19,54,55. På grund af den høje tæthed af den voksende MTs, påvisning af pause begivenheder efterfulgt af enten svind eller vækst er tilbøjelige til at falske resultater, hvis sporings parametrene er indstillet forkert. U-track-software sporings modulerne registrerer såkaldte under spor (episoder med kontinuerlig vækst) og klassificerer dem derefter som sammensatte spor med pause-hændelser kaldet "huller". Applegate et al. Diskuter to parametre, som er vigtige for sporing og under spor, som forbinder50. Disse er "maksimal Gap længde" og "maksimal krympning faktor". Hvis det under spor, der følges, vises igen i den stigende retning af MT i den efterfølgende tid-trin, så er det klassificeret som en Forward Gap. På den anden side, hvis under sporet vender tilbage modsat vækst retningen, vil det blive klassificeret som en tilbagestående kløft. Den maksimale Mellemrumslængde definerer antallet af rammer, der skal søges efter, for de fremadrettede og bagudrettede mellemrum. Som nævnt, den høje tæthed og natur høj dynamicitet af mitotisk MTs sætter begrænsningen, og mindre værdier bør defineres. Som vist i figur 1E påvirkes dynamiteten mest. Dynamiteten beregnes som kollektiv forskydning af alle huller, der indeholder spor over deres globale levetid. Den anden parameter, den maksimale krympning faktor, har meget lidt eller ingen effekt på enten dynamitet eller væksthastighed (figur 1D, E).

Generelt, når de studerer MT vækstegenskaber, omhyggelig opmærksomhed bør rettes mod billeddannelse betingelser. For det første er MTs meget følsomme over for temperatur og depolymerisere, når de udsættes for kold vækstmedium56,57,58,59. For at undgå indsamling af falske resultater bør temperaturen derfor kontrolleres strengt i hele eksperimentet. For det andet kan den ioniske sammensætning af det medium, der anvendes under forsøgene, påvirke MT Growth58,60. For eksempel påvirker eksponeringen for calciumioner MT-dynamikken på forskellige måder61,62. Derfor bør sammensætningen af det vækstmedium, der anvendes i alle forsøg, være den samme. På samme måde bør analyseparametrene defineres én gang og opretholdes konstant for alle gentagelser. Desuden, tidsforskudt film genereret efter analysen skal inspiceres visuelt, og enhver film med baggrundsstøj, der giver anledning til falske positiver (videoer 5 og 6) eller med høj ekspression af tdTomato resulterer i dårlig opløsning af MT voksende Tips (videoer 7 og 8) bør udelukkes fra yderligere statistisk analyse.

For nylig, kombinationen af gitter lys-Sheet mikroskopi af en mitotisk spindler ved subsecond intervaller, sammen med sofistikeret billedbehandling tillader analyse af MT montage rater i tre dimensioner63,64. Dette har indlysende fordele i forhold til clsm, men yderligere forbedringer vil være påkrævet, før metoden bliver til almindelig brug, såsom udvidelse af strategier, der anvendes i U-track til den tredje dimension26,50,63.

Protokollen af MT Dynamics Detection vi beskriver her kan være en metode til valg af narkotika screening. Metoden er robust, og det fjerner med held menneskelig bias sammenlignet med den udførte analyse manuelt. Automatisering af filmen behandling giver mulighed for analyse af tusindvis af MT spor i hver celle, og dermed øge den statistiske effekt af analysen. Desuden kan metoden ændres ved at ændre, for eksempel, synkroniserings protokollen og opnå celler fra forskellige faser af cellecyklussen. Det kan for eksempel være et nyttigt værktøj til screening af kemoterapeutiske lægemidler, når virkningen på interfase-og skille celler skal skelnes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker medlemmerne af den lette mikroskopi facilitet, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, for deres ekspertrådgivning og støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05%/0.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100xC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647 nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, temperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4 (2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343 (2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153 (2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39 (2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
  33. Elektrisches teleskop. Germany patent. Nipkow, P. , (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
  35. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. Tanaami, T., Kenta, M. , EP92114750A (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3 (1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138 (2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).

Tags

Biologi mikrotubulus Dynamics mikrotubulus vækst plus-end mikrotubulus tracking prometaphase Live-Cell Imaging spinning disk confokal mikroskopi
Måling af dynamik i Mikrotubulen ved spinding af Diskmikroskopi i monopolære mitotiske spindler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Movsisyan, N., Pardo, L. A.… More

Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter