Summary
We beschrijven een 3D menselijke extracellulaire matrix-adipocyte in vitro cultuur systeem dat het mogelijk maakt dissectie van de rollen van de matrix en adipocytes in bij te dragen tot vetweefsel metabole fenotype.
Abstract
De extracellulaire matrix (ECM) speelt een centrale rol bij het reguleren van weefselhomeostase, het betrekken van Overspraak met cellen en het reguleren van meerdere aspecten van cellulaire functie. De ECM speelt een bijzonder belangrijke rol in de vetweefsel functie bij obesitas, en veranderingen in vetweefsel ECM afzetting en samenstelling zijn geassocieerd met metabole ziekte bij muizen en mensen. Tractable in vitro-modellen die een dissectie van de rollen van de ECM mogelijk maken en cellen die bijdragen aan het wereldwijde weefsel fenotype zijn schaars. We beschrijven een roman 3D in vitro model van menselijke ECM-adipocyte cultuur die het mogelijk maakt studie van de specifieke rollen van de ECM en adipocytes in het reguleren van vetweefsel metabole fenotype. Humaan vetweefsel is decellularized te isoleren van ECM, die vervolgens wordt herbevolkt met preadipocytes die vervolgens worden gedifferentieerd binnen de ECM in volwassen adipocytes. Deze methode creëert ECM-adipocyten constructies die metabolisch actief zijn en kenmerken van de weefsels en patiënten waarvan zij afkomstig zijn, behouden. We hebben dit systeem gebruikt om ziekte-specifieke ECM-adipocyten overspraak in menselijk vetweefsel aan te tonen. Dit cultuur model biedt een hulpmiddel voor het ontleden van de rollen van de ECM en adipocytes in het bijdragen aan wereldwijd adipeus weefsel metabole fenotype en maakt studie van de rol van de ECM in het reguleren van vetweefsel homeostase.
Introduction
De extracellulaire matrix (ECM) biedt niet alleen een mechanische steiger voor weefsels, maar houdt ook in complexe Overspraak met cellen die erin wonen, reguleren van diverse processen die nodig zijn voor weefselhomeostase, met inbegrip van celproliferatie, differentiatie, signalering en metabolisme1. Terwijl gezonde ECM een essentiële rol speelt bij het behoud van de normale weefsel functie, is disfunctionele ECM betrokken bij meerdere ziekten2.
Vetweefsel speelt een belangrijke rol in de pathogenese van metabole ziekten. Obesitas wordt geassocieerd met overmatige adipocyte hypertrofie en cellulaire hypoxie, defecten in adipocyte cellulaire metabolisme, en vetweefsel endoplasmisch reticulum en oxidatieve stress en ontsteking. Terwijl slecht begrepen, deze complexe processen samenspannen te beschadigen vetweefsel nutriënten buffercapaciteit, wat leidt tot nutriënten overloop van vetweefsel, toxiciteit in meerdere weefsels, en systemische metabole ziekte3,4 ,5. De opeenvolging van gebeurtenissen en specifieke mechanismen die ten grondslag liggen aan vetweefsel falen zijn slecht begrepen, maar wijzigingen in adipeus weefsel ECM zijn betrokken. De samenstelling van de ECM is veranderd in vetweefsel in menselijke en muriene obesitas, met verhoogde afzetting van ECM-eiwitten samen met kwalitatieve biochemische en structurele verschillen in de vetweefsel-ECM geassocieerd met menselijke metabole ziekte, waaronder type 2 diabetes en hyperlipidemie6,7,8,9,10,11.
Ondanks deze observaties, de rol van adipeus weefsel ecm in bemiddelen vetweefsel dysfunctie is niet goed gedefinieerd. Dit is deels te wijten aan een gebrek aan Tractable experimentele modellen die een dissectie van de specifieke rollen van ECM en adipocytes in de regulering van Ultimate adipeus weefsel functie toestaan. ECM-adipocyten cultuur simuleert beter de in vivo omgeving van native vetweefsel in ten minste twee opzichten. Ten eerste biedt de ECM-cultuur een moleculaire omgeving die lijkt op inheems vetweefsel, inclusief inheemse collagens, Elastinen en andere matrix proteïnen die afwezig zijn in de standaard 2D-cultuur. Ten tweede is de cultuur op 2D-plastic aangetoond dat het adipocyten metabolisme verandert via mechanische effecten als gevolg van een verminderde elasticiteit van kunststof substraat12, die de ECM-cultuur elimineert.
Methoden om biologische steigers te engineeren door isolatie van ECM uit decellularized vetweefsel en andere weefsels zijn bestudeerd in de context van regeneratieve en reconstructieve geneeskunde en weefsel engineering13,14, 15,16,17,18. We hebben eerder de methodologie gepubliceerd waarin we deze methoden hebben aangepast om een in vitro 3D-model van humane ECM-adipocyten cultuur te ontwikkelen, met behulp van ECM en adipocyten stamcellen (preadipocytes) afgeleid van humane viscerale vetweefsels11. In dit artikel beschrijven we deze methoden in detail. De decellularisatie procedure voor menselijk vetweefsel is een vierdaags proces waarbij mechanische en enzymatische behandelingen worden uitgevoerd om cellen en lipide te verwijderen, waardoor een biologische steiger blijft die kenmerken van het weefsel behoudt waaruit het is afgeleid. Decellularized ECM ondersteunt adipogenic differentiatie van menselijke preadipocytes, en wanneer gereconstitueerd met adipocytes, onderhoudt microarchitectuur en biochemische en ziekte-specifieke kenmerken van intact vetweefsel en houdt zich bezig met metabole functies die kenmerkend zijn voor inheemse vetweefsel. Deze matrix kan alleen worden bestudeerd of herplaatst met cellen, het toestaan van studie van interacties en overspraak tussen de cellulaire en extra-cellulaire componenten van vetweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vetweefsel worden verkregen van menselijke proefpersonen die electieve bariatrische chirurgie ondergaan onder goedkeuring van de institutionele beoordelings Raad.
1. voorbereiding van preadipocyten isolatie en cultuur reagens
- Bereid 2% bovien serumalbumine (BSA) in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C.
- Bereid type II Collagenase: 2 mg/mL in 2% BSA in 1x PBS. Bereid onmiddellijk voor gebruik.
- Bereid rode bloedcel (RBC) Lysing oplossing: 1,5 M NH4Cl, 100 mm NaHCO3, 10 mm dinatriumedta in gedeïoniseerd water (di/H2O). Bewaren bij 4 °C. Bereid 1x RBC Lysing oplossing van 10x stockoplossing in DI/H2O onmiddellijk voor gebruik.
- Bereid groei media voor: 15% foetaal runderserum (FBS), 1% antibioticum-antimycotische oplossing (ABAM) in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium: nutriënten mengsel F-12 (DMEM/F12). Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C.
- Bereiding Preadipocyte invriezing oplossing: 10% dimethylsulfoxide, 15% FBS in DMEM/F12 media. Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C.
- Maak een differentiatie medium: 10 mg/L transferrin, 33 μM biotine, 0,5 μM humane insuline oplossing, 17 μM D-Pantotheenzuur hemicalciumzout, 100 nM dexamethason, 2 nM 3, 3 ', 5-Triiodo-L-thyronine natriumzout (T3), 1 μM ciglitizone, 540 μM 3- Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1% ABAM in DMEM/F12. Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C.
2. voorbereiding van het ECM-reagens
- Bereiding Vries buffer oplossing: 10 mM tris-basis, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) in DI/H2O. Roer oplossing om EDTA op te lossen. Pas de pH tot 8,0 aan met HCl of NaOH. bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
- Bereid enzymatische oplossing #1:1% ABAM in 0,25% trypsine-EDTA. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
- Bereiding spoel buffer oplossing: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM na2HPO4, 1,5 mm KH2po4, 1% abam, 1% PMSF in gesteriliseerde di/H2O. roer om zouten te ontbinden. Stel de pH in op 8,0 met HCl of NaOH. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
- Enzymatische oplossing bereiden #2:55 mM na2HPO4, 17 mm KH2po4, 4,9 mm MgSO4∙ 7h2O, 1% abam, 1% PMSF in di/H2O. bewaren 4 °c gedurende maximaal 3 maanden. Roer om zouten te ontbinden. Voeg onmiddellijk vóór gebruik 80 U/mL lipase toe van de alvleesklier, type VI-S; 160 U/mL deoxyribonuclease I van boviene alvleesklier, type II-S; en 100 μg/mL ribonuclease A van boviene alvleesklier, type III-A.
- Bereid polaire oplosmiddelextractie oplossing: 1% ABAM, 1% PMSF in isopropanol.
Let op: isopropanol is ontvlambaar; bewaren in een ontvlambare kast bij 25 °C en afvoeren in brandbare afvalstoffen. - Bereid 70% ethanol, 1% ABAM, 1% PMSF in DI/H2O. Voeg abam en PMSF toe net vóór gebruik.
Let op: ethanol is ontvlambaar; bewaren in een ontvlambare kast bij 25 °C en afvoeren in brandbare afvalstoffen. - Opslagoplossing voorbereiden: 1% ABAM, 1% PMSF in 1x PBS. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
3. metabool voorbereiding van de fenotyping reagens
- Glucose opname
- Bereid serum verhongering media: DMEM/F12, 1% ABAM. Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C
- Bereid 200 nM humane insuline oplossing direct voor gebruik in 1x PBS.
- Bereid 200 nM humane insuline, 0,1 mM 2-deoxy-D-glucose, 1 μCi/well deoxy-D-glucose, 2-[1, 2-3H (N)]-, in 1x PBS. Bereid onmiddellijk voor gebruik.
- Lipolyse
- Bereid isoproterenol verdund in PBS: 3 mM stockoplossing. Verdun tot een werkconcentratie van 3 μM voor assay.
- Olie rood-O kleuring
- Bereid 4% Formalin in DI/H2O. bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid olie rood-O werkoplossing. Verdunde olie rood-O-oplossing (ORO) met DI/H2o in een 3:2-verhouding (Oro: di/h2o). Bereid onmiddellijk voor gebruik. Filtreer door filtreerpapier (tabel met materialen).
4. aankoop van vetweefsel
Opmerking: visceraal vetweefsel (BTW) wordt verzameld van het grotere Omentum aan het begin van de operatie door de chirurg en getransporteerd naar het laboratorium op ijs voor onmiddellijke verwerking. Universele voorzorgsmaatregelen moeten worden gebruikt bij het hanteren van alle menselijke weefsels en bijtende reagentia, inclusief het uitvoeren van al het werk in een laminaire stroom afzuigkap, met behulp van complete laboratorium veiligheids slijtage en geen recappen van naalden.
- Voeg 5-10 g intacte BTW toe aan 15-25 mL Vries buffer oplossing in een conische buis van 50 mL om het weefselmonster onder te dompelen. Bewaar voorbeelden bij-80 °C tot decellularisatie, voor maximaal 1 maand.
- Gebruik een afzonderlijk vers VAT van de BTW voor de isolatie van preadipocyten, zoals beschreven in rubriek 5.
5. isolatie van preadipocyten
- Plaats 2 g intacte BTW in 20 mL Collagenase, type II, oplossing in een conische buis van 50 mL. Dan grondig gehakt door het inbrengen van een steriele schaar in de conische buis en het hakken van het weefsel in de buis. Eenmaal volledig fijngemalen tot een fijne slurry, inbroed het weefsel in de Collagenase-oplossing op een rondschudapparaat bij 130 rpm en 37 °C gedurende 60 min.
- Filtreer het resulterende verteren door een 100 μm nylon gaas in een nieuwe conische buis van 50 mL door het digestaat te gieten van een conische buis door een stuk gaas dat over de bovenkant van een frisse conische buis is gevouwen. Het digestaat op dit punt moet een geel-oranje vloeistof met matige viscositeit, met kleine hoeveelheden residuele strengen van onverteerd vezelige weefsel. Het gaas moet grotere stukjes onverteerd weefsel te vangen, die worden weggegooid.
- Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 270 x g . Verwijder het supernatant en rebreng de celpellet in 2 ml 1x RBC Lysing oplossing met een pipet.
- Incuberen gedurende 1 minuut bij 25 °C en voeg vervolgens 10 mL 15% FBS-DMEM/F12 toe. Centrifugeer bij 270 x g gedurende 10 min.
- Verwijder de supernatant en rebreng de celpellet in 10 mL 15% FBS-DMEM/F12 met een pipet. Breng de celsuspensie over naar 100 mm Petri schaaltje met een pipet en inbroed bij 37 °C en 5% CO2, tot de cellen 80-100% samenvloeiing bereiken, meestal 2-6 dagen. Verander de media elke 2-3 dagen.
- Maak cellen los en spoel ze.
- Verwijder media met een pipet en breng 4 mL 0,25% trypsine-EDTA aan op aan te brengen cellen. Inincuberen bij 37 °C gedurende 10 minuten, waarbij de plaat periodiek zachtjes wordt gezwenkenom de cellen los te maken.
- Voeg 20 mL 15% FBS-DMEM/F12 toe en rebreng de losgekoppelde cellen in deze media met een pipet. Breng vervolgens over naar een frisse 50 mL conische buis en centrifuge 270 x g gedurende 10 min.
- Verwijder het supernatant en gooi het weg. Was de celpellet eenmaal in 1x PBS en breng vervolgens de celpellet in 20 mL verse 15% FBS-DMEM/F12 met een pipet. Breng de celsuspensie over in een T-150 kweek kolf.
- Kweekcellen bij 37 °C en 5% CO2. Splits en breid cellen elke 2-3 dagen uit terwijl ze 80-100% samenvloeiing bereiken door 7 mL 0,25% trypsine-EDTA toe te passen, uit één kolf naar 8 kolven uit te breiden.
Let op: dit vereist meestal 3-4 passages, die een passende uitbreiding mogelijk maakt en behoudt adipogenic potentieel en patiënt-en depot-specifieke cellulaire metabole fenotypes. Doorgang preadipocytes boven 4-5 passages leidt tot verlies van adipogenic potentieel. - Maak cellen in 8 kolven los met 7 mL 0,25% trypsine-EDTA per kolf, zoals hierboven beschreven, en inincuberen bij 37 °C gedurende 10 minuten.
- Voeg 8 mL 15% FBS-DMEM/F12 per kolf toe en hervat de losgekoppelde cellen met een pipet. Breng de gehele celsuspensie gelijkmatig verdeeld in 3 50 mL conische buizen en centrifugeer bij 270 x g gedurende 10 minuten.
- Respendeer de resulterende celpellets in 5 mL 15% FBS-DMEM/F12 in een conische buis van 15 mL en Tel cellen met behulp van een cel teller en Trypaan blauw.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 270 x g . Hervat vervolgens de celpellet in de oplossing van het invriezen van Preadipocyten tot een uiteindelijke celconcentratie van 1 x 106/ml en aliquot 1 ml celsuspensie per 1,5 ml cryoviale buis.
- Bewaarcellen in cryoflesjes gedurende 1 dagen bij-80 °C. Breng cryoflesjes over naar vloeibare stikstof voor lange termijn opslag voor 3-6 maanden.
- Wanneer klaar voor gebruik, ontdooit een cryovial in een waterbad van 37 °C voor 3-5 min. Respendeer de cellen in 20 mL 15% FBS-DMEM/F12, en centrifugeer bij 270 x g gedurende 10 minuten.
- Respendeer de celpellet in 20 mL 15% FBS-DMEM/F12, Pipetteer in een enkele T-150 kolf en groei vervolgens tot 80% samenvloeiing over 2-3 dagen bij 37 °C en 5% CO2.
- Maak cellen los met 7 mL 0,25% trypsine-EDTA per kolf zoals hierboven beschreven in stap 5,6. Respenderen bij 3.000.000 cellen per mL (d.w.z. 6 x 104 cellen per 20 μL) in 15% FBS-DMEM/F12, en gebruik zoals hieronder uiteengezet (sectie 7, stap 7,4).
6. voorbereiding van vetweefsel ECM
- Dag 1: Vries-ontdooien en enzymatische spijsvertering #1
- Bevriezen-ontdooien eerder bevroren (stap 4,2) BTW-monsters opgeslagen in Vries buffer oplossing in 50 mL conische buizen van-80 °C tot 37 °C in een voorverwarmd waterbad, waarbij 20 minuten worden ingevroren met zachte periodieke handmatige opwinding. Eenmaal ontdooid, terug te brengen tot-80 °C en inbroed 20 min. herhalen bevriezen-ontdooien 3x, eindigend door het ontdooien van monsters in een 37 °C waterbad.
- Gebruik steriele Tang, breng de BTW-monsters over naar verse 50 mL conische buisjes met 15-25 mL enzymatische oplossing #1, zodat de BTW-monsters volledig worden ondergedompeld. Inincuberen dan 's nachts op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C).
- Dag 2: enzymatische spijsvertering #2
- Was samples 3x met 15-25 mL spoel buffer oplossing op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt). Giet de spoel buffer oplossing na elke wasbeurt af.
- Breng monsters over naar verse 50 mL conische buisjes met 15-25 mL enzymatische oplossing #2 en inincuberen op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 's nachts).
- Dag 3: Delipidation
- Was samples 3x met 15-25 mL spoel buffer oplossing op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt). Giet de spoel buffer oplossing na elke wasbeurt af.
- Breng monsters over naar verse 50 mL conische buisjes met 15-25 mL polaire oplosmiddelextractie oplossing en inincuberen op een rondschudapparaat (130 rpm, 25 °C, 's nachts). Na deze stap, een meerderheid van het lipide moet worden verwijderd, en de monsters moeten wit of doorschijnend in kleur.
Let op: de polaire oplosmiddelextractie oplossing is ontvlambaar en dient te worden bewaard en gebruikt bij 25 °C.
- Dag 4: wassen en opbergen
- Breng monsters over naar verse 50 mL conische buisjes met 15-25 mL spoel buffer oplossing. Was samples 3x op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt).
- Was monsters 3x met 15-25 mL 70% ethanol op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt) en giet na elke wasbeurt de 70% ethanol oplossing af.
- Was één keer met opslagoplossing op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt).
- Gebruik steriele tang om monsters over te brengen naar verse 50 mL conische buisjes met 15-25 mL opslagoplossing. Zorg ervoor dat voldoende opslagoplossing wordt gebruikt om monsters volledig onder te dompelen. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
7. ECM-adipocyten preparaat
- Breng opgeslagen ECM-fragmenten over naar afzonderlijke putjes van 24-Wells plaat met behulp van steriele Tang. Voeg zo veel ECM-fragmenten toe in zoveel putten als nodig is voor de geplande downstreamtest (bijv. glucose opname of lipolyse, zie hieronder), inclusief duplicaten of triplicaten. Wassen met 500 μL van 70% ethanol 3x op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt).
- Rehydraat ECM door het wassen van 3x in steriele 1x PBS op een rondschudapparaat (130 rpm, 37 °C, 20 min elke wasbeurt).
- Gebruik een steriele schaar, snijd en weeg ECM in 100 mg fragmenten. Gebruik steriele Tang, plaats 1 100 mg fragment in elke put van een 24-Well plaat. Incuberen bij 25 °C gedurende 15 minuten om overtollige PBS uit fragmenten te laten extruderen. Verwijder de overtollige PBS voorzichtig met een pipet.
- Zaai elk 100 mg ECM-fragment met 20 μL preadipocyten celsuspensie (3.000.000 cellen per mL, 6 x 104 cellen per 20 μL, in 15% FBS-DMEM/F12, vanaf stap 5,10). Pipetteer de cellen rechtstreeks in de ecu door het uiteinde van de pipet in de ecu te plaatsen en de celsuspensie zachtjes in het midden van de matrix te zetten, waarbij wordt gezorgd dat de celsuspensie niet overloopt en op de bodem van de put eindigt.
- Als de celsuspensie overloopt van de ecu waar de pipetpunt is geplaatst, verwijdert u de punt van die locatie en plaatst u ergens anders in de ecu. Inincuberen ecu voor 40 min bij 37 °C.
Opmerking: voor RNA-extractie voor qrtPCR, zaai elke 500 mg ECM-fragmenten met 3 x 105 cellen in 100 μL (3.000.000 cellen per ml, d.w.z. 3 x 105 cellen per 100 μL, in 15% FBS-DMEM/F12).
- Als de celsuspensie overloopt van de ecu waar de pipetpunt is geplaatst, verwijdert u de punt van die locatie en plaatst u ergens anders in de ecu. Inincuberen ecu voor 40 min bij 37 °C.
- Vul elke put van de 24-put plaat met 500 μL groeimedia om de geseede ECM-fragmenten te bedekken. Cultuur bij 37 °C en 5% CO2 voor 72 h.
- Na 72 h, voorzichtig te aspireren 15% FBS-DMEM/F12, kantelen van de plaat enigszins om media te pool onder fragment, en het plaatsen van de pipetpunt net grenzend aan het ECM-fragment zonder te storen. Na het opzuigen, voeg 500 μL differentiatie media toe, veranderende media elke 2-3 dagen met behulp van een vergelijkbare techniek, voor een totale cultuur periode van 14 dagen.
- Controleren op differentiatie met behulp van Lichtmicroscopie: cellen zullen lipiden accumuleren, bruin-geel in kleur en meer bolvormig in vorm.
Opmerking: geseede matrices kunnen worden gebruikt voor metabole tests (bijv. glucose opname test, lipolysisassay, ORO), histologie of immunohistochemie (IHC) of standaard weefsel beeldvorming. Voor ORO-kleuring en beeldvorming op vaste weefsels, bevriezen van ECM-adipocyten monsters in vloeibare stikstof.
- Controleren op differentiatie met behulp van Lichtmicroscopie: cellen zullen lipiden accumuleren, bruin-geel in kleur en meer bolvormig in vorm.
8. metabole fenotyping
- Scanning elektronenmicroscopie
- Repareer monsters in 2,5% Glutaaraldehyde in de fosfaatbuffer van Sorensen bij 25 °C gedurende 12 h. postfix in 1% osmium tetroxide in de fosfaatbuffer van Sorensen bij 4 °C gedurende 1 uur.
- Monsters in ethanol. Was in hexamethyldisalizane en lucht-droog. Monteer dan op een Scanning elektronenmicroscopie stub met colloïdaal grafiet. Droog en sputter-Coat met goud.
- Leg beelden vast met een scanning elektronen microscoop.
- Olie rood-O kleuring
- Levend weefsel: olie rood-O-oplossing
- Zuig de media zorgvuldig op uit putten met een pipet. Spoel vervolgens monsters eenmaal met 500 μL 1x PBS per put.
- Fixeer monsters met 200 μL van 4% formaline in steriel gedeïoniseerd H2O bij 25 °c gedurende 15 min. aspirate formaline met een pipet, was de monsters tweemaal met 1x PBS (500 μL per wasbeurt).
- Voeg 200 μL 60% isopropanol monsters toe bij 25 °C gedurende 5 min. Aspirate 60% isopropanol met een pipet.
- Vlek monsters met olie rode-O-werkoplossing bij 25 °C gedurende 5 min. Aspirate olie rood-O met een pipet en spoel vervolgens samples 3x met 1x PBS (500 μL elke Wash). Dan beeld met een optische Microscoop.
- Vast weefsel: olie rood-O vlek Kit
- Flash-Freeze ECM-adipocyten monsters in optimale snijtemperatuur (OCT) compound en sectie (5 μm) op een cryostat.
- Plaats de glijbaan in 85% propyleenglycol in DI/H2o gedurende 2 min. plaats de glijbaan in Oro stain bij 60 °c gedurende 6 min. plaats steh lide in 85% propyleenglycol in di/h2o gedurende 1 min. Spoel de glijbaan tweemaal met di/h2o.
- Plaats de dia in gemodificeerde Mayer's Hematoxylin van Oil Red-O-kleuringsset gedurende 1 minuut. Spoel de glijbaan tweemaal met kraanwater. Spoel de glijbaan tweemaal met DI/H2O.
- Monteer de dekslip met behulp van een waterige montage medium en een afbeelding op een microscoop.
- RNA-extractie van ECM voor qrtPCR
Opmerking: om de RNA-opbrengst te maximaliseren, gebruikt u 500 mg ECM-fragmenten die zijn geseeerd met 3 x 105 preadipocyten in 100 μL en differentiëren zoals hierboven in 6-well-platen in 3 ml differentiatie media per put.- Eenmaal gedifferentieerd, breng elk afzonderlijk ecu-adipocyte monster over in een conische buis van 50 mL op ijs met behulp van steriele Tang.
- Was goed leeg met 500 μL buffer-RLT. Voeg buffer RLT toe aan 50 mL conische buis met bijpassende ECM-adipocyte monster.
- Met behulp van steriele schaar, fijngehakt elk ECM-adipocyte monster in de 50 mL conische buis, terwijl het vasthouden van de buis op ijs, het inbrengen van de schaar in de conische buis aan het weefsel gehakt.
- De conische buizen volledig bevriezen en ontdooien van-80 °C tot 37 °C 3x.
- Centrifugeer conische buizen bij 500 x g en 4 °c gedurende 10 minuten.
- Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gebruik voor RNA-extractie met een vezelig weefsel RNA extraction Kit (tabel van materialen).
- Levend weefsel: olie rood-O-oplossing
- Glucose opname test
- Differentiëren 6 x 104 preadipocyten in 100 mg ECM-fragmenten in 0,5 ml van het differentiatie medium in 24-put platen zoals hierboven beschreven (rubriek 5).
- Na 14 dagen van differentiatie, verwijder de medium en Wash ECM-adipocytes eenmaal met 1x PBS. Voeg 0,5 mL/well serum Starvation medium en cultuur toe bij 37 °C en 5% CO2 voor 12 uur.
- Verwijder medium en spoel de cellen tweemaal met 1x PBS. Voeg 0,5 mL/goed 2% BSA toe in PBS en cultuur bij 37 °C en 5% CO2 voor 2 uur.
- Spoel cellen één keer met 1x PBS, Voeg 0,5 mL/goed 1x PBS toe met of zonder 200 nM insuline en inincuberen bij 37 °C gedurende 40 min.
- Aspirate 1x PBS, toevoegen 0,5 mL/goed 1X PBS met 0,1 mM 2-deoxy-D-glucose, 2 μCi/mL deoxy-D-glucose, 2-[1, 2-3H (N)], met of zonder 200 nm insuline, en incuberen bij 37 °c en 5% Co2 voor 40 min. gebruik standaard voorzorgsmaatregelen voor het hanteren en verwijderen van alle radioactieve reagentia en afval, zoals voorgeschreven door de lokale regelgevende statuten.
- Verwijder medium met een pipet en spoel cellen 3x met 1x PBS. Voeg 420 μL 1% SDS-oplossing toe in DI/H2O en lyse-cellen met krachtige Pipetteer. Incuberen 25 °C gedurende 10 min.
- Verzamel 5 μL van elke put voor Bradford Protein assay. Breng 400 μL resterend cellysaat over in 2 mL scintillatievloeistof in een Scintillatie flacon. Count 3H-2dg activiteit op Scintillatie teller. Analyseer gegevens als tellingen per minuut genormaliseerd naar eiwitten, mg/mL.
- Lipolyse assay
- Differentiëren 6 x 104 preadipocyten in 100 mg ECM-fragmenten in 0,5 ml menselijk differentiatie medium in 24-put platen zoals hierboven beschreven (rubriek 5).
- Na 14 dagen van differentiatie, verwijder medium en was de cellen tweemaal met warm 1x PBS. Voeg 0,5 mL serum verhongering (zonder insuline) toe met of zonder 3 μM isoproterenol en kweek adipocytes bij 37 °C en 5% CO2 voor 72 h.
- Verzamel cultuur supernatants, die kunnen worden bewaard bij-80 °C tot het klaar is voor assay. Verzamel de ECM in microcentrifuge buizen voor DNA-kwantificering voor gegevens normalisatie.
- Pipet keer 2 μL van elk supernatant in een 96-well microplaat. Reserve putten voor blanco's (gedistilleerd H2O) en glycerol standaardoplossing voorzien in de triglyceride Bepalingskit.
- Voeg aan elke put 270 μL vrij glycerol-reagens toe van de triglyceride Bepalingsset, pipet om te mengen. Incuberen plaat bij 37 °C gedurende 5 min.
- Meet de extinctie bij 540 nm op een microplaat spectrofotometer.
- Bereken de concentratie van glycerol en Normaliseer met DNA van ECM:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bereiding van adipeus weefsel ECM, zaaien met preadipocytes, en in vitro differentiatie in volwassen adipocytes resulteren in duidelijke sequentiële morfologische veranderingen in weefsel die visuele beoordeling van de vooruitgang in het hele protocol mogelijk maakt (Figuur 1) . Preadipocyten die worden gebruikt om de ECM te zaaien, worden geïsoleerd met behulp van Collagenase-spijsvertering uit afzonderlijke BTW-monsters (Figuur 2). Scanning elektronenmicroscopie van ECM-adipocyten constructies in elk stadium van de verwerking onthult decellularisatie van ECM en daaropvolgende recapitulatie van lipide-bevattende adipocytes bij het opnieuw zaaien en differentiatie (Figuur 3). Collageen 1-specifieke Immunohistochemie van decellularized ECM onthult het onderhoud van collageen microarchitectuur, terwijl olie rood-O kleuring van levende en vaste/gesectioneerde 3D ECM-adipocyte constructies onthult lipide-bevattende adipocytes (Figuur 4 A). qrtpcr van adipocytes gedifferentieerd in ECM toont de gemarkeerde upregulatie van adipogene genen ten opzichte van ongedifferentieerde preadipocyten gekweekt in ECM (Figuur 4B). Metabole fenotyping van ECM-adipocyten constructies die alle combinaties van ECM en adipocyten van diabetische (DM) en niet-diabetische (NDM) proefpersonen bestuderen, onthult verminderde glucose opname en Lipolytische functie in ECM-adipocyten constructies van DM ten opzichte van NDM van DM-specifieke metabolische defecten die we eerder hebben gerapporteerd in humane adipocytes in standaard 2D-cultuur11. Belangrijker, NDM ECM redt insuline-gestimuleerd glucose opname en Lipolytische capaciteit in DM adipocytes (Figuur 4C)11. Samen tonen deze gegevens ziektespecifieke regulering van het cellulaire metabolisme van adipocyten door de ECM. Nadere bijzonderheden worden gerapporteerd in Baker et al.11.
Figuur 1: workflow voorbereiding van de ECM-adipocyten. Dag 1: hele viscerale vetweefsel monsters ondergaan drie vries-dooi cycli gevolgd door een nachtelijke incubatie met enzymatische digestie oplossing #1. Dag 2: na de spijsvertering met enzymatische oplossing #1, monsters worden 's nachts verteerd met enzymatische spijsvertering oplossing #2. Op dit punt worden monsters gedeeltelijk delipidated. Dag 3: na enzymatische spijsvertering #2, monsters ondergaan nachtelijke incubatie met polaire oplosmiddelextractie oplossing, die de delipidation zal voltooien. Na dag 3, monsters moeten volledig penitentiaire en wit/doorschijnend van kleur. Monsters worden grondig gewassen met spoelbufferoplossing vervolgens 70% ethanol en opgeslagen in de opslagoplossing in 40 °C tot klaar voor het opnieuw seeden met preadipocytes. Dag 4: Preadipocytes worden onderverdeeld in decellularized BTW, gevolgd door adipogenic differentiatie voor 14 dagen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: werkstroom voor isolatie van preadipocyten. BTW wordt fijngehakt, verteerd met collagenase, gefilterd, gecentrifugeerd, en de resulterende stromovasculaire cel pellet verguld en gekweekt om uit te breiden preadipocytes. Zie Baker et al. 201721 voor meer informatie over humane preadipocyten isolatie en 2D-adipocyten cultuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: scannen van elektronenmicroscopie beelden. Intact vetweefsel, decellularized vetweefsel, en decellularized vetweefsel herbevolkt met preadipocytes en gedifferentieerd in adipogenic media voor 14 dagen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: karakterisering van adipocytes in ECM. (A) decellularized VETWEEFSEL ECM onderhoudt microarchitectuur en ondersteunt adipocyte-differentiatie: Top: collageen 1 Immunohistochemie van volledige menselijke BTW voor en na decellularisatie waaruit het onderhoud van microarchitectuur Midden: 3D confocale photomicrografen van levende menselijke adipocytes binnen ECM; intact decellularized menselijke BTW gekleurd met olie rood-O voor het opnieuw zaaien met preadipocytes, 4 dagen na het zaaien, en 14 dagen na het zaaien met preadipocytes gevolgd door adipogene differentiatie; blauw: DAPI-kleuring van celkernen; rood: olie rood-O kleuring van intracellulaire lipide; bodem: Formalin-vast, paraffine-ingebed, 5 μm verdeeld, olie rood-O-gebeitst menselijke BTW voorafgaand aan decellularisatie, onmiddellijk na decellularisatie, en na decellularisatie, preadipocyten-zaaien, en 14 dagen van adipogenic differentiatie, aantonen van cytoplasmische lipide accumulatie in adipocytes binnen ECM. B) ADIPOCYTEN in ECM-upregulaat-adipogene genexpressie: qrtPCR-analyse met vergelijking van adipogene gentranscriptie niveaus in RNA van menselijke BTW-adipocyten gedifferentieerd in BTW-ECM gedurende 14 dagen ten opzichte van ongedifferentieerde preadipocytes in de BTW-ECM gekweekt voor 72 h in nonadipogenic media. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM. acly: ATP citraat lyase, atgl: vetweefsel triglyceriden lipase, fasn: vetzuur synthase, pparg: peroxisomale proliferatieve geactiveerde receptor gamma; ordinaat: Fold verschil in transcriptie niveau in volwassen adipocytes ten opzichte van ongedifferentieerde preadipocyte referent = 1; alle vouw verschillen significant (p < 0,001, gepaarde t-toets); ECM van 10 proefpersonen, preadipocyten/adipocytes van n = 11 personen. (C) ECM reguleert het adipocyten metabolisme op een DM-specifieke manier: 3D-ECM van DM-of NDM-proefpersonen die met preadipocyten van DM-of NDM-proefpersonen werden gesepeeerd, en onderzocht met metabole fenotypen. Gegevensbalken gelabeld met patiëntenbron (NDM, DM) van ECM en adipocytes (ECM/AD); NDM/NDM betekent bijvoorbeeld zowel ECM als preadipocyten afgeleid van NDM-patiënten, terwijl NDM/DM de ECM van NDM-patiënten in combinatie met preadipocyten van DM-patiënten aanduidt. Gegevens zijn gemiddeld ± SEM. ordinaten: glucose opname (CPM), genormaliseerd naar ECM/cel lysaat eiwitconcentratie (mg/mL); lipolyse: Cultuur supernatant glycerol concentratie (mg/ml) genormaliseerd naar ECM/Cell lysaat DNA-concentratie (ng/ml); * p < 0.050, * * p < 0.100 vergelijking van de aangegeven gegevens-punt naar corresponderende gegevens-punt (basale of insuline-gestimuleerd voor glucose opname, basale of isoproterenol-gestimuleerd voor lipolyse) in DM/DM-arm, met behulp van gemengde modelanalyse aanpassen voor herhaalde maatregelen ECM van n = 9 NDM, 8 DM-proefpersonen, preadipocyten van 10 NDM, 9 DM-proefpersonen voor glucose opname; ECM van 6 NDM, 6 DM-proefpersonen, preadipocyten van 6 NDM, 6 DM-proefpersonen voor lipolyse. Dit cijfer is aangepast van O'Rourke en Lumeng11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ECM-adipocyte cultuur model biedt een waardevol hulpmiddel voor het ontleden van de individuele rollen van ECM en cellen in het dicteren van Ultimate tissue fenotype. Het ECM-isolatie protocol is vrij reproduceerbaar, maar de variabiliteit in het decellularisatie proces kan worden waargenomen. De dag 3 delipidation stap is een cruciaal punt in het protocol. Bij de voltooiing van de nachtelijke extractie, moet delipidatie van de matrix worden aangetoond door de polaire oplosmiddel oplossing geel te worden, terwijl de matrix moet overgaan van een geel-oranje kleur karakteristiek van intact vetweefsel tot doorschijnend/ wit (Figuur 1). Als deze kleurwijzigingen niet worden doorgevoerd, is delipidation waarschijnlijk niet voltooid. De variabiliteit van de Inter-patiënt in de efficiëntie van delipidation is gebruikelijk, maar tot op heden hebben we geen correlatie waargenomen van de efficiëntie van delipidatie met onderwerp DM-status, leeftijd, BMI of andere klinische variabelen. Grote monsters (groter dan 20 g) zullen geen efficiënte delipidatie ondergaan; het verwerken van monsters < 20 g kan dit probleem voorkomen. Als een monster na dag 3 niet volledig penitentiaire wordt, verdeel het monster dan in tweeën met een steriele schaar, breng vervolgens monsters over naar verse 15-20 ml polaire oplosmiddelextractie oplossing en plaats op een rondschudapparaat voor 3-5 uur. Sommige monsters kunnen niet volledig decellularize na het herhalen van de polaire oplosmiddelextractie stap. Als een meerderheid van het monster decellularized is, is het mogelijk om de secties met lipide te knippen voordat u het monster in experimenten gebruikt.
Verontreiniging kan optreden als de steriliteit gedurende het hele proces niet ijverig wordt gehandhaafd. Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroom afzuigkap met behulp van standaard celkweek voorzorgsmaatregelen. We bewaren ECM doorgaans tot 3 maanden bij 4 °C en preadipocyten tot 6 maanden in vloeibare stikstof. Behoud van biofunctionaliteit en ziekte-en depot-specifieke eigenschappen na deze tijd is niet getest.
Confocale microscopie maakt visualisatie van rijpe adipocytes binnen de ECM mogelijk, die kan worden versterkt met olie rode-O-kleuring. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) biedt ook een niet-kwantitatieve methode voor het visualiseren van adipocytes binnen ECM. Van Note, SEM en Oil Red-O kleuring suggereren uniloculaire adipocytes in de ECM-adipocyte constructies, een morfologie die vergelijkbaar is met in vivo adipocytes en in tegenstelling tot de typische meerhokkige adipocyten waargenomen wanneer preadipocyten adipogenic ondergaan differentiatie op 2D-kunststof (Figuur 3, Figuur 4A). Deze observatie suggereert dat de ECM een meer fysiologisch klimaat biedt voor adipogene differentiatie dan standaard weefselkweek op plastic. Fixatie en snijden van ECM-adipocyt constructies kan moeilijk zijn, omdat de OCT-embedded constructies kwetsbaar zijn en niet gemakkelijk sectie. Het snijden van ingesloten weefsels direct na het verwijderen uit de opslag van de-80 °C vriezer en het uitvoeren van snijden in een koude kamer (4 °C) op een voorgekoelde cryostaat maakt snijden mogelijk.
ECM-adipocyte cultuur biedt een fysiologisch klimaat dat de in vivo vetweefsel omgeving benadert en een duurzame omgeving biedt voor stamcel groei en-differentiatie van preadipocyten, zoals blijkt uit de opregulatie van adipogenic genen in 3D-ECM-adipocyte cultuur. ECM-adipocyte culturen ook deelnemen aan adipocyte metabole functies, met inbegrip van de opname van glucose en lipolyse8. We rapporteren de opname van glucose als CPM genormaliseerd tot ofwel totaal eiwit geëxtraheerd uit ECM-adipocyten culturen gemeten met een Bradford-test, of tot DNA-inhoud gemeten met een DNA-assay kit, en hebben vergelijkbare resultaten met beide methoden waargenomen. Evenzo, we rapporteren lipolyse als mg/mL van glycerol release genormaliseerd naar ofwel eiwitten of DNA, ook met vergelijkbare resultaten verkregen met beide normalisatie methode. Anderen suggereren normaliseren adipocyte metabole gegevens naar lipide-inhoud, maar tot op heden onze pogingen om betrouwbaar uittreksel lipide van ECM constructies is mislukt. Rapportage van glucose opname percentage als mol van glucose per eenheid van tijd en lipolyse als mol van glycerol/vrije vetzuren per eenheid van tijd kan toestaan meer accurate vergelijkingen tussen afzonderlijke experimenten. Isolatie van RNA van ECM voor qrtPCR-analyse wordt gekenmerkt door lagere opbrengsten in vergelijking met cellen in 2D-cultuur, maar de voorbereiding van grotere ECM-fragmenten die zijn geseerd met meer cellen overkomt dit probleem, zoals beschreven in stap 8.3.1. We hebben moeilijkheden ondervonden bij het isoleren van adequate hoeveelheden onaangetast eiwit met fosfoniteiten intact voor Western Blot-analyse, wat een beperking van het model vertegenwoordigt.
Vergelijkbare methodologie voor het isoleren van ECM van vetweefsel en zaaien met preadipocytes is eerder gepubliceerd, met aanwijzingen dat ECM adipogene differentiatie kan bevorderen afwezige klassieke adipogene bemiddel kers, waaronder cAMP agonisten, insuline en PPAR-γ-agonisten12,14. Onze gegevens is de eerste om aan te tonen ziektespecifieke regulering van cellulaire metabolisme door ECM in vetweefsel, met behulp van methoden waarin adipocytes worden gestimuleerd met klassieke adipogene differentiatie factoren11; vergelijkbare studies in de afwezigheid van adipogenic stimuli zijn een doelwit van toekomstig onderzoek. Andere hebben een vergelijkbare ziektespecifieke Overspraak van de ECM-cel aangetoond met behulp van ECM en cellen die geïsoleerd zijn uit longweefsel19,20. Er zijn ook alternatieve strategieën toegepast, waaronder het maken van matrices door het mengen van gehomogeniseerde vetweefsel ECM-preparaten in peptide hydrogels12.
Terwijl Inter-patiënt variabiliteit in humaan adipocyten cellulaire metabolisme wordt waargenomen in zowel 2D-kunststof en 3D-ECM-cultuur, wanneer geanalyseerd in geaggregeerde, deze cellen manifesteren ziekte-, depot-en geslacht-specifieke verschillen in cellulaire metabolisme, zoals beschreven door onze groep en anderen11,21,22,23,24, valideren van het nut en de generalizability van deze cultuur modellen voor de studie van adipocyte cellulaire metabolisme. We hebben aangetoond dat adipocytes gedifferentieerd in op ziekte afgestemde ECM (d.w.z. NDM-adipocyten in NDM ECM, DM adipocytes in DM ECM) metabolische fenotypes van geïsoleerde NDM en DM adipocyten in standaard 2D-cultuur recapituleren, waarbij de ECM-adipocyten cultuur wordt ondersteund als een model voor het bestuderen van ziektespecifieke veranderingen in het cellulaire metabolisme van adipocyten in een meer fysiologisch milieu. We hebben geen verschillen waargenomen in de omvang of richting van metabole functies, waaronder de opname van glucose of lipolyse, wanneer ECM en adipocytes van dezelfde of verschillende donoren worden bestudeerd. In beide gevallen maakt ECM-adipocyten manifest DM-specifiek metabolisch fenotype (bv. verlaagde GU in DM/DM ten opzichte van NDM/NDM-constructies), zonder duidelijk verschil bij het vergelijken van constructies bestaande uit ECM en adipocytes van dezelfde of verschillende donoren .
ECM-adipocyte cultuur maakt studie van combinaties van ECM en preadipocyten uit verschillende patiëntenpopulaties en weefsel depots mogelijk, waardoor analyse van ziekte-en depot-specifieke bijdragen van ECM en adipocytes aan Ultimate vetweefsel metabole Fenotype. We hebben aangetoond dat de ECM van het NDM-weefsel de capaciteit heeft om metabole defecten in DM-adipocyten te redden (Figuur 4C)11om deze kracht van het kweek model van de ECM-adipocyte te demonstreren. Voorlopige gegevens in muriene viscerale en subcutane vetweefsel suggereren dat Murine ECM het metabolisme van Murine adipocyten op dezelfde wijze regelt in een depot-specifieke manier (ongepubliceerde gegevens, O'Rourke RW, 2019), wat suggereert dat dit modelsysteem kan worden gebruikt voor het bestuderen van ECM-adipocyten overspraak in zowel Murine als menselijke systemen. Bovendien maakt dit model het mogelijk om geïsoleerde manipulatie van ECM te bestuderen als middel om het fenotype van vetweefsel te reguleren. Voor studie van ECM behandeld in omstandigheden die glycation induceren die specifiek gericht is op de ECM, bijvoorbeeld suggereren dat deze wijzigingen het cellulaire metabole fenotype van cellen die vervolgens in de behandelde ECM zijn opgenomen, reguleren (niet-gepubliceerde gegevens, O'Rourke RW, 2019), een model voor studie van de effecten van gerichte manipulatie van de ECM op het fenotype van adipocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.
Acknowledgments
We danken Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa en Retha Geiss voor hulp bij studie coördinatie. SEM werd uitgevoerd door de Universiteit van Michigan microscopie & beeldanalyse laboratorium biomedisch onderzoek kern faciliteit. Dit project werd gesteund door NIH grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans affaires Merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot en haalbaarheids subsidie van het Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veteranen Administratie VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektronenmicroscopie uitgevoerd door de Universiteit van Michigan microscopie & beeldanalyse laboratorium biomedisch onderzoek kern faciliteit. Figuur 4 van dit manuscript werd oorspronkelijk gepubliceerd in Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1; 102 (3), 1032-1043. DOI: 10.1210/JC. 2016-2915, en is gereproduceerd met toestemming van Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Voor toestemming om dit materiaal te hergebruiken, gaat u naar http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M.
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
