Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

דגירה פחד באמצעות פרוטוקול מיזוג פחד מורחב לחולדות

Published: August 22, 2020 doi: 10.3791/60537
Automatic Translation
1,6, 2, 2, 3, 3, 4, 2, 2, 2,5
1School of Psychology, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, 2Animal Behavior Laboratory, Fundación Universitaria Konrad Lorenz, 3Department of Psychology, Universidad de Los Andes, 4School of Veterinary Medicine, Animal Health Department, Universidad Nacional de Colombia, 5Department of Psychology, Troy University, 6Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Summary

אנו מתארים פרוטוקול מורחב של מיזוג פחד המייצר אי-ניסיון יתר ופחד מחשירה בחולדות. פרוטוקול זה כרוך באימון יחיד עם 25 זיווגים של הלם טון (כלומר, אימון יתר) והשוואה של תגובות הקפאה מותנות במהלך בדיקות הקשר וסימן 48 שעות (לטווח קצר) ו-6 שבועות (לטווח ארוך) לאחר האימון.

Abstract

זיכרון רגשי נחקר בעיקר עם פרדיגמיות של מיזוג פחד. התניה פחד היא סוג של למידה שדרכה אנשים לומדים את היחסים בין אירועים aversive וגירויים ניטרליים אחרת. ההליכים הנפוצים ביותר לחקר זיכרונות רגשיים כרוכים בהתניה של פחד בחולדות. במשימות אלה, הגירוי ללא תנאי (ארה"ב) הוא הלם רגל שהוצג פעם או מספר פעמים על-פני מפגשים בודדים או מספר מפגשים, והתגובה המותנה (CR) מקפיאה. בגרסה של הליכים אלה, הנקראת "מיזוג פחד cued", טון (גירוי מותנה, CS) מזווג עם רעידות רגל (ארה"ב) במהלך שלב האימון. במהלך הבדיקה הראשונה, בעלי חיים נחשפים לאותו הקשר שבו התקיימה ההכשרה, ותגובות הקפאה נבדקות בהיעדר רעידות רגליים וגוונים (כלומר, מבחן הקשר). במהלך הבדיקה השנייה נמדדת ההקפאה כאשר ההקשר משתנה (לדוגמה, על ידי מניפולציה של הריח והקירות של התא הניסיוני) והטון מוצג בהיעדר רעידות רגליים (כלומר, מבחן רמז). רוב הליכי מיזוג הפחד cued כרוכים כמה זיווגים הלם טון (למשל, 1-3 ניסויים בפגישה אחת). יש עניין הולך וגדל בגרסאות פחות נפוצות הכוללות מספר רב של זיווגים (כלומר, עודף ניסיון) הקשורים לאפקט ארוך טווח הנקרא דגירה של פחד (כלומר, תגובות הפחד גדלות עם הזמן ללא חשיפה נוספת לאירועים או גירויים מותנים). משימות מורחבות של מיזוג פחד היו המפתח להבנת ההיבטים ההתנהגותיים והנוירוביולוגיים של הדגירה של הפחד, כולל הקשר שלה עם תופעות פסיכולוגיות אחרות (למשל, הפרעת דחק פוסט-טראומטית). כאן, אנו מתארים פרוטוקול מורחב של מיזוג פחד המייצר אי-ניסיון יתר ופחד דגירה בחולדות. פרוטוקול זה כרוך באימון יחיד עם 25 זיווגים של הלם טון (כלומר, אימון יתר) והשוואה של תגובות הקפאה מותנות במהלך בדיקות הקשר וסימן 48 שעות (לטווח קצר) ו-6 שבועות (לטווח ארוך) לאחר האימון.

Introduction

זיכרון הוא תהליך פסיכולוגי המקיף שלבים שונים: רכישת מידע, איחוד (מאפשר יציבות של מידע שנרכש) ואחזור (ראיות לתהליך האיחוד)1. במהלך שלב האיחוד, מתרחשים הקמה של חיבורים סינפטיים חדשים ושינוי של חיבורים קיימים מראש. הדבר מצביע על הצורך לתקופה של זמן שבמהלכה אירועים מולקולריים ופיזיולוגיים האחראים לשינויים אלהמתרחשים 1,2. שינויים פיזיולוגיים או מולקולריים אלה משתנים בין אם האירועים שאוחזרו טעונים רגשית או לא (כלומר, זיכרון רגשי). לדוגמה, מחקרים הראו כי גרעין הים הניצי ותסביך האמיגדלה הבסקית רלוונטיים במיוחד לזיכרון הרגשי3,,4,,5.

תופעות זיכרון רגשי נחקרו בעיקר עם פרדיגמים מיזוג פחד5,6. מיזוג פחד הוא סוג של למידה שדרכה אנשים לומדים את היחסים בין אירועים aversive וגירויים ניטרליים אחרת7. פרדיגמות מיזוג פחד לייצר מולקולרי, תאי, ושינויים מבניים האמיגדלה. בנוסף, מיזוג הפחד משנה את הקישוריות של ההיפוקמפוס במהלך תהליכי הקונסולידציה ואחזור של זיכרון רגשי.

אחד ההליכים הנפוצים ביותר לחקר זיכרונות פחד הוא קלאסי (פבלובי) מיזוג בחולדות. הליך זה משתמש בדרך כלל בהלם רגל (ארה"ב) כגירוי aversive, אשר מועבר פעם או מספר פעמים על פני אחד או מספר מפגשים. התגובה מותנית (CR) של חולדות שנחשפו להליך זה היא הקפאה (כלומר, "חוסר תנועה כללי הנגרמת על ידי תגובת טוניק כללית של שרירי השלד של בעלי החיים למעט השרירים המשמשיםבנשימה" 7). ניתן להעריך תגובה זו בשני סוגים של בדיקות: בדיקות הקשר וסימן. למבחן ההקשר, הנבדק עובר מספר נתון של רעידות רגליים במהלך האימון, ולאחר מכן מוסר מהתא הניסיוני למשך זמן מוגדר. במהלך הבדיקה, הנושא מוחזר לאותו הקשר שבו האימונים התקיימו ומדדים שונים של הקפאה נאספים בהיעדר רעידות רגליים (למשל, משך, אחוז או תדירות של פרקי הקפאה), ובהשוואה לרמות הבסיס שנקבעו בשלב האימון. עבור הסוג השני של הבדיקה, מבחן cue, גירוי (בדרך כלל טון) מזווג עם רעידות הרגל במהלך שלב האימון (כלומר, גירוי מותנה, CS). לאחר השלמת האימון, החיה מוסרת מהקשר האימון לזמן מוגדר ולאחר מכן ממוקמת בהקשר שונה (לדוגמה, תא ניסיוני שונה בעל צורות שונות של קירות וריח שונה). לאחר מכן הסימן מוצג מספר נתון של פעמים, ותגובות הקפאה לסימן נמדדות בהשוואה לרמות הבסיסיות שנאספו במהלך האימון. הגרסה הנפוצה ביותר של פרדיגמה זו משתמשת 1 עד 3 זיווגים הלם טון במהלך אימון יחיד, ואחריו בדיקות הקשר ו cue שנערך מספר שעות או כמה ימים לאחר מכן.

הליכי מיזוג פחד אחרים מיושמים בתדירות נמוכה יותר כרוכים במספר רב של זיווגים של מקלות הלם (כלומר, ניסויים), אשר נקראו לעתים קרובות הליכי אובר-און8. עניין הולך וגובר במשימות אלה קשור להשפעות הזיכרון הארוכות והגדלות שלהם הנקראות דגירה של פחד (כלומר, תגובות פחד מותנות גדלות עם הזמן בהיעדר חשיפה נוספת לאירועים או גירויים מותנים)9,,10,,11. דוגמה של נהלי אימון יתר כאלה כרוכה בשלב אימון של 100 זיווגים הלם טון מופץ על פני 10 הפעלות, ואחריו בדיקות הקשר ו cue שנערך 48 שעות ו 30 ימים מאוחריותר 11,12. כדי להימנע מהכשרה מקיפה הפרושה על פני מספר ימים, מרן (1998) דיווח כי אימון יתר יכול להיות מבוסס ואופטימיזציה בפגישה אחת עם 25זיווגים 8. אפקט הדגירה הוא עדות ברמות גבוהות יותר באופן משמעותי של פחד מותן בחולדות שנבדקו 31 ימים לאחר האימון, לעומת חולדות שנבדקו 48 שעות לאחר מכן. משימות מורחבות של מיזוג פחד היו המפתח להבנת היבטים התנהגותיים ונוירוביולוגיים הבסיסיים דגירה של פחד, כולל הקשר שלה עם תופעות פסיכולוגיות אחרות (למשל, הפרעת דחק פוסט-טראומטית מתעכבת)11,,12,,13.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מורחב של מיזוג פחדים שגורם לאורופן יתר ופחד מדגירה בחולדות. שונה פרדיגמים אחרים הדורשים מספר ימיאימון 11, הפרוטוקול הנוכחי מתמקד אימון יחיד8. השתמשנו ב-25 זיווגים של הלם טון כדי לייצר תגובות הקפאה מותנות גבוהות יותר במהלך בדיקות ההקשר והרמז שנערכו 6 שבועות לאחר האימון, בהשוואה לבדיקות שנערכו 48 שעות לאחר מכן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הבא אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של אוניברסיטת Fundación Konrad Lorenz (IACUC-KL). ההכרזה האוניברסלית בדבר זכויות בעלי חיים שהונפקה על ידי הליגה הבינלאומית לזכויות בעלי חיים בז'נבה, שווייץ (1989) ועקרונות אתיים של ניסויים בבעלי חיים שהונפקו על ידי ICLAS היו מכובדים.

1. הכנת נושא

  1. בחר חולדות Wistar בוגר זכר (n = 12). להאוסן אותם בקבוצות של ארבעה לכלוב במשך שלושה ימים של התאקלמות, לפני תחילת פרוטוקול האימונים והבדיקה. לספק לחולדות גישה חופשית למים לאורך כל הניסוי. שלוט בטמפרטורת החדר בין 20°C ל-25°C, תחת מחזור בהיר של 12 שעה (אורות דולקים בשעה 07:00).
    הערה: זנים חולדה הראו ביצועים דיפרנציאליים במהלך מיזוג פחד. לדוגמה, Schaap et al. (2013) דיווח כי זני Wistar ולואיס הראו משכי זמן ארוכים יותר של התנהגות הקפאה לעומת חולדות פון ברדסוחומים נורווגיה 12. לכן, יש להעריך הבדלים בכאב ותרמי סף כדי להתאים את העוצמה ואת משך הזעזועים.
  2. לשמור על חולדות ב 85% של משקולות ההאכלה החופשית שלהם (משקל רגיל בין 350-400 גרם) על ידי מתן גישה מוגבלת למזון באותה שעה בכל יום. לשקול חולדות כל יום באותה שעה במהלך מחזור האור. חשב את משקל ה-ad lib (100% משקל) במשך שלושה ימים לפני תחילת אימון ממושך להתניית פחד.
    הערה: בעלי חיים המשמשים בניסוי הנוכחי נבדקו בבדיקות אינסטרומנטליות נוספות שלא דווחו כאן. נדרש מחסור במזון לבדיקות נוספות אלה. וריאציה פרוצדורלית זו מניחה כי סביר להרחיב את היקף ההליך הנוכחי, כפי שהוא מרמז על הפוטנציאל של בדיקות משולבות פחד אינסטרומנטלי. עם זאת, מחקרים המשתמשים רק בבדיקות מיזוג פחד לא ידרשו מניעת מזון.
  3. להקצות באופן אקראי נושאים לאחת מהקבוצות הבאות: בדיקות רגשיות 6 שבועות לאחר האימון (n = 6); בדיקה רגשית 48 שעות לאחר האימון (n = 6).
  4. בצע אימונים ובדיקות בשעות דומות, במהלך שלב האור של מחזור האור האפל. הקצה את בעלי החיים לאותו תא ניסיוני ולשמור על אותו סדר של בעלי חיים במהלך אימונים ובדיקות.
    הערה: בקרה נוספת שיכולה להיות מיושמת היא איון נגד סדר בעלי החיים בשלבי אימון ובדיקה. מומלץ להשתמש בטכניקה זו כאשר קבוצות כפולות מוערכות, או משימות שונות מוחלות על-פני ניסויים, כדי להפחית השפעה אפשרית של סדר משימות על אופן הפעולה.

2. הגדרת ם לכיול והלם

  1. נקה את כל המשטחים הפנימיים של התא הניסיוני ואת רצפת הרשת מפלדת אל-חלד עם 10% אתנול. חזור על הפעולה לפני שתבדוק כל חיה.
  2. חבר את הציוד למחשב באמצעות כבל USB והתניע את ציוד מערכת זיהוי ההקפאה: המעבד המרכזי, ארון השליטה, אור האינפרא-אדום, הממריץ/מערבל הזעזועים והקליברטור בעוצמת ההלם.
    הערה: למרות פרוטוקול זה בוצע באמצעות מכשירים מסחריים זמינים(טבלת חומרים),ציוד ותוכנה של מותגים שונים ניתן להשתמש. ההתקן מורכב מתא מרובע אקריליק פנימי (29.53 ס"מ על 23.5 ס"מ על 20.96 ס"מ, הנקרא תא הניסוי) המשובץ בקופסת עץ מכוסה בפלסטיק. הדלתות החיצוניות מאפשרות בידוד של קול, רעש או אור (דלתות תיבה מקלות). המצלמה ממוקמת לרוחב בחלק הפנימי של הדלת החיצונית. תיבת אקריליק פנימית עם רשתות מתכת הרצפה (36 מוטות נירוסטה, כל אחד של 3 מ"מ קוטר ומנומק 8 מ"מ, מרכז למרכז) מאפשר משלוח הלם רגל. באחד הקירות הפנימיים-לרוחב, רמקול ממוקם 6 ס"מ מהרצפה כדי להציג רמז שמיעתי.
  3. חבר את הסרטונים האדומים והשחורים של קליברטור עוצמת ההלם (כלומר, מחברים חיוביים ושליליים) לשני מוטות שונים על רצפת הרשת. חבר את כבל ה-USB ליציאה המתאימה של המחשב. הקפד לחבר את הקליפים האדומים והשחורים לסורגים המופרדים באמצעות סרגל אחר.
    הערה: סעיף זה מתאר את תהליך כיול עוצמת ההלם באמצעות מותג מסוים של ציוד המוזכר בטבלת החומרים. עם זאת, ניתן לבצע את תהליך הכיול באמצעות מותגים שונים של ציוד. מומלץ לכייל את עוצמת ההלם בשלושה מגזרים של רצפת הרשת כדי לוודא שהוא עקבי. בנוסף, תמיד להסיר שאריות צואה ושתן מרצפה הרשת כדי למנוע הפרעה במהלך המסירה של ההלם.
  4. הפעל את תוכנת calibrator בעוצמת הלם (טבלת חומרים). בחר עוצמה של 1.0 mA ביישום על ידי לחיצה על חץ הטווח. לאחר מכן, שנה את המתג הפעלה/עצור להפעלה.
    הערה: אנו מציעים 1.0 mA בהתבסס על המחקרים שלנו עם מודלים מכרסמים במעבדה שלנו וספרות המדווחת על טווח בין 0.75 mA ל 1.5 mA מתאים ללימודים של פחד מיזוג33,,34,35.
  5. הפעל את הממריץ aversive או את הציוד המשמש כדי לספק את הזעזועים ברגל ולהסתכל על עוצמת ההלם המוצגת בלוח של היישום. במידת הצורך, התאימו את העוצמה ל-1.0 mA באמצעות הידית של הממריץ האוורסיבי.
    הערה: יש להגדיר את ממריץ Aversive כ- "OUT" כדי לבדוק, לכייל ולהפעיל את הניסוי כראוי.

3. כיול מערכת זיהוי הקפאה

  1. סגור את התא הניסיוני ודלתות התיבה המיוחכות. אל תציגו את החיה בשלב זה, כפי שהוא יוצב לתוך התא לאחר כיול מערכת זיהוי הקפאה הושלמה. ודא שעוצמת האור בתוך התיבה היא בין 20 ל-30 לוקס.
  2. הפעל את תוכנת מערכת זיהוי ההקפאה ופתח את חלון הדיאלוג של הגדרת ניסוי. הזן את הפרטים של כל נושא (כגון מספר זיהוי נושא, תאריך וקבוצה) וטען את הקובץ שכותרתו "פרוטוקול הדרכה VFC.pro" (זמין http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
    הערה: בדיקות הקשר וסימן משתמשות בתצורת תוכנית אחרת; לכן, הקפד להשתמש בקובץ הנכון בכל בדיקה. בשלב זה הקובץ הנכון מתאים ל"פרוטוקול הדרכה VFC.pro". זכור כי במהלך שלבי הבדיקה הקובץ המתאים יהיה שונה להפעלה אימונים.
  3. בחר את המצלמות המתאימות ובדוק את האפשרות שמור וידאו (במידת הצורך). הגדר את סף התנועה ל- 100 ואת משך ההקפאה המינימלי ל- 30 מסגרות.
    הערה: ערך סף תנועה זה מבוסס על גודל המינים המשמשים (בהתבסס על מספר הפיקסלים). היצרן ממליץ על ערך משך הקפאה מינימלי. ערכים אלה משמשים להבטחת הכרה נאותה של בעל החיים בתא.
  4. ודא שההזנה החיה מהמצלמה שנבחרה מופיעה על המסך, יחד עם גרף סף התנועה וציר הזמן של הגירויים השונים המוצגים במהלך האימון (לדוגמה, קול והלם).
    הערה: באמצעות מותג אחר, הגדרת הציוד צריכה להציע את האפשרות למדוד את התנועות של בעל החיים כדי לזהות "אינדקס" של תנועה שאמור לאפשר השוואות על משך הזמן שהחיה נעה או קופאת. אפשרות נוספת היא שימוש בתוכנה שעם מקור הווידאו בלבד (במהלך הניסוי או אחריו) יכולה לזהות את משך הזמן שבו בעל החיים נמצא בתנועה או הקפאה, כגון תוכנה חופשית ImageFZ13, ארגז כלים ב-Matlab14, או מסווג חינם של התנהגות בעלי חיים כמו JAABA15.
  5. לחץ על האפשרות כיול שלוש פעמים, תוך כדי בדיקה שמדד התנועה נשאר מתחת ל- 100 (סף). לאחר מכן, הגדר את הציוד לנעילה על-ידי לחיצה על הלחצן המתאים על המסך.
    הערה: סעיף זה מתאר תהליך כיול מערכת הקפאה באמצעות מותג מסוים של ציוד המפורט בטבלת החומרים. כפי שהוזכר קודם לכן, תהליך הכיול יכול לערך באמצעות מותגים שונים של ציוד (לסקירה של אפשרויות שונות בציוד ותוכנה ראה Anagnostaras ואח ' 2010)16.

