Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

La incubación del miedo utilizando un protocolo de acondicionamiento del miedo extendido para ratas

Published: August 22, 2020 doi: 10.3791/60537
Automatic Translation
1,6, 2, 2, 3, 3, 4, 2, 2, 2,5
1School of Psychology, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, 2Animal Behavior Laboratory, Fundación Universitaria Konrad Lorenz, 3Department of Psychology, Universidad de Los Andes, 4School of Veterinary Medicine, Animal Health Department, Universidad Nacional de Colombia, 5Department of Psychology, Troy University, 6Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Summary

Describimos un protocolo de acondicionamiento de miedo extendido que produce sobreentrenamiento e incubación del miedo en ratas. Este protocolo implica una sola sesión de entrenamiento con 25 emparejamientos de choque de tono (es decir, sobreentrenamiento) y una comparación de las respuestas de congelación condicionadas durante las pruebas de contexto y cue 48 h (corto plazo) y 6 semanas (a largo plazo) después del entrenamiento.

Abstract

La memoria emocional se ha estudiado principalmente con paradigmas de acondicionamiento del miedo. El condicionamiento del miedo es una forma de aprendizaje a través de la cual las personas aprenden las relaciones entre los eventos aversivos y los estímulos neutrales. Los procedimientos más utilizados para estudiar recuerdos emocionales implican el condicionamiento del miedo en ratas. En estas tareas, el estímulo no condicionado (EE.UU.) es un footshock presentado una o varias veces a través de una o varias sesiones, y la respuesta condicionada (CR) se está congelando. En una versión de estos procedimientos, llamados acondicionamiento del miedo cued, un tono (estímulo condicionado, CS) se empareja con los reposapiés (EE.UU.) durante la fase de entrenamiento. Durante la primera prueba, los animales se exponen al mismo contexto en el que se llevó a cabo el entrenamiento, y las respuestas de congelación se prueban en ausencia de tornillos y tonos (es decir, una prueba de contexto). Durante la segunda prueba, la congelación se mide cuando se cambia el contexto (por ejemplo, manipulando el olor y las paredes de la cámara experimental) y el tono se presenta en ausencia de reposapiés (es decir, una prueba de cue). La mayoría de los procedimientos de acondicionamiento del miedo implican pocos emparejamientos de choque de tono (por ejemplo, 1-3 ensayos en una sola sesión). Existe un interés creciente en las versiones menos comunes que implican un gran número de emparejamientos (es decir, sobreentrenamiento) relacionados con el efecto duradero llamado incubación del miedo (es decir, las respuestas al miedo aumentan con el tiempo sin una mayor exposición a eventos aversivos o estímulos condicionados). Las tareas de acondicionamiento del miedo extendidas han sido clave para entender los aspectos conductuales y neurobiológicos de la incubación del miedo, incluida su relación con otros fenómenos psicológicos (por ejemplo, trastorno de estrés postraumático). Aquí, describimos un protocolo de acondicionamiento de miedo extendido que produce sobreentrenamiento y la incubación del miedo en ratas. Este protocolo implica una sola sesión de entrenamiento con 25 emparejamientos de choque de tono (es decir, sobreentrenamiento) y una comparación de las respuestas de congelación condicionadas durante las pruebas de contexto y cue 48 h (corto plazo) y 6 semanas (a largo plazo) después del entrenamiento.

Introduction

La memoria es un proceso psicológico que abarca diferentes fases: adquisición de información, consolidación (permite la estabilidad de la información adquirida) y recuperación (evidencia para el proceso de consolidación)1. Durante la fase de consolidación, se produce el establecimiento de nuevas conexiones sinápticas y la modificación de conexiones preexistentes. Esto sugiere la necesidad de un período de tiempo durante el cual se producen eventos moleculares y fisiológicos responsables de estos cambios1,2. Estos cambios fisiológicos o moleculares varían si los eventos recuperados están cargados emocionalmente o no (es decir, memoria emocional). Por ejemplo, la investigación ha demostrado que el núcleo lateral y el complejo basolateral de la amígdala son particularmente relevantes para la memoria emocional3,4,5.

Los fenómenos de memoria emocional se han estudiado principalmente con paradigmas de condicionamiento del miedo5,,6. El condicionamiento del miedo es una forma de aprendizaje a través de la cual las personas aprenden las relaciones entre los eventos aversivos y los estímulos neutros7. Los paradigmas de acondicionamiento del miedo producen cambios moleculares, celulares y estructurales en la amígdala. Además, el condicionamiento del miedo modifica la conectividad del hipocampo durante los procesos de consolidación y recuperación de la memoria emocional.

Uno de los procedimientos más utilizados para estudiar los recuerdos del miedo es el acondicionamiento clásico (Pavlovian) en ratas. Este procedimiento normalmente utiliza footshock (EE.UU.) como el estímulo aversivo, que se entrega una o varias veces a través de una o varias sesiones. La respuesta condicionada (CR) de las ratas expuestas a este procedimiento es la congelación (es decir, "inmovilidad generalizada causada por una respuesta tónica generalizada de la musculatura esquelética de los animales, excepto los músculos utilizados en la respiración"7 ). Esta respuesta podría evaluarse en dos tipos de pruebas: pruebas de contexto y cue. Para la prueba de contexto, el sujeto se somete a un número determinado de reposapiés durante la sesión de entrenamiento, y luego se retira de la cámara experimental durante un tiempo definido. Durante la prueba, el sujeto vuelve al mismo contexto en el que se llevó a cabo el entrenamiento y se recogen diferentes medidas de congelación en ausencia de tornillos (por ejemplo, duración, porcentaje o frecuencia de los episodios de congelación), y en comparación con los niveles basales establecidos durante la fase de entrenamiento. Para el segundo tipo de prueba, cue test, un estímulo (normalmente un tono) se empareja con los reposapiés durante la fase de entrenamiento (es decir, estímulo condicional, CS). Una vez completado el entrenamiento, el animal se retira del contexto de entrenamiento durante un tiempo definido y posteriormente se coloca en un contexto modificado (por ejemplo, una cámara experimental diferente que tiene diferentes formas de paredes y olor diferente). A continuación, se presenta la cue un número determinado de veces, y las respuestas de congelación a la cue se miden y se comparan con los niveles basales recopilados durante el entrenamiento. La versión más común de este paradigma utiliza emparejamientos de choque de tono de 1 a 3 durante una sola sesión de entrenamiento, seguido de pruebas de contexto y cue realizadas una serie de horas o unos días más tarde.

Otros procedimientos de acondicionamiento del miedo menos frecuentemente implementados implican un gran número de emparejamientos de choque -cue (es decir, ensayos), que a menudo se han llamado procedimientos de sobreentrenamiento8. Un interés creciente en estas tareas está relacionado con sus efectos de memoria duraderos y aumentados llamados incubación del miedo (es decir, las respuestas al miedo condicionadas aumentan con el tiempo en ausencia de una mayor exposición a eventos aversivos o estímulos condicionados)9,,10,,11. Un ejemplo de estos procedimientos de sobreentrenamiento implica una fase de entrenamiento de 100 emparejamientos de choque de tono distribuidos en 10 sesiones, seguido de pruebas de contexto y cue realizadas 48 h y 30 días después11,,12. Para evitar una amplia formación distribuida a lo largo de varios días, Maren (1998) informó que el sobreentrenamiento podría establecerse y optimizarse en una sola sesión con 25 emparejamientos8. El efecto de incubación se evidencia en niveles significativamente más altos de miedo condicionado en ratas probadas 31 días después del entrenamiento, en comparación con ratas probadas 48 h después. Las tareas de acondicionamiento del miedo extendidas han sido clave para la comprensión de los aspectos conductuales y neurobiológicos subyacentes a la incubación del miedo, incluyendo su relación con otros fenómenos psicológicos (por ejemplo, trastorno de estrés postraumático de inicio retrasado)11,12,13.

Aquí, describimos un protocolo de acondicionamiento de miedo extendido que induce el sobreentrenamiento y la incubación del miedo en ratas. A diferencia de otros paradigmas que requieren varios días de entrenamiento11,el protocolo actual se centra en una sola sesión de entrenamiento8. Utilizamos 25 emparejamientos de choque de tono para producir respuestas de congelación condicionadas más altas durante el contexto y las pruebas de cue realizadas 6 semanas después del entrenamiento, en comparación con las pruebas realizadas 48 h después.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

El siguiente protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal de la Fundación Universitaria Konrad Lorenz (IACUC-KL). Se respetaron la declaración universal de derechos de los animales emitida por la Liga Internacional de Derechos de los Animales, Ginebra, Suiza (1989), y los principios éticos de experimentación con los animales emitidos por el ICLAS.

1. Preparación del sujeto

  1. Seleccione ratas Wistar adultas machos (n.o 12). Alojarlos en grupos de cuatro por jaula durante tres días de aclimatación, antes del inicio del protocolo de entrenamiento y pruebas. Proporcionar a las ratas acceso gratuito al agua durante todo el experimento. Controlar la temperatura ambiente entre 20oC y 25oC, bajo un ciclo claro-oscuro de 12 horas (luces encendidas a las 07:00 h).
    NOTA: Las cepas de rata habían mostrado un rendimiento diferencial durante el acondicionamiento del miedo. Por ejemplo, Schaap et al. (2013) informaron que las cepas Wistar y Lewis mostraron duraciones más largas de comportamiento de congelación en comparación con las ratas Fawn Hooded y Brown Norway12. Por lo tanto, se deben evaluar las diferencias en el dolor y el umbral térmico para ajustar la intensidad y duración de los shocks.
  2. Mantener las ratas en el 85% de sus pesos de alimentación libre (peso normal entre 350-400 g) dando acceso restringido a los alimentos a la misma hora todos los días. Pesar las ratas todos los días a la misma hora durante el ciclo de luz. Calcula el peso ad lib (100% de peso) durante tres días antes del inicio del entrenamiento de acondicionamiento de miedo extendido.
    NOTA: Los animales utilizados en el presente experimento fueron probados en pruebas instrumentales adicionales que no se informan aquí. Se requirió la privación de alimentos para esas pruebas adicionales. Esta variación de procedimiento se supone que es probable que amplíe el alcance del presente procedimiento, ya que sugiere la posibilidad de pruebas combinadas de miedo instrumental. Sin embargo, los estudios que solo utilizan pruebas de acondicionamiento del miedo no requerirán privación de alimentos.
  3. Asignar aleatoriamente sujetos a uno de los siguientes grupos: pruebas emocionales 6 semanas después del entrenamiento (n a 6); pruebas emocionales 48 h después del entrenamiento (n.o 6).
  4. Realizar entrenamientos y pruebas a horas similares, durante la fase de luz del ciclo de luz oscura. Asigne a los animales a la misma cámara experimental y mantenga el mismo orden de los animales durante el entrenamiento y las pruebas.
    NOTA: Un control adicional que podría implementarse es contrarrestar el orden de los animales durante las fases de entrenamiento y prueba. Se recomienda usar esta técnica cuando se evalúan varios grupos, o se aplican diferentes tareas en todos los experimentos, para reducir un posible efecto del orden de tareas en el comportamiento.

2. Ajuste del aparato y calibración de choques

  1. Limpie todas las superficies internas de la cámara experimental y el suelo de rejilla de acero inoxidable con un 10% de etanol. Repita antes de probar cada animal.
  2. Conecte el equipo a un ordenador mediante un cable USB e inicie el equipo del sistema de detección de congelación: la CPU, el gabinete de control, la luz infrarroja, el estimulador/scrambler aversivo y el calibrador de intensidad de choque.
    NOTA: Aunque este protocolo se ejecutó utilizando instrumentos disponibles comercialmente (Tabla de Materiales), se pueden utilizar equipos y software de diferentes marcas. El aparato consiste en una cámara cuadrada acrílica interna (29,53 cm x 23,5 cm x 20,96 cm, llamada cámara experimental) incrustada en una caja de madera cubierta con plástico formico. Las puertas externas permiten el aislamiento de sonido, ruido o luz (puertas de caja atenuantes). La cámara se encuentra lateralmente en la parte interna de la puerta externa. La caja de acrílico interna con rejillas metálicas de suelo (36 varillas de acero inoxidable, cada una de 3 mm de diámetro y espaciada de 8 mm, de centro a centro) permite la entrega de reposapiés. En una de las paredes laterales internas, un altavoz se encuentra a 6 cm del suelo para presentar una señal auditiva.
  3. Conecte los clips rojos y negros del calibrador de intensidad de choque (es decir, conectores positivos y negativos) a dos varillas diferentes en el suelo de la rejilla. Conecte el cable USB al puerto correspondiente del ordenador. Asegúrese de conectar los clips rojos y negros a las barras separadas por otra barra.
    NOTA: En esta sección se describe el proceso de calibración de la intensidad de los golpes utilizando una marca específica de equipos mencionada en la Tabla de materiales. Sin embargo, el proceso de calibración se puede realizar utilizando diferentes marcas de equipos. Se recomienda calibrar la intensidad del choque en tres sectores del suelo de la rejilla para verificar que es consistente. Además, retire siempre los residuos de orina y fecales del suelo de la rejilla para evitar interferencias durante la entrega del choque.
  4. Inicie el software calibrador de intensidad de choque (Tabla de materiales). Elija una intensidad de 1,0 mA en la aplicación haciendo clic en la flecha de rango. A continuación, cambie el interruptor Ejecutar/Detener a Ejecutar.
    NOTA: Proponemos 1.0 mA basado en nuestros estudios con modelos de roedores en nuestro laboratorio y literatura que reporta un rango de 0.75 mA a 1.5 mA como adecuado para estudios de miedo condicionando33,,34,,35.
  5. Encienda el estimulador aversivo o el equipo utilizado para entregar los reposapiés y observe la intensidad de choque que se muestra en el panel de la aplicación. Si es necesario, ajuste la intensidad a 1,0 mA con la perilla del estimulador aversivo.
    NOTA: El estimulador aversivo debe establecerse en "OUT" para probar, calibrar y ejecutar adecuadamente el experimento.

3. Calibración del sistema de detección de congelación

  1. Cierre la cámara experimental y las puertas de la caja que atenúan el sonido. No introduzca el animal en este punto, ya que se colocará en la cámara después de que se haya completado la calibración del sistema de detección de congelación. Compruebe que la intensidad de la luz dentro de la caja está entre 20 y 30 lux.
  2. Inicie el software del sistema de detección de congelación y abra la ventana de diálogo Configuración de experimento. Introduzca los detalles de cada asunto (como el número de identificación del sujeto, la fecha y el grupo) y cargue el archivo titulado "Protocolo de entrenamiento VFC.pro" (disponible en http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
    NOTA: Las pruebas de contexto y cue utilizan una configuración de programa diferente; por lo tanto, asegúrese de utilizar el archivo correcto en cada prueba. En este punto, el archivo correcto corresponde a "Protocolo de entrenamiento VFC.pro". Recuerde que durante las fases de prueba el archivo correspondiente será diferente a la sesión de entrenamiento.
  3. Elija las cámaras correspondientes y marque la opción Guardar vídeo (si es necesario). Establezca el Umbral de movimiento en 100 y Duración mínima de congelación en 30 fotogramas.
    NOTA: Este valor de Umbral de movimiento se basa en el tamaño de la especie utilizada (basado en el número de píxeles). El fabricante recomienda el valor de Duración mínima de congelación. Estos valores se utilizan para garantizar el reconocimiento adecuado del animal en la cámara.
  4. Compruebe que la transmisión en directo de las cámaras elegidas aparezca en la pantalla, junto con el gráfico de umbral de movimiento y la línea de tiempo de los diferentes estímulos que se presentan durante el entrenamiento (por ejemplo, sonido y choque).
    NOTA: Utilizando una marca diferente, la configuración del equipo debe ofrecer la posibilidad de medir los movimientos del animal para detectar un "índice" de movimiento que debe permitir comparaciones sobre la cantidad de tiempo que el animal se está moviendo o congelando. Otra posibilidad es utilizar un software que con sólo la fuente de vídeo (durante o después del experimento) puede detectar la cantidad de tiempo que el animal está en movimiento o congelación, como el software libre ImageFZ13,caja de herramientas de código abierto en Matlab14,o un clasificador libre de comportamiento animal como JAABA15.
  5. Haga clic en la opción Calibrar tres veces, mientras comprueba que el índice de movimiento permanece por debajo de 100 (umbral). A continuación, configure el equipo para que se bloquee haciendo clic en el botón correspondiente en la pantalla.
    NOTA: En esta sección se describe un proceso de calibración del sistema de detección de congelación utilizando una marca específica de equipos enumerados en la Tabla de materiales. Como se mencionó anteriormente, el proceso de calibración se puede llevar a cabo utilizando diferentes marcas de equipos (para una revisión de diferentes opciones en equipos y software véase Anagnostaras et al. 2010)16.

4. Entrenamiento extendido de acondicionamiento del miedo

  1. Transportar a las ratas en sus jaulas de origen, cubiertas con un paño, desde el centro de cuidado de animales a la sala de entrenamiento conductual en el laboratorio. Evite la exposición al ruido o a las condiciones generadoras de estrés durante el transporte de animales a la sala de entrenamiento conductual. Si varios animales son transportados al mismo tiempo, sólo traiga a los animales para ser probados y mantenga otras ratas en una sala de retención para mejorar el control experimental. Manipule suavemente a los animales durante 2 minutos antes de comenzar el entrenamiento.
    NOTA: En el protocolo, los animales fueron manipulados cada día durante 2 minutos antes del entrenamiento conductual. Después de la manipulación, los animales fueron introducidos en la cámara experimental. Recomendamos manipular animales para hacer que las ratas habitulen al investigador.
  2. Introducir la rata a la cámara experimental. Manéjelo suavemente por la base de su cola y colóquelo en el centro de la cámara. Cierre la cámara experimental y las puertas de la caja que atenúan el sonido.
  3. Inicie la sesión haciendo clic en el botón Grabar. Deje que la rata se aclimate a la cámara durante 3 minutos. Este período de 3 minutos es el estándar recomendado por el fabricante del equipo y sirve como línea de base y tiempo de habituación a la cámara.
  4. Ofrezca veinticinco emparejamientos de choque de tono (pruebas) con un intervalo de pruebas (ITI) de 60 s, a partir del minuto 3 de la sesión. Presente el tono (estímulo condicionado – CS; 90 dB SPL, 2000 Hz, 50-ms Rise Time) durante los últimos 10 s de cada ITI, y el choque (estímulo no condicionado – US) durante los últimos 2 s de cada ITI.
    NOTA: La activación del botón Grabar está condicionada a que las cámaras estén correctamente calibradas y bloqueadas.
  5. Retire la rata de la cámara experimental cuando termine la sesión de 28 minutos. Devuelva a los animales a la jaula de origen respectiva. Transportar a las ratas en sus jaulas de origen cubiertas con un paño desde la sala de entrenamiento conductual hasta el centro de cuidado de animales.
  6. Repita la calibración del sistema de detección de congelación (pasos 3.1-3.5) y el acondicionamiento del miedo (pasos 4.1 y 4.3) para entrenar a todos los sujetos.
    NOTA: Recomendamos encarecidamente recalibrar el sistema de detección de cada animal para asegurarse de que el software mantiene los mismos parámetros cuando procesa la información para la detección de congelación.
  7. Período de descanso: Durante este período, pida a los animales que descansen individualmente en sus jaulas de origen. Monitorear el peso de los animales dos veces por semana durante las 6 semanas del período de incubación. Manipule suavemente a cada animal durante dos minutos mientras se ponderan.

5. Prueba de contexto – sesión única de 10 minutos

  1. Después de la fase de entrenamiento, exponga a los animales a la primera prueba de memoria llamada prueba de contexto. Durante esta fase de 10 min, exponga a las ratas al mismo contexto en el que se llevó a cabo el entrenamiento pero no presentaran señales ni choques. Transportar a las ratas en sus jaulas cubiertas del hogar (por ejemplo, con un paño) desde el centro de cuidado de animales a la sala de entrenamiento conductual. Tenga en cuenta que los animales se dividieron en grupos, por lo tanto un grupo se prueba 48 h después de la fase de entrenamiento y el otro grupo se prueba 6 semanas después del entrenamiento (ver Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Línea de tiempo del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Limpie todas las superficies internas de la cámara experimental y el suelo de rejilla de acero inoxidable con un 10% de etanol. Repita antes de probar cada animal.
  2. Repita la calibración del sistema de detección de congelación (pasos 3.1 a 3.5). Abra la ventana de diálogo Configuración del experimento y cargue el archivo denominado "protocol.pro de prueba de contexto", que está disponible en http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    NOTA: Este archivo contiene la configuración de esta fase experimental que consta de ningún choque o tono.
  3. Introducir el animal a la cámara experimental. Manéjelo suavemente por la base de su cola y colóquelo en el centro de la cámara. Cierre la cámara experimental y las puertas de la caja que atenúan el sonido.
  4. Inicie la sesión haciendo clic en el botón Grabar. Durante esta sola sesión de prueba de contexto de 10 minutos, no se presentan estímulos (no se puede impactar ni sonido).
  5. Retire el sujeto de la cámara experimental cuando la sesión de 10 minutos haya terminado. Devolver a los animales a sus respectivas jaulas y transportar a las ratas en sus jaulas cubiertas desde la sala de entrenamiento conductual al centro de cuidado de animales. Repita los pasos 5.2-5.5 para probar todos los sujetos.

6. Prueba Cue – sesión individual de 13 min

  1. Un día después de la prueba de contexto, pida a los animales que se sometan a la segunda prueba de memoria llamada cue test. Durante esta fase, las ratas estarán en un contexto diferente de entrenamiento durante 13 min;; se presentan señales (tonos), pero no se emiten choques. Transportar a las ratas en sus jaulas de origen cubiertas con una cubierta desde el centro de cuidado de animales a la sala de entrenamiento conductual. Pruebe un grupo 72 h después del entrenamiento de acondicionamiento del miedo, y pruebe a otro grupo 6 semanas y un día después del entrenamiento (Figura 1).
    NOTA: Se podría implementar un sistema diferente de transporte (desde el centro de cuidado de animales hasta la sala experimental) para diferenciar más el contexto y las pruebas de referencia. Dado que los animales fueron transportados a la sesión de entrenamiento y sesión de prueba de contexto en sus jaulas de origen, se podría utilizar una jaula de transporte diferente, ropa de cama y/o cubierta durante el transporte a la sesión de prueba.
  2. Limpie todas las superficies internas de la cámara experimental y el suelo de rejilla de acero inoxidable con un 10% de etanol. Repita antes de probar cada animal.
  3. Para cambiar el contexto visual, inserte la pared circundante de plástico en la cámara experimental.
  4. Para cambiar el contexto olfativo, aplicar 1% de ácido acético a un hisopo con punta de algodón, y colocarlo en la bandeja metálica debajo del piso de rejilla17,18,19.
  5. Repita la calibración del sistema de detección de congelación (pasos 3.1-3.5). Cargue el archivo denominado archivo "Cue test protocol.pro", que está disponible en http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    NOTA: Este archivo contiene la configuración de esta fase experimental, que consiste en la entrega de los mismos tonos presentados durante la fase de entrenamiento (CS), pero en ausencia de choques (EE.UU.).
  6. Introducir el animal a la cámara experimental. Manéjelo suavemente por la base de su cola y colóquelo en el centro de la cámara. Cierre la cámara experimental y las puertas de la caja que atenúan el sonido.
  7. Inicie la sesión haciendo clic en el botón Grabar. Durante la sola sesión de prueba cue de 13 minutos, el estímulo CS (tono) se presenta 10 veces, comenzando en el minuto 3 de la sesión.
    NOTA: Los primeros 3 minutos corresponden a la línea de base de esta sesión, seguido de 10 ensayos de prueba (es decir, 10 s cada uno) entregados con 50 s de ITIs en ausencia de choques. La entrega de tonos es automática, mediante el uso del archivo previamente cargado.
  8. Retire al animal de la cámara experimental cuando termine la sesión de 13 minutos. Devolver los animales a la jaula respectiva y transportarlos cubiertos a la instalación de cuidado de animales. Repita los pasos 6.2 a 6.5 para probar todos los sujetos.

