Summary
Serbestçe yüzen japon balığının beyninden hücre dışı sinir selülasyon sinyallerini kaydetmek için yeni bir kablosuz teknik sunulmuştur. Kayıt cihazı iki tetrode, bir mikrosürücü, bir sinirsel veri kaydedici ve su geçirmez bir kasaoluşur. Veri kaydedicisi ve bağlayıcısı dışında tüm parçalar özel olarak üretilir.
Abstract
Balıkların davranışlarını yöneten sinirsel mekanizmalar çoğunlukla bilinmemekle birlikte, balıklar tüm omurgalıların çoğunluğunu oluşturur. Serbestçe hareket eden balıklardan beyin aktivitesini kaydetme yeteneği, balık davranışlarının sinirsel temelinde araştırmayı oldukça ilerletecektir. Ayrıca, beyindeki kayıt yerinin kesin kontrolü balık beynindeki bölgeler arasında eşgüdümlü nöral aktiviteyi incelemek için çok önemlidir. Burada, kayıt yerinin derinliğini kontrol ederken serbestçe yüzen balıkların beyninden kablosuz olarak kaydeden bir teknik salıyoruz. Sistem mikrosürücü kontrollü tetrodes tarafından kayıt konumunu ayarlayabilirsiniz yeni bir su uyumlu implant ile ilişkili bir nöral logger dayanmaktadır. Sistemin yetenekleri japon balığı nın telensefalon kayıtları ile gösterilmiştir.
Introduction
Balık omurgalıların en büyük ve en çeşitli grubudur ve diğer omurgalılar gibi gezinme, sosyalleşme, uyku, avcılık gibi karmaşık bilişsel yetenekler sergilerler. Bununla birlikte, balık davranışlarını yöneten sinirsel mekanizmalar çoğunlukla bilinmemektedir.
Son birkaç on yıl içinde, hareketsiz balıkların hücre dışı kayıtları öncelikle davranış1,2sinirsel temelfarklı yönlerini araştırmak için uygulanmıştır. Bu teknik bazı duyu sistemleri için uygun olsa da, hareketsiz hayvanlarda imkansız olmasa da, davranışın nöral temelinin tüm spektrumunun araştırılması zordur. İlk gelişmeler bağlı yüzme balıkMauthnerhücrelerinden kayıt dahil 3,4. Ancak, Mauthner hücreleri orantısız büyük ve kaydedilen eylem potansiyeli genlikleri, hangi birkaç mV kadar yüksek gidebilirsiniz, kayıt kolaylaştırmak. Daha sonra, Canfield ve ark. balık telencephalon kaydetmek için bir tethered hayvan kullanırken kavram bir kanıtı açıklanan5. Balıkn nöral aktiviteyi kaydetmek için bir diğer yeni teknik kalsiyum görüntülemedir (Orger ve de Polavieja6ve Vanwalleghem ve ark.7tarafından yapılan yorumlara bakınız). Bu teknik zebra balığı larvaları ile kullanılmak üzere geliştirilmiştir çünkü larva evresinde deri ve kafatası saydamdır. Ancak, bu teknik geliştirmenin sonraki aşamalarında karmaşık davranışları incelemek için kullanılamaz.
Burada, serbestçe yüzen balıkların beyinlerinden hücre dışı nöral aktiviteyi kaydetmek için yeni bir teknik sıyoruz. Bu, Vinepinsky ve ark.8'deaçıklanan protokolün değiştirilmiş bir sürümüdür. Ana yenilik mümkün ameliyat sonrası elektrotların konumunu kontrol etmek için kılan bir mikrosürücü eklenmesidir. Bu teknik, bir mikrosürücü aracılığıyla nöral veri kaydedicisine bağlanan bir dizi tetrode kullanarak japon balıklarının telensefalonundan kayıt için tasarlanmıştır. Tüm kurulum kablosuz ve balığın kafatasına bağlı. Sistemin özgül ağırlığı, balığın serbestçe yüzmesini sağlayan küçük bir şamandıra ekleyerek suya özgü ağırlığa eşitlenir.
Teknik, sinyali bir dahili bellek aygıtında yükselten, sayısallaştıran ve depolayan bir nöral veri kaydedicisinin kullanımına dayanır. Logger telemetri sistemi başlatmak ve kayıtları durdurmak için kullanılır ve video kamera ile senkronizasyon için. Bu protokolde, mikrosürücü ile birlikte su geçirmez bir kutuya gömülü 16 kanallı nöral logger kullanılır.
Mikrosürücü montajı iki ana bileşenden imal edilmiştir: mikrosürücünün kendisi ve mikrosürücü gövdesi(Şekil 1A,B). Gövde mikrosürücü ve tetrodes tutar ve aynı zamanda kafatası ve logger kutusu arasında çapa olarak hareket eder (Şekil 1C). PVC logger kutusu bir makine işlemi kullanılarak imal edilir ve bir O-halkası kullanılarak mühürlenir(Şekil 1E-G, ayrıca bkz. Ek Şekil 1, Ek Şekil 2, ve Üç boyutlu [3D] diyagramı için Ek Şekil 3). Bir ucunda, implantın ağırlığını dengelemek ve balıklara yüzdürme-nötr bir implant sağlamak için bir parça polistiren köpük logger kutusuna eklenir. Protokolde tanımlanan mikrosürücünün yapımı, Vandecasteele ve ark.9 tarafından sunulan prosedürü, mikrosürücüyü gövdeye takmak için yapılan bir değişiklikle takip eder(Şekil 1A). Tüm önemli adımlar sunulur.
Balık kafatasının hazırlanması için protokolde tanımlanan prosedür Vinepinsky ve ark.8'de sunulana benzer ve protokolde kısaca anlatılmaktadır. Ameliyattan bir gün sonra, balıklar normalde anestezinin etkilerinden tamamen kurtulur lar ve davranışsal deneylere hazırdırlar. Tetrode yerinin microdrive vidasının çevirilerek ayarlanabildiği unutulmamalıdır. Vida tam dönüş başına 300 μm'lik bir aralıktadır ve hedef beyin konumuna ulaşıncaya kadar 75 μm ilerleme önerilir. İlgi çekici belirli beyin bölgesini hedeflemek için uygun bir beyin atlasına danışılmalıdır. Bu balık pil veya bellek kartı değişimi için anestezi her zaman elektrot empedansı test etmek için tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm cerrahi prosedürler, hayvan refahı ile ilgili yerel etik komiteler tarafından onaylanmalıdır (örn. IACUC).
1. Microdrive Konut İnşaatı
- Gövdeyi oluşturmak için, testere kullanarak 19 mm x 29 mm x 1 mm plakaya 1 mm genişliğinde pirinç plaka kesin. Kenarına dik uzun kenarların her birinde iki adet 5,5 mm yarık kesin, böylece her yarık dar kenarlardan 6,5 mm uzaktadır(Şekil 2A).
- Pliers kullanarak, uzun kenarları nda kisitler arasındaki alanı içe doğru katlayın, sonra gövde elde etmek için alt kısmı içe ve üst tarafı dışa doğru katlayın(Şekil 2B,C).
- 3 mm'lik matkap ucu kullanarak, mikrosürücü gövdesindeki vidalar için delikler edin.
NOT: Bu delikler daha sonra gövdeyi logger kutusuna takmak için kullanılacaktır (Şekil 2D). - Konutun yanlarında lehim.
- İnce dairesel bir dosya kullanarak, gövdenin alt kısmında küçük, 1,5 mm yarıçap, yarım daire yarık(Şekil 2E)oluşturur.
NOT: Bu daha sonra elektrotlar kılavuzu için paslanmaz çelik tüp eklemek için kullanılacaktır. - Tetrodes(Şekil 2F)için gövde arkasında bir delik yapmak için 1 mm matkap ucu kullanın.
NOT: Konut bir 3D modeli Ek konut.stl dosyasındabulunur.
2. Microdrive İnşaat
- Bir kesici kullanarak, tek bir satır erkek pin üstbilgi şeritten üç iğneli bir parça yıkmak(Şekil 1H). Eğeriler kullanarak, orta pimi çekin.
- Bir kesici kullanarak, kalan pimleri 10 mm uzunluğa (vida uzunluğundan 2 mm daha az) kesin. Başka bir olasılık daha uzun bir vida kullanmaktır (bkz. adım 2.4).
- Orta pim deliğinden #65 bir matkap ucu kullanarak bir delik aç. 00−99 musluğu kullanarak bir iplik delin.
- Mikro sürücüyü ve pirinç plakaları (7,5 mm x 2,5 mm x 0,6 mm, bkz. Ek Şekil 4)pirinç plakalar iğnelere dokunuyor. Bir vida (#00-90 yuvarlak kafa, 12 mm, pirinç) ilk pirinç plaka ile, sonra pin başlık iplik ve ikinci pirinç plaka ile takın. Son olarak, vida üzerine bir somun yerleştirin ve yavaşça monte microdrive sıkın.
- Pirinç plakalar ile birlikte pimleri lehim ve vida ucu ile somun.
- Lehim mikrosürücü muhafaza içine microdrive dört noktada microdrive pirinç plakalar tarafında.
- Keskin uçlardan kaçınmak için bir paslanmaz çelik boruyu 6 mm uzunluğunda, iç çapı 1,5 mm olan bir paslanmaz çelik boruyu ve 3 mm uzunluğunda, iç çapı 1,2 mm. Olan tüplerin uçlarını parlat.
- Epoksi kullanarak mikrosürücü gövdesinin altındaki küçük yarım daire yarıkiçin 6 mm uzunluğundaki tüpü yapıştırın. 3 mm uzunluğundaki paslanmaz çeliği pim başlığına yapıştırın, gövdeüzerinde 6 mm uzunluğunda tüple sıralayın.
- 0,64 mm çapında iki 5 cm uzunluğunda silikon tüp segmenti ve 0,250 mm çapında bir 5 cm uzunluğunda poliimid tüp kesin.
- İki paslanmaz çelik boruiçine üç tüp takın. Tüpleri, siyanoakrilat tutkal kullanarak pim başlığına bağlı paslanmaz çelik boruya yapıştırın. Mikro sürücüyü tamamen yukarı vidalayın ve iki çelik tüpün üst ve alt kısmından fazla boruyu kesin.
NOT: Gövdeli mikrosürücü kullanıma hazırdır (Şekil 1C).
3. Tetrode Dizisinin Hazırlanması
- Her tetrod üzerinde dört elektrot içeren iki tetrode bir implant imal etmek için, her biri 12 cm uzunluğunda, Formvar yalıtımlı, 25 μm çapındaki tungsten telden sekiz tel hazırlayın.
NOT: Aynı tasarım dört tetrode barındırabilir. - Mikroskop altında 16 kanallı elektrot arayüz kartı (EIB-16) PCB (Bkz. Malzeme Tablosu)için bir tutucu yerleştirin.
- Yumuşak uçlu bir cızırtı ve çakmak kullanarak, bir taraftaki sekiz telin her birinin kaplamasını alev kullanarak çıkarın.
NOT: Bu, kablonun daha sonra PCB konektörüne düzgün bir şekilde bağlandığından emin olmak içindir. - EIB-16'daki deliklerden birine bir tel itin ve deliği kapladı. Bir iğne yerleştirin ve pliers kullanarak basın. Pim ile telin kaplamasız tarafı arasındaki direnci ölçerek bağlantıyı kontrol edin.
NOT: Direniş onlarca Ohm'un emrinde. - Adım 3.4'ün tüm sekiz kablosuyla tekrarlayın.
- Her telin ucundaki koli bandı kullanarak dört telden oluşan iki grubu bantlayın.
NOT: Her grup daha sonra bir tetrode oluşturmak için birbirine yapıştırılır. - 50 μm çapında 12 cm uzunluğunda tungsten tel bir parça kesin. EIB-16 bağlantılarından birine bağlayın.
NOT: Bu tel referans elektrodu olarak hizmet verecek. - Kayıt kaydedici için zemin olarak hizmet verecek bir 75 μm çapında 12 cm uzunluğunda iki çıplak gümüş teller kesin. EIB-16'daki yer bağlantısına iki kablole.
- EIB-16'yı motorlu bir tornalama cihazının üzerinde tutun ve dört kablodan oluşan bir grubun koli bandı ucunu motorlu alet cihazına yerleştirin. Saat yönünde 130 mermi uygulayın ve ardından 20 saat yönünün tersine dönüşler uygulayın. Tetrode kapsayacak şekilde siyanoakrilat tutkal uygulayın.
- Yapıştırıcının tedavi etmesini bekle. Tetrode'u koli bandına yakın kesin.
- İkinci tetrode 3.9 ve 3.10 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Bu bitmiş iki-tetrode dizi üretir (Şekil 1D).
4. İmplantın Montajı
- Mikro sürücüyü tamamen aşağı yasla.
- 1 x 3M Phillips yuvarlak kafa vidaları kullanarak EIB-16'yı PVC plakaya takın.
- Yumuşak uçlu cımbızları kullanarak, tüm tetrode'ları ve telleri logger kutusunun kapağının önündeki delikten çekin.
- 2 x 6M Phillips düz kafa vidalarını kullanarak PVC plakayı logger kutusu kapağına takın. EIB-16 konektörünü doğru yönlendirmede tutun, böylece kaydedici EIB-16'ya monte edilebilir. Kaydedilen sinyaldeki hareket yapıtlarını önlemek için EIB-16'nın yerinde sabit olduğundan emin olun.
- Epoksi kullanarak telleri kutuya kapatın. Birincil sızdırmazlık daha sonra oda sıcaklığında vulkanizasyon (RTV) tarafından yapılacaktır, çünkü mümkün olduğunca az uygulayın.
- 2 mm vida kullanarak mikrosürücü gövdesini logger kutusu kapağına takın.
- Tetrode'ları ve tüm telleri mikrosürücü gövdesinin arka yerindeki delikten geçirin. Tetrode'ları mikrosürücüdeki iki silikon tüpten geçirin. Mikrosürücüdeki poliimid tüpten 50 μm tungsten teli geçirin.
- Hareket mikrosürücü ile tutarlı olduğundan emin olmak için, tüplerin üst ucuna siyanoakrilat tutkal uygulayarak tüplere tetrodes ve teller tutkal. Mikro sürücüyü en üste kadar vidala.
- Hareketi önlemek için mikrosürücü gövdesiiçindeki açıkta kalan tetrode ve tellere yumuşak petrol (Bkz. Malzeme Tablosu)uygulayın.
- Isıtmalı jilet kullanarak 12 mm x 14,5 mm Petri kabının alt pencerelerini kesin. Epoksi ile mikrosürücü gövdesinin önüne pencereyi takın. Yer kablolarını pencerenin dışında tut.
- Logger kutusu kapağı ve microdrive muhafaza arasında maruz tetrodes ve tellerE RTV kaplama uygulayın.
- RTV tedavi edildikten sonra, içinde küçük bir ağırlık ile kutuyu kapatın ve kutuya su sızıntısı olmadığından emin olmak için bir gecede suya batırın.
- Keskin makas kullanarak tetrodes ve referans tel istenilen uzunlukta kesin.
- İşaretli ekstrüde polistiren köpüğü kutuya takın (Bkz. Malzemeler Tablosu). Bir su banyosuna batırıldığında yüzdürme sinin dengelenmesi için boyutunu ayarlayın.
- Tetrode uçlarını platin siyah çözeltiye batırın ve elektrotları kaplamak ve elektrotların empedansını istediğiniz gibi ayarlamak için doğru akım (-0,2 μA) kullanın. Kaplama ve empedans ölçümleri için çok elektrotlu empedans test eden (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
NOT: Japon balığı pallium, 40 kOhm bir değer en iyisidir. Uygulamaya bağlı olarak, elektrot empedansı platin siyah kaplama değiştirilerek ayarlanabilir10,11.
5. Anestezi Hazırlama — %1 MS-222 Stok Çözeltisi
DİkKAT: Anestezi hazırlığı toz MS-222, bir karsinojen kullanımını içerir. Bu nedenle, adımlar 5.2 ve 5.3 eldiven kullanılarak kimyasal bir başlık yapılmalıdır.
- 100 mL'den fazla su içerebilen bir tüpe 100 mL su ekleyin.
- Kimyasal bir başlık, bir ölçekte tek kullanımlık bir ağırlık plakası yerleştirin. Bir spatula kullanarak MS-222 toz 1 g ekleyin, sonra tüp için toz ekleyin.
- Tüpü iyice sallayın.
NOT: Sıvı formda, MS-222 eldiven giyen kimyasal başlık dışında kullanılabilir ama bir maske gerektirmez. - Tek kullanımlık bir ağırlık plakası bir ölçekte yerleştirin. Bir spatula kullanarak sodyum bikarbonat 2 g ekleyin, sonra tüp e toz ekleyin. Tüpü iyice sallayın.
6. Balık Kafatası Hazırlama
NOT: Bu aşamada, balık implant cerrahisi için hazırdır. Ameliyattan önce, tüm bileşenlerin ve malzemelerin uygun prosedürlerle sterilize edildiğinden emin olun. Bu adım için, su u şeklinde balık tutucu bir dışarı gereklidir. Bu protokolde, kuyruk uzun japon balığı kuyruk 15 cm baş uyan bir alüminyum tutucu kullanılır. Bu sistem, solungaçları oksijenli suyla perfüzyonyaparken balığı sudan uzak tutar. Ayrıntılar için Bkz. Vinepinsky ve ark.8.
- Balık uyuyana kadar 20 dakika boyunca% 0.02 MS-222 su banyosu balık yerleştirin.
- Steril eldivenler kullanarak, balığı sudan çıkarıp tutucuya yerleştirin.
NOT: Balığı perfüzyon oksijenli su% 0.02 konsantrasyonda MS-222 içerir, böylece balık ameliyat sırasında anestezi kalır. - Steril bir spatula kullanarak, 10 dakika için ameliyat için belirlenen yerin üzerinde deriüzerinde lidokain% 5 macun uygulayın, sonra lidokain kaldırın.
NOT: Belirli beyin bölgesini hedeflemek için uygun bir beyin atlasına danışın. - Steril 15 bıçak neşter kullanarak, implant bölgesinde kafatası üzerinde deri kaldırın.
- 0,7 mm matkap uçları ile bir diş matkap kullanarak, kafatasında 4 delik delin. Her deliğe 1 mm'lik bir vida (3 mm uzunluğunda) yerleştirin ve vidayı takmadan önce deliklere siyanoakrilat tutkalını uygulayın.
- Bir diş yanık kullanarak, vidalar ve maruz kafatası nın çevre üzerinde diş çimentosu uygulayın.
- Diş matkabı nı kullanarak, kafatasında beyin bölgesinin üzerinde 5 mm çapında bir delik aç. Kafatası ve beyin arasındaki yağ dokusunu çıkarın ve ince cımbız ve yumuşak doku kağıt kullanarak beyin bölgesi hedef ortaya çıkarmak. Kafatasının altındaki büyük kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin.
NOT: Bu aşamanın sonunda, balık sonda implant için hazırlanmıştır. Burada yalnızca bu protokole özgü ana adımlar açıklanmıştır. Çeşitli ameliyat sonrası prosedürler (örneğin, hayvanın sağlığı ve ameliyat araçlarının ve alanının sterilizasyonu hakkında ayrıntılı belgeler) balık veya küçük hayvanlarla yapılan tüm ameliyatlar için geçerli olduğu için sunulmaz ve tartışılır.
7. Probun İmplantı
NOT: Protokolün son basamanı tamamlamak için, beyne yerleştirilirken implantı yerinde tutabilen bir manipülatöre ihtiyaç vardır.
- Balık beynine doğru işaret tetrodes ile logger kutusu kapağı tutmak için manipülatör kullanın.
- Referans elektrodu bükün ki, tetrodelar beyne indirildiğinde, referans beynin dışında kalır.
- Kafatasına sığacak şekilde kes. İsteğe bağlı olarak, bir zemin telini kafatası vidalarından birine bağlayın.
- Mikrosürücü gövdesinin alt kısmı kafatasına yakınken elektrotlar beyne sokulacak şekilde implantı düşürün.
- Gövde ve en yakın kafatası vidası arasında diş çimentosu küçük bir miktar uygulayarak kafatası implant takmaya başlayın.
- Diş çimentosu ilk bölümü tedavi edildikten sonra, diş çimentosu uygulayın ve kafatası ve tüm maruz kafatası üzerinde delik kapatın.
NOT: Genellikle diş çimentouygulamaları birkaç tur tüm maruz kafatası kapsayacak şekilde gereklidir. - Logger'ı ve pili kutuya töşekilde kurun ve kutuyu tüm vidalarla kapatın.
- Deneylerde kullanılan balık türüne göre antibiyotik ve lokal ağrı kesici uygulayın.
- Balık uyanmaya başlayana kadar balığın solungaçlarını tatlı suyla yıkayın. Balığı tutucudan çıkarın ve kendi tankına geri yerleştirin.
NOT: Balık ameliyattan 60 dakika sonra tamamen iyileşir. - Balığın implantla serbestçe yüzep gelebildiğinden emin olun(Şekil 3, Ek Video 1). Gerekirse, balık kolayca dengeleyebilir şekilde logger kutusunun üzerinde ekstrüde polistiren köpük boyutunu yeniden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir kayıt oturumu sırasında japon balığı, telensefalonundaki sinirsel aktivite kaydedilirken, kare su tankında serbestçe yüzdü. Bu deneylerin amacı, tek hücrelerin nöral aktivitesinin balığın davranışını nasıl belirlediğini incelemekti. Bunu yapmak için, spiking etkinliği kaydedilen verilerde tanımlanması gerekiyordu. Beyin aktivitesi kaydedilirken 31.250 Hz'de sayısallaştırıldı ve yüksek geçiş 300 Hz'de veri kaydedici tarafından filtrelendi. Daha sonra, çevrimdışı, sinyallere bant geçiş filtresi (300−5.000 Hz) uygulandı ve presorted ham veriler her tetrode kanalları ve referans kanalına ayrıldı(Şekil 4A). Daha sonra, tek hücreli etkinliği karakterize etmek için12 yaygın başak sıralama algoritmaları kullanılmıştır. İlk olarak, her kanal en az başak genliği eşiği (her kanalın gürültü düzeylerine göre) tarafından el ile filtrelendi. Daha sonra, tetrodes 'ipuçları aynı sitede değildir ve referans elektrot beyin dışında olduğu için, birden fazla tetrode veya referans kanalında ortaya çıkan sivri de filtre edildi. Filtreuygulanmış veriler daha sonra şekil, uzunluk, ani artış aralığı (sonraki eylem potansiyelleri arasındaki süre nöronların refrakter dönemine uygun olmalıdır) ve temel bileşen analizi (PCA) tarafından el ile kümelenmiş ve filtrelenmiştir. Tek hücreli kümeleme ve çoklu üniteve gürültü kümelerine örnekler Şekil 4'teverilmiştir.
Şekil 1: İmplant montajı. (A) Microdrive, bir iğne başlık, pirinç plakalar ve bir vida yapılmış. (B) Microdrive muhafaza, katlanır tek bir pirinç plaka yapılmış. (C) Microdrive (A) ve gövde(B)ile yapılan microdrive montaj. (D) Tetrode dizisi EIB-16, iki tetrode, bir referans elektrodu ve konektöre bağlı zeminler kullanılarak yapılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu). (E) ve (F) Mikrosürücü implant montajı su geçirmez logger kutusu kapağına bağlanır. Tetrode montaj konektörü kutunun içinde yer alır ve tetrodes mikrosürücüye yapıştırılmış. (G) Logger ve pilin bulunduğu logger kutusu tabanı. Tabanın etrafındaki O halkası sızdırmazlık için kullanılır. (H) Tek sıra lı erkek iğne başlıkları şerit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Microdrive konut katlama tekniği. (A) 1 mm genişliğinde pirinç plaka ile başlayın ve dört yarık yapın. (B) Yan tarafın orta kısmını içe doğru katlayın. (C) Üst kısmı geriye, alt kısmı içe doğru katlayın. (D) Üst kısmında üç adet 3 mm delik delin. (E) Alt kısımda 1 mm yarım daire kazın. (F) Üst tarafın ortasında 1 mm delik aç. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Serbestçe davranan bir japon balığından kayıt. (A)Tetrodes balık beynine yerleştirilir ve montaj balığın kafatasına bağlanır. (B) Kutu içinde logger ile mühürlü. (C-E) Ameliyattan sonra montajla özgürce yüzen bir balık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsili sonuçlar. (A) Ameliyattan 24 saat sonra serbestçe yüzen bir balıktan 0,5 s uzunluğunda kayıt. Sinyal bant geçiş filtresi (300−10.000 Hz) kullanılarak filtrelenir. Referans elektrotta hareket yapıtlarının eksikliğini gösteren yüksek genlikli bir gürültü yoktur. İkinci tetrode (yeşil kanallar) eylem potansiyeli yoktur. İlk elektrot verileri kahverengi kanallarda gösterilir. Mavi ve kırmızı yıldızlar, sırasıyla B ve C panellerinde gösterilen mavi ve kırmızı kümelerden gelen ani artışları gösterir. (B) Tek nöronların iki farklı kümelerinin başak şekilleri, tetrode 1'den kaydedilmiştir. (C) Eşiği geçen tüm başak adaylarının ilk tetrode gelen verilerin ilk üç temel bileşenleri üzerinde projeksiyon. Mavi ve kırmızı kümeler, b. Gri nokta panelindeki mavi ve kırmızı başak şekillerine karşılık gelir ve nöral gürültüyü veya çok birimli etkinliği temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: Yüzme desenleri: japon balığı örneği implantasyon ameliyatından bir gün önce (solda) ve bir gün sonra (sağda). Video, balık cerrahi tarafından engel olmadığını gösteren benzer yüzme desenleri gösterir. Video hızı x1.8'dir. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Ek Şekil 1: Logger kutusu ana haznesinin diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Logger kutusu kapağının diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: EIB-16 oda örtüsünün diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 4: Mikrosürücü için kullanılan pirinç plakanın diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Konut Diyagramı. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, serbestçe yüzen japon balığının telensefalonuna bir tetrode dizisi nin yer leştirilmesindeki adımları ayrıntılarıyla anlatır. Bu teknik, beyindeki tetrode pozisyonunu ayarlayabilen bir mikrosürücü ile birlikte 16 kanaldan elde edilen sinyalleri yükselten ve kaydeden bir sinir kaydedici uygular. Mikrosürücü, kaydı optimize etmek için beyindeki pozisyonu ayarlamayı mümkün kılar.
Bu protokol kolayca diğer beyin bölgelerinden kayıt için değiştirilebilir (benzer bir teknik kullanarak optik tectum kayıtiçin Vinepinsky ve ark 8 bakınız) veya başka bir su hayvanı 15 cm uzunluğunda veya daha büyük (yaklaşık kuyruk bir japon balığı baş eşit, ~ 100 gram ağırlık). Buna ek olarak, protokol, suya nüfuz edebilen bir frekansta iletişim kurduğu sürece herhangi bir veri kaydedicisiyle çalışacak şekilde değiştirilebilir. Burada kullanılan kaydedici 900 MHz radyo frekansı kullanarak iletişim kurar ve yaklaşık 20 cm su ile iletişim kurabilir. 2,4 GHz'lik bir radyo frekansı da ~15 cm tatlı su ile nüfuz edebilir. Düşük frekanslar ve diğer alternatifler daha iyi sonuçlar verebilir13,14,15. Burada sunulan protokol, sekiz kayıt kanalı içeren iki tetrode bir dizi kullandı. Buna ek olarak, protokol bir tel dizi16 veya silikon probları9gibi diğer prob geometrileri dahil etmek için değiştirilebilir.
Tam bir telemetri kayıt sistemi veya bağlı bir sistem üzerinde bir veri kaydedici kullanmanın çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, kablosuz iletişim kayda gürültü ekler. Bu nedenle, verilerin tam iletimi sinyal kalitesini azaltacaktır. Buna ek olarak, verileri günlüğe kaydetme, iletişim başarısız olursa hiçbir verinin kaybolmamasını sağlar. Ayrıca, kablosuz sistemler balıkların, bağlı hayvanların aksine özgürce yüzmelerini sağlar. Son olarak, bu protokol eylem potansiyellerini kaydetmek için geliştirilmiştir, ancak logger analog yüksek geçiş filtresini 300 Hz yerine 1 Hz'e ayarlayarak yerel alan potansiyellerini kaydetmek için de kullanılabilir. Logger bir dezavantajı fiziksel verileri indirmek ve aşağı çalıştığında pil değiştirme ihtiyacıdır.
Protokolde önerilen mikrosürücü, tek hücreaktivitesini kaydetme olasılığını önemli ölçüde artırır. Mikrosürücü cihazı olmadan, implante edilmiş tetrode'lar balıktest edildiği süre boyunca beyindeki aynı kayıt alanına yerleştirilir. Bu fiziksel olarak aynı balıktan birden fazla tek nöronların kaydedilmesi olasılığını sınırlar ve bu nedenle balık başına kayıt verimini kısıtlar. Beyindeki özel kayıt alanının ameliyat tan sonrasına kadar bilinmemesi, fiksasyon dan sonra beyindeki elektrotların hareket ettirilmesini mümkün kılan hareketli bir cihaza olan ihtiyacı güçlendirir.
Bu protokolün netlik için atlanan önemli bir özelliği elektrot empedansının belirlenmesidir. Elektrot empedansı, daha düşük çaplara ve daha düşük empedansa sahip telleri üreten tel çapının (yani daha yüksek çapın daha düşük empedansa yol açtığı), tel bileşimi (örn. tungsten veya nichrome) ve elektrot kaplama (örn. tungsten için platin siyahı ve nichrome için altın) seçimi ile ayarlanabilir. Tüm bu parametreler nöronal kayıtların başarısı için kritik olduğundan, okuyucu şiddetle Harris ve ark17dahil olmak üzere, bu konuda geniş literatür danışmak için teşvik edilir.
Sistemdeki olası dış gürültü kaynaklarının saptandırılabında referans elektrotun önemine dikkat edin. Referans elektrot kafatasına yerleştirilen ancak beynin dışında bulunan nispeten düşük empedans elektrodudur. Beyin dokusuile temas etmediği için, termal gürültü, hareket objeleri ve dış gürültüden oluşan sinyalin imzasını kaydeder. Bu sistemdeki başlıca gürültü kaynakları, kaydedici tarafından kontrol edilebilen ve zamanlanabilen hareket artefakt ve iletişim gürültüleridir. Bu sesler, referans elektrotun sinyaline verdikleri imza ile kolayca tespit edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz Nachum Ulanovsky ve Ulanovsky laboratuvar üyeleri için tüm yardım için müteşekkiriz. Ayrıca, tal Novoplansky-Tzur'a yardımcı teknik yardım için müteşekkiriz. İsRAİl Bİlİm VAKFI - İlk Program (hibe no. 281/15) ve Necef Ben-Gurion Üniversitesi Tarımsal, Biyolojik ve Bilişsel Robotik İnisiyatifi ile Helmsley HayırseverLik Vakfı'nın mali desteğini takdir ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm round drill bits | Compatible with the drill. | ||
| 15 blade Scalpel | Sigma-Aldrich | ||
| 16 channel PCB board | Neurlynx | EIB-16 | |
| 1x3M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 1x3M phillips round head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 27 cm x 19 cm x 1 mm brass plate | See Figure 2 | ||
| 2x6M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 3140 RTV coating | Dow Crowning | 2767996 | |
| 75 µm Silver wire | A-M Systems | ||
| Brass machine screws #00-90 | 947-1006 | ||
| Brass plates 7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm | A 3D drawing is provided. See supplementary 1 | ||
| Coated Tungsten wire 25µm | California Fine Wire Company | 5000160 | Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000) |
| Coated Tungsten wire 50 µm | A-M Systems | 795500 | Can be replaced with any other wire with low impedance |
| Cyanoacrilic glue | |||
| Dental Burnisher | ComDent UK | Any small sterille stainless-still tool will do. | |
| Dental cement - GCFujiPLUS | GC | 431011 | Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other. |
| Dental drill or nail polish drill | Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement. | ||
| Drill bit #65 | 947-65 | ||
| Fast curing epoxy | Any 5 min curing epoxy can be used here. | ||
| Logger box with O-ring sealing | A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger. | ||
| Motorized turning device | Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means. | ||
| Mouselog-16 Neural logger | Deuteron Technologies Ltd | There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam | |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% |
| Nano-Z plating | White Matter LLC | The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics. | |
| PCB pins | Neurlynx | Neuralynx EIB Pins | |
| Polymide tubing 250 µm | A-M Systems | 822000 | |
| Rechargable battery | 3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time. | ||
| Silicone tubing 0.64 mm | A-M Systems | 806100 | |
| Stainless steel 1.5 mm | A-M Systems | 846000 | |
| Sudium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Tap #00-90 | 947-1301 | ||
| Vaseline | Any type of soft petroleum skin protectant can be used here. |
References
- Jacobson, M., Gaze, R. M. Types of visual response from single units in the optic tectum and optic nerve of the goldfish. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 49 (2), 199-209 (1964).
- Ben-Tov, M., Donchin, O., Ben-Shahar, O., Segev, R. Pop-out in visual search of moving targets in the archer fish. Nature Communications. 6, 6476 (2015).
- Zottoli, S. J. Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).
- Canfield, J. G., Rose, G. J. Activation of Mauthner neurons during prey capture. Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. Journal of Neuroscience Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Vanwalleghem, G. C., Ahrens, M. B., Scott, E. K.
- Vinepinsky, E., Donchin, O., Segev, R. Wireless electrophysiology of the brain of freely swimming goldfish. Journal of Neuroscience Methods. 278, 76-86 (2017).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3568 (2012).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators A: Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Arcot Desai, S., Rolston, J. D., Guo, L., Potter, S. M. Improving impedance of implantable microwire multi-electrode arrays by ultrasonic electroplating of durable platinum black. Frontiers in Neuroengineering. 3, 5 (2010).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network: Computation in Neural Systems. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Teixeira, F. B., Freitas, P., Pessoa, L. M., Campos, R. L., Ricardo, M. Evaluation of IEEE 802.11 underwater networks operating at 700 MHz, 2.4 GHz and 5 GHz. Proceedings of the 10th International Conference on Underwater Networks & Systems. , Arlington, VA. (2015).
- Sendra, S., Lloret, J., Rodrigues, J. J., Aguiar, J. M. Underwater wireless communications in freshwater at 2.4 GHz. IEEE Communications Letters. 17 (9), 1794-1797 (2013).
- Lloret, J., Sendra, S., Ardid, M., Rodrigues, J. J. Underwater wireless sensor communications in the 2.4 GHz ISM frequency band. Sensors. 12 (4), 4237-4264 (2012).
- Hoogerwerf, A. C., Wise, K. D. A three-dimensional microelectrode array for chronic neural recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 41 (12), 1136-1146 (1994).
- Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165 (2016).
