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Behavior

Incubation de la peur à l’aide d’un protocole étendu de conditionnement de la peur pour les rats

Published: August 22, 2020 doi: 10.3791/60537
Automatic Translation
1,6, 2, 2, 3, 3, 4, 2, 2, 2,5
1School of Psychology, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, 2Animal Behavior Laboratory, Fundación Universitaria Konrad Lorenz, 3Department of Psychology, Universidad de Los Andes, 4School of Veterinary Medicine, Animal Health Department, Universidad Nacional de Colombia, 5Department of Psychology, Troy University, 6Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Summary

Nous décrivons un protocole prolongé de conditionnement de la peur qui produit l’incubation de surentraînement et la peur chez les rats. Ce protocole comprend une seule séance d’entraînement avec 25 appariements de choc sonore (c.-à-d. surentraînement) et une comparaison des réponses de congélation conditionnées au cours des tests de contexte et de repère 48 h (à court terme) et 6 semaines (à long terme) après l’entraînement.

Abstract

La mémoire émotionnelle a été principalement étudiée avec des paradigmes de conditionnement de la peur. Le conditionnement de la peur est une forme d’apprentissage par laquelle les individus apprennent les relations entre les événements aversifs et les stimuli autrement neutres. Les procédures les plus largement utilisées pour étudier les souvenirs émotionnels impliquent le conditionnement de la peur chez les rats. Dans ces tâches, le stimulus non conditionné (US) est un coup de pied présenté une ou plusieurs fois à travers une ou plusieurs sessions, et la réponse conditionnée (CR) est le gel. Dans une version de ces procédures, appelée conditionnement de la peur cued, un ton (stimulus conditionné, CS) est jumelé avec des chocs de pied (US) pendant la phase d’entraînement. Au cours du premier test, les animaux sont exposés au même contexte dans lequel la formation a eu lieu, et les réponses de congélation sont testées en l’absence de chocs de pied et de tons (c.-à-d. un test de contexte). Au cours du deuxième essai, la congélation est mesurée lorsque le contexte est modifié (p. ex., en manipulant l’odeur et les parois de la chambre expérimentale) et la tonalité est présentée en l’absence de chocs de pied (c.-à-d. un test de repère). La plupart des procédures de conditionnement de la peur cued impliquent peu d’appariements ton-choc (p. ex., 1-3 essais en une seule séance). Il y a un intérêt croissant pour les versions moins courantes impliquant un grand nombre d’appariements (c.-à-d. surentraînement) liés à l’effet à long terme appelé incubation de la peur (c.-à-d. que les réactions de peur augmentent avec le temps sans être plus exposées à des événements aversifs ou à des stimuli conditionnés). Des tâches prolongées de conditionnement de la peur ont été essentielles à la compréhension des aspects comportementaux et neurobiologiques de l’incubation de la peur, y compris sa relation avec d’autres phénomènes psychologiques (p. ex., trouble de stress post-traumatique). Ici, nous décrivons un protocole prolongé de conditionnement de la peur qui produit l’incubation de surentraînement et de peur chez les rats. Ce protocole comprend une seule séance d’entraînement avec 25 appariements de choc sonore (c.-à-d. surentraînement) et une comparaison des réponses de congélation conditionnées au cours des tests de contexte et de repère 48 h (à court terme) et 6 semaines (à long terme) après l’entraînement.

Introduction

La mémoire est un processus psychologique englobant différentes phases : acquisition d’informations, consolidation (permet la stabilité des informations acquises) et récupération (preuve du processus de consolidation)1. Au cours de la phase de consolidation, l’établissement de nouvelles connexions synaptiques et la modification des connexions préexistantes se produisent. Ceci suggère la nécessité d’une période pendant laquelle les événements moléculaires et physiologiques responsables de ces changements se produisent1,2. Ces changements physiologiques ou moléculaires varient que les événements récupérés soient chargés émotionnellement ou non (c.-à-d. la mémoire émotionnelle). Par exemple, la recherche a montré que le noyau latéral et le complexe d’amygdale basolaterale sont particulièrement pertinents pour la mémoire émotionnelle3,4,5.

Les phénomènes de mémoire émotionnelle ont été principalement étudiés avec des paradigmes de conditionnement de la peur5,6. Le conditionnement de la peur est une forme d’apprentissage par laquelle les individus apprennent les relations entre les événements aversifs et les stimuli autrement neutres7. Les paradigmes de conditionnement de la peur produisent des changements moléculaires, cellulaires et structurels dans l’amygdale. En outre, le conditionnement de la peur modifie la connectivité de l’hippocampe pendant les processus de consolidation et de récupération de la mémoire émotionnelle.

L’une des procédures les plus couramment utilisées pour étudier les souvenirs de peur est le conditionnement classique (pavlovien) chez les rats. Cette procédure utilise généralement footshock (US) comme stimulus aversif, qui est livré une ou plusieurs fois à travers une ou plusieurs sessions. La réponse conditionnée (CR) des rats exposés à cette procédure est la congélation (c.-à-d. « l’immobilité généralisée causée par une réponse tonique généralisée de la musculature squelettique des animaux, à l’exception des muscles utilisés dans la respiration »7 ). Cette réponse pourrait être évaluée sur deux types de tests : les tests de contexte et de repère. Pour le test de contexte, le sujet subit un certain nombre de coups de pied pendant la séance d’entraînement, puis est retiré de la chambre expérimentale pour une période définie. Au cours de l’essai, le sujet est retourné dans le même contexte dans lequel la formation a eu lieu et différentes mesures de congélation sont recueillies en l’absence de chocs de pied (p. ex., durée, pourcentage ou fréquence des épisodes de congélation) et par rapport aux niveaux de base établis au cours de la phase de formation. Pour le deuxième type d’essai, test de repère, un stimulus (généralement une tonalité) est jumelé avec les chocs de pied pendant la phase d’entraînement (c.-à-d. stimulus conditionnel, CS). Une fois la formation terminée, l’animal est retiré du contexte d’entraînement pendant un temps défini et est ensuite placé dans un contexte modifié (p. ex., une chambre expérimentale différente qui a des formes différentes de murs et une odeur différente). Le signal est ensuite présenté un nombre donné de fois, et les réponses de congélation à la queue sont mesurées et comparées aux niveaux de base recueillis pendant la formation. La version la plus courante de ce paradigme utilise 1 à 3 appariements de choc de tonalité au cours d’une seule session de formation, suivie par le contexte et les tests de repère effectué un certain nombre d’heures ou quelques jours plus tard.

D’autres procédures de conditionnement de la peur moins fréquemment mises en œuvre impliquent un grand nombre d’appariements de points de choc (c.-à-d. les essais), qui ont souvent été appelés procédures de surentraînement8. Un intérêt croissant pour ces tâches est lié à leurs effets de mémoire durables et accrus appelés incubation de la peur (c.-à-d. les réponses à la peur conditionnées augmentent au fil du temps en l’absence d’une exposition supplémentaire à des événements aversifs ou à des stimuli conditionnés)9,10,11. Un exemple de ces procédures de surentraînement implique une phase de formation de 100 paires de choc sonore réparties sur 10 sessions, suivies de tests de contexte et de repère effectués 48 h et 30 jours plus tard11,12. Afin d’éviter une formation approfondie étalée sur plusieurs jours, Maren (1998) a indiqué que le surentraînement pouvait être établi et optimisé en une seule session avec 25 jumelages8. L’effet d’incubation est démontré dans des niveaux significativement plus élevés de peur conditionnée chez les rats testés 31 jours après l’entraînement, par rapport aux rats testés 48 h après. Les tâches prolongées de conditionnement de la peur ont été essentielles pour la compréhension des aspects comportementaux et neurobiologiques sous-jacents à l’incubation de la peur, y compris sa relation avec d’autres phénomènes psychologiques (p. ex., syndrome de stress post-traumatique retardé)11,12,13.

Ici, nous décrivons un protocole prolongé de conditionnement de la peur qui induit l’incubation surentraînée et la peur chez les rats. Différent des autres paradigmes qui nécessitent plusieurs jours de formation11, le protocole actuel est axé sur une seule session de formation8. Nous avons utilisé 25 appariements tone-choc pour produire des réponses de congélation plus élevées conditionnées pendant le contexte et les tests de repère effectués 6 semaines après l’entraînement, par rapport aux tests effectués 48 h après.

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Protocol

Le protocole suivant a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de fundación Universitaria Konrad Lorenz (IACUC-KL). La déclaration universelle des droits des animaux publiée par la Ligue internationale des droits des animaux, Genève, Suisse (1989), et les principes éthiques d’expérimentation des animaux publiés par l’ICLAS ont été respectés.

1. Préparation des sujets

  1. Sélectionner les rats Wistar adultes mâles (n = 12). Les loger en groupes de quatre par cage pendant trois jours d’acclimatation, avant le début du protocole d’entraînement et d’essai. Fournir aux rats un accès gratuit à l’eau tout au long de l’expérience. Contrôler la température ambiante entre 20 °C et 25 °C, sous un cycle clair-foncé de 12 h (lumières allumées à 07:00 h).
    REMARQUE : Les souches de rats avaient montré des performances différentielles pendant le conditionnement de la peur. Par exemple, Schaap et coll. (2013) ont signalé que les souches De Wistar et de Lewis présentaient des durées plus longues de comportement de congélation que les rats Fawn Hooded et Brown Norway12. Ainsi, les différences de douleur et de seuil thermique devraient être évaluées afin d’ajuster l’intensité et la durée des chocs.
  2. Maintenir les rats à 85% de leur poids libre (poids normal entre 350-400 g) en donnant un accès limité à la nourriture à la même heure chaque jour. Peser les rats tous les jours à la même heure pendant le cycle de lumière. Calculez le poids de l’annonce lib (100% de poids) pendant trois jours avant le début de l’entraînement prolongé de conditionnement de la peur.
    REMARQUE : Les animaux utilisés dans la présente expérience ont été testés sur d’autres tests instrumentaux qui ne sont pas signalés ici. La privation de nourriture était nécessaire pour ces