7. Análisis de datos

  1. Obtenga el índice de actividad general (es decir, índice de movimiento) que se deriva de la secuencia de vídeo mediante el software del sistema de detección de congelación. Este software transforma automáticamente el índice de movimiento para proporcionar el porcentaje de tiempo de congelación por sesión y el número de episodios de congelación. Establezca el umbral de congelación en el ajuste predeterminado Duración mínima de congelación del sistema (1 s a 30 fotogramas).
  2. Utilice el programa personalizado adicional (archivo disponible en http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ)para obtener:
    1. Utilice el programa para determinar el porcentaje de congelación durante los tres primeros minutos de la sesión de entrenamiento (es decir, congelación de línea de base, ya que no se presentaron choques o tonos antes o durante ese período de 3 minutos) y durante los tres primeros minutos de la sesión de prueba cue.
    2. Utilice el programa para determinar el porcentaje de congelación para cada uno de los ocho contenedores de 3 minutos de la sesión de entrenamiento.
    3. Utilice el programa para determinar el porcentaje de congelación durante las presentaciones cue (es decir, congelación durante los tonos) y períodos sin cue (intervalos intertriales; IT), tanto para sesiones de capacitación como de pruebas de cue.
  3. Para obtener estos datos, abra el software del sistema de detección de congelación.
    1. Seleccione Archivo ?? Informes ? Resumen de componentes por lotes.
    2. Seleccione el archivo con extensión . CMP disponible a partir de http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    3. Asigne un nombre al archivo de salida y cambie Umbral de movimiento a 100. A continuación, haga clic en Aceptar.
    4. Seleccione los archivos que desea analizar (extensión . RAW). Estos archivos se generan automáticamente a partir del software del sistema de detección de congelación cuando la sesión ha terminado y corresponden a los datos sin procesar de cada sesión. Inicialmente, los archivos se guardan en el escritorio del ordenador, pero se pueden almacenar en una carpeta personalizada (por ejemplo, condicionamiento documentos-miedo) para facilitar su posterior identificación y apertura cuando necesitan ser analizados.
    5. Abra los archivos de salida (extensión . CSV). Se pueden editar en un software de hoja de cálculo para su posterior análisis. Este archivo contiene los resultados de la congelación durante la sesión experimental.
      NOTA: Para obtener el porcentaje total de congelación, divida el tiempo que el sujeto pasó inmóvil durante el tiempo total de la sesión. El número de episodios de congelación se puede calcular contando el número de eventos de congelación a través de la sesión. En ambos casos, es necesario definir un umbral de movimiento basado en una duración mínima de congelación. Este es el criterio temporal que define si se registra un episodio de congelación. Los sistemas automatizados de grabación pueden utilizar cierta cantidad de fotogramas por segundo (fps) como medida de la duración mínima de congelación. Por ejemplo, con una frecuencia de muestreo de 30 fps, una duración mínima de congelación de 15 fotogramas registrará como congelación de una instancia de inmovilidad que dura 30 s.
  4. Calcula la duración media de cada episodio de congelación para cada sesión (entrenamiento y ambas pruebas, contexto y cue) dividiendo la duración total de congelación (en segundos) sobre el número total de episodios de congelación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Se analizaron variaciones en el porcentaje de tiempo de congelación durante las diferentes etapas de la sesión de entrenamiento para todas las asignaturas (n a 12) utilizando una prueba t dependiente (Tabla 1). Los animales fueron activos y exploraron la cámara experimental durante los primeros tres minutos de la sesión de entrenamiento (primer día del protocolo), tiempo durante el cual no se entregaron tonos o choques (es decir, línea de base-BL). Como se muestra en la Figura 2A, porcentaje del tiempo de congelación durante los 25 emparejamientos de choque de tono subsiguientes(M a 48,88; SE 4,37) fue significativamente mayor que durante el BL(M a 14,65; SE 4,05), que se asume como una indicación de la adquisición del miedo.

Prueba estadística Figura Fases
Prueba t dependiente 2A t (11) a -6,21, p < .001, d a 2,34
Contenedores de 3 minutos
Medidas repetidas ANOVA 2B F (3,75, 41,32) a 11,19, p < .001,p2 a .50.
Fases Grupo Fases Grupo X
ANOVA mixto 2c F(3, 30) a 14,21, p < .001,2 x.58 F(3, 30) a 4,63, p < .05,2 x.31 F(1, 10) a 2,06, p >.05,2 x.17
ANOVA unidireccional 3a F(1, 10) a 6,91, p < .05,2 x.40
ANOVA unidireccional 3B F(1, 10) a 10,30, p < .05,2 x.50
ANOVA unidireccional 3c F(1, 10) a 5,83, p <. 05, p2 x.36
ANOVA mixto 4A F(2, 20) a 29,28, p < .001,2 x.74 F(2, 20) a 2,33, p >.05,2 x.18 F(1, 10) a 2,14, p >.05,2 x.17
ANOVA mixto 4b F(1, 10) a 1,53, p >.05,2 x.13 F(1, 10) a 3,98, p < .05,2 x.28 F(1, 10) a .23, p >.05,a p 2.02
ANOVA mixto 4c F(1, 10) a 25,43, p < .001,2 x.71 F(1, 10) a 6,17, p < .05,2 x.38 F(1, 10) a .22, p >.05,a p 2.02

Tabla 1: Estadísticas utilizadas en el análisis de datos. Para la Figura 2A, el porcentaje medio de congelación de todos los sujetos (n.o 12) durante los primeros 3 minutos de la sesión de entrenamiento (correspondiente a la línea de base, BL) se comparó con el porcentaje de congelación durante los 25 minutos restantes de la sesión (25 ensayos de choque de tono) mostrando una diferencia significativa y un gran tamaño de efecto(D d á 2,34 de Cohen). Para la Figura 2B,se realizó una comparación entre contenedores de 3 minutos que muestra una diferencia significativa en una prueba ANOVA de Medidas Repetidas (BL y ocho contenedores de 3 minutos). Para la Figura 2C, las comparaciones entre el porcentaje medio de congelación de cada grupo de ratas durante la línea de base (BL, primeros 3 minutos de la sesión de entrenamiento), el período de entrenamiento (25 emparejamientos de choque de tono), la sesión de prueba de contexto y la sesión de prueba de cue se llevaron a cabo a través de un ANOVA Mixto con factor de entre sujetos (48 h o 6 semanas) y dentro del factor de sujetos las fases (BL, Entrenamiento, Contexto y Prueba). Se encontraron diferencias en fases y grupo, pero no en la interacción Fases*Grupo. La Figura 3A – 3B muestra datos sobre la actividad (panel 3A, índice de movimiento), congelación (panel 3B, congelación media en segundos) y duración de los episodios (panel 3C, episodios de congelación media en segundos). Estos datos se analizaron utilizando un ANOVA unidireccional, que indicaba diferencias entre los grupos en todas las mediciones. Finalmente, para la Figura 4A – 4C se realizó un ANOVA Mixto para cada panel (A, B y C), teniendo como intermediarios factor el grupo (48 h o 6 semanas) y dentro de los sujetos factor las fases (BL, Entrenamiento, Prueba de Contexto y Prueba Cue).

Figure 2
Figura 2: Fase de entrenamiento de un protocolo de acondicionamiento de miedo extendido. Los datos se muestran como la media (barras) y el SEM (barras de error) de la respuesta de congelación. (A) muestra el porcentaje medio de congelación de todos los sujetos (n a 12) durante los primeros 3 minutos de la sesión de entrenamiento, durante el cual no se presentaron choques o tonos (línea de base, BL), y los 25 minutos restantes de la sesión (25 ensayos de choque de tono, con intervalo intertrial, ITI, de 60 s); Diferente de BL (p < .001). (B) muestra el tiempo medio de congelación de todos los animales (n a 12) durante el período de referencia de 3 min (BL, sin choques ni tonos entregados) y los siguientes contenedores de 3 minutos de la sesión de entrenamiento; • diferente de todas las bandejas restantes (p < .001). (C) muestra el porcentaje medio de congelación de cada grupo de ratas (pruebas 48 h después del entrenamiento; pruebas 6 semanas después del entrenamiento) durante la línea de base (BL, primeros 3 minutos de la sesión de entrenamiento), período de entrenamiento (25 emparejamientos de choque de tono), sesión de prueba de contexto y sesión de prueba de cue; * Diferente de las pruebas después de 48 h(contexto de diferencia mediaContext -34,95, SE a 14,99, p < .05, d de Cohen a 1,34); a - diferente del período de entrenamiento(diferencia mediaEntrenamiento48h - 42,51; SE 7,28; p < .05; Cohen's d 3,03); b - diferente del período de entrenamiento(media diffTraining6Weeks 25.94; SE 7,28; p < .05; Cohen d 1.77), prueba de contexto(media diffContext6Weeks - 50.36; SE 10,58; p < .01; Cohen d 3.13), y cue test(significa diffCue6Weeks - 55.86; SE 10,25; p < .01; Cohen's d 2,47). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se realizó un análisis de la respuesta de congelación a lo largo de la adquisición segmentando la sesión de entrenamiento en ocho contenedores de 3 minutos(Figura 2B). Estos datos muestran que el tiempo medio asignado a esta respuesta alcanza la asíntota cerca o a 180 s durante los tres primeros ensayos de choque de tono (es decir, la Papelera 1). Este hallazgo ha sido considerado en investigaciones anteriores como una indicación de sobreentrenamiento11. Medidas repetidas ANOVA reveló diferencias significativas consistentes entre la línea de base y todas las ubicaciones posteriores, con tamaños de efectos grandes (Tabla 1 y Tabla 2).

Comparación Diferencia media Error estándar p valor D de Cohen
Línea de base de la ubicación frente a la bandeja 1 -60.075* 12,243 < .05 1.95
Línea de base de la ubicación frente a la bandeja 2 -69.053* 16,220 < .05 1.89
Línea de base de la ubicación frente a la bandeja 3 -66.197* 13,706 < .05 1.91
Línea de base de la ubicación frente a la bandeja 4 -68.595* 11,969 < .05 2.08
Línea de base de la ubicación frente a la bandeja 5 -65.475* 10,991 < .05 2.15
Línea de base de la ubicación frente a la bandeja 6 -65.795* 13,509 < .05 2.06
Línea de base de la ubicación frente a la bandeja 7 -72.900* 12,231 < .05 2.53
Línea de base de la ubicación frente a la bandeja 8 -78.633* 8,692 < .001 3.37

Tabla 2: Diferencia media, error estándar y tamaño de efecto para 3 minutos bins en la Figura 2B. Esta tabla muestra las comparaciones entre la ubicación de línea base y cada una de las ubicaciones siguientes (Figura 2B). La diferencia media, el error estándar y el valor py el valor d de Cohen se notifican como un índice del tamaño de estas diferencias (tamaño del efecto).

Se llevó a cabo un ANOVA mixto para probar las diferencias en el porcentaje de congelación durante la tarea, teniendo fases (BL, entrenamiento, prueba de contexto y prueba de cue) como el factor dentro del sujeto y el grupo (48 h y 6 semanas) como el factor entre sujetos (Tabla 1). El porcentaje de congelación de todos los animales durante el período de entrenamiento fue significativamente mayor que durante el período de referencia (véase la figura 2C). No se observaron diferencias significativas entre el porcentaje de congelación durante las pruebas de memoria y el período de entrenamiento(ps > .05).

No se observaron diferencias significativas entre los dos grupos (48 h y 6 semanas) en el porcentaje de congelación durante la BL, el entrenamiento y la prueba de cue(ps > .115; véase la figura 2C). Por el contrario, los animales probados 6 semanas después del entrenamiento mostraron porcentajes significativamente más altos de congelación durante la prueba de contexto que los animales probados a 48 h, con un gran tamaño de efecto (ver Figura 2C). En general, la Figura 2C muestra que la congelación durante el contexto retrasado a largo plazo y las pruebas de cue (es decir, 6 semanas después del entrenamiento) fue significativamente mayor que durante la sesión de entrenamiento. La tendencia decreciente opuesta se observó en el grupo de animales que fueron probados 48 h después del entrenamiento. Sin embargo, estas diferencias en el grupo de 48 h no fueron estadísticamente significativas(ps > .05). Por último, aunque el nivel de congelación mostró diferencias entre diferentes fases, podrían considerarse bajas en comparación con otros protocolos. Una explicación podría ser las diferencias metodológicas inherentes entre los laboratorios o el umbral de índice de movimiento establecido durante el proceso de calibración, lo que dificulta la comparación de datos entre los laboratorios.

La respuesta de congelación condicionada de los dos grupos de sujetos durante la prueba de contexto se examinó más a través del análisis de otras medidas, a saber, la actividad media (esdecir, el índice de movimiento),el tiempo total de congelación y el tiempo de congelación por episodio. Se utilizó un ANOVA unidireccional para probar las diferencias entre estas variables (Tabla 1). La actividad de los sujetos que se probaron 6 semanas después del entrenamiento fue significativamente menor que la de los animales probados 48 h después de la sesión de entrenamiento (Figura 3A). En consecuencia, el tiempo total de congelación de los animales probados poco después del entrenamiento fue significativamente menor que el de los animales probados 6 semanas después(Figura 3B). Por último, un análisis de la duración media de cada episodio de congelación indicó que los animales probados 6 semanas después del entrenamiento mostraron episodios de congelación más largos que los animales probados 48 h después del entrenamiento (Figura 3C). En conjunto, estos hallazgos indican un efecto de incubación del miedo.

Figure 3
Figura 3: Efectos de un protocolo de acondicionamiento de miedo extendido en la respuesta de congelación de ratas.
Los datos se muestran como la media (barras) y el SEM (barras de error) de la respuesta de congelación. (A) muestra la actividad (es decir, índice de movimiento) de cada grupo de sujetos (pruebas 48 h después del entrenamiento; pruebas 6 semanas después del entrenamiento) durante la prueba de contexto; * Diferente de 6 semanas. (B) muestra el tiempo medio de congelación total (en segundos) de cada grupo de sujetos durante la prueba de contexto; * Diferente de 6 semanas. (C) muestra la duración media de cada episodio de congelación (en segundos) para cada grupo de sujetos durante la prueba de contexto; * Sólo es diferente de 6 semanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se realizó un nuevo examen del rendimiento durante la sesión de prueba de referencia mediante análisis de (a) porcentajes de congelación durante los períodos de referencia (BL Training y BL Cue Test) y durante toda la prueba de cue de 10 min (diez presentaciones de tono de 10 s y diez ITI de 50 s - Figura 4A), (b) tiempo medio de congelación específicamente durante las presentaciones de 10 s de la cue (tono), tanto para las sesiones de Entrenamiento como de Prueba Cue (Figura 4B), y (c) tiempo medio de congelación (en segundos) durante los intervalos intertricionales de 50 s (ITI; es decir, períodos sin tono solamente – Figura 4C). Se utilizó un ANOVA mixto para analizar cada una de estas medidas dependientes, asumiendo las fases (ENTRENAMIENTO BL, Prueba de Cue BL y Prueba Cue) como el factor y los grupos dentro de los sujetos (48 h y 6 semanas) como el factor entre sujetos (Tabla 1). Como se muestra en la Figura 4A,el grupo de ratas probadas 6 semanas después del entrenamiento aumentó significativamente su porcentaje de congelación durante la línea de base de la sesión de Cue Test (PRUEBA de Cue; primeros 3 minutos de la sesión) y durante la Prueba Cue de 10 minutos, en comparación con el entrenamiento BL (es decir, antes de cualquier exposición a tonos y choques). No se observó ninguna diferencia análoga entre el entrenamiento de BL y BL Cue para el grupo de ratas probadas después de 48 h(p > .05). Para ambos grupos de ratas, el porcentaje de congelación durante la prueba Cue de 10 minutos fue mayor que durante el período de referencia correspondiente de esa misma sesión (BL Cue Test), lo que sugiere un efecto de recuperación. No se observaron diferencias entre los grupos de ratas en porcentaje de congelación en los diferentes períodos(ps > .05).

La Figura 4B muestra una comparación del tiempo medio de congelación (en segundos) específicamente durante las presentaciones de tono de 10 s a través de Entrenamiento (emparejamientos de choque de tono) y Prueba de Cue (solo presentaciones de tono). Sólo las ratas probadas 6 semanas después del entrenamiento aumentaron significativamente la cantidad de tiempo de congelación durante la cue.

Por último, como se muestra en la Figura 4C,sólo el grupo de ratas probado 48 h después del entrenamiento disminuyó significativamente el tiempo de congelación durante los ITI de la sesión de entrenamiento a la prueba Cue. No se observaron diferencias en el tiempo de congelación durante las ITI en los dos grupos de ratas(ps >.05).

Figure 4
Figura 4: Efectos de un protocolo de acondicionamiento de miedo extendido en la respuesta de congelación durante la prueba de cue.
Los datos se muestran como la media (barras) y el SEM (barras de error) de la respuesta de congelación. (A) muestra el porcentaje de congelación de cada grupo de sujetos (pruebas 48 h después del entrenamiento; pruebas 6 semanas después del entrenamiento) durante los primeros 3 minutos de la sesión de entrenamiento (BL, línea de base), los primeros 3 minutos de la sesión de prueba cue (BL Cue) y los 10 min de la prueba cue (Cue Test); a - diferente de la prueba de Cue después de 48 h (diferencia mediaBLTraining-Cue48h a 32,84; SE 10,25; p < .05; Cohen's d 1,52); b - diferente de BL Cue Test(diferencia mediaBLCue-BL6Weeks a 33.98; SE 8,36; p < .05; Cohen's d 1.59) y Cue Test(significa diffCue-BL6Weeks á 55.86; SE 10,25; p < .05; Cohen's d 2,47); c - diferente de Cue Test después de 48 h (media diffBLCue-Cue48h a 18,99; SE 5,17; p < .05; Cohen's d .67); d - diferente de Cue Test después de 6 semanas (media diffBLCue-Cue6Weeks a 21.87; SE 5,17; p < .05; Cohen's d .88). (B) muestra el tiempo medio de congelación (en segundos) durante la cue (tono) de cada grupo de asignaturas durante el Entrenamiento y la Prueba Cue; * Diferente de 6 semanas durante el período de prueba de Cue Test(diferencia mediaTraining-Cue6Weeks -3.14; SE 1,37; p < .05; Cohen's d 1,64). (C) muestra el tiempo medio de congelación (en segundos) durante los intervalos intertriales (ITI) de la sesión de entrenamiento (10 emparejamientos de choque de tono) y la prueba Cue (10 presentaciones solo tono) en los dos grupos de ratas (48 h y 6 semanas); • diferente de Entrenamiento para grupo de ratas probadas 48 h después del entrenamiento(diferencia mediaTraining-Cue48h a 506.16; SE 95,08; p < .001; Cohen's d 2,48). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El actual protocolo de acondicionamiento del miedo extendido es un enfoque eficiente y válido para evaluar la memoria emocional en períodos cortos (48 h) y largo plazo (6 semanas). Por lo tanto, el protocolo permite estudiar fenómenos de sobreentrenamiento y miedo de incubación en ratas. Entre las diferentes ventajas de este protocolo se encuentran las siguientes. Ofrece dos tipos de pruebas de memoria, a saber, context y cue, que permiten identificar el efecto diferencial de dos retrasos (48 h y 6 semanas) a través de las manipulaciones de contexto y cue. En segundo lugar, la tarea implica una sola sesión de entrenamiento de 28 minutos, que a su vez produce efectos a largo plazo que se extienden por varias semanas. Esta ventaja es notable, teniendo en cuenta que algunas versiones de acondicionamiento de miedo extendido necesitan al menos 100 choques en 10 sesiones de entrenamiento11. En tercer lugar, el protocolo ofrece varias alternativas de medición, que se calculan automáticamente. Además, hay un aumento de evidencia farmacológica, fisiológica y anatómica que apoya la validez de este paradigma para evaluar los fenómenos de memoria emocional15,,16.

En comparación con otros paradigmas de acondicionamiento del miedo con breves sesiones de entrenamiento (es decir, pocos ensayos), los protocolos extendidos que resultan en efectos de sobreentrenamiento han recibido menos atención. Sin embargo, las tareas de acondicionamiento del miedo extendidas han sido clave para comprender los procesos conductuales y neurobiológicos subyacentes de la incubación del miedo, incluyendo su relación con otros fenómenos psicológicos (por ejemplo, trastorno de estrés postraumático de inicio retardado)11,12,13. El actual protocolo de acondicionamiento del miedo produce de forma fiable la incubación del miedo. Esto se demuestra con tiempos de congelación más altos e índices de movimiento más bajos en animales evaluados 6 semanas después del entrenamiento, en comparación con los animales probados 48 h después del entrenamiento. Además, este efecto podría observarse diferencialmente en cada uno de los tipos de prueba; específicamente, episodios de congelación más largos durante la prueba de contexto 6 semanas después del entrenamiento y los incrementos en la congelación durante las presentaciones de cue 6 semanas después del entrenamiento. Relacionado con este último efecto (es decir, incrementos en la congelación durante las presentaciones de cue 6 semanas después del entrenamiento), parece que la novedad de la situación experimental (es decir, nuevo contexto) puede descartarse, ya que los niveles de congelación de línea de base durante esa misma sesión fueron significativamente más bajos que durante las presentaciones cue posteriores.

Aunque una tendencia hacia el aprendizaje del miedo era evidente en ambos grupos (es decir, diferencias entre la línea de base de 3 minutos y el entrenamiento), los animales que fueron probados después de 48 h (contexto) y 72 h (cue) no mostraron diferencias significativas en el nivel de congelación durante ambas pruebas. Esto se puede considerar una limitación del protocolo, que parece el resultado de una alta variabilidad del comportamiento en el grupo de 48 h (véase la figura 2C). Un cambio metodológico que se puede implementar con el fin de reducir la variabilidad y mejorar el procedimiento es llevar a cabo el contexto y la prueba de cue 24 h después del entrenamiento, que es común en algunos procedimientos de acondicionamiento del miedo.

El presente protocolo podría aplicarse en la investigación clínica23. El fuerte efecto de traza de memoria e incubación que resulta de su implementación puede permitir probar los efectos de los medicamentos utilizados regularmente para el tratamiento de patologías psicológicas y psiquiátricas (por ejemplo, tratamientos ansiolíticos o reguladores del estado de ánimo24) en fenómenos de memoria emocional (por ejemplo, anuosa extinción)25,,26,,27. Por lo tanto, el protocolo podría permitir medir la influencia de los medicamentos en el seguimiento de la memoria a través de diferentes marcos de tiempo, incluyendo correlaciones biológicas como neurotransmisores y moléculas relacionadas con el mantenimiento de la memoria28,29. El protocolo también podría ser de relevancia para la investigación con una perspectiva traslacional, que ha propuesto que los paradigmas del miedo podrían ser útiles para probar modelos preclínicos de terapias conductuales30 y estudios comparativos sobre el miedo en las especies21,,22. Por último, desde una visión neurobiológica, el presente protocolo es un modelo robusto para estudiar los mecanismos cerebrales, las comunicaciones entre estructuras, redes o conjuntos neuronales implicados en la adquisición a largo plazo, consolidación y almacenamiento de la memoria emocional, o efectos de incubación durante el desarrollo32.

Merece la pena discutir otros aspectos del protocolo. La privación de alimentos se utilizó durante todo el experimento. Esta decisión fue adoptada porque otras pruebas de comportamiento basadas en recompensas alimentarias (por ejemplo, técnicas operativas o instrumentales)33,34,35 se pueden integrar con cambios mínimos, haciendo del presente protocolo una técnica más versátil. Por ejemplo, hemos integrado con éxito este protocolo con protocolos de ejercicio basados en ruedas y tareas de memoria de laberinto en T. Otro aspecto está relacionado con el tamaño del grupo (n-6) implementado en este protocolo. Aunque se trataba de una muestra relativamente pequeña, y ciertamente se recomiendan muestras más grandes, el tamaño del efecto de incubación compensa esta limitación (véase el Cuadro 1). Esto podría considerarse una ventaja de este protocolo, especialmente en lo que respecta a las recomendaciones de los comités de animales basadas en el principio de reducción. Una limitación del protocolo era que no se evaluó la exposición mínima o nula a los golpes de los pies y el curso del tiempo de incubación del miedo. Un grupo de control adicional con las condiciones anteriores podría aumentar el rigor del diseño experimental.

Las recomendaciones finales para la mejor implementación y los resultados de este protocolo incluyen la limpieza correcta de la cámara experimental, especialmente el suelo de la rejilla, la calibración de las intensidades de choque antes del entrenamiento de cada sujeto (por ejemplo, las heces y la orina a menudo reducen la fiabilidad de la intensidad del choque en diferentes áreas de la cámara) y la calibración del sistema de detección de congelación (la fiabilidad de las medidas de congelación depende del ajuste adecuado del umbral de movimiento y de la duración mínima de congelación).

Este protocolo podría probarse con otras cepas de ratas u otros roedores (por ejemplo, ratones o jerbos mongoles), ampliando el alcance de las aplicaciones. En esos casos, es importante ajustar la intensidad del choque y los umbrales de movimiento y duración. La intensidad de choque utilizada en los protocolos de acondicionamiento del miedo con ratones suele oscilar entre 0,4 mA y 1,5 mA, con 0,75 mA y una intensidad efectiva reportada a menudo16,,36,,37,,38 y 1,5 mA la intensidad más alta reportada39. El jerbo mongol es un modelo de roedores menos frecuentemente elegido para la investigación del miedo acondiciar; sin embargo, los jerbos mongoles se han utilizado con éxito para modelar ritmos circadianos en mamíferos40. En consecuencia, el protocolo actual podría aplicarse para estudiar las relaciones potenciales entre los ritmos circadianos y la memoria emocional, ambos relevantes en patologías como la depresión, la ansiedad o la alteración del estado de ánimo41,,42. En el caso de los jerbos, un rango de intensidad de choque eficaz para este y protocolos de acondicionamiento aversivo análogos está entre 1,0 y 4,0 mA43,44,45,46. Por último, es importante tener en cuenta que los umbrales de movimiento y duración deben ajustarse en función de las especies elegidas47. Estos umbrales son los límites establecidos en el software de seguimiento del movimiento, por encima del cual el comportamiento animal se registra como movimiento y por debajo del cual el software registra la congelación. En estudios de acondicionamiento aversivos con ratones y jerbos, los umbrales efectivos de movimiento y duración notificados han sido de 25 y 30 fps (es decir, mínimo 1 s de inmovilidad), respectivamente30,,35.

Para garantizar un control adecuado de la estimulación aversiva (pies), todos los sectores del suelo de la rejilla deben ofrecer la misma intensidad. Se recomienda calibrar la intensidad del choque en tres sectores del suelo de la rejilla para verificar que es consistente. Esto evita que los animales aprendan a reducir la exposición a los golpes moviéndose a un lugar de la caja que emita una intensidad más baja. Si la calibración muestra que la rejilla metálica no está dando la misma intensidad en todos los sectores, retire la rejilla del suelo, limpie las varillas y reemplace la rejilla de la cámara. El suelo de la rejilla debe insertarse correctamente en la cámara para garantizar la mejor transmisión eléctrica desde el dispositivo de estimulación aversiva hasta el suelo de la rejilla.

El fabricante calibra el enfoque y la apertura de la cámara del sistema de detección de congelación. Sin embargo, si se requiere una calibración adicional, afloje el tornillo de fijación en el anillo de enfoque, ajuste hasta que se logre una imagen clara y, a continuación, apriete el tornillo de fijación en el anillo de enfoque. El fabricante recomienda bloquear la abertura de la lente en la posición máxima abierta. Para lograr este ajuste, asegúrese de que el punto blanco del anillo de apertura esté alineado con el número 1.4 en el cañón de la lente. Se recomienda consultar el manual del fabricante. Tenga en cuenta que si se ha ajustado el enfoque de la cámara, también debe producirse la calibración de la cámara con el software correspondiente. La calibración de la cámara requiere un ajuste del brillo, la ganancia y el obturador. Se recomienda consultar el manual del fabricante para obtener instrucciones precisas sobre el proceso de calibración de la cámara.

En conclusión, el protocolo permite probar la memoria emocional a través de períodos cortos y largos y produce una incubación del miedo a largo plazo. Este efecto de incubación del miedo se genera a través de un sobreentrenamiento de una sola sesión, que muestra efectos 6 semanas más tarde en pruebas de contexto y cue. Esto sugiere un fuerte rastro de memoria emocional. El protocolo actual es un enfoque eficiente y válido para explorar los componentes de la memoria emocional en ratas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El apoyo financiero para esta investigación fue proporcionado por la Fundación Universitaria Konrad Lorenz - número de subvención 9IN15151. Los autores quieren agradecer al Departamento de Comunicaciones de la Universidad Konrad Lorenz su ayuda en la grabación y edición del vídeo, en particular Natalia Rivera y Andrés Serrano (Productores). También, Nicole Pfaller-Sadovsky y Lucía Medina por sus comentarios sobre el manuscrito, y Johanna Barrero, decano de Corporacion Universitaria Iberoamericana, para colaboración institucional. Los autores no tienen conflictos de intereses.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (ethanoic acid) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid
Aversive Stimulation Current Package MED Associates Inc ENV-420 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Contextual test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Cue test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Curved Wall Insert MED Associates Inc VFC-008-CWI https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Data processing.zip http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
NIR/White Light Control Box MED Associates Inc NIR-100
Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse MED Associates Inc ENV-005FPU-M https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Small Tabletop Cabinet and Power Supply MED Associates Inc SG-6080D https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) MED Associates Inc ENV-414S https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standard Fear Conditioning Chamber MED Associates Inc VFC-008 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Training protocol VFC.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Video Fear Conditioning Package for Rat MED Associates Inc MED-VFC-SCT-R https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nature Reviews Neuroscience. 6 (2), 119-130 (2005).
  2. Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, P. W., Kida, S. Activation of LVGCCs and CB1 receptors required for destabilization of reactivated contextual fear memories. Learning & Memory. 15 (6), 426-433 (2008).
  3. Hermans, E. J., et al. How the amygdala affects emotional memory by altering brain network properties. Neurobiology of Learning and Memory. 112, 2-16 (2014).
  4. Moryś, J., Berdel, B., Jagalska-Majewska, H., ŁUczyńSka, A. The basolateral amygdaloid complex -its development, morphology and functions. Folia Morphologica. 58 (3), 29-46 (1998).
  5. LeDoux, J. E. Emotional memory systems in the brain. Behavioural Brain Research. 58 (1-2), 69-79 (1993).
  6. Labar, K. S. Beyond fear: Emotional memory mechanisms in the human brain. Current Directions in Psychological Science. 16 (4), 173-177 (2007).
  7. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  8. Maren, S. Overtraining Does Not Mitigate Contextual Fear Conditioning Deficits Produced by Neurotoxic Lesions of the Basolateral Amygdala. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 3097-3097 (1998).
  9. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, Unit-6.27 (2013).
  10. Morrow, J. D., Saunders, B. T., Maren, S., Robinson, T. E. Sign-tracking to an appetitive cue predicts incubation of conditioned fear in rats. Behavioural Brain Research. 276, 59-66 (2015).
  11. Pickens, C. L., Golden, S. A., Adams-Deutsch, T., Nair, S. G., Shaham, Y. Long-lasting incubation of conditioned fear in rats. Biological Psychiatry. 65 (10), 881-886 (2009).
  12. Schaap, M. W. H., et al. Nociception and Conditioned Fear in Rats: Strains Matter. PLoS ONE. 8 (12), 83339 (2013).
  13. Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871 (2014).
  14. Patel, T. P., et al. An open-source toolbox for automated phenotyping of mice in behavioral tasks. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 349 (2014).
  15. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: Interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  16. Anagnostaras, S. G. Automated assessment of Pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the VideoFreeze system. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 4 (58), (2010).
  17. Moyer, J. R., Brown, T. H. Impaired Trace and Contextual Fear Conditioning in Aged Rats. Behavioral Neuroscience. 120 (3), 612-624 (2006).
  18. Schuette, S. R., Hobson, S. Conditioned contextual fear memory to assess natural forgetting and cognitive enhancement in rats. Journal of Biological Methods. 5 (3), 99 (2018).
  19. Chang, C. H., et al. Fear extinction in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 (SUPPL. 47) (2009).
  20. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, 1-18 (2013).
  21. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  22. Vetere, G., et al. Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice Article Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice. Neuron. 94 (2), 363-374 (2017).
  23. Koob, G. F., Zimmer, A. Chapter 9 - Animal models of psychiatric disorders. Neurobiology of Psychiatric Disorders. 106, 137-166 (2012).
  24. Bourin, M. Animal models for screening anxiolytic-like drugs: a perspective. Dialogues in clinical neuroscience. 17 (3), 295-303 (2015).
  25. Murray, S. B., et al. Fear as a translational mechanism in the psychopathology of anorexia nervosa. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 95, 383-395 (2018).
  26. Pamplona, F. A., et al. Prolonged fear incubation leads to generalized avoidance behavior in mice. Journal of Psychiatric Research. 45 (3), 354-360 (2011).
  27. Török, B., Sipos, E., Pivac, N., Zelena, D. Modelling posttraumatic stress disorders in animals. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 90, 117-133 (2019).
  28. Bhakta, A., Gavini, K., Yang, E., Lyman-Henley, L., Parameshwaran, K. Chronic traumatic stress impairs memory in mice: Potential roles of acetylcholine, neuroinflammation and corticotropin releasing factor expression in the hippocampus. Behavioural Brain Research. 335, 32-40 (2017).
  29. Uniyal, A., et al. Pharmacological rewriting of fear memories: A beacon for post-traumatic stress disorder. European Journal of Pharmacology. , 172824 (2019).
  30. Barad, M. Fear extinction in rodents: basic insight to clinical promise. Current Opinion in Neurobiology. 15 (6), 710-715 (2005).
  31. Haaker, J., et al. Making translation work: Harmonizing cross-species methodology in the behavioural neuroscience of Pavlovian fear conditioning. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 107, 329-345 (2019).
  32. Heroux, N. A., Horgan, C. J., Pinizzotto, C. C., Rosen, J. B., Stanton, M. E. Medial prefrontal and ventral hippocampal contributions to incidental context learning and memory in adolescent rats. Neurobiology of Learning and Memory. 166, 107091 (2019).
  33. Rossi, M. A., Yin, H. H. Methods for Studying Habitual Behavior in Mice. Current Protocols in Neuroscience. 60 (1), 8-29 (2012).
  34. Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant Procedures for Assessing Behavioral Flexibility in Rats. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  35. Zoccolan, D., Di Filippo, A. Methodological Approaches to the Behavioural Investigation of Visual Perception in Rodents. Handbook of Behavioral Neuroscience. , Elsevier B.V. (2018).
  36. Lguensat, A., Bentefour, Y., Bennis, M., Ba-M'hamed, S., Garcia, R. Susceptibility and Resilience to PTSD-Like Symptoms in Mice Are Associated with Opposite Dendritic Changes in the Prelimbic and Infralimbic Cortices Following Trauma. Neuroscience. 418, 166-176 (2019).
  37. Li, Q., et al. N-Acetyl Serotonin Protects Neural Progenitor Cells Against Oxidative Stress-Induced Apoptosis and Improves Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus Following Traumatic Brain Injury. Journal of Molecular Neuroscience. 67 (4), 574-588 (2019).
  38. Pantoni, M. M., Carmack, S. A., Hammam, L., Anagnostaras, S. G. Dopamine and norepinephrine transporter inhibition for long-term fear memory enhancement. Behavioural Brain Research. 378 (112266), 112266 (2020).
  39. Smith, K. L., et al. Microglial cell hyper-ramification and neuronal dendritic spine loss in the hippocampus and medial prefrontal cortex in a mouse model of PTSD. Brain, Behavior, and Immunity. 80, 889-899 (2019).
  40. Liu, X., Zheng, X., Liu, Y., Du, X., Chen, Z. Effects of adaptation to handling on the circadian rhythmicity of blood solutes in Mongolian gerbils. Animal Models and Experimental. 2 (2), 127-131 (2019).
  41. Landgraf, D., McCarthy, M. J., Welsh, D. K. The role of the circadian clock in animal models of mood disorders. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 344-359 (2014).
  42. Refinetti, R., Kenagy, G. J. Diurnally active rodents for laboratory research. Laboratory annimals. 52 (6), 577-587 (2018).
  43. Hurtado-Parrado, C., et al. Assessing Mongolian gerbil emotional behavior: effects of two shock intensities and response-independent shocks during an extended inhibitory-avoidance task. PeerJ. 5, (2017).
  44. Frey, P., Eng, S., Gavinf, W. Conditioned suppression in the gerbil. Behavior Research Methods & Instrumentation. 4 (5), 245-249 (1972).
  45. Woolley, M. L., Haman, M., Higgins, G. A., Ballard, T. M. Investigating the effect of bilateral amygdala lesions on fear conditioning and social interaction in the male Mongolian gerbil. Brain Research. 1078 (1), 151-158 (2006).
  46. Ballard, T. M., Sänger, S., Higgins, G. a Inhibition of shock-induced foot tapping behaviour in the gerbil by a tachykinin NK1 receptor antagonist. European Journal of Pharmacology. 412 (3), 255-264 (2001).
  47. Luyten, L., Schroyens, N., Hermans, D., Beckers, T. Parameter optimization for automated behavior assessment: plug-and-play or trial-and-error. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8 (28), (2014).

Tags

Comportamiento Número 162 memoria emocional condicionamiento del miedo incubación del miedo sobreentrenamiento congelación memoria de contexto memoria de cue
La incubación del miedo utilizando un protocolo de acondicionamiento del miedo extendido para ratas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Acevedo-Triana, C., Rico, J. L.,… More

Acevedo-Triana, C., Rico, J. L., Ortega, L. A., Cardenas, M. A. N., Cardenas, F. P., Rojas, M. J., Forigua-Vargas, J. C., Cifuentes, J., Hurtado-Parrado, C. Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats. J. Vis. Exp. (162), e60537, doi:10.3791/60537 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter