Summary
Målet med detta manuskript är att presentera en skiss för de omfattande biokemiska och funktionella studierna av RINGTYP E3 ubiquitin Ligaser. Denna i flera steg pipeline, med detaljerade protokoll, validerar en enzymatisk aktivitet av det testade proteinet och visar hur man kopplar aktiviteten till funktion.
Abstract
Ubiquitination, som en posttranslationell modifiering av proteiner, spelar en viktig reglerande roll i homeostas av eukaryotiska celler. Den kovalent fastsättning av 76 aminosyran ubiquitin modifierare till ett målprotein, beroende på längden och topologin av polyubiquitin kedjan, kan resultera i olika resultat från proteinnedbrytning till förändringar i lokalisering och/eller aktivitet av modifierat protein. Tre enzymer katalyserar sekventiellt den ubiquitination processen: E1 ubiquitin-aktiverande enzym, E2 ubiquitin-konjugating enzym, och E3 ubiquitin Ligase. E3 ubiquitin Ligase bestämmer substrat specificitet och, därför, representerar en mycket intressant studieämne. Här presenterar vi en övergripande strategi för att studera sambandet mellan den enzymatiska aktiviteten och funktionen av RINGTYP E3 ubiquitin Ligase. Detta protokoll i fyra steg beskriver 1) hur man genererar en E3 Ligase bristfällig Mutant genom platsriktade mutagenes riktade mot den bevarade RING domänen; 2 – 3) hur man undersöker ubiquitination aktivitet både in vitro-och i planta; 4) hur man kopplar dessa biokemiska analyser till den biologiska betydelsen av det testade proteinet. Generering av en E3 Ligase-brist Mutant som fortfarande interagerar med dess substrat men inte längre ubiquitinates det för nedbrytning underlättar testning av enzym-substrat interaktioner in vivo. Dessutom ger mutationen i den bevarade RING domänen ofta en dominerande negativ fenotyp som kan utnyttjas i funktionella knockout-studier som en alternativ metod för en RNA-interferensmetod. Våra metoder var optimerade för att undersöka den biologiska rollen av växten parasitiska Nematoden effektor RHA1B, som kapar värd ubiquitination systemet i växtceller för att främja parasitism. Med smärre ändringar av in vivo-uttryckssystemet kan detta protokoll tillämpas på analysen av alla RINGTYP E3 Ligase oavsett dess ursprung.
Introduction
De allra flesta av E3 ubiquitin Ligaser tillhör RING (Really jagnteresting NEW Gene)-typ proteiner. RING fingret domänen identifierades ursprungligen av Freemont et al. 1 och funktionellt beskrivas som en domän medla protein-protein interaktion2. Den kanoniska RING fingret är en speciell typ av zink samordnande domän definieras som en konsensus sekvens av åtta bevarade CYS (C) och hans (H) särskilt fördelade på andra aminosyra rester (X), C-X2-c-x9 – 39-c-x1 – 3-H-x2 – 3-c/H-x2-c-x4 – 48-c-x2-c. Två Zn2 + -joner stabiliseras med Core c och H-rester genom unik "Cross-Brace"-topologi med c1/c2 och c/H5/c6 som samordnar den första Zn2 + -Jon medan c3/h4 och c7/c8 binder den andra (figur 1A)3,4. Beroende på närvaron av antingen C eller H i femte Zn2 +-koordinations platsen, definierades två kanoniska subklasser av ringfinger proteiner: C3HC4 och C3H2C3 (Ring-HC respektive ring-H2). Eftersom RING domänen E3 ubiquitin Ligase förmedlar samspelet mellan E2 konjugerande enzymer och substrat, har mutation av dessa essentiella C-och H-rester visat sig störa ligasaktiviteten5. Ytterligare fem mindre vanliga subklasser av RING E3 Ligaser har beskrivits (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T, och RING-G)6. RINGTYPEN E3 ubiquitin Ligaser kan delas upp i enkla och komplexa E3-enzymer. Den enkla enskilda del enhets ringen E3-Ligaser innehåller både substrat igenkännings platsen och den E2-bindande RING domänen. Däremot multisubunit RING-typ E3 komplex antingen rekrytera substrat eller förmedlar bindning av E2-ubiquitin intermediären till E3-komplexet. RING domänen Lys rester (s) som fungerar som en primär ubiquitin bifogad plats (er) för själv-ubiquitination kan också vara viktigt för E3 Ligase aktivitet.
Inte alla RINGHALTIGA proteiner fungerar som E3-Ligaser. Sålunda, den bioinformatiska förutsägelse av RING fingret domän och kapaciteten för E2-beroende protein ubiquitination måste vara biokemiskt validerade och kopplade till den biologiska rollen av det testade proteinet. Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll som beskriver hur man upptäcker och funktionellt karakteriserar den enzymatiska aktiviteten hos RINGTYP E3 ubiquitin-Ligaser, både in vitro och i planta, genom en platsstyrd mutagenes-metod. Representativa resultat från denna pipeline visas för RING-Type E3 Ligase RHA1B. RHA1B är ett effektorprotein som produceras av växten parasitisk cysta Nematoden Globodera pallida att undertrycka växt immunitet och manipulera morfologin av växt rot celler. För att skydda sig mot patogen/parasit invasion, växter har utvecklats nukleotid-bindande domän och leucin-Rich REPEAT (NB-LRR) typ immun receptorer som upptäcker närvaron av en patogen eller parasit och, som en följd, utveckla den överkänsliga svar (HR), som är en form av snabb och lokaliserad celldöd inträffar vid infektionsstället att gripa koloniseringen av patogener. En sådan immun receptor är Potato Gpa2 protein som ger resistens mot vissa isolat av G. pallida (fält populationer D383 och D372)7.
Med hjälp av de presenterade protokollen, har det nyligen visat sig att RHA1B interfererar med växt immun signalering på ett E3-beroende sätt genom att rikta anläggningen Gpa2 immunoreceptor för ubiquitination och nedbrytning8.
Protocol
1. platsriktad mutagenes (figur 1)
- Identifiera de bevarade Cys och hans aminosyror i ringen domänen (figur 1A) och design primers som bär substitution kodon av intresse flankerad av 15 bas par på vardera sidan av Mutations området (figur 1B).
- Introducera den önskade mutationen genom PCR-baserad amplifiering av Plasmiden härda genen av intresse med mutagena primrar och HiFi-DNA-polymeras innehållande PFU i 50 μl av den totala PCR-reaktionsvolymen som visas i tabell 1 och tabell 2 enligt tillverkarens protokoll.
- Smält den Escherichia coli-härledda föräldrarnas metylerade och semi-METYLERAT DNA genom att tillsätta 3 μl av DPNI -restriktionsenzymer direkt till PCR-reaktionen (steg 1,2) och inkuberas vid 37 ° c i 2 timmar.
Anmärkning: metylering är en posttranskriptionell proteinmodifiering som tillsätts plasmiden som produceras och isoleras från bakterier. Nya kopior av PCR-genererade plasmid-brist metylering, därför kommer de nya kopiorna förbli intakt under DPNI behandling. - Rena mutageniserade plasmider med hjälp av en kommersiell DNA-extraktion kit baserad på spinn kolumn teknik och eluera DNA med 50 μL vatten.
- Omvandla DH5α kemiskt kompetenta celler med 0,5 μl av det återvunna mutageniserade PLASMID-DNA enligt tillverkarens protokoll. I korthet, inkubera kompetenta celler med DNA på is i 30 min, sedan värma-chock dem för 20 s vid 42 ° c, och placera rören igen på is för 2 min. Inkubera celler med 500 μL LB-media vid 37 ° c i 1 h vid 250 rpm och sedan sprida dem på selektiva pates.
- Kontrollera den önskade mutationen genom att Sanger sekvenserar DNA-plasmiderna isolerade från E. coli.
2. rekombinant Proteinrening och in vitro-analys av ubiquitination
- Klona Wild Type ring och muterade ring gener av intresse i pmal-C2 vektor (följ tillverkarens protokoll; Tabell 3) att smälta dessa gener med MBP epitop tagg som tillåter en-stegs rening med och harts. Introducera de resulterande konstrukkterna i E. coli BL21 stammen som beskrivs i steg 1,5.
- Odla E. coli stam BL21 hyser önskad konstruktion i 50 ml lb flytande medium vid 37 ° c för 2 – 3 h tills den når den logaritmiska fasen (OD600 av 0,4 – 0,6).
- Tillsätt IPTG till en slutlig koncentration av 0,1 – 1 mM för att inducera uttrycket av MBP-märkt rekombinant protein av intresse och inkubera E. coli -kulturen i 2 – 3 timmar vid 28 ° c. Placera kulturen på isen efter inkubering.
Anmärkning: Utför steg 2.4 – 2.13 på is för att skydda proteiner från nedbrytning. - För att kontrollera induktions effektiviteten, samla 1,5 mL av inducerade celler, snurra ner dem på 13 000 x g i 2 min, ta bort supernatanten och Omsuspendera cellerna i 20 μl 2x lastbuffert med SDS-sida (24 mm Tris-HCl pH 6,8, 0,8% SDS, 10% (v/v) glycerol, 4 mm dtt, 0,04% (w/v) bromfenolblått).
- Koka proverna i 5 min och kör dem på en 10% SDS-PAGE gel. För att visuellt utvärdera ackumulering av MBP-fusion protein (molekylvikt av protein av intresse + 42,5 kDa MBP), färga gelen i 20 min genom att agitera med Coomassie färgbuffert (50% metanol, 10% ättiksyra, 0,1% Coomassie blå) och avfärgning över natten med avfärgningsbufferten (20% metanol, 10% ättiksyra).
- Skörda de kvarvarande E. coli -cellerna genom centrifugering vid 1 350 x g i 6 minuter, Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten med 5 ml kolonnbuffert (20 mm Tris HCl, 200 mm n ACL, 1 mm EDTA, bakteriell proteashämmare).
Obs: Detta är ett bra ställe att stoppa protokollet över natten. De frusna cellerna kan förvaras upp till 1 vecka vid-20 ° c. - Bryt ner E. coli -celler genom att placera röret som innehåller bakterierna i ett isvatten bad och tillämpa 10 ultraljudsbehandling cykler: 10 s ultraljudsbehandling vid 30% amp följt av 20 s raster.
- Centrifugera provet vid 13 000 x g vid 4 ° c i 10 min och spara supernatanten (rå extrakt).
- Bered 500 μl och-harts i ett 15 ml-rör. Tvätta kådan genom att tillsätta 10 mL kallkolonnbuffert och centrifugering vid 1 800 x g, 4 ° c i 5 min. Gör detta 2x.
- Tillsätt 5 ml råextrakt till röret med och-harts och inkubera över natten vid 4 ° c.
- Centrifugera vid 1 800 x g vid 4 ° c i 5 min och Kassera supernatanten.
- Tillsätt 10 mL kolonnbuffert till hartpelleten och inkubera i 20 minuter. Centrifugera sedan vid 1 800 x g vid 4 ° c i 5 min. Upprepa detta steg 2x.
- Eluera fusionsproteinet med 0,5 mL kolonnbuffert innehållande 10 mM maltos genom inkuberande av ett prov i 2 h vid 4 ° c. Centrifugera vid 1 800 x g vid 4 ° c i 5 min och samla upp det eluerade proteinet. Upprepa detta steg 2x.
- Dialyze 1 mL av protein fraktionen mot den kalla PBS. Aliquot-protein i engångsrör (10 – 20 μL) för att undvika att frysa-Tina och förvara vid-80 ° c tills det behövs.
- Mät protein koncentrationen med hjälp av Bradford-analysen9.
- Konfigurera ubiquitination in vitro-reaktionen i en total volym av 30 μL genom att blanda upp 40 ng av E1 (t. ex. AtUBA1), 100 ng av E2 (t. ex. AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32), 1 μg MBP-RING typ protein, och 2 μg flagga-UB (eller HA-UB) i den ubiquitination buffert (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 30 mm kreatin fosfat, 50 μg/ml kreatin fosfokinas). Inkubera blandningen vid 30 ° c i 2 timmar.
Anmärkning: Premake 20x ubiquitination buffert och lagra den upp till 6 månader vid-20 ° c i små alikvoter för en enda användning. Kreatinfosfokinas lätt förlorar sin enzymatiska aktivitet när bufferten Tinas och frysta upprepade gånger. - Avsluta reaktionen genom att blanda 30 μL-proverna med 7,5 μL 5x lastbuffert för SDS-sida (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 25% (v/v) glycerol, 10 mM DTT, 0,1% (w/v) bromofenolblått) och kokning i 5 min.
- Separera proteinerna med 7,5% SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), överför sedan till PDVF-membranet och detektera ubiquitination av Western blotting med anti-flaggan (eller anti-HA).
- Fläcken PVDF membranet med Coomassie blå för att kontrollera lika lastning av testade MBP-RING-typ protein.
3. Agrobacterium-medierad övergående proteinuttryck i Nicotiana benthamiana blad och i planta ubiquitination assay
- Streak lämpliga Agrobacterium tumefaciens stammar bär Epitope-märkta genen av intresse (t. ex., ha-RHA1B, ha-RHA1BC135S, ha-RHA1BK146R, ha-UB) och tom vektor som en kontroll på lb medium som innehåller lämpliga urvalet antibiotika.
- Efter 2 dagars tillväxt vid 28 ° c, plocka upp enstaka kolonier och odla dem i LB flytande medium med lämplig antibiotika vid 28 ° c/250 RPM för ytterligare 24 h.
- Överför 100 μL agrobakteriell kultur till 3 mL färskt LB med lämplig antibiotika och inkubera kulturen i ytterligare 4 – 6 h vid 28 ° c med rotation (250 rpm) till den sena exponentiella tillväxtfasen.
- Spinna agrobakteriella celler på 1 800 x g för 6 min, Kassera supernatanten, och Omsuspendera celler med 3 ml tvättbuffert (50 mm MES pH 5,6, 28 mm glukos, 2 mm NaH2Po4). Upprepa detta steg 2x.
- Efter den andra tvätten, Omsuspendera cellerna i induktions bufferten (50 mM MES pH 5,6, 28 mM glukos, 2 mM NaH2Po4, 200 μm acetospruta, 37 mm NH4cl, 5 mm MgSO4. 7H2o, 4 mm KCL, 18 ΜM feber4. 7h2o, 2 mm CaCl2). Inkubera cellerna med induktions buffert i ytterligare 10 – 12 timmar vid 28 ° c.
Anmärkning: Acetospruta inducerar T-DNA-överföring. - Centrifugera cellerna vid 1 800 x g i 6 min, Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna med 2 ml infiltrations buffert (10 mm MES pH 5,5, 200 μm acetospruta).
Anmärkning: om Agrobacteria aggregat efter inkubering med induktions buffert, låt de aggregerade cellerna sjunka till botten av röret genom att lämna den på bänken i några minuter, och överföra Clear Agrobacterium suspensionen till ett nytt rör innan du fortsätter med steg 3,6. - Mät koncentrationen av bakterier med hjälp av OD600 -värdet (den optiska densiteten vid absorbans 600 Nm). Justera OD600 -värdena till de önskade.
Anmärkning: vanligtvis en OD600 värde mellan 0,2 – 0,4 fungerar bäst för en enda agrobakteriell fläck uttryck. Om en kombination av olika agrobakteriella stammar appliceras, den totala OD600 värden av agrobakteriell stammar bör inte överstiga 1. - Agroinfiltrate 4-veckors gammal N. bethamiana blad genom att försiktigt prickning dem med en nål, följt av hand-injicera Agrobacterium med en spruta utan nålen. Cirkel det infiltrerade löv området med markören (vanligtvis 1 – 2 cm i diameter).
- Samla in de infiltrerade blad vävnaderna 36 h efter infiltration. Slipa vävnaden till ett fint pulver med flytande kväve.
- Återsuspenderat vävnads pulver med 300 μL proteinextraktionsbuffert (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol, 1% polyvinylpolypyrrolidon, 1 mM PMSF, växt proteashämmare cocktail) och centrifugera vid 15 000 x g i 15 min vid 4 ° c.
- Överför supernatanten till ett nytt rör. Lägg till 5x SDS-PAGE lastning buffert till en slutlig koncentration av 1x och koka i 5 min.
- Separera råa proteiner på 10% SDS-PAGE geler, överföring till PVDF membran, och sond med anti-HA att upptäcka i planta ubiquitination.
4. upprättande av kopplingen mellan enzymatisk aktivitet och funktion i planta
Anmärkning: till exempel, RHA1B främjar nedbrytning av resistenta protein Gpa2 att undertrycka HR celldöd. Det här steget visar hur du kontrollerar att de virulent aktiviteter av RHA1B är E3-beroende.
- Streak lämpliga Agrobacterium tumefaciens stammar bär taggade gener av intresse (i detta exempel ha-RHA1B, ha-RHA1BC135S, ha-RHA1BK146R, MYC-Gpa2, RBP1) och tom vektor som en kontroll. Följ steg 3.1 – 3.8 för beredning av Agrobacterium och injektion på N. bethamiana blad.
- För den E3-beroende substrat proteinnedbrytningen, Följ steg 3.9 – 3.12 och utför Western blotting med lämpliga antikroppar för att detektera proteinackumulering i växtceller (t. ex. anti-HA och anti-MYC).
- För E3-beroende överkänslig respons (HR) medierad celldöd hämning, övervaka agroinfiltrerade bladen för HR celldöd symtom 2 – 4 dagar efter infiltration.
Representative Results
I detta avsnitt ges representativa resultat för det protokoll som används för undersökning av en enda subenhet E3 ubiquitin Ligase RHA1B som har en PROSITE-förväntad RING-H2 typ domän (132 – 176 aminosyror)10. Som framgår av figur 1måste minst en av de åtta bevarade CS eller HS i ring domänen (figur 1A) mutageniseras(figur 1B) för att få ett mutant-protein på E3-brist. Således, som ett första steg, två muterade versioner av RHA1B, RHA1BC135S (en substitution av CYS av ser i bevaras C3 i ringen domän) och RHA1BK146R (en substitution av lys av arg i de enda Lys som finns i RHA1B) genererades. Även om enstaka delenhet E3 Ligaser förmedlar ubiquitin överföring från ubiquitin hyser E2 till underlaget i stället för att direkt interagera med ubiquitin, kan själv ubiquitination av E3 vid Lys krävas för sin maximala enzymatisk aktivitet.
Den västerländska blotting resultat i figur 2a visar en typisk positiv in vitro ubiquitination assay resultat, med en multibanding smeta börjar på molekylvikt av det testade proteinet (t. ex., MPB-smält RHA1B ~ 100 kDa) och framåt uppåt. Anti-HA-antikroppar erkänt HA-märkta UB införlivas i Poly-ubiquitination kedjan av olika längder, skapa denna typiska ubiquitin-associerad stege-liknande smear. För att validera de positiva resultaten visar figur 2A också alla viktiga negativa kontroller som saknar enskilda komponenter (E1, E2, UB eller MBP-RHA1B) eller använder MBP som kontroll och saknar den utsmetade ubiquitination signalen. Dessutom visade Coomassie Blåfärgning av PVDF membranet lika lastning av MBP-RHA1B eller MBP i alla kontroller.
Figur 2B visar hur resultaten av ubiquitination in vitro varierade beroende på den specifika kombinationen E2/E3. I det här exemplet testades 11 olika E2s som representerade 10 olika E2-familjer. Den upptäckta ubiquitination aktiviteten varierade från ingen signal (inget smeta) till en multibanding smeta börjar vid olika molekylvikter, vilket indikerar olika ubiquitination mönster.
Figur 3 visar resultaten från ubiquitination för ring-och K-muterade versioner av testat protein. Brist på enzymatisk aktivitet för RHA1BC135S stöds av dess oförmåga att antingen generera en multibanding smeta in vitro (figur 3a) eller främja Poly-ubiquitination signal i planta (figur 3B). Det är anmärkningsvärt att överuttryck av HA-märkta UB i planta på egen hand gav basal nivå ubiquitination i alla testade prover, inklusive vektor kontroll, i motsats till den starka ubiquitination signalen ges av enzymatisk aktivitet av vild typ RHA1B. Dessutom tyder analysen på RHA1BK146R Mutant på att K146 restsubstanser också är av avgörande betydelse för RHA1B verksamhet på E3. Även om en marginell själv ubiquitination signal upptäcktes in vitro (figur 3a), i planta analysen bestäms Mutant är E3-bristfällig (figur 3B, endast bakgrund ubiquitination signal upptäcks).
Efter att ha utvecklat och biokemiskt validerat E3-brist Mutant, kan funktionella studier utformas för att bestämma den E3-associerade biologiska rollen för den testade ringen E3 ubiquitin Ligase. När det gäller RHA1B, detta Nematoden effektor dämpar växt immun signalering, som manifesteras genom dämpning av den Gpa2-utlöst HR celldöd. Som presenteras i figur 4A, till skillnad från Wild typ RHA1B, RHA1BC135S Mutant saknar E3 Ligase aktivitet inte störa HR celldöd. Med tanke på att det vanligaste utfallet av protein ubiquitination är dess Proteasome-medierad nedbrytning, mutationer bosatta i ringen domänen kan också användas för att kontrollera en E3-beroende förmåga att utlösa nedbrytning av deras direkta och/eller indirekta substrat. Sålunda, signifikant, Western blotting resultat i figur 4B bekräfta att Gpa2 inte ackumuleras i närvaro av vild typ RHA1B men RHA1BC135S hade ingen inverkan på Gpa2 protein stabilitet.
Figur 1: schematisk representation av den princip och de moment som är involverade i platsriktad mutagenes. (A) Ring-CH/H2 domän med bevarade Cys och hans aminosyror markerade. B) ett exempel på utformning av mutagena primers. C) åtgärder för platsstyrd mutagenes. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ in vitro-analys av ubiquitination. (A) Top gel visar ubiquitination assay inklusive alla negativa kontroller, och botten gel visar lika lastning. B) utbudet av förväntade resultat beroende på E2-enzymer. Denna siffra har modifierats från Kud et al8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: resultat från ubiquitination för ring-och K-mutanter (RHA1BC135S och RHA1BK146R). A) resultat från ubiquitination in vitro för RHA1BC135S och RHA1BK146R. (B) i planta ubiquitination assay resultat för RHA1BC135S och RHA1BK146R. Denna siffra har modifierats från Kud et al8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativ funktionell studie för E3 beroende biologiska funktioner. Ett exempel på funktionella studier som visar den E3-beroende biologiska funktionen. (A) E3-beroende HR cell Death suppression och (B) nedbrytning av en växt immun receptor Gpa2. Denna siffra har modifierats från Kud et al8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| PCR-uppsättning | |
| 1 μL | plasmid (~ 100 ng) |
| 1,5 μL | F mutagen primer (10 μM) |
| 1,5 μL | R mutagen primer (10 μM) |
| 1 μL | dNTPs (10 mM) |
| 5 μL | buffert (10X) |
| 1 μL | Ultra PFU-polymeras (2,5 U/μl) |
| 39 μL | ddH2O |
| 50 μL | TOTAL VOLYM |
Tabell 1: Konfigurera PCR-reaktion
| termocyklern program | |||
| 1 | 95 ° c | 30 s | |
| 2 | 95 ° c | 30 s | |
| 3 | 60 ° c | 30 s | |
| 4 | 72 ° c | 5 min | Upprepa 2-4 30 gånger |
| 5 | 72 ° c | 5 min | |
Tabell 2: programmet PCR termocyklern
| ligering reaktion som inrättats för RHA1B exempel | ||
| 1,5 μL | pMAL-C2:: MBP linearized vektor genom matsmältning med BamHI och SalI (60 ng) | |
| 7 μL | RHA1B/RHA1BC135S eller RHA1BK146R skär smälts med BamHI och SalI (25 ng) | |
| 1 μL | T4 Ligase buffert (10X) | |
| 0,5 μL | T4 Ligase (400 U/μL) | |
| 10 μL | TOTAL VOLYM | |
Tabell 3: ligering reaktion inrättas för RHA1B exempel.
Discussion
Belysa den biokemiska och mekanistiska grunden för RING typ E3 ubiquitin Ligaser kan bidra i hög grad till vår förståelse av deras biologiska betydelse i utvecklingen, stress signalering, och underhåll av homeostas. Det protokoll som beskrivs här par en mutagenes metod med in vitro-och i planta funktionella studier. Genom att införa en enda aminosyrasubstitution i de bevarade resterna av ringen domänen genom plats-direkt mutagenes, den resulterande E3-brist Mutant kan testas parallellt med Wild typ protein för att länka enzymatisk aktivitet med funktionalitet.
Det är viktigt att korrekt identifiera ringen domänen, särskilt dess bevarade Cys och hans rester. Online-verktyg som PROSITE kan användas för att göra det10. För att destabilisera ringen domän ansvarig för rekrytering av E2 enzymet, CYS ersätts normalt med ser, som är dess närmaste strukturella ersättare saknar förmåga att skapa en disulfid obligation som används för zink samordning. Lorick et al. visade att mutationen i någon av dessa kritiska CYS rester skulle avskaffa ubiquitination aktiviteten av enstaka subenhet ring-typ E3 Ligaser5. Även om vissa CYS rester är också viktiga för bokades E3 Ligase komplex som innehåller ring-typ proteiner, på grund av den mångfacetterade och dynamiska tredimensionell struktur av dessa ubiquitination komplex och olika roll ring-typ proteiner, enstaka substitutioner av bevarade rester i ringen domän i bokades E3 Ligase har inte lyckats generera en Ligase bristfällig fenotyp11.
För den platsriktade mutagenes, fann vi att använda mindre plasmid vektorer och lägre amplifiering cykler vanligtvis gav högre effektivitet för mutagenes. Den PFU enzym kan ersättas med någon annan High-Fidelity och hög processivitet DNA-polymeras. Dessutom, om genen av intresse innehåller sällsynta kodons, en annan E. coli fläck, Rosetta, kan användas för att uppnå högre avkastning av rekombinant protein. Dessutom kan både inkuberingstid och temperatur för IPTG-induktion optimeras ytterligare. Lägre temperaturer minska E. coli Division Rate, som kan vara gynnsam för uttryck av vissa proteiner. Även om högre koncentration av IPTG kan förbättra protein uttrycket, det hämmar också E. coli Division processer och rekommenderas inte.
Enstaka subenhet ring typ E3 Ligaser fungerar inte bara som en molekylär byggnadsställning som placerar E2-UB intermediären i närheten av underlaget, men också stimulera ubiquitin överföring aktivitet av deras besläktat E2s. Med tanke på att en E2/E3-kombination är viktig för längden och kopplingarna i kedjan polyubiquitin som bestämmer ödet för ett modifierat substrat, måste varje övervägande av RINGTYP E3s innefatta deras enzymatiska partner E2s12. Som visas i figur 3Bär inte alla testade E2s kompatibla med RHA1B Ligase. Därför bör ubiquitination in vitro-analyser utföras parallellt med flera E2-enzymer som representerar olika E2-klasser för att undvika falskt negativa resultat.
Presenteras här är den in vitro enzymatisk analys som detekterar själv ubiquitination förmåga testade RING-typ proteiner. Men med små ändringar, detta protokoll kan lätt anpassas för att upptäcka in vitro ubiquitination av substrat. För detta ändamål bör den ubiquitination in vitro-blandningen från steg 2,15 kompletteras med det rekombinanta proteinet av det potentiella E3-ligassubstrat (500 ng). Efter en 2 h inkubation vid 30 ° c ska och protein fångas upp med 15 μl av anti-ha-affinitetsmatrisen (om ha-UB används, eller om flagg-UB används vid användning av flagga) genom agitation under 2 timmar vid 4 ° c. Efter tvättning av pärlorna 4x gånger med den kalla UB tvättbuffert (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 1x PMSF), kassera alla utom 40 μL av bufferten och flytta till steg 2,16. Den ubiquitination signalen, detekteras av antikroppar som är specifika för Epitope-märkta UB och substrat, respektive, som växer fram från molekylvikt av substrat proteinet, bekräftar substratet/enzym specificitet.
Dessutom är identifiering av E3 ligassubstrat in vivo vanligtvis förknippat med flera utmaningar på grund av övergående enzym-substrat interaktion och snabb nedbrytning av och målprotein. Med hjälp av en E3 Ligase bristfällig Mutant, som fortfarande interagerar med sitt mål men inte längre ubiquitinates det13, är ett mycket användbart alternativ till tillsats av proteasomen inhibitor MG132, som inte alltid tillräckligt störa 26S proteasom funktion.
En vanlig egenskap hos RINGTYP E3-Ligaser är en tendens att bilda och fungera som homo-och/eller heterodimers. Intressant, substitution i bevarade rester av ringen domänen är vanligtvis förknippas med en dominerande negativ fenotyp där muterade RING-typ E3 Ligase blockerar enzymatisk aktivitet av en infödd vild typ protein13. Således kan överuttryck av RING mutanter i planta vara ett alternativt sätt att knacka ut E3 Ligase genen.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vårt arbete möjliggjordes av det ekonomiska stödet från jordbruks-och livsmedels forskningsinitiativet Competitive Grant (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) från USDA National Institute of Food and Agriculture, USDA-NIFA Farm Bill, Northwest potato Konsortiet och ISDA Specialty Crop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Amylose resin | NEB | E8021S | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
| Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
| Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
| Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
| Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
| E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
| FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
| FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
| Glucose | VWR | 188 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
| Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
| Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
| Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
| IPTG | Roche | 10724815001 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Liquide nitrogen | university chemistore | ||
| Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
| Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
| monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
| Mortar | VWR | 89038-144 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
| Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
| Pestle | VWR | 89038-160 | |
| Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
| Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
| pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
| Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| T4 ligase | NEB | M0202S |
References
- Freemont, P. S., Hanson, I. M., Trowsdale, J. A novel gysteine-rich sequence motif. Cell. 64, 483-484 (1991).
- Borden, K. L. B. RING fingers and B-boxes: Zinc-binding protein-protein interaction domains. Biochemistry and Cell Biology. 76, 351-358 (1998).
- Barlow, P. N., Luisi, B., Milner, A., Elliott, M., Everett, R. Structure of the C3HC4 Domain by 1H-nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: A New Structural Class of Zinc-finger. Journal of Molecular Biology. 237, 201-211 (1994).
- Borden, K. L. B., et al. The solution structure of the RING finger domain from the acute promyelocytic leukaemia proto-oncoprotein PML. The EMBO Journal. 14, 1532-1541 (1995).
- Lorick, K. L., et al. RING fingers mediate ubiquitin-conjugating enzyme (E2)-dependent ubiquitination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96, 11364-11369 (1999).
- Jiménez-López, D., Muñóz-Belman, F., González-Prieto, J. M., Aguilar-Hernández, V., Guzmán, P. Repertoire of plant RING E3 ubiquitin ligases revisited: New groups counting gene families and single genes. PLoS ONE. 13, 1-28 (2018).
- Sacco, M. A., et al. The Cyst Nematode SPRYSEC Protein RBP-1 Elicits Gpa2- and RanGAP2-Dependent Plant Cell Death. PLoS Pathogens. 5, 1-14 (2009).
- Kud, J., et al. The potato cyst nematode effector RHA1B is a ubiquitin ligase and uses two distinct mechanisms to suppress plant immune signaling. PLoS Pathogens. 15, 1007720 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Research. 41, 344-347 (2013).
- Dove, K. K., Stieglitz, B., Duncan, E. D., Rittinger, K., Klevit, R. E. Molecular insights into RBR E3 ligase ubiquitin transfer mechanisms. EMBO Reports. 17, 1221-1235 (2016).
- Metzger, M. B., Pruneda, J. N., Klevit, R. E., Weissman, A. M. RING-type E3 ligases: Master manipulators of E2 ubiquitin-conjugating enzymes and ubiquitination. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1843, 47-60 (2014).
- Xie, Q., et al. SINAT5 promotes ubiquitin-related degradation of NAC1 to attenuate auxin signals. Nature. 419, 167-170 (2002).