4. אימון מורחב למיזוג פחד

  1. להעביר את החולדות בכלובים הביתיים שלהם, מכוסה במטלית, ממתקן טיפול בבעלי חיים לחדר האימונים ההתנהגותי במעבדה. הימנע מחשיפה לרעש או לתנאים ליצירת מתחים במהלך העברת בעלי חיים לחדר האימונים ההתנהגותי. אם מספר בעלי חיים מועברים בו זמנית, להביא את בעלי החיים רק להיבדק ולתחזק חולדות אחרות בחדר מעצר כדי לשפר את השליטה הניסיונית. לטפל בעדינות בבעלי החיים במשך 2 דקות לפני תחילת האימון.
    הערה: בפרוטוקול, בעלי החיים טופלו כל יום במשך 2 דקות לפני אימון התנהגותי. לאחר הטיפול, בעלי חיים הוצגו בתא הניסוי. המלצנו לתמרן בעלי חיים כדי להפוך חולדות למגורים לחוקר.
  2. הצג את העכברוש לתא הניסיוני. טפל בו בעדינות על ידי בסיס זנבו והישם אותו באמצע התא. סגור את התא הניסיוני ודלתות התיבה המיוחכות.
  3. התחל את ההפעלה על-ידי לחיצה על לחצן הקלט. תן לעכברוש להסתגל לתא למשך 3 דקות. תקופה זו של 3 דקות היא התקן המומלץ על ידי יצרן הציוד ומשמשת כזמן בסיסי וזמן מגורים לתא.
  4. ספק 25 זיווגים (ניסויים) עם מרווח זמן בין-ניסיון (ITI) של 60 שניות, החל מדקה 3 של ההפעלה. הצג את הטון (גירוי מותנה – CS; 90 dB SPL, 2000 הרץ, 50-ms זמן עלייה) במהלך 10 s האחרון של כל ITI, ואת ההלם (גירוי ללא תנאי – ארה"ב) במהלך 2 s האחרונות של כל ITI.
    הערה: הפעלת לחצן הקלט מותנית בכך שמצלמות מכוילות ונעולות כראוי.
  5. הסר את העכברוש מהתא הניסיוני כאשר הפגישה של 28 דקות הסתיימה. להחזיר בעלי חיים לכלוב הבית בהתאמה. להעביר את החולדות בכלובים הביתיים שלהם מכוסה במטלית מחדר האימונים ההתנהגותי למתקן לטיפול בבעלי חיים.
  6. חזור על כיול מערכת זיהוי הקפאה (שלבים 3.1-3.5) ועל מיזוג פחד (שלבים 4.1 ו- 4.3) כדי לאמן את כל הנושאים.
    הערה: אנו ממליצים בחום כייל מחדש של מערכת הזיהוי עבור כל בעל חיים כדי להבטיח שהתוכנה תשמור על אותם פרמטרים כאשר היא מעבדת מידע לזיהוי הקפאה.
  7. תקופת מנוחה: במהלך תקופה זו, בעלי החיים נחים בנפרד בכלובים הביתיים שלהם. לפקח על המשקל של בעלי החיים פעמיים בשבוע במהלך 6 השבועות של תקופת הדגירה. לתמרן בעדינות כל בעל חיים במשך שתי דקות בזמן שהם משוקללים.

5. מבחן הקשר – הפעלה אחת של 10 דקות

  1. לאחר שלב האימון, לחשוף את בעלי החיים למבחן הזיכרון הראשון שנקרא מבחן הקשר. במהלך שלב זה של 10 דקות, לחשוף את החולדות לאותו הקשר שבו האימונים התקיימו אך לא להציג רמזים או זעזועים. להעביר את החולדות בכלובים הביתיים המכוסים שלהם (למשל, עם מטלית) ממתקן הטיפול בבעלי חיים לחדר האימונים ההתנהגותי. יש לזכור כי בעלי חיים חולקו לקבוצות, ולכן קבוצה אחת נבדקת 48 שעות לאחר שלב האימון והקבוצה השנייה נבחנת 6 שבועות לאחר האימון (ראה איור 1).

Figure 1
איור 1: ציר הזמן של הניסוי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. נקה את כל המשטחים הפנימיים של התא הניסיוני ואת רצפת הרשת מפלדת אל-חלד עם 10% אתנול. חזור על הפעולה לפני שתבדוק כל חיה.
  2. חזור על כיול מערכת זיהוי הקפאה (שלבים 3.1 עד 3.5). פתח את חלון הדו-שיח של הגדרת ניסוי וטען את הקובץ בשם "protocol.pro בדיקת הקשר", הזמין http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    הערה: קובץ זה מכיל את ההתקנה עבור שלב ניסיוני זה המורכב ללא זעזועים או גוונים.
  3. הצג את החיה לתא הניסיוני. טפל בו בעדינות על ידי בסיס זנבו והישם אותו באמצע התא. סגור את התא הניסיוני ודלתות התיבה המיוחכות.
  4. התחל את ההפעלה על-ידי לחיצה על לחצן הקלט. במהלך אחד זה 10 דקות הקשר מבחן הפעלה, אין גירויים מוצגים (הלם אף קול).
  5. הסר את הנושא מהתא הניסיוני כאשר הפגישה של 10 דקות הסתיימה. החזירו את בעלי החיים לכלובים שלהם והעבירו את החולדות בכלובים הביתיים המכוסים שלהם מחדר האימונים ההתנהגותי למתקן לטיפול בבעלי חיים. חזור על שלבים 5.2-5.5 כדי לבדוק את כל הנבדקים.

6. מבחן Cue – יחיד 13 דקות מושב

  1. יום אחד לאחר בדיקת ההקשר, בעלי חיים לעבור את המבחן השני של זיכרון שנקרא מבחן cue. בשלב זה, החולדות יהיו בהקשר שונה של אימון במהלך 13 דקות; רמזים (גוונים) מוצגים, אך לא מועברים זעזועים. להעביר את החולדות בכלובים הביתיים שלהם מכוסה בכיסוי ממתקן טיפול בבעלי חיים לחדר האימונים ההתנהגותי. לבחון קבוצה 72 שעות לאחר אימון מיזוג הפחד, ולבדוק קבוצה אחרת 6 שבועות ויום אחד לאחר האימון(איור 1).
    הערה: ניתן ליישם מערכת תחבורה שונה (ממתקן הטיפול בבעלי חיים לחדר הניסיוני) כדי להבדיל יותר את ההקשר ואת המבחנים. מאחר שבעלי החיים הועברו לאימון ולמבחן הקשר בכלובים הביתיים שלהם, ניתן להשתמש בכלוב תחבורה שונה, מצעים ו/או כיסוי במהלך ההסעות למפגש הבדיקה של הסימן.
  2. נקה את כל המשטחים הפנימיים של התא הניסיוני ואת רצפת הרשת מפלדת אל-חלד עם 10% אתנול. חזור על הפעולה לפני שתבדוק כל חיה.
  3. כדי לשנות את ההקשר החזותי, הכנס את הקיר המקיף את הפלסטיק לתא הניסיוני.
  4. כדי לשנות הקשר חוש הריח, למרוח 1% חומצה אצטית על ספוגית כותנה קצה, ולמקם אותו במגש מתכת מתחת לרצפת הרשת17,18,19.
  5. חזור על כיול מערכת זיהוי ההקפאה (שלבים 3.1-3.5). טען את הקובץ בשם הקובץ "protocol.pro תותן" קובץ, הזמין http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    הערה: קובץ זה מכיל את ההתקנה עבור שלב ניסיוני זה, המורכב ממסירה של אותם גוונים המוצגים במהלך שלב האימון (CS), אך בהיעדר זעזועים (ארה"ב).
  6. הצג את החיה לתא הניסיוני. טפל בו בעדינות על ידי בסיס זנבו והישם אותו באמצע התא. סגור את התא הניסיוני ודלתות התיבה המיוחכות.
  7. התחל את ההפעלה על-ידי לחיצה על לחצן הקלט. במהלך הבדיקה היחידה של 13 דקות, הגירוי של CS (טון) מוצג 10 פעמים, החל מדקה 3 של הפגישה.
    הערה: 3 השעות הראשונות תואמות לקו הבסיס של הפעלה זו, ואחריהן 10 ניסויי בדיקת cue (כלשהם, 10 שניות כל אחד) שנמסרו עם ITIs של 50 s בהיעדר זעזועים. מסירת הגוונים היא אוטומטית, באמצעות הקובץ שנטען בעבר.
  8. מוציאים את החיה מהתא הניסיוני כאשר הפגישה של 13 דקות נגמרת. החזר בעלי חיים לכלוב המתאימים והעביר אותם מכוסים למתקן לטיפול בבעלי חיים. חזור על שלבים 6.2 עד 6.5 כדי לבדוק את כל הנבדקים.

7. ניתוח נתונים

  1. השג את מדד הפעילות הכללית (כלומר, אינדקס תנועה) הנגזר מזרם הווידאו באמצעות תוכנת מערכת זיהוי ההקפאה. תוכנה זו משנה באופן אוטומטי את מדד התנועה כדי לספק את אחוז זמן ההקפאה בכל הפעלה ואת מספר פרקי ההקפאה. הגדר את סף ההקפאה להגדרת ברירת המחדל של משך ההקפאה המינימלי של המערכת (1 s = 30 מסגרות).
  2. השתמש בתוכנית הנוספת בהזמנה אישית (קובץ זמין http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ) כדי להשיג:
    1. השתמש בתוכנית כדי לקבוע את אחוז ההקפאה במהלך שלוש הדקות הראשונות של האימון (כלומר, הקפאה בסיסית, שכן לא הוצגו זעזועים או גוונים לפני או במהלך תקופה זו של 3 דקות) ובמהלך שלוש הדקות הראשונות של הבדיקה של הסימן.
    2. השתמש בתוכנית כדי לקבוע את אחוז ההקפאה עבור כל אחד משמונה 3 דקות פחים של האימון.
    3. השתמש בתוכנית כדי לקבוע את אחוז ההקפאה במהלך מצגות הסימן (כלומר, הקפאה במהלך הגוונים) ותקופות ללא תווים (מרווחי זמן בין-משפטיים; ITIs), הן לאימונים והן למבחנים.
  3. כדי להשיג נתונים אלה, פתח את תוכנת מערכת זיהוי ההקפאה.
    1. בחר קובץ | דוחות | סיכום רכיב אצווה.
    2. בחר את הקובץ עם סיומת . CMP זמין http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    3. תן שם לקובץ הפלט ושנה את סף התנועה ל- 100. לאחר מכן, לחץ על אישור.
    4. בחר את הקבצים שיש לנתח (סיומת . RAW). קבצים אלה נוצרים באופן אוטומטי מהתוכנה של מערכת זיהוי הקפאה כאשר ההפעלה נגמרת ומתאימות לנתונים הגולמיים של כל הפעלה. בתחילה, הקבצים נשמרים בשולחן העבודה של המחשב, אך ניתן לאחסן אותם בתיקיה מותאמת אישית (לדוגמה, מיזוג מסמכים-פחד) כדי להקל על הזיהוי והפתיחה הבאים שלהם כאשר יש לנתח אותם.
    5. פתח את קבצי הפלט (סיומת . CSV). ניתן לערוך ם בתוכנה גיליון אלקטרוני לניתוח נוסף. קובץ זה מכיל את תוצאות ההקפאה במהלך ההפעלה הניסיונית.
      הערה: כדי לקבל את האחוז הכולל של ההקפאה, חלק את הזמן שהנושא בילה ללא תנועה לאורך זמן ההפעלה הכולל. ניתן לחשב את מספר פרקי ההקפאה בספירה של מספר אירועי ההקפאה במהלך ההפעלה. בשני המקרים, יש להגדיר סף תנועה המבוסס על משך הקפאה מינימלי. זהו הקריטריון הזמני המגדיר אם פרק הקפאה נרשם. מערכות הקלטה אוטומטיות יכולות להשתמש בכמות מסוימת של מסגרות לשניה (fps) כמדד למשך הקפאה מינימלי. לדוגמה, עם קצב דגימה של 30 fps, משך הקפאה מינימלי של 15 מסגרות יתואם כהקפאה של מופע של חוסר ניידות להימשך 30 s.
  4. חשב את משך הזמן הממוצע של כל פרק הקפאה עבור כל הפעלה (אימון והן בדיקות, הקשר וסימן) על-ידי חלוקת משך ההקפאה הכולל (בשניות) על פני המספר הכולל של פרקי הקפאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

וריאציות באחוז זמן ההקפאה בשלבים שונים של האימון נותחו עבור כל הנושאים (n = 12) באמצעות בדיקת t תלויה (טבלה 1). בעלי חיים היו פעילים וחקרו את התא הניסיוני במהלך שלוש הדקות הראשונות של האימון (היום הראשון של הפרוטוקול), זמן שבמהלכו לא נמסרו גוונים או זעזועים (כלומר, קו הבסיס-BL). כפיצג באות 2A, אחוז זמן ההקפאה במהלך 25 הזיווגים הבאים של הלם טון (M = 48.88; SE = 4.37) היה גבוה משמעותית מאשר במהלך BL (M = 14.65; SE = 4.05), אשר מניח כאינדיקציה לרכישת פחד.

בדיקת סטטיסטיקה איור (איור) שלבים ושלבים
מבחן t תלוי 2A (2א) t (11) = -6.21, p < .001, d = 2.34
פחי 3 דקות
צעדים חוזרים ונשנים ANOVA 2B (2B) F (3.75, 41.32) = 11.19, p < .001, ηp2 = .50.
שלבים ושלבים קבוצה (קבוצה) קבוצת שלבים X
ANOVA מעורב 2C (2C) F(3, 30) = 14.21, p < .001, ηp2 =.58 F(3, 30) = 4.63, p < .05, ηp2 =.31 F(1, 10) = 2.06, p >.05, ηp2 =.17
ANOVA חד-דרך 3A -------- F(1, 10) = 6.91, p < .05, ηp2 =.40
ANOVA חד-דרך 3B (3B) F(1, 10) = 10.30, p < .05, ηp2 =.50
ANOVA חד-דרך 3C (3C) F(1, 10) = 5.83, p <. 05, ηp2 =.36
ANOVA מעורב 4א 'לה F(2, 20) = 29.28, p < .001, ηp2 =.74 F(2, 20) = 2.33, p >.05, ηp2 =.18 F(1, 10) = 2.14, p >.05, ηp2 =.17
ANOVA מעורב 4B (4B) F(1, 10) = 1.53, p >.05, ηp2 =.13 F(1, 10) = 3.98, p < .05, ηp2 =.28 F(1, 10) = .23, p >.05, ηp2 =.02
ANOVA מעורב 4C (4C) F(1, 10) = 25.43, p < .001, ηp2 =.71 F(1, 10) = 6.17, p < .05, ηp2 =.38 F(1, 10) = .22, p >.05, ηp2 =.02

טבלה 1: סטטיסטיקה המשמשת בניתוח הנתונים. עבור איור 2A, אחוז ממוצע של הקפאה של כל הנושאים (n = 12) במהלך 3 הדקות הראשונות של האימון (המקביל לקו הבסיס, BL) הושווה לאחוז ההקפאה במהלך 25 הדקות הנותרות של ההפעלה (25 ניסויים בהלם טון) המציג הבדל משמעותי וגודל אפקט גדול(כהן של * 2.34). עבור איור 2B, בוצעה השוואה על פני פחים של 3 דקות המציגים הבדל משמעותי במבחן ANOVA של אמצעים חוזרים (BL ושמונה פחי 3 דקות). עבור איור 2C, השוואות בין אחוז ההקפאה ממוצע של כל קבוצת חולדות במהלך הבסיס (BL, 3 הדקות הראשונות של האימון), תקופת אימון (25 זיווגים של הלם טון), מפגש מבחן הקשר ומפגש מבחן cue נערכו באמצעות ANOVA מעורב עם גורם בין נושאים הקבוצה (48 שעות או 6 שבועות) ובתוך נושאים גורם את השלבים (BL, הכשרה, בדיקת הקשר ומבחן Cue). נמצאו הבדלים בשלבים ובקבוצה, אך לא באינטראקציה שלבים*קבוצה. איור 3A – 3B מציג נתונים על פעילות (לוח 3A, מדד תנועה), הקפאה (לוח 3B, כלומר הקפאה בשניות) ומשך פרקים (פאנל 3C, אומר הקפאת פרקים בשניות). נתונים אלה נותחו באמצעות ANOVA חד-כיוון, אשר הצביע על הבדלים בין קבוצות בכל המדידות. לבסוף, עבור איור 4A – 4C ANOVA מעורב בוצע עבור כל פאנל (A, B ו-C), לאחר בין נושאים גורם הקבוצה (48 שעות או 6 שבועות) ובתוך נושאים גורם השלבים (BL, הדרכה, מבחן הקשר ומבחן Cue).

Figure 2
איור 2: שלב אימון של פרוטוקול מורחב של מיזוג פחד cued. הנתונים מוצגים כמ ממוצע (פסים) ו- SEM (קווי שגיאה) של תגובת ההקפאה. (A) מראה אחוז מתכוון של הקפאה של כל הנושאים (n = 12) במהלך 3 הדקות הראשונות של האימון, במהלכן לא הוצגו זעזועים או צלילים (בסיסי, BL) ואת 25 הדקות הנותרות של ההפעלה (25 ניסויים בהלם טון, עם מרווח בין משפט, ITI, של 60 s); = שונה מ- BL(p < .001). (ב)מציג זמן הקפאה ממוצע של כל בעלי החיים (n = 12) במהלך תקופת הבסיס של 3 דקות (BL, ללא זעזועים או גוונים שנמסרו) ו-3 דקות לאחר מכן פחים של האימון; = שונה מכל הפחים הנותרים(p < .001). (C) מראה אחוז מתכוון של הקפאה של כל קבוצה של חולדות (בדיקות 48 שעות לאחר האימון; בדיקות 6 שבועות לאחר האימון) במהלך הבסיס (BL, 3 הדקות הראשונות של האימון), תקופת אימון (25 זיווגים הלם טון), מבחן הקשר, ומפגש מבחן cue; * = שונה מבדיקות לאחר 48 שעות (ממוצע diffContext = -34.95, SE = 14.99, p < .05, כהן של d = 1.34); a = שונה מתקופתאימון ( ממוצע diffTraining48h = 42.51; SE = 7.28; ב-2015, לאחר ש-100 מיליון דולר, כהן של * 3.03); b = שונה מתקופת האימונים (ממוצע diffTraining6Weeks = 25.94; SE = 7.28; ב-2015, לאחר ש-100 מיליון דולר, כהן של * 1.77), מבחן הקשר (ממוצע diffContext6Weeks = 50.36; SE = 10.58; ב-2015, לאחר ש-100 מיליון דולר, כהן של * 3.13), ומבחן cue (אומר diffCue6Weeks = 55.86; SE = 10.25; ב-2015, לאחר ש-100 מיליון דולר, כהן של * 2.47). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

ניתוח של תגובת ההקפאה לאורך כל הרכישה נערך על ידי פילוח האימון בשמונה פחי 3 דקות (איור 2B). נתונים אלה מראים כי הזמן המוקצה לתגובה זו מגיע ל- asymptote ליד או ב- 180 s במהלך שלושת הניסויים הראשונים בהלם טון (כלומר, סל 1). ממצא זה נחשב במחקרים קודמים כאינדיקציה לאומת יתר11. צעדים חוזרים ונשנים של ANOVA חשפו הבדלים משמעותיים עקביים בין הבסיס לבין כל הפחים הבאים, עם גדלי אפקטים גדולים(טבלה 1 וטבלה 2).

השוואה בין אנשים הבדל משמעות שגיאה רגילה ערך p כהן של d
סל בסיסי לעומת סל 1 -60.075* 12,243 0.05 .05 1.95
סל בסיסי לעומת סל 2 -69.053* 16,220 0.05 .05 1.89
סל בסיסי לעומת סל 3 -66.197* 13,706 0.05 .05 1.91
סל בסיסי לעומת סל 4 -68.595* 11,969 0.05 .05 2.08
סל בסיסי לעומת סל 5 -65.475* 10,991 0.05 .05 2.15
סל בסיסי לעומת סל 6 -65.795* 13,509 0.05 .05 2.06
סל בסיס לעומת סל 7 -72.900* 12,231 0.05 .05 2.53
סל בסיסי לעומת סל 8 -78.633* 8,692 ב-2015, לאחר ש 3.37

טבלה 2: הפרש ממוצע, שגיאה סטנדרטית וגודל אפקט עבור פחי 3 דקות באות 2B. טבלה זו מציגה את ההשוואות בין סל הבסיס לבין כל אחד מהפחים הבאים (איור 2B). הבדל משמעות, שגיאה סטנדרטית וערך pו- d של כהן מדווחים כאינדקס בגודל של הבדלים אלה (גודל אפקט).

ANOVA מעורב נערך כדי לבדוק את ההבדלים באחוז ההקפאה במהלך המשימה, לאחר שלבים (BL, אימון, בדיקת הקשר, ומבחן cue) כגורם בתוך הנושא וקבוצה (48 שעות ו 6 שבועות) כגורם ביןהנושאים (טבלה 1). אחוז ההקפאה של כל בעלי החיים במהלך תקופת האימון היה גבוה משמעותית מאשר במהלך תקופת הבסיס (ראה איור 2C). לא נצפו הבדלים משמעותיים בין אחוז ההקפאה במהלך בדיקות הזיכרון לבין תקופת האימון (ps > .05).

לא נצפו הבדלים משמעותיים בין שתי הקבוצות (48 שעות ו-6 שבועות) באחוז ההקפאה במהלך בדיקת BL, אימון ומבחן רמז (ps > .115; ראה איור 2C). לעומת זאת, בעלי חיים שנבדקו 6 שבועות לאחר האימון הראו אחוזים גבוהים משמעותית של הקפאה במהלך מבחן ההקשר מאשר בעלי חיים שנבדקו ב 48 שעות, עם גודל אפקט גדול (ראה איור 2C). בסך הכל, איור 2C מראה כי הקפאה במהלך ההקשר לטווח ארוך ובדיקות cue (כלומר, 6 שבועות לאחר האימון) היה גבוה באופן משמעותי באופן כללי מאשר במהלך האימון. מגמת הירידה ההפוכה נצפתה בקבוצת בעלי החיים שנבדקו 48 שעות לאחר האימון. עם זאת, הבדלים אלה בקבוצה של 48 שעות לא היו משמעותיים סטטיסטית (ps > .05). לבסוף, למרות רמת ההקפאה הראה הבדלים על פני שלבים שונים, הם יכולים להיחשב נמוך בהשוואה לפרוטוקולים אחרים. הסבר אחד יכול להיות הבדלים מתודולוגיים טבועים בין מעבדות או סף מדד התנועה שנקבע במהלך תהליך הכיול, מה שהופך את השוואת הנתונים בין מעבדות קשה.

תגובת ההקפאה המותנה של שתי קבוצות הנבדקים במהלך מבחן ההקשר נחקרה עוד יותר באמצעות ניתוח של אמצעים אחרים, כלומר פעילות ממוצעת (כלומר,מדד תנועה),זמן הקפאה כולל וזמן הקפאה לפרק. ANOVA חד-דרך שימשה לבדיקה של הבדלים בין משתנים אלה (טבלה 1). פעילות הנבדקים שנבדקו 6 שבועות לאחר האימון הייתה נמוכה משמעותית מזה של בעלי חיים שנבדקו 48 שעות לאחר האימון(איור 3א). בהתאם לכך, זמן ההקפאה הכולל של בעלי חיים שנבדקו זמן קצר לאחר האימון היה נמוך משמעותית מזה של בעלי חיים שנבדקו 6 שבועות לאחר(איור 3B). לבסוף, ניתוח של משך הזמן הממוצע של כל פרק הקפאה הצביע על כך שבעלי חיים שנבדקו 6 שבועות לאחר האימון הציגו פרקי הקפאה ארוכים יותר מאשר בעלי חיים שנבדקו 48 שעות לאחר אימון (איור 3C). בסך הכל, ממצאים אלה מצביעים על אפקט דגירה של פחד.

Figure 3
איור 3: השפעות של פרוטוקול מיזוג פחד מורחב על הקפאת תגובה של חולדות.
הנתונים מוצגים כמ ממוצע (פסים) ו- SEM (קווי שגיאה) של תגובת ההקפאה. (א)מראה פעילות (כלומר, מדד תנועה) של כל קבוצת נושאים (בדיקה 48 שעות לאחר האימון; בדיקה 6 שבועות לאחר האימון) במהלך מבחן ההקשר; * = שונה מ 6 שבועות. (ב)מציג את זמן ההקפאה הכולל הממוצע (בשניות) של כל קבוצת נושאים במהלך בדיקת ההקשר; * = שונה מ 6 שבועות. (ג)מציג את משך הזמן הממוצע של כל פרק הקפאה (בשניות) עבור כל קבוצת נושאים במהלך בדיקת ההקשר; * = שונה רק מ 6 שבועות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

בדיקה נוספת של הביצועים במהלך הפעלת מבחן הסימן נערכה באמצעות ניתוחים של (א) אחוזי הקפאה בתקופות בסיסיות (אימון BL ומבחן Cue BL) ובמהלך כל מבחן 10 דקות הסימן (עשר מצגות טון של 10 ועשר ITIs של 50 s - איור 4 A), (ב) זמן הקפאה ממוצע במיוחד במהלך 10 מצגות של הסימן (טון), הן עבור אימונים והן עבור הפעלות מבחן Cue(איור 4B),ו-(ג) זמן הקפאה ממוצע (בשניות) במהלך מרווחי הזמן הבין-משפטיים (ITIs; כלומר, תקופות ללא גוון בלבד – איור 4C). ANOVA מעורב שימש לניתוח כל אחד מהאמצעים phases התלויים הללו, בהנחה שלבים (אימון BL, בדיקת Cue BL, ו- Cue Test) כגורם בתוך נושאים וקבוצות (48 שעות ו 6 שבועות) כגורם בין נושאים(טבלה 1). כפי שמתואר באיור 4A, קבוצת החולדות שנבדקו 6 שבועות לאחר האימון הגדילה באופן משמעותי את אחוז ההקפאה שלהן במהלך קו הבסיס של הפעלת Cue Test (מבחן Cue BL; 3 הדקות הראשונות של המפגש) ובמהלך מבחן Cue של 10 דקות, בהשוואה לאימוני BL (כלומר, לפני כל חשיפה לגוונים וזעזועים). לא נצפה הבדל מקביל בין אימון BL לבין BL Cue עבור קבוצת החולדות שנבדקו לאחר 48 שעות(p > .05). עבור שתי קבוצות החולדות, אחוז ההקפאה במהלך בדיקת Cue של 10 דקות היה גבוה יותר מאשר במהלך תקופת הבסיס המתאימה של אותה הפעלה (BL Cue Test), מה שמצביע על אפקט אחזור. לא נצפו הבדלים בין קבוצות החולדות באחוז ההקפאה בתקופות השונות (ps > .05).

איור 4B מציג השוואה של זמן הקפאה מתכוון (בשניות) במיוחד במהלך מצגות הטון של 10 שניות על-פני הדרכה (זיווגים של הלם טון) ו-Cue Test (מצגות טון בלבד). רק חולדות שנבדקו 6 שבועות לאחר האימון הגדילו באופן משמעותי את משך ההקפאה של הזמן במהלך הסימן.

לבסוף, כפי שהראה על איור 4C, רק קבוצת החולדות נבדק 48 שעות לאחר אימון הפחית באופן משמעותי את זמן ההקפאה במהלך ITIs ממפגש האימון למבחן Cue. לא נצפו הבדלים בזמן ההקפאה במהלך ITIs על פני שתי קבוצות שלחולדות (ps >.05).

Figure 4
איור 4: השפעות של פרוטוקול מיזוג פחד מורחב על הקפאת תגובה במהלך בדיקת הסימן.
הנתונים מוצגים כמ ממוצע (פסים) ו- SEM (קווי שגיאה) של תגובת ההקפאה. (A) מציג את אחוז ההקפאה של כל קבוצת נבדקים (בדיקה 48 שעות לאחר האימון; בדיקה 6 שבועות לאחר האימון) במהלך 3 הדקות הראשונות של האימון (BL, בסיס), את 3 הדקות הראשונות של הפעלת מבחן הסימן (BL Cue) ו-10 דקות של מבחן הסימן (Cue Test); a = שונה ממבחן Cue לאחר 48 שעות (ממוצע diffBLTraining-Cue48h = 32.84; SE = 10.25; ב-2015, לאחר ש-100 מיליון דולר, כהן של * 1.52); b = שונה ממבחן Cue BL (ממוצע diffBLCue-BL6Weeks = 33.98; SE = 8.36; ב-2015, לאחר ש-100 מיליון דולר, כהן של * 1.59) ו מבחן Cue (ממוצע diffCue-BL6Weeks = 55.86; SE = 10.25; ב-2015, לאחר ש-100 מיליון דולר, כהן של * 2.47); c = שונה ממבחן Cue לאחר 48 שעות (ממוצע diffBLCue-Cue48h = 18.99; SE = 5.17; ב-2015, לאחר ש-100 מיליון דולר, כהן של = .67); d = שונה ממבחן Cue לאחר 6 שבועות (ממוצע diffBLCue-Cue6Weeks = 21.87; SE = 5.17; ב-2015, לאחר ש-100 מיליון דולר, כהן של = .88). (ב)מציג את זמן ההקפאה הממוצע (בשניות) במהלך cue (טון) של כל קבוצת נושאים במהלך אימון ומבחן Cue; * = שונה מ 6 שבועות במהלך תקופת הבדיקה של מבחן Cue (ממוצע diffהדרכה-Cue6Weeks = -3.14; SE = 1.37; ב-2015, לאחר ש-100 מיליון דולר, כהן של * 1.64). (C) מציג את זמן ההקפאה הממוצע (בשניות) במהלך המרווחים הבין-משפטיים (ITI) של האימון (10 זיווגים בזעזוע טון) ומבחן Cue (10 מצגות בגוונים בלבד) על פני שתי קבוצות החולדות (48 שעות ו-6 שבועות); = שונה מאימונים לקבוצת חולדות שנבדקו 48 שעות לאחר האימון (ממוצע diffTraining-Cue48h = 506.16; SE = 95.08; ב-2015, לאחר ש-1000 מיליון דולר, כהן של * 2.48). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול מיזוג הפחד המורחב הנוכחי הוא גישה יעילה ותקפה להערכת זיכרון רגשי בתקופות קצרות (48 שעות) ותקופות ארוכות טווח (6 שבועות). לפיכך, הפרוטוקול מאפשר ללמוד עודף על תופעות דגירה וחשש בחולדות. בין היתרונות השונים של פרוטוקול זה הם להלן. הוא מציע שני סוגים של בדיקות זיכרון, כלה הקשר וסימן, המאפשרים לזהות את ההשפעה הה דיפרנציאלית של שני עיכובים (48 שעות ו- 6 שבועות) על פני מניפולציות הקשר וסימן. שנית, המשימה כרוכה אימון יחיד 28 דקות, אשר בתורו מייצר השפעות ארוכות טווח המשתרעות על ידי מספר שבועות. יתרון זה הוא יוצא דופן, בהתחשב בכך כמה גרסאות של מיזוג פחד מורחב צריך לפחות 100 זעזועים על פני 10 מפגשים שלאימון 11. שלישית, הפרוטוקול מציע מספר חלופות מדידה, המחושבות באופן אוטומטי. בנוסף, יש הצטברות ראיות פרמקולוגיות, פיזיולוגיות, ואנטומיות התומכות בתקפות הפרדיגמה הזו להערכת תופעות זיכרוןרגשיות 15,,16.

בהשוואה לפרדיגות אחרות של מיזוג פחד עם אימונים קצרים (כלומר, מעט ניסויים), פרוטוקולים מורחבים התוצאתם השפעות אימון יתר קיבלו פחות תשומת לב. עם זאת, משימות מורחבות של מיזוג פחד היו המפתח להבנת התהליכים ההתנהגותיים והנוירוביולוגיים הבסיסיים של הדגירה של הפחד, כולל הקשר שלה עם תופעות פסיכולוגיות אחרות (למשל, הפרעת דחק פוסט-טראומטית מאוחרת)11,,12,,13. פרוטוקול מיזוג הפחד הנוכחי מייצר באופן אמין דגירה של פחד. זה מדגים עם זמני הקפאה גבוהים יותר ומדדי תנועה נמוכים יותר בבעלי חיים העריכו 6 שבועות לאחר האימון, לעומת בעלי חיים שנבדקו 48 שעות לאחר אימון. בנוסף, ניתן לצפות באפקט זה באופן דיפרנציאלי בכל אחד מסוגי הבדיקה; באופן ספציפי, פרקי הקפאה ארוכים יותר במהלך מבחן ההקשר 6 שבועות לאחר אימון ומותן בהקפאה במהלך מצגות cue 6 שבועות לאחר האימון. קשור לאפקט האחרון הזה (כלומר, מותווה בהקפאה במהלך מצגות cue 6 שבועות לאחר האימון), נראה כי החידוש של המצב הניסיוני (כלומר, הקשר חדש) ניתן למחוק, מאז רמות ההקפאה הבסיסית במהלך אותה הפעלה היו נמוכות באופן משמעותי מאשר במהלך מצגות cue הבאות.

למרות מגמה לקראת למידה פחד היה ניכר בשתי הקבוצות (כלומר, הבדלים בין 3 דקות בסיס ואימונים), בעלי חיים שנבדקו לאחר 48 שעות (הקשר) ו 72 שעות (cue) לא הפגינו הבדלים משמעותיים ברמת ההקפאה במהלך שתי הבדיקות. ניתן לראות בכך מגבלה של הפרוטוקול, שנראית כתוצאה משונות התנהגותית גבוהה בקבוצה 48 שעות (ראה איור 2C). שינוי מתודולוגי שניתן ליישם על מנת להפחית את השונות ולשפר את ההליך הוא לבצע את ההקשר ומבחן cue 24 שעות לאחר אימון, אשר נפוץ בכמה הליכי מיזוג פחד.

הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם במחקר קליני23. עקבות זיכרון חזקים ואפקט הדגירה הנובעים מיישומו עשוי לאפשר לבדוק את ההשפעות של תרופות המשמשות באופן קבוע לטיפול בפתולוגיות פסיכולוגיות ופסיכיאטריות (למשל, טיפולים ברגולטורים אקסיוליטיים או מצב רוח24)על תופעות זיכרון רגשי (למשל, חשש להכחדה)25,26,27. הפרוטוקול כך יכול לאפשר למדוד את ההשפעה של תרופות על עקבות זיכרון על פני מסגרות זמן שונות, כולל קורלציה ביולוגית כגון נוירוטרנסמיטורים ומולקולות הקשורותלתחזוקת זיכרון 28,29. הפרוטוקול יכול להיות גם רלוונטי למחקר עם פרספקטיבה תרגום, אשר הציע כי פרדיגמות פחד יכול להיות שימושי כדי לבדוק מודלים פרה-קליניים שלטיפולים התנהגותיים 30 ומחקרים השוואתיים על פחדעל פני מינים 21,22. לבסוף, מתוך השקפה נוירוביולוגית, הפרוטוקול הנוכחי הוא מודל חזק ללמוד מנגנוני מוח, תקשורת בין מבנים, רשתות או הרכבים עצביים המעורבים ברכישה לטווח ארוך, קונסולידציה ואחסון של זיכרון רגשי, או השפעות של דגירהבמהלך פיתוח 32.

כמה היבטים אחרים של הפרוטוקול שווה לדון. מניעת מזון שימשה לאורך כל הניסוי. החלטה זו אומצה משום שניתן לשלב בדיקות התנהגותיות אחרות המבוססות על תגמולי מזון (לדוגמה, טכניקות אופרנטיות או אינסטרומנטליות)33,34,35, עם שינויים מינימליים, מה שהופך את הפרוטוקול הנוכחי לטכניקה רב-תכליתית יותר., לדוגמה, שילבנו בהצלחה פרוטוקול זה עם פרוטוקולי פעילות גופנית מבוססי גלגל ומשימות זיכרון T-מבוך. היבט נוסף קשור לגודל הקבוצה (n=6) המיושם בפרוטוקול זה. למרות שזה היה מדגם קטן יחסית, דגימות גדולות יותר מומלץ בהחלט, הגודל של אפקט הדגירה מפצה על מגבלה זו (ראה טבלה 1). הדבר יכול להיחשב כיתרון של פרוטוקול זה, במיוחד בכל הנוגע להמלצות ועדות בעלי חיים המבוססות על עקרון ההפחתה. מגבלה של הפרוטוקול הייתה כי חשיפה מינימלית או ללא חשיפה לרעידות רגליים ומסלול זמן של דגירה פחד לא הוערכו. קבוצת בקרה נוספת עם התנאים שלפני יכול להגדיל את הקשיחות של העיצוב הניסיוני.

המלצות סופיות ליישום הטוב ביותר ותוצאות פרוטוקול זה כוללות ניקוי נכון של התא הניסיוני, במיוחד רצפת הרשת, כיול עוצמת ההלם לפני אימון כל נושא (למשל, צואה ושתן לעתים קרובות להפחית את האמינות של עוצמת ההלם על פני אזורים שונים של התא) והקפאת כיול מערכת זיהוי (אמינות אמצעי ההקפאה תלויה בהגדרה נכונה של סף תנועה ומשך הקפאה מינימלי).

פרוטוקול זה יכול להיבדק עם זנים אחרים של חולדות או מכרסמים אחרים (למשל, עכברים או גרבילים מונגוליים), הרחבת היקף היישומים. במקרים אלה, חשוב להתאים את עוצמת ההלם, ואת סף תנועה ומשך. עוצמת ההלם המשמשת בפרוטוקולים מיזוג פחד עם עכברים בדרך כלל נע 0.4 mA כדי 1.5 mA, עם 0.75 mA בעוצמה יעילה דיווחלעתים קרובות 16 , 36,3737,38 ו 1.5 mA בעוצמה המדווחתהגבוהה ביותר 39., הגרביל המונגולי הוא מודל מכרסמים שנבחר בתדירות נמוכה יותר למחקר מיזוג פחד; עם זאת, גרבילים מונגוליים שימשו בהצלחה כדי מודל מקצבים היממה ביונקים40. בהתאם לכך, ניתן ליישם את הפרוטוקול הנוכחי כדי ללמוד יחסים פוטנציאליים בין מקצבים ביולוגיים וזיכרון רגשי, שניהם רלוונטיים בפתולוגיות כגון דיכאון, חרדה אושינוי של מצב רוח 41,42. במקרה של גרבילים, טווח עוצמת הלם יעיל עבור זה ופרוטוקולי מיזוג aversive מקבילים הוא בין 1.0 ו 4.0 mA43,44,45,46. לבסוף, חשוב לציין כי יש להתאים את סף התנועה ומשך הזמן בהתאם למין שנבחר47. סף זה הוא המגבלות שנקבעו על תוכנת מעקב התנועה, שמעליה התנהגות בעלי החיים רשומה כתנועה ומתחתיה התוכנה רושמת הקפאה. במחקרי התניה aversive עם עכברים וגרבילים, תנועה יעילה סף משך דיווחים היו 25 ו 30 fps (כלומר, מינימום 1 s חוסר ניידות),בהתאמה 30,35.

כדי להבטיח שליטה נאותה של גירוי aversive (רעידות רגליים), כל המגזרים של רצפת הרשת חייב לספק את אותה עוצמה. מומלץ לכייל את עוצמת ההלם בשלושה מגזרים של רצפת הרשת כדי לוודא שהוא עקבי. הדבר מונע מבעלי חיים ללמוד כדי להפחית את החשיפה לזעזועים על ידי מעבר למקום בקופסה הפולט עוצמה נמוכה יותר. אם הכיול מראה כי רשת המתכת אינה מספקת את אותה עוצמה בכל המגזרים, הסר את הרשת מהרצפה, נקה את המוטות והחלף את הרשת בתא. יש להכניס כראוי את רצפת הרשת לתא כדי להבטיח את תיבת ההילוכים החשמלית הטובה ביותר ממכשיר הגירוי aversive לרצפת הרשת.

המוקד והמצמצם של מצלמת מערכת זיהוי ההקפאה מכוילים על-ידי היצרן. עם זאת, אם נדרש כיול נוסף, שחרר את ה- setscrew בטבעת המוקד, התאם עד להשגת תמונה ברורה ולאחר מכן הדק את ה- setscrew בטבעת המוקד. היצרן ממליץ לנעול את פתיחת העדשה במיקום הפתוח המרבי. כדי להשיג הגדרה זו, ודא שהנקודות הלבנות של טבעת הפתיחה מיושרות עם המספר 1.4 בחבית העדשה. מומלץ להתייעץ עם המדריך של היצרן. שים לב שאם המוקד של המצלמה הותאם, כיול המצלמה באמצעות התוכנה המתאימה חייב להתרחש גם כן. כיול המצלמה דורש התאמה של הבהירות, הרווח והתריס. מומלץ לעיין במדריך של היצרן לקבלת הוראות מדויקות בתהליך כיול המצלמה.

לסיכום, הפרוטוקול מאפשר לבחון זיכרון רגשי בתקופות קצרות וארוך ומייצר דגירה של פחד לטווח ארוך. אפקט זה של דגירה-פחד נוצר באמצעות אימון יתר של הפעלה אחת, אשר מראה אפקטים 6 שבועות מאוחר יותר בהקשר ובדיקות cue. זה מצביע על עקבות זיכרון רגשי חזק. הפרוטוקול הנוכחי הוא גישה יעילה ותקפה לחקור את מרכיבי הזיכרון הרגשי בחולדות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

תמיכה כספית במחקר זה סופקה על ידי Fundación אוניברסיטת קונרד לורנץ - מענק מספר 9IN15151. המחברים רוצים להודות למחלקת התקשורת באוניברסיטת קונרד לורנץ על עזרתם בהקלטה ועריכה של הסרטון, במיוחד נטליה ריברה ואנדרס סראנו (מפיקים). כמו כן, ניקול פלר-סדובסקי ולוסיה מדינה על הערותיהם על כתב היד, וג'ואנה בררו, דיקן באוניברסיטת קורפורציה איבריאמריקנה, לשיתוף פעולה מוסדי. למחברים אין ניגודי עניינים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (ethanoic acid) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid
Aversive Stimulation Current Package MED Associates Inc ENV-420 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Contextual test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Cue test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Curved Wall Insert MED Associates Inc VFC-008-CWI https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Data processing.zip http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
NIR/White Light Control Box MED Associates Inc NIR-100
Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse MED Associates Inc ENV-005FPU-M https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Small Tabletop Cabinet and Power Supply MED Associates Inc SG-6080D https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) MED Associates Inc ENV-414S https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standard Fear Conditioning Chamber MED Associates Inc VFC-008 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Training protocol VFC.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Video Fear Conditioning Package for Rat MED Associates Inc MED-VFC-SCT-R https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nature Reviews Neuroscience. 6 (2), 119-130 (2005).
  2. Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, P. W., Kida, S. Activation of LVGCCs and CB1 receptors required for destabilization of reactivated contextual fear memories. Learning & Memory. 15 (6), 426-433 (2008).
  3. Hermans, E. J., et al. How the amygdala affects emotional memory by altering brain network properties. Neurobiology of Learning and Memory. 112, 2-16 (2014).
  4. Moryś, J., Berdel, B., Jagalska-Majewska, H., ŁUczyńSka, A. The basolateral amygdaloid complex -its development, morphology and functions. Folia Morphologica. 58 (3), 29-46 (1998).
  5. LeDoux, J. E. Emotional memory systems in the brain. Behavioural Brain Research. 58 (1-2), 69-79 (1993).
  6. Labar, K. S. Beyond fear: Emotional memory mechanisms in the human brain. Current Directions in Psychological Science. 16 (4), 173-177 (2007).
  7. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  8. Maren, S. Overtraining Does Not Mitigate Contextual Fear Conditioning Deficits Produced by Neurotoxic Lesions of the Basolateral Amygdala. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 3097-3097 (1998).
  9. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, Unit-6.27 (2013).
  10. Morrow, J. D., Saunders, B. T., Maren, S., Robinson, T. E. Sign-tracking to an appetitive cue predicts incubation of conditioned fear in rats. Behavioural Brain Research. 276, 59-66 (2015).
  11. Pickens, C. L., Golden, S. A., Adams-Deutsch, T., Nair, S. G., Shaham, Y. Long-lasting incubation of conditioned fear in rats. Biological Psychiatry. 65 (10), 881-886 (2009).
  12. Schaap, M. W. H., et al. Nociception and Conditioned Fear in Rats: Strains Matter. PLoS ONE. 8 (12), 83339 (2013).
  13. Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871 (2014).
  14. Patel, T. P., et al. An open-source toolbox for automated phenotyping of mice in behavioral tasks. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 349 (2014).
  15. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: Interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  16. Anagnostaras, S. G. Automated assessment of Pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the VideoFreeze system. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 4 (58), (2010).
  17. Moyer, J. R., Brown, T. H. Impaired Trace and Contextual Fear Conditioning in Aged Rats. Behavioral Neuroscience. 120 (3), 612-624 (2006).
  18. Schuette, S. R., Hobson, S. Conditioned contextual fear memory to assess natural forgetting and cognitive enhancement in rats. Journal of Biological Methods. 5 (3), 99 (2018).
  19. Chang, C. H., et al. Fear extinction in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 (SUPPL. 47) (2009).
  20. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, 1-18 (2013).
  21. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  22. Vetere, G., et al. Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice Article Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice. Neuron. 94 (2), 363-374 (2017).
  23. Koob, G. F., Zimmer, A. Chapter 9 - Animal models of psychiatric disorders. Neurobiology of Psychiatric Disorders. 106, 137-166 (2012).
  24. Bourin, M. Animal models for screening anxiolytic-like drugs: a perspective. Dialogues in clinical neuroscience. 17 (3), 295-303 (2015).
  25. Murray, S. B., et al. Fear as a translational mechanism in the psychopathology of anorexia nervosa. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 95, 383-395 (2018).
  26. Pamplona, F. A., et al. Prolonged fear incubation leads to generalized avoidance behavior in mice. Journal of Psychiatric Research. 45 (3), 354-360 (2011).
  27. Török, B., Sipos, E., Pivac, N., Zelena, D. Modelling posttraumatic stress disorders in animals. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 90, 117-133 (2019).
  28. Bhakta, A., Gavini, K., Yang, E., Lyman-Henley, L., Parameshwaran, K. Chronic traumatic stress impairs memory in mice: Potential roles of acetylcholine, neuroinflammation and corticotropin releasing factor expression in the hippocampus. Behavioural Brain Research. 335, 32-40 (2017).
  29. Uniyal, A., et al. Pharmacological rewriting of fear memories: A beacon for post-traumatic stress disorder. European Journal of Pharmacology. , 172824 (2019).
  30. Barad, M. Fear extinction in rodents: basic insight to clinical promise. Current Opinion in Neurobiology. 15 (6), 710-715 (2005).
  31. Haaker, J., et al. Making translation work: Harmonizing cross-species methodology in the behavioural neuroscience of Pavlovian fear conditioning. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 107, 329-345 (2019).
  32. Heroux, N. A., Horgan, C. J., Pinizzotto, C. C., Rosen, J. B., Stanton, M. E. Medial prefrontal and ventral hippocampal contributions to incidental context learning and memory in adolescent rats. Neurobiology of Learning and Memory. 166, 107091 (2019).
  33. Rossi, M. A., Yin, H. H. Methods for Studying Habitual Behavior in Mice. Current Protocols in Neuroscience. 60 (1), 8-29 (2012).
  34. Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant Procedures for Assessing Behavioral Flexibility in Rats. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  35. Zoccolan, D., Di Filippo, A. Methodological Approaches to the Behavioural Investigation of Visual Perception in Rodents. Handbook of Behavioral Neuroscience. , Elsevier B.V. (2018).
  36. Lguensat, A., Bentefour, Y., Bennis, M., Ba-M'hamed, S., Garcia, R. Susceptibility and Resilience to PTSD-Like Symptoms in Mice Are Associated with Opposite Dendritic Changes in the Prelimbic and Infralimbic Cortices Following Trauma. Neuroscience. 418, 166-176 (2019).
  37. Li, Q., et al. N-Acetyl Serotonin Protects Neural Progenitor Cells Against Oxidative Stress-Induced Apoptosis and Improves Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus Following Traumatic Brain Injury. Journal of Molecular Neuroscience. 67 (4), 574-588 (2019).
  38. Pantoni, M. M., Carmack, S. A., Hammam, L., Anagnostaras, S. G. Dopamine and norepinephrine transporter inhibition for long-term fear memory enhancement. Behavioural Brain Research. 378 (112266), 112266 (2020).
  39. Smith, K. L., et al. Microglial cell hyper-ramification and neuronal dendritic spine loss in the hippocampus and medial prefrontal cortex in a mouse model of PTSD. Brain, Behavior, and Immunity. 80, 889-899 (2019).
  40. Liu, X., Zheng, X., Liu, Y., Du, X., Chen, Z. Effects of adaptation to handling on the circadian rhythmicity of blood solutes in Mongolian gerbils. Animal Models and Experimental. 2 (2), 127-131 (2019).
  41. Landgraf, D., McCarthy, M. J., Welsh, D. K. The role of the circadian clock in animal models of mood disorders. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 344-359 (2014).
  42. Refinetti, R., Kenagy, G. J. Diurnally active rodents for laboratory research. Laboratory annimals. 52 (6), 577-587 (2018).
  43. Hurtado-Parrado, C., et al. Assessing Mongolian gerbil emotional behavior: effects of two shock intensities and response-independent shocks during an extended inhibitory-avoidance task. PeerJ. 5, (2017).
  44. Frey, P., Eng, S., Gavinf, W. Conditioned suppression in the gerbil. Behavior Research Methods & Instrumentation. 4 (5), 245-249 (1972).
  45. Woolley, M. L., Haman, M., Higgins, G. A., Ballard, T. M. Investigating the effect of bilateral amygdala lesions on fear conditioning and social interaction in the male Mongolian gerbil. Brain Research. 1078 (1), 151-158 (2006).
  46. Ballard, T. M., Sänger, S., Higgins, G. a Inhibition of shock-induced foot tapping behaviour in the gerbil by a tachykinin NK1 receptor antagonist. European Journal of Pharmacology. 412 (3), 255-264 (2001).
  47. Luyten, L., Schroyens, N., Hermans, D., Beckers, T. Parameter optimization for automated behavior assessment: plug-and-play or trial-and-error. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8 (28), (2014).

Tags

התנהגות גיליון 162 זיכרון רגשי מיזוג פחד דגירה פחד עודף הקפאה זיכרון הקשר זיכרון סימן
דגירה פחד באמצעות פרוטוקול מיזוג פחד מורחב לחולדות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Acevedo-Triana, C., Rico, J. L.,… More

Acevedo-Triana, C., Rico, J. L., Ortega, L. A., Cardenas, M. A. N., Cardenas, F. P., Rojas, M. J., Forigua-Vargas, J. C., Cifuentes, J., Hurtado-Parrado, C. Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats. J. Vis. Exp. (162), e60537, doi:10.3791/60537 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter