Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von hochfrequenter Ultraschall-Bildgebung zur Messung von Luminaldurchmesser, Pulsausbreitungsgeschwindigkeit, Distensibilität und radialer Belastung an einem Mausmodell des abdominalen Aortenaneurysmus.
Abstract
Ein abdominales Aortenaneurysm (AAA) ist definiert als eine lokalisierte Dilatation der Bauchaorta, die den maximalen intraluminalen Durchmesser (MILD) um das 1,5-fache seiner ursprünglichen Größe überschreitet. Klinische und experimentelle Studien haben gezeigt, dass kleine Aneurysmen brechen können, während eine Subpopulation großer Aneurysmen stabil bleiben kann. So kann neben der Messung des intraluminalen Durchmessers der Aorta die Kenntnis der strukturellen Merkmale der Gefäßwand wichtige Informationen liefern, um die Stabilität der AAA zu beurteilen. Aortenversteifung hat sich vor kurzem als zuverlässiges Werkzeug zur Bestimmung früher Veränderungen in der Gefäßwand herauskristallisiert. Pulsausbreitungsgeschwindigkeit (PPV) zusammen mit der Distensibilität und radialen Dehnung sind sehr nützliche Ultraschall-basierte Methoden, die für die Beurteilung der Aortensteifigkeit relevant sind. Der Hauptzweck dieses Protokolls ist es, eine umfassende Technik für den Einsatz von Ultraschall-Bildgebungssystem zur Erfassung von Bildern und Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Aorta, wie durch MILD, PPV, Distensivität und radiale Dehnung bestimmt bieten.
Introduction
Ein abdominales Aortenaneurysm (AAA) stellt eine signifikante Herz-Kreislauf-Erkrankung dar, die durch eine permanente lokalisierte Dilatation der Aorta gekennzeichnet ist, die den ursprünglichen Gefäßdurchmesser um 1,5 mal1überschreitet. AAA gehört zu den 13 häufigsten Todesursachen in den Vereinigten Staaten2. Das Fortschreiten von AAA wird auf die Degeneration der Aortenwand und DerElastinfragmentierung zurückgeführt, was letztlich zu einem Aortenbruch führt. Diese Veränderungen in der Aortenwand können ohne signifikante Erhöhung des maximalen intraluminalen Durchmessers (MILD) auftreten, was darauf hindeutet, dass MILD allein nicht ausreicht, um die Schwere der Krankheit vorherzusagen3. Daher müssen zusätzliche Faktoren identifiziert werden, um erste Veränderungen in der Aortenwand zu erkennen, die zu frühen Behandlungsmöglichkeiten führen können. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen praktischen Leitfaden zur Beurteilung der aortenfunktionellen Eigenschaften mittels Ultraschallbildgebung zu liefern, die durch Messungen der Pulsausbreitungsgeschwindigkeit (PPV), Distensibilität und radialen Dehnung gekennzeichnet ist.
Ein gut charakterisiertes experimentelles Modell zur Untersuchung von AAA, das zuerst von Daugherty und Kollegen beschrieben wurde, beinhaltet eine subkutane Infusion von Angiotensin II (AngII) über osmotische Pumpen in Apoe-/- Mäuse4. Die präzise Messung von MILD mittels Ultraschallbildgebung war entscheidend für die Charakterisierung von AAA in diesem Mausmodell5. Obwohl histologische Veränderungen während der Entwicklung von AAA ausgiebig untersucht wurden, sind Veränderungen der funktionellen Eigenschaften der Gefäßwand wie Aortensteifigkeit nicht gut charakterisiert. Dieses Protokoll betont den Einsatz von Hochfrequenz-Ultraschall in Kombination mit den ausgeklügelten Analysen als leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung der zeitlichen Progression von AAA. Insbesondere ermöglichen uns diese Ansätze, die funktionellen Eigenschaften der Gefäßwand zu bewerten, gemessen durch PPV, Distensivität und radiale Dehnung.
Jüngste klinische Studien an Humanpatienten mit AAA sowie im murinen Elastase-induzierten AAA-Modell deuten auf eine positive Korrelation zwischen Aortensteifigkeit und Aortendurchmesser6,7hin. PPV, ein Indikator für Aortensteifigkeit, wird als hervorragende Messung zur Quantifizierung von Steifigkeitsänderungen in der Gefäßwand6,8akzeptiert. PPV wird berechnet, indem die Transitzeit der Pulswellenform an zwei Stellen entlang der Vaskulatur gemessen wird, wodurch eine regionale Beurteilung der Aortensteifigkeit erfolgt. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass erhöhte Aortensteifigkeit, gemessen durch PPV, und auf zellulärer Ebene, wie durch Atomkraftmikroskopie bestimmt, positiv mit der Aneurysmaentwicklungkorreliert 9. Darüber hinaus legt die Literatur nahe, dass aortenhafte Steifigkeit der aneurysmalen Dilatation vorausgehen kann und somit nützliche Informationen über regionale intrinsische Eigenschaften der Gefäßwand während der Entwicklung von AAA10liefern kann. In ähnlicher Weise sind Distensivitäts- und Dehnungsmessungen die Quantifizierungswerkzeuge, um frühere Veränderungen der arteriellen Fitness zu messen. Gesunde Arterien sind flexibel und elastisch, während bei erhöhter Steifigkeit und weniger Elastizität die Distensibilität und Belastung verringert wird. Hier bieten wir einen praktischen Leitfaden und Schritt für Schritt Protokoll für den Einsatz eines hochfrequenten Ultraschallsystems zur Messung von MILD, PPV, Distensivität und radialer Dehnung bei Mäusen. Das Protokoll enthält technische Ansätze, die in Verbindung mit den grundlegenden Informationen verwendet werden sollten, die in Handbüchern für spezifische Ultraschall-Bildgebungsinstrumente und dem dazugehörigen Video-Tutorial bereitgestellt werden. Wichtig ist, dass das beschriebene Bildgebungsprotokoll in unseren Händen reproduzierbare und genaue Daten liefert, die bei der Untersuchung der Entwicklung und des Fortschreitens experimenteller AAA wertvoll erscheinen.
Um den Nutzen der Ultraschall-Bildgebung weiter zu demonstrieren, stellen wir Beispielbilder und Messungen aus eigenen Studien zur Verwendung pharmakologischer Ansätze zur Verhinderung experimenteller AAA11zur Verfügung. Insbesondere wurde vorgeschlagen, Kerbsignalisierung in mehreren Aspekten der Gefäßentwicklung und Entzündung12beteiligt werden . Mit Gen-Haploinsuffizienz und pharmakologischen Ansätzen haben wir zuvor gezeigt, dass Notch-Hemmung die Entwicklung von AAA bei Mäusen reduziert, indem die Infiltration von Makrophagen an der Stelle der Gefäßverletzung13,14,15verhindert wird. Für den aktuellen Artikel konzentrieren wir uns mit dem pharmakologischen Ansatz für Notch-Hemmung auf die Beziehung zwischen Aortensteifigkeit und Faktoren im Zusammenhang mit AAA. Diese Studien zeigen, dass Notch-Hemmung die Aortensteifigkeit reduziert, was ein Maß für aAA Progression11ist.
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Protocol
Das Protokoll für den Umgang mit Mäusen und Ultraschall-Bildgebung wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Missouri (Tierprotokoll Nummer 8799) genehmigt und nach AAALAC International durchgeführt.
1. Ausrüstungsaufbau und Vorbereitung von Mäusen
- Ausrüstungsaufbau
- Schalten Sie das Ultraschallgerät, den Ultraschall-Gelwärmer und das Heizkissen ein.
- Öffnen Sie das Ultraschallprogramm und geben Sie den Studiennamen und die beschreibenden Informationen für jede Maus ein.
- Wählen Sie die Anwendung als General Imagingaus.
- Wählen Sie den geeigneten Messumformer für die Bauchbildgebung (Abbildung 1B,C). In diesem Experiment wird der MS400-Wandler verwendet.
- Stellen Sie sicher, dass der Anästhesie-Isofluran- und Sauerstoffgehalt für jede Versuchssitzung ausreichend ist.
- Reinigen Sie die Ultraschall-Tierbildplattform.
- Mausvorbereitung
- Legen Sie den Mauskäfig auf ein Heizkissen (36,5 bis 38,5 °C).
- Halten Sie die Maus vorsichtig an der Schwanzbasis und legen Sie sie in die sauerstoffgefüllte Isoflurankammer.
- Richten Sie den Isofluran- und Sauerstofffluss in die Induktionskammer.
- Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer ein und stellen Sie den Isofluran-Spiegel auf 1-2% Vol.-V/Vol. Schalten Sie den Sauerstofftankdruck auf 1-2 L/min ein.
- Nach 2 min bestätigen Sie die ausreichende Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen von Entzugsreflexen beim Kneifen des Fußpolsters der Maus.
- Als nächstes schalten Sie den Induktionskammerversorgungszweig aus und schalten Sie den zweig, der auf den Anästhesie-Nasenkegel gerichtet ist.
- Übertragen Sie die Maus aus der Induktionskammer auf das Ultraschall-Bildgebungsstadium und positionieren Sie den Anästhesiekegel über der Nase des Tieres.
- Neigen Sie die Tierbildplattform um 10° in die untere rechte Ecke für ein optimales Scannen (Abbildung 1B).
- Legen Sie einen Tropfen steriler ophthalmologischer Lösung in beide Augen von Mäusen, um eine Trocknung unter Anästhesie zu verhindern.
- Positionieren Sie die Maus in der Supine-Position mit der Nase in den Anästhesiekegel eingesetzt.
- Tragen Sie das Elektrodengel auf alle vier Pfoten mit einem Wattestäbchen auf und kleben Sie die Pfoten auf die Kupferleitungen auf der Tierbildplattform für Elektrokardiogrammmessungen (Abbildung 1C).
- Verwenden Sie Clippers, um Haare an der Bildstelle zu rasieren und dann Enthaarungscreme auftragen, um das verbleibende Fell zu entfernen. Weniger als 1 min.
- Wischen Sie die Creme und das Haar vorsichtig mit einem feuchten Papiertuch ab.
- Überwachen Sie die Atmung und stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz zwischen 450-550 Schlägen/min gehalten wird. Wenn unter diesem Niveau, reduzieren Sie den Isofluran-Fluss und warten, bis sich die Herzfrequenz erholt.
- Vorgewärmtes Ultraschallgel (37 °C) auf die vorbereitete Hautstelle auftragen und den Messumformer an seinem Halter und tiefer befestigen, bis er das Gel berührt (Abbildung 1C).
2. Ultraschall-Bildgebung der Bauchaorta
- Positionieren Sie den Messumformer horizontal (d. h. senkrecht zur Mittellinie der Maus).
- Glätten Sie das Ultraschallgel und entfernen Sie Blasen mit dem Holzstab eines Wattestäbchens.
- Senken Sie den Messumformer und legen Sie 0,5 - 1 cm unter das Zwerchfell, nachdem Sie das Gel berührt haben. Nun beginnen Sie, die Bilder zu beobachten.
- Visualisieren Sie die Bauchaorta in der kurzen Achsenansicht (Abbildung 1C).
HINWEIS: Der B-Modus ist der standard- und effektivste Modus, um die Aorta anatomisch zu lokalisieren und den Messumformer zu positionieren. Die Abdominal-Aorta wird durch das Vorhandensein von pulsatile Mließströmung mit Farbdoppler und Power Doppler Modi in der kurzen Achse (d.h. der umfanglendiale Querschnitt der Aorta) identifiziert. Passen Sie die Mikromanipulatoren auf der Tierbühne und den Wandler an, um den Querschnitt der Aorta in die Bildmitte zu bringen. - Drehen Sie den Messumformer vorsichtig um 90° im Uhrzeigersinn, und stellen Sie den x-Achsen-Mikromanipulatorknopf langsam ein, um die Aorta in der langen Achsenansicht (Längsschnitt der Aorta) zu visualisieren.
HINWEIS: In vielen Fällen können Magen-Darm-Gase das Bild stören, oder die Aorta ist möglicherweise nicht im optimalen Winkel, um eine klare lange Achsenansicht zu ermöglichen. Passen Sie den Winkel des Messumformers langsam und horizontal an, bis eine akzeptable Lange-Achsen-Ansicht erhalten ist. Wenn weiterhin Probleme auftreten, heben Sie den Messumformer, überprüfen Sie luftblasen unter dem Messumformer, passen Sie den Neigungswinkel der Tierstufe leicht an, tragen Sie Gele erneut auf, und wiederholen Sie alle Schritte erneut. - Legen Sie die Fokuszone und -tiefe im Bereich der Aorta mithilfe der Umschalter Fokuszone bzw. Fokustiefe fest. Passen Sie den Zeitgewinnkompensationsregler manuell an, um das Lumen der Aorta zu verdunkeln, um einen optimalen Kontrast der Aortawand zu erzielen.
- Passen Sie den y-Achsenmanipulator an, um die Verzweigungspunkte der überlegenen mesenterischen und der rechten Nierenarterien zu visualisieren. Verwenden Sie die rechte Nierenarterie als Landmark, um das Bild der suprarenalen Aorta zu erfassen (Abbildung 2A).
- Zeichnen Sie mindestens 100 Bilder mit B-Modus auf der suprarenalen Aorta auf.
- Drücken Sie cinestore, um die B-Modus-Bilder zu speichern.
- Drücken Sie die M-Modus-Taste auf der Instrumententastatur, um die M-Modus-Aufnahme zu aktivieren. Rollen Sie den Cursorball, um die gelbe Indikatorlinie zu einem normalen Aorta-Abschnitt mit klarem Gefäßwandbild zu bringen, oder zu den Abschnitten, in denen der maximale Durchmesser des Aneurysmus beobachtet wird.
- Drücken Sie den SV/Gate-Umschalter und passen Sie den Cursorball an, um sicherzustellen, dass Gefäßwände in der Messhalterung enthalten sind. Drücken Sie das Update, um M-Modus-Messungen aufzuzeichnen, und drücken Sie cinestore, um sie zu erfassen (Abbildung 2A,B).
HINWEIS: Der maximale Durchmesser des Aneurysmus befindet sich möglicherweise nicht in derselben Bildebene wie die optimale Lange-Achsen-Ansicht der Aorta. Passen Sie den x-Achsen-Manipulatorknopf für jede M-Modus-Messung leicht an, um sicherzustellen, dass die MILD jedes Abschnitts erfasst wird. - Um EKG-Gated Kilohertz Visualization (EKV) Bilder zu erhalten, drücken Sie die B-Modus-Taste, um zur B-Modus-Aufnahme zurückzukehren.
HINWEIS: Wenn die Bilder nicht scharf sind, passen Sie den x-Achsenmanipulator an, um das schärfste Bild der oberen Wand des Lumens über eine Schnittlänge (d. h. > 6 mm) zu erhalten. - Drücken Sie die Taste Physio-Einstellungen auf der Tastatur und wählen Sie Atemschutz-Gating. Passen Sie die Gating-Verzögerung und das Fenster manuell an, um die Daten nur während der flacheren Teile der Atmungswelle aufzuzeichnen. Die Aufnahmeabschnitte werden als farbige Blöcke auf der Rückverfolgung der Atmungswelle angezeigt.
HINWEIS: Ohne die Einstellung des Atmungs-Gatings werden die EKV-Bilder aufgrund der normalen Bewegung des Tieres während der Atmung verwischt. - Drücken Sie die EKV-Taste, um den EKV-Modus zu aktivieren. Wählen Sie im entsprechenden Menü Standardauflösung und Bildrate 3000 oder höheraus. Wählen Sie fortfahren, um EKV-Bilderaufzuzeichnen. Drücken Sie cinestore, um die Bilder zu speichern. Verwenden Sie das EKV-Modusbild, um Messungen der Pulsausbreitungsgeschwindigkeit (PPV), der Distensibilität und der radialen Dehnung zu erhalten.
HINWEIS: EKV-Aufzeichnung kann fehlschlagen, wenn es ungewöhnliche Schwankungen in der Atmung, Tier ist zu schnell atmen, oder Bildraten Einstellungen sind zu hoch. Legen Sie in diesem Fall die Bildrate niedriger fest und warten Sie, bis sich die Atmung des Tieres stabilisiert. Die Einstellung der Bildrate auf 3000 ist in der Regel sowohl für Mäuse als auch für Ratten geeignet.
3. Post-Imaging-Schritte
- Wischen Sie das Ultraschallgel vorsichtig aus dem Bauchbereich der Maus mit einem mit warmem Wasser befeuchteten Papiertuch ab.
- Legen Sie die Maus wieder in ihren Hauskäfig auf einem Heizkissen.
- Schalten Sie die Isofluran-Maschine aus, reinigen Sie die Tierbildplattform und den Wandler mit feuchten Tüchern.
- Übertragen Sie die während des Ultraschallscans gesammelten Bilddaten auf die Festplatte.
- Schalten Sie das Ultraschallgerät aus.
- Nachdem sich die Maus von der Anästhesie erholt hat und wachsam ist, entfernen Sie das Heizkissen und geben Sie den Käfig an das Tierhausregal zurück.
4. Analyse von Abdominalaortenbildern
- Analyse von M-Modus-Bildern zur Messung von MILD
- Öffnen Sie das Ultraschallprogramm und geben Sie den Studiennamen und die beschreibenden Informationen für jede Maus ein.
- Öffnen Sie die Ultraschalldaten in der Analysesoftware, öffnen Sie das M-Modus-Bild und halten Sie den Herzschlag an.
- Klicken Sie auf Messungen.
- Wählen Sie das Gefäßpaket aus den Dropdown-Optionen aus. Klicken Sie auf Tiefe und zeichnen Sie eine Linie über das Aortenlumen, das sich von Innenwand zu Wand erstreckt (Abbildung 2C,D).
HINWEIS: Aus Gründen der Konsistenz sollten die Messungen in der systolischen Phase des Herzzyklus durchgeführt werden, wenn die Aorta maximal erweitert wird. Zeichnen Sie drei Linien über drei verschiedene Herzschläge, um genaue und durchschnittliche Messungen von MILD zu erhalten. In AAA werden die Messungen bei der maximalen Dilatation der Aorta durchgeführt. Es ist auch ratsam, die Tiere 4-6 h vor dem Sammeln von Bildern zu fasten, um Interferenzen durch Darmbewegung zu vermeiden und Bildklarheit zu gewährleisten.
- Analyse der Pulsausbreitungsgeschwindigkeit (PPV)
- Öffnen Sie das EKV-Bild, und halten Sie den Takt an.
- Öffnen Sie ein neues Fenster der Analysesoftware (z.B. Vevo Vac), indem Sie auf das Namenssymbol klicken.
- Klicken Sie auf die PPV-Option (Pfeil in Abbildung 3D). Ein kleines Fenster wird weiter mit dem Bild der Aorta erscheinen.
- Zeichnen Sie einen rechteckigen Kasten, indem Sie auf die obere Gefäßwand klicken und den Zeiger für etwa 4 mm ziehen, der beide Wände der suprarenalen Aorta bedeckt.
HINWEIS: Halten Sie die Länge der Box konsistent (ca. 4 mm) für alle Bilder. Der Benutzer kann den rechteckigen Kasten anpassen, indem er sich dreht, um die Box auszurichten, und die Linie auswählt und dann an eine neue Position auf dem analysierten Gefäß zieht, um die am besten geeignete und klare Beugung der Pulswelle zu erhalten. Die vertikalen Datenlinien aus dem Rechteck werden als linkes (oberes Bild) und Rechts (unteres Bild) auf dem ROI angezeigt und identifiziert. Für eine bessere Visualisierung der Beugung der Pulswelle ist es manchmal nützlich, die Zugbox nur an der oberen Wand zu verwenden, wie in Abbildung 3dargestellt. Die Software berechnet automatisch die PPV (m/s). Es ist jedoch immer besser, die violetten Linien manuell anzupassen, um den genauen Biegepunkt auf den Pulswellen einzustellen und PPV wird sich entsprechend ändern. - Wählen Sie schließlich den Befehl Akzeptieren aus, um die PPV-Werte zu speichern. Exportieren Sie die Zahlen und die Daten auf das Datenspeicherlaufwerk.
- Analyse auf Distensivität und radiale Dehnung
- Öffnen Sie das EKV-Bild, und halten Sie den Takt an.
- Klicken Sie auf das Software-Symbol. Die Software öffnet ein neues Fenster.
- Klicken Sie auf den neuen ROI der Spur und zeichnen Sie einen rechteckigen Kasten an den beiden Wänden des Schiffes. Die Software verfolgt automatisch die oberen und unteren Wände des Schiffes. Der Benutzer kann die Spurart anpassen, um sie an der Wand auszurichten, indem er auf grüne Punkte klickt (Abbildung 4A,B).
- Akzeptieren Sie nun die Ablaufverfolgung. Die Software berechnet die Distensibilität (1/Mpa) im ausgewählten ROI.
- Wählen Sie für die radiale Dehnungsmessung die entsprechende Dehnungsoption aus den Menüleisten oben links aus. Die Bilder für radiale Dehnung und tangentiale Dehnung werden geöffnet.
- Erhalten Sie den Wert für radiale Dehnung (%) durch Bewegen des Cursors auf der Spitze der Kurve. Exportieren Sie die Daten als Bilder oder im Videoformat (Abbildung 4A,B).
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Representative Results
Repräsentative M-Modus-Bilder der normalen und aneurysmalen Bauchaorta von Mäusen sind in Abbildung 2A bzw. Abbildung 2Bdargestellt. Die suprarenale Bauchaorta wird durch ihre Lage neben der rechten Nierenarterie und der überlegenen mesenterischen Arterie identifiziert (Abbildung 2A). Repräsentative Bilder, die für die Berechnung von MILD verwendet werden, bei drei verschiedenen Herzschlägen des systolischen Herzzyklus, in normalen und aneurysmalen Aorten sind in Abbildung 2C,D bzw. dargestellt. In der Situation, in der sich ein Aortenaneurysm entwickelt hat, wird der Luminaldurchmesser durch Zeichnen einer senkrechten gelben Linie zwischen den beiden inneren Rändern des Lumens im Bereich der maximalen Dilatation bestimmt (Abbildung 2B). Drei unabhängige Messungen werden in der Regel gemittelt, um einen genauen intraluminalen Durchmesser zu bestimmen.
Repräsentative EKV-Bilder der bei der Analyse von PPV verwendeten Bauchaorta sind in Abbildung 3dargestellt. PPV wird berechnet, indem ein rechteckiger Kasten auf der luminalen Wand der suprarenalen Aorta (Abbildung 3E) gezeichnet und die violetten vertikalen Datenlinien aus dem rechteckigen Kasten angepasst werden (Abbildung 3F). Die violetten Linien sollten angepasst werden, um den Biegepunkt der Pulswellen einzustellen. Repräsentative EKV-Bilder der Bauchaorta, die für die Analyse der Distensibilität und radialen Dehnungen geeignet sind, sind in Abbildung 4dargestellt. Distensibilität und radiale Dehnung werden berechnet, indem die luminalen Wände der suprarenalen Aorta nachverfolgt werden, wie in Abbildung 4Edargestellt. Der Wert für Distensibilität (1/MPa) wird durch Auswahl der Distensibilitäts-/Elastizitätsoption aus dem Dropdown-Menü des Feldes ermittelt (roter Pfeil, Abbildung 4F). Die radiale Dehnung (%) wird erreicht, indem sie die Radialdehnungsoption (Abbildung 4G) wählen und den Cursor an den Höhepunkt des radialen Dehnungsdiagramms bewegen (Abbildung 4H).
Wir haben die Bedeutung von PPV im AngII-induzierten Mausmodell von AAA validiert und das therapeutische Potenzial eines Kerbinhibitors weiter untersucht (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-(S)-phenylglycine t-Butylester; DAPT) über die Progression und Stabilität der vorab festgelegten AAA. Insbesondere wurden alle diese Aneurysmstudien an 8-10 Wochen alten Apoe-/- männlichen Mäusen nach Infusion von AngII durch veröffentlichte Protokolle4,13durchgeführt. Am 28. Tag der AngII-Infusion wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt und bis zum Opfer an Tag 5613fahrzeug- oder DAPT (10 mg/kg) verabreicht. Die transabdominale Ultraschall-Bildgebung zeigte eine fortschreitende Zunahme der MILD, PPV, und eine Abnahme der Distensivität und radialen Belastung als Reaktion auf AngII an Tag 28 (Abbildung 5A-E). AngII-Infusion leicht erhöht MILD von Tag 28 bis 56 und DAPT nicht signifikant ändern MILD im Vergleich zu AngII allein (Abbildung 5A und Abbildung 5B). Jedoch, PPV stieg schrittweise mit AngII-Infusion von Tag 28 bis Tag 56 und DAPT deutlich verringerte weitere Anstiege in PPV an Tag 56 (Abbildung 5C). Distensibilität und radiale Dehnungen, Parameter zur Beurteilung der Elastizität der Gefäßwand wurden mit AngII-Infusion verringert, während DAPT keine signifikante Wirkung zeigte (Abbildung 5D und 5E). Es ist wichtig zu verstehen, dass PWV stark mit MILD an Tag 28 korrelierte (R2=0,51, Abbildung 5F), während die Korrelation an Tag 56 relativ schwach war (R2=0,22) (Abbildung 5G). Die Aortensteifigkeit in AAA ist in erster Linie mit Änderungen in der Aortenwandarchitektur verbunden. Histologisch erhöhte die AngII-Infusion den Kollagenabbau und die proteolytische Aktivität in der medialen Schicht der Aorta (Abbildung 5H, obere Reihe). Die DAPT-Behandlung minimierte solche Veränderungen im ECM-Abbau (Abbildung 5H, untere Reihe).
Abbildung 1: Einrichtung des Instruments. (A) Gesamtansicht der Ultraschallmaschine zusammen mit Induktionskammer für Anästhesie und Gelwärmer. (B) Nahansicht der Bildgebungsplattform und des Messumformersystems. (C) Die Ansicht der Wandlerplatzierung während der Aufnahme kurzes Achsenbild der Bauchaorta. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Analyse von M-Modus-Bildern zur Erlangung des maximalen intraluminalen Durchmessers (MILD). Gezeigt werden die M-Modus-Bilder von normaler Aorta (A) und Aorta mit abdominalem Aortenaneurysm (B) von Mäusen. (C) und (D), MILD gezeichnet in der systolischen Phase des Herzzyklus in der suprarenalen Aorta von normalen Mäusen (C) und Mäusen mit AAA (D). Die Messungen an drei verschiedenen Herzschlägen werden wie gezeigt durchgeführt und der Durchschnittswert berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Analyse von EKV-Bildern zur Erzielung der Pulsausbreitungsgeschwindigkeit (PPV). EKV-Bilder aus normaler Mausaorta. Die Analyse erfolgt durch Anklicken von Messungen (A) und dem Softwaresymbol (B). Ein neues Fenster wird mit den Symbolen auf der rechten Seite angezeigt, wie in Cgezeigt. Klicken Sie nun auf PPV (D) und wieder erscheint ein kleines Fenster (E). Zeichnen Sie einen rechteckigen Kasten auf die obere Wand des Lumens, wie in E gezeigt, und klicken Sie auf Akzeptieren. Der PPV-Wert wird wie in F (Pfeil) dargestellt erhalten. Die violetten Linien werden angepasst, um den Biegepunkt der Pulswellen (G) einzustellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Messung der Distensibilität und radialen Dehnung. EKV-Bilder aus normaler Mausaorta. Die Analyse erfolgt durch Anklicken von Messungen (A) und dem Softwaresymbol (B). Ein neues Fenster wird mit den Symbolen auf der rechten Seite angezeigt, wie in Cgezeigt. Klicken Sie nun auf neue ROI (D) verfolgen , ein neues Fenster mit Spuren auf der oberen und unteren Wand des Lumens, wie in E gezeigt und klicken Sie auf Akzeptieren. Der Wert für distensibility wird in der Tabelle als Anzeige in der Ferhalten. Für Dehnung, klicken Sie auf Stamm (G). Das Fenster zeigt den radialen Dehnungswert (%, grün hervorgehobenes Feld), wenn der Cursor auf der Spitze des radialen Dehnungsdiagramms (H) platziert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: PPV korreliert mit strukturellen Merkmalen von Aorta in der etablierten AAA. (A) Repräsentative transabdominale Ultraschallbilder, die die MILD an Tag 0, 28, 42 und 56 der angegebenen Versuchsgruppen bei Apoe-/- Mäusen zeigen. DAPT wurde am 28. Tag gestartet. Gepunktete gelbe Linien umreißen das Lumen. (B) Quantifizierung von MILD in den angegebenen Gruppen (lila und grüne Farbe zeigt AngII + Fahrzeug und AngII + DAPT behandelte Mäuse (n=16-18). (C, D und E) PPV, Distensivität und radiale Dehnung an verschiedenen Tagen der AngII- und DAPT-Behandlungen (n=8). (F und G), Graphen, die Pearsons Korrelation zwischen PPV und MILD an Tag 28 (F) und Tag 56 (G) zeigen. (H) Repräsentative histologische Bilder für Kollagenfärbung (mit Trichrom gefärbt und als blaue Färbung gesehen) und proteolytische Aktivität durch In-situ-Zymographie mit oder ohne DAPT-Behandlung an Tag 56. Für die Datenanalyse wurde ein Tukey-Test für mehrfache Vergleiche verwendet. *P<0.05; ns = nicht signifikant. Skala 50 'm in H. Diese Zahl ist angepasst von Sharma et al. (2019), Scientifc Reports (SREP-19-16491B)11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Ultraschall-Bildgebung bietet eine leistungsstarke Technik zur Bestimmung der funktionellen Eigenschaften der Aorta durch Messungen von PPV, Distensivität und radialer Dehnung. Diese Messungen sind besonders lehrreich für die Untersuchung von Mausmodellen von AAA und der In-vivo-Ansatz ermöglicht die Sammlung von Längsdaten, die potenziell wichtig sind, um die zeitliche Entwicklung der Aortenpathologie zu verstehen. Insbesondere werden Messungen der In-vivo-Aortensteifigkeit lokal in der Bauchaorta durch PPV, Distensivität und radiale Dehnung durch DieAnalyse von EKV-Daten bestimmt und gelten als unabhängiger Risikofaktor für AAA-Instabilität16. Die in diesen Protokollen beschriebenen Techniken sind relativ geradlinig und brauchen nur 8-10 min, um Bildsätze von einer Maus zu erhalten. Alle Bilder sollten vorzugsweise von einem einzigen Bediener mit genau definierten und konsistenten Landmarken gesammelt werden, um reproduzierbare und präzise Daten zu generieren.
Es gibt potenzielle Faktoren, die technisches Know-how für die Anwendungen dieser Tools erfordern. Zum Beispiel kann PPV nicht nur den Grad der AAA-Entwicklung in der lokalen Arterienwand widerspiegeln, da es sich um ein indirektes Maß für die regionale arterielle Steifigkeit handelt. Zweitens kann es schwierig sein, PPV genau zu messen, wenn die Intimwand beschädigt ist. Drittens kann es schwierig sein, scharfe Auflösungsbilder ohne Know-how im Betrieb des Instruments zu erhalten. Einige dieser Bedenken wurden in den letzten Versionen von Ultraschall-Bildgebungssystemen angesprochen, bei denen Fleckengeräusche und Artefakte reduziert werden, während gleichzeitig die Datenerfassung für Kleintierstudien erhalten und verbessert wird.
Der Schwerpunkt der in der Vergangenheit eingesetzten Techniken (Doppler, Mikroangiographie, Magnetresonanztomographie) zur Bestimmung der Aortensteifigkeit beschränkte sich auf zweidimensionale Bilder. PPV, das aus der Ultraschall-Bildgebung berechnet wird, hat sich als zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Bestimmung der Aortensteifigkeit entwickelt und scheint unabhängig vom Arteriendruck9,17zu sein. Es ist wichtig zu beachten, dass die vorherrschende Definition von AAA unter Verwendung des maximalen Durchmessers als Standardindex nicht immer zuverlässig mit klinischen Beobachtungen korreliert. Zum Beispiel können kleine Aneurysmen brechen, während einige große Aneurysmen in der Regel stabil bleiben18,19,20. Aortenversteifung ist eine frühe Veränderung, die Aortenwandspannung erzeugt, die aneurysmales Wachstum auslöst, undUmgestaltung 10 und wurde stark mit Mmp2 und Mmp9 in Mausmodellen von AAA10korreliert. So können neben dem Durchmesser der Aorta funktionelle Analysen wichtige Informationen liefern, um das Fortschreiten und die Stabilität von AAA zu beurteilen.
Mit diesen Protokollen haben wir das therapeutische Potenzial eines potenten pharmakologischen Kerbinhibitors (2S-N-[(3,5-Difluorphenyl) Acetyl]-L-Alanyl-2-phenylglycin1,1-dimethylethylester untersucht; DAPT) über die Progression und Stabilität von vorab etablierten AAA mit einem AngII-induzierten Mausmodell von AAA11. Die transabdominale Ultraschall-Bildgebung zeigte eine fortschreitende Zunahme der MILD, PWV, und eine Abnahme der Distensivität und radialen Belastung in der Apoe-/- Mäuse als Reaktion auf AngII als Kontrollen an Tag 28. Über Tag 28 bis Tag 56 wurde kein weiterer Anstieg der MILD beobachtet (Abbildung 5). Allerdings stieg ppV schrittweise und war an Tag 56 deutlich höher als an Tag 28. Mit der Hemmung der Notch-Signalisierung durch DAPT unterschieden sich MILD-Mäuse nicht signifikant von AngII allein an Tag 56. Interessanterweise verhinderte DAPT einen weiteren Anstieg der PPV, so dass sie an Tag 56 deutlich niedriger als AngII war (Abbildung 5C). Die DAPT-Behandlung hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Distensibilität oder die radiale Dehnung (Abbildung 5D,E). Interessanterweise korrelierte PPV stark mit MILD an Tag 28 (R2=0,51), während an Tag 56 die Korrelation relativ schwach war (R2=0,22; Abbildung 5F). Diese Veränderungen der Aortensteifigkeit spiegelten sich in der erhöhten Kollagendegradation und proteolytischen Aktivität mit AngII und der Dämpfung durch DAPT wider (Abbildung 5H). Diese Beispielstudie zeigt den potenziellen Wert von Ultraschall-basierten Aortensteifigkeitsmessen beim Verständnis des Zeitverlaufs und der Vorhersehbarkeit sowohl der AAA-Progression als auch der Stabilität auf.
Darüber hinaus erscheint der Ultraschall-basierte Ansatz wertvoll für die Bewertung der potenziellen Rolle für pharmakologische Interventionen, insbesondere in Phasen, die wahrscheinlich unabhängig von Veränderungen des intraluminalen Durchmessers sind (d. h. über die Erwartungen an die tatsächlichen Regression). Zusammenfassend wird ein detailliertes Verständnis und die Anwendung einer solchen Technologie bei der Bewertung der Prognose von AAA in einem frühen Stadium der Krankheit für wirksame therapeutische Interventionen von Nutzen sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von R01HL124155 (CPH) und Der Enzbaudesit des Forschungsinstituts der University of Missouri an CPH unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma | A9525 | |
| Apoe-/- mice | The Jackon lab |  |
|
| Clippers | WAHL | 1854 | |
| Cotton swab | Q-tips | ||
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| Depilatory cream | Nair | LL9038 | |
| Electrode cream | Sigma | 17-05 | |
| Gel warmer | Thermasonic (Parker) | 82-03 (LED) | |
| Heating pad | Stryker | T/pump professional | |
| Isoflurane | VetOne | Fluriso TM | |
| Isoflurane vaporizer | Visualsonics | VS4244 | |
| Lubricating ophthalmic ointment | Lacri-lube | ||
| Osmotic pumps | Alzet | Model 2004 | |
| Oxygen tank | Air gas | ||
| Tranducer | Visualsonics | MS-400 or MS550D | |
| Ultrasonic gel | Parker | Aquasonic clear | |
| Ultrasound Imaging System | Visualsonics | Vevo 2100 | |
| Vevo Vasc Software | Visualsonics |
References
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