Summary
在这里，我们提出了一个强大而详细的微管动力学分析方法，在预元相中同步的细胞使用活细胞旋转磁盘共聚焦显微镜和基于MATLAB的图像处理。
Abstract
我们描述了对确定活细胞中微管动力学的既定方法的修改。该协议基于微管正端（EB3标有tdTomato荧光蛋白）的遗传编码标记的表达，以及使用旋转盘共聚焦显微镜的高速、高分辨率活细胞成像。通过抑制线细胞中的中位体分离，实现细胞周期同步和微管密度的增加，并使用开源U-Track软件进行生长分析。使用明亮和红色转移荧光蛋白，结合较低的激光功率和减少曝光时间所需的旋转盘显微镜减少光毒性和光诱导伪影的可能性。这允许在相同的制备中成像更多细胞，同时在标准培养条件下将细胞保持在生长培养基中。由于分析以受监督的自动方式执行，因此结果在统计上是可靠的，可重现。
Introduction
微管（MTs）是几乎所有真核细胞和某些细菌1中发现的高度动态结构。与蛋白和中间丝一起，他们雕刻细胞骨架2，3。细胞分裂4，分子传输5，鞭拉击6，感觉周围环境通过原发性硅7，听力（基诺西）8，9，胚胎发生10，11，12，入侵和转移13，14，甚至记忆形成15，16，17，18，和许多其他过程主要依赖于MT。如果没有在生长（聚合）和收缩（去聚合）之间快速切换的非凡能力，那么，在所有这些事件中，如果MT的参与是不可能的。此属性被描述为动态不稳定19。MT动态性在许多病理条件下改变20，21，22。因此，确定此属性的性质可以帮助了解疾病机制及其后的治疗。
已经为MT动力学分析开发了一长串的方法，其中大多数都基于成像技术23。最初，宽场光学显微镜用于观察在体外24体中形成图布林聚合物。最终结合（EB）蛋白的发现，在MT加端聚集，并开发荧光标记蛋白质的方法，使得在宽场和共聚焦荧光显微镜25、26、27的活细胞中直接观察MT的行为成为可能。一个EB蛋白是最终结合蛋白3（EB3）28;通过过度表达和跟踪EB3融合到荧光蛋白，MT加端组装速率可以确定29，30。
共聚焦激光扫描荧光显微镜（CLSM）经常用于跟踪MT动力学。然而，这种成像技术带来了光毒性和光漂白的高风险，两个不良的过程活细胞和暗淡样品成像31。为了获得更好的信噪比，激光功率和曝光持续时间应足够高，同时不损坏样品，这需要牺牲分辨率以换取速度。CLSM的一个合适的替代方案是旋转磁盘显微镜32。这种成像模式基于使用Nipkow磁盘33，它包括一个带有一系列针孔的移动磁盘，并且与许多CLS显微镜同时成像同一样品34的工作相同。因此，来自激光的光将同时照亮样品中的多个区域，但会保持共聚焦性质。因此，Nipkow 磁盘允许获取类似于 CLSM 的图像，但速度更快，使用更少的激光功率。横川电机进一步改进了Nipkow圆盘，该盘引入了第二个圆盘，上面装有一系列微透镜，可单独将光线定向到各自的针孔中，进一步降低了光毒性和光漂白35。因此，旋转盘激光扫描显微镜成为活细胞成像的首选方法，并且它使得以高速31、36获得高信噪比的图像成为可能，这对解析来自快速增长的MT端信号至关重要。
MT 动态暂时不同。例如，线粒体MT比相间的37，38更动态。同样，即使在相同的细胞周期阶段，如米细胞炎39，40，也观察到生长速率和收缩的差异。因此，为了避免错误数据收集，MT 动力学的测量应限制在单元周期中的狭窄时间窗口。例如，通过用二甲基苯丙酮（DME）处理细胞，可以测量预元相中的MT动力学，这是一种抑制运动动蛋白Eg541并防止双极线轴42形成的单体模拟物。用Eg5抑制剂DME和其他单星衍生物抑制细胞在预元相不影响MT动力学43，44，45，这使得DME成为研究固定细胞和活细胞44MT动力学的有用工具。
在这里，我们将Ertych等人44描述的prometa相细胞中的MT动力学分析方法与双旋转磁盘成像相结合。该方法允许测量从单个焦平面收集的Prometa相细胞中的MT动力学，成像速率较高，但无光漂白和最小光毒性。此外，作为荧光报告员，我们使用串联二聚体番茄荧光蛋白（tdTomato），与绿色荧光蛋白（EGFP）相比，具有更高的亮度和光稳定性，并且以低能量光46激发。因此，tdTomato 需要较少的激光功率来激发，并且光毒性更少。总之，通过降低光毒性，提高MT动力学分析所需的分辨率和后处理，进一步完善了该方法。此外，我们通过将方法与其他同步技术相结合，为将来修改该方法奠定基础。
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Protocol
1. 赫拉细胞的种子
- 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备 2 mL 的 5 μg/mL 纤维化溶液，并将其加入 4 口井盖玻片 （#1.5） 的每个井中。在37°C和5%CO2下孵育幻灯片15分钟。
- 用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）冲洗异步生长的HeLa细胞，并在37°C下孵育胰蛋白酶-EDTA（0.05%：0.02%;w：v）。5分钟。停止酶反应添加罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640介质辅以10%热灭活胎儿小牛血清（FCS）在3：1 （v：v）比例添加胰蛋白酶-EDTA。
注：HeLa细胞在RPMI 1640介质中保持，在37°C和5%CO2下辅以10%热灭活FCS，一旦达到80-90%的汇合，则按照上述方式定期通过。 - 使用 Neubauer 腔室确定细胞浓度。以 1：1 （v：v） 比率将细胞悬浮液的 50 μL 等分与锥蓝色试孔混合，重新悬浮，并将悬浮液的 10 μL 转移到腔室中。只计算四个大方块内的锥形蓝负细胞（详情见Phelan等人47）。使用以下公式从计数的细胞数中派生细胞浓度：
- 在300 x g下离心将细胞压离2分钟，用新鲜的RPMI 1640重新悬浮，以获得1 x 106细胞/mL。
- 从密室盖玻片中取出纤维，用DPBS洗井两次，每口井播种50，000个细胞。
- 将带细胞的室盖玻片返回培养箱，在37°C和5%CO2下生长24小时。
2. HeLa细胞中pEB3-tdtomato的表达
- 准备一个1.5 mL微离心管。对于每管，用转染缓冲液（水溶液中的合成产物）将2μg的pEB3-tdTomato48稀释至396μL的最终体积。
- 将4μL转染试剂（非脂质，含有聚乙烯酰胺）加入第一管，并立即涡旋混合物正好10s。
- 用微离心机短暂地旋转管，并在室温 （RT） 下孵育 10 分钟。
- 从培养箱中取出 HeLa 细胞。顺流，将100μL的转染混合物加入4个井室盖玻片的每个井中，并将细胞返回到孵化器。
- 在37°C和5%CO2孵育4小时后，用新鲜生长培养基补充细胞，并在37°C和5%CO2下孵育至少24小时。
注：有必要优化每种细胞类型的转染条件。表达级别需要足够低，以便识别单个 MT 增长端。或者，在实验中可以使用一条能稳定表达EB3-tdTomato的细胞系;这将减少来自同一制剂的细胞之间和细胞之间的EB3-tdTomato表达水平的变异性49。
3. pEB3-tdtomato_表达HeLa细胞的同步和活细胞成像
- 在不含苯酚红色的Dulbeco改性鹰介质（DMEM）中制备2.5 μM二甲基苯丙胺（DME）溶液，辅以10%FCS和2 mM L-谷氨酰胺或替代谷氨酰胺供应。
- 用含有2.5μM DME的生长培养基500μL替换室盖玻片中的生长培养基，并在37°C和5%CO2下孵育细胞。
- 使用DME孵育3.5小时后，将细胞转移到显微镜上，将室盖玻片安装到带有深色面板的环境室中，在37°C和5%CO2下进行成像，并进一步孵育，直到总孵育时间为4小时。
注：保持37°C的温度无波动对实验至关重要。 - 在配备 100x 1.49 N.A. 油浸物、双旋转盘共焦系统和可靠自动对焦系统的倒置显微镜上执行延时成像，以便持续维护焦平面。定义成像参数，如下所示。
注：我们使用电子倍增电荷耦合器件相机（EM-CCD）。- 对于 EB3-tdTomato 激发，请使用 561 nm 激光线，曝光时间为 200 ms。通过四联带通（405、488、561、640 nm）二色镜和 600/52 nm 发射滤波器收集发射光。
注：可以为每个成像单元调整激光功率，以防止图像饱和。在此处给出的所有延时电影中，激光功率设置为 5.3 mW。 - 在与单极线轴中心相对应的 Z 平面中查找预相和焦点的细胞。每 0.5 秒获取一次图像，总共 1 分钟，曝光之间没有分箱和照明。
- 对于 EB3-tdTomato 激发，请使用 561 nm 激光线，曝光时间为 200 ms。通过四联带通（405、488、561、640 nm）二色镜和 600/52 nm 发射滤波器收集发射光。
4. 使用 U-Track v2.2.0 分析 MT 动力学
- 要分析 MT 动力学，需要一个数字计算环境软件（例如 MATLAB）。
注：对软件的基本了解足以进行分析。全面的帮助材料和教程可在开发人员的网站 （https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html） 上找到。 - 下载 （https://github.com/DanuserLab/u-track） 并安装开源 U-Track v2.2.0 软件，按照"Readme_u-track.pdf"文件中给出的详细说明进行操作。
- 启动数值分析软件，并将带有子文件夹的 U-Track v2.2.0 文件夹添加到软件搜索路径中。
- 从命令窗口调用"电影选择GUI"。这将打开一个对话框窗口，从中可以导入显微镜上图像采集软件生成的原始文件（补充图1，图2，图3，图4）。
注：U-Track 软件与其他图像数据格式兼容。它使用生物格式，它识别不同的生命科学数据格式53。 - 从元数据自动读取每个图像的大小。手动输入目标的数字孔径（本例中为 1.49）和用于成像的时间间隔 （0.5 s）（补充图 1B）。此外，还可以提供有关激发波长、荧光和暴露时间的信息，但它们对于进一步分析并不重要。
- 加载所有图像后，通过选择"保存为影片列表"，将输入的延时序列另存为影片列表。在对话框的右侧选择"U-Track"选项，然后按"继续"（补充图1C）。
注：这些值针对 HeLa 细胞进行了优化。如果切换到其他单元格线，应再次定义值。或者，使用软件开发人员建议的设置。每个参数的详细说明以及如何定义它们，请参阅与该软件的早期版本一起提供的技术报告，以及TipTracker50。 - 从弹出窗口中选择"微管加端"，然后按"确定"（补充图1C）。新的对话窗口允许确定分析的三个步骤的参数（补充图 1D），即检测、跟踪和跟踪分析。
- 在步骤 1 中选择"设置"，从下拉菜单中选择"彗星探测"作为检测方法（补充图 2B）。
- 在新的对话窗口中定义高斯滤波器差异的参数和分水岭分割如下（补充图2C）：用于检测的掩码过程= 无;低通高斯标准差 = 1 像素;高通高斯标准差 = 3 像素;最小阈值 = 3 个标准偏差;阈值步长大小 = 0.25 标准偏差。选择"对所有影片应用设置"和"应用"。
- 在步骤 2 中，链接、间隙闭合、合并和拆分以及 Kalman 筛选器函数的参数以三个步骤定义，相应地以粉红色、绿色和蓝色突出显示（补充图 3B）。对于这些步骤，选择"微管加端动力学"和"设置"选项分别定义补充图 3C+E中所示的值。
- 对于尺寸问题，请从下拉菜单中选择"2"。使用最大间隙关闭 = 5 帧;从第一步开始的轨道段最小长度 = 3 帧。与之前一样，选择"对所有影片应用设置"，然后单击"应用"。
- 在分析的第 3 步中，检测到的 MT 磁道被分类 （补充图 4）。作为跟踪分析方法，选择"微管动力学分类"，并通过补充图4B，C所示的"设置"按钮定义参数。之后，选择"对所有影片应用设置"框，然后单击"应用"。
- 定义所有参数后，从"控制面板+U-Track"窗口（补充图 1D）中选择"对所有影片应用检查/取消选中"和"运行所有影片"框并按"运行"。这将启动延时系列的 MT 分析。
- 完成影片处理后，将显示一条消息"您的影片已成功处理"。按"确定"，然后"保存"。
- 现在，可以安全地退出数值分析软件。影片处理的结果存储在子文件夹结构中，作为 m 文件存储在存储原始文件的文件夹中。
5. MT动力学的统计分析
- 将 m 文件导入首选统计分析程序。
注：在我们的案例中，我们首先在标准电子表格中导入文件，使其可读。m-file 包含不同参数（例如，增长速度、MT 动态性）的统计信息（中位数、均值和标准偏差）。参数的详细列表在该软件的早期版本提供的技术报告中给出，加上TipTracker50，52。生成的 m 文件也可以导入到其他数据处理软件中。 - 选择"增长速度平均值"参数并将其导入表进行统计和显示。在新表或同一分组表和绘图的新列中输入有关其他参数的信息（例如，"动态性"）。
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Representative Results
按照图1A中概述的给定协议，pEB3-tdTomato质粒在异步生长的HeLa细胞中瞬时表达。通过DME治疗在临元相转染后48小时与细胞同步（图1B）。此步骤可确保 MT 动力学的测量始终在细胞周期的同一阶段进行。延时电影被进一步处理和分析与U-Track v2.2.0，如其补充文件50，51，52所述。虽然加端结合蛋白仅跟踪MT生长阶段，但U-Track v2.2.0通过链接顺序生长阶段和重建完整轨迹26，50来推断暂停和收缩事件的信息。该算法基于Jaqaman等人51描述的空间和时空全球跟踪框架。
需要注意的是，分析的灵敏度和准确性在很大程度上取决于多个分析参数。例如，按协议（图1C、视频1"之前"和视频2"后"分析）对延时电影进行了分析，并分别在图1E、F（黑圈）中绘制了由此产生的增长速度和动态（含间隙轨道在整个生命周期内的集体位移）。然后，对同一组延时影片（视频3和4）修改了"最大间隙长度"和"最大收缩系数"等对分析50产生巨大影响的参数。图1E、F中分别给出了生长速度和动态的对应值，分别为红色方块和蓝色三角形。由此产生的增长速度没有受到很大影响。但是，在修改"最大间隙长度"时，获得的动态值明显不同，而在更改"最大收缩系数"时，该值保持不变。如图1D所示，在所有三种情况下，MT子轨迹的检测同样可靠。然而，当"最大间隙长度"设置为15时，整个MT轨迹的重建受到的影响最大（图1D，内集图像）。此外，为了评估成像条件是否干扰了MT行为，分别分析了延时序列的第一半（1~61帧）和第二部分（61~121帧），并比较了相应的生长速度和动态值（图1G，H）。正如所料，在延时序列的两个部分之间没有发现显著差异。在视频中给出了在临相中同步并表达EB3-tdTomato的线粒细胞的1⁄8延时图像（持续时间=1分钟;间隔= 0.5秒）。
图1：在临元相中同步的HeLa细胞的MT动力学分析。（A） 协议步骤的概述.（B） DME介导形成单极线轴机制的示意图表示。（C） 使用 U-Track 软件处理的前 10 帧延时电影的蒙太奇，每显示一秒帧。检测到的 MT 增长轨迹用红色标记。（D） 原始图像文件的时序投影和 MT 跟踪后使用协议中描述的设置（"最佳"），并在更改"最大间隙长度"或"最大收缩系数"时给出。内联表示完整的 MT 轨迹，包括增长（红色）、暂停（浅蓝色）、收缩（黄色）、fgap 重新分类为增长（绿色）和 bgap 重新分类为暂停（深蓝色）事件。显示增长速度（E） 和动态性（F） 值，并使用建议的最佳标准（黑色圆圈）、最大间隙长度设置为 15（红色方块）或设置为 1.0（蓝色三角形）的最大收缩系数的结果绘制（n = 45 个单元格;均值 = SEM;使用 Tukey 柱位测试进行单向 ANOVA 分析以进行多次比较）。延时电影（n = 45 个单元;均值 = SEM;未配对的 t 检验与 Welch 的校正）的第一个 （1~61 帧） 和第二个 （61–121 帧） 的值显示 （G） 和动态性 （H） 值。请点击此处查看此图的较大版本。
视频1：分析前预元相细胞的代表性延时原始图像。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
视频 2：使用建议的 U-Track 软件设置检测和跟踪视频 1 中单元格中的 MT。使用描述的设置使用 U-Track v2.2.0 软件处理的视频 1 中的同一延时图像，检测到的增长轨迹以红色标记。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
视频 3：使用"最大间隙长度"的非最佳值检测和跟踪视频 1 中单元格中的 MT。视频 1 中的同一延时图像使用与之前相同的设置使用 U-Track v2.2.0 软件处理，但"最大间隙长度"设置为 15。其余参数未更改。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
视频 4：使用"最大收缩系数"的非最佳值检测和跟踪视频 1 中单元格中的 MT。视频 1 中的同一延时图像使用与之前相同的设置使用 U-Track v2.2.0 软件处理，但"最大收缩系数"设置为 1。其余参数未更改。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
视频 5：带有细胞碎片的细胞的延时序列示例。分析后，软件在MT跟踪过程中也检测到一些细胞碎片。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
视频 6：与视频 5 对应的原始数据。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
视频 7：具有 EB3-tdTomato 高表达的单元格的延时序列示例，导致生长提示定义不良。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
视频 8：与视频 7 对应的原始数据。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
补充图1：使用U-Track软件进行分析的工作流程。（A） 软件所采用步骤的示意图.（B） Bio-Formats导入器的屏幕截图，显示如何导入延时文件。（C） 上传文件后，选择带有 MT 加端模块的 U-Track。（D） U-Track 控制面板的屏幕截图，其中定义了彗星探测、跟踪和跟踪分析的设置。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图2：分析的第一步说明，彗星探测。（A） 算法执行的主要事件的大纲.（B， C）软件的屏幕截图显示最佳值。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图3：描述第二步分析，彗星跟踪。（A） 概述了该算法执行的主要步骤.（B） 给出了"跟踪"面板的屏幕截图。最大间隙接近对应于最大间隙长度，并设置为 5。使用红色、绿色和蓝色矩形突出显示三个子步骤的跟踪。（C，D，E）此处输入每个子步骤所需的数值。最大收缩系数设置为 1.5，如 （D） 所示。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图4：说明最后一步的分析，跟踪分析。（A） 在此步骤中执行复合轨道的 MT 动态分类和重新分类。（B，C）将显示轨道分析和相应设置的屏幕截图。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了Ertych等人首先建立的方法的修改。除了其他几种修改之外，我们还将这一MT动力学分析技术与双旋转磁盘共聚焦成像相结合。使用双纺盘提高了增长的MT的分辨率，同时降低了光毒性36。通过切换到长波长荧光报告器，我们进一步减少了光漂白和激光引起的细胞损伤。与EGFP46相比，tdTomato荧光蛋白具有更高的光稳定性和亮度系数。最后，由于U-Track后续分析的局限性，MT动力学的测量仅限于一个Z平面。U-Track软件设计用于检测XYZ轴50、51中的荧光标记MT提示。因此，采用 Z 堆栈延时序列并创建最大投影延时序列很容易产生错误的结果。在不同的Z平面中检测到的信号，而不属于同一增长的MT，它们被汇集在最大投影中，从而形成了MT增长的假轨迹。
此处使用的同步协议通过将线心轴限制为单极结构来诱导高密度的 MT。线粒体是高度动态的结构，具有生长和收缩阶段，在它们之间的过渡处暂停19，54，55。由于增长的 MT 的密度很高，如果跟踪参数设置不正确，则检测暂停事件后跟收缩或增长很容易产生错误的结果。U-Track 软件跟踪模块检测所谓的子轨迹（持续增长的情节），然后将它们分类为复合轨道，暂停事件称为"间隙"。Applegate等人讨论了两个参数，对跟踪和子跟踪链接50至关重要。它们是"最大间隙长度"和"最大收缩系数"。如果后续时间步长中，所遵循的子轨迹在 MT 的成长方向上重新出现，则将其归类为正向间隙。另一方面，如果子轨道重新出现与增长方向相反，则将其归类为向后缺口。最大间隙长度定义要搜索前进和后退间隙的帧数。如前所述，线粒的高密度和自然高度动态性设定了限制，并且应定义较小的值。如图1E所示，动态性受影响最大。动态性计算为所有含间隙轨道在其全球生命周期内的集体位移。第二个参数，最大收缩系数，对动态性或生长速度几乎没有影响（图1D，E）。
一般来说，在研究MT生长特性时，应注意成像条件。首先，当暴露于冷生长培养基56、57、58、59时，MT对温度非常敏感，并去聚。因此，为了避免收集错误的结果，应在整个实验过程中严格控制温度。其次，实验中使用的介质的离子组成会影响MT生长58，60。例如，接触钙离子以不同的方式影响MT动力学61，62。因此，所有实验中使用的生长介质的组成应该是相同的。同样，分析的参数应定义一次，并对所有重复保持恒定。此外，分析后生成的延时电影应目视检查，任何背景噪音导致误报（视频 5 和 6）或 tdTomato 表达高导致 MT 生长提示（视频 7 和 8）分辨率不佳的影片都应排除在进一步统计分析之外。
最近，以亚秒间隔将线粒光片显微镜与复杂的图像处理相结合，使MT装配速率在三维63，64中得以分析。与CLSM有明显的优势，但在该方法成为普遍使用之前还需要进一步改进，例如将U-Track中使用的策略扩展到第三维度26、50、63。
我们在这里描述的MT动力学检测协议是药物筛选的首选方法。该方法非常可靠，与手动执行的分析相比，它成功地消除了人类的偏见。电影处理的自动化允许分析每个单元内的数千个 MT 轨道，从而提高分析的统计能力。此外，该方法可以通过更改同步协议和从单元周期的不同阶段获取单元来修改。例如，当应区分对相间和分裂细胞的影响时，这可以是筛选MT靶向化疗药物的有用工具。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢马克斯-普朗克实验医学研究所光显微镜设施的成员，感谢他们的专家建议和支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylenastron | Merck | 324622 | |
| DMEM w/o phenol red | Gibco | 31053-28 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0415 | |
| Fibronectin Bovine Plasma | Merck | F4759 | Sterile powder |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | Stable glutamine substitutive |
| jetPRIME | Polyplus | 114-15 | |
| EB3-TdTomato | Addgene | plasmid #50708 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Trypan Blue | Merck | T8154-20ML | |
| Trypsin/EDTA solution | Biochrom | L2143 | 0.05%/0.02 % w/o calcium and magnesium |
| µ-slide | Ibidi | 80426 | 4-well slide with #1.5 coverslip |
| Eclipse Ti Inverted microscope | Nikon | NA | |
| Objective | Nikon | MRD01991 | CFI Apo TIRF 100xC Oil |
| ACAL Laser Excahnger | Nikon | Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647 nm | |
| Spinning disk module | Andor | CSU-W | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| Environmental Chamber | Okolab | Dark chamber equipped with CO2 supply, temperature control and humidifier | |
| HeLa Cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIS Elements v4 | Nikon | Spinning disk microscope. Acquisition Software | |
| MATLAB | Mathworks | Computing environment | |
| Prism 8 | GraphPad | Statistical analysis and display software |
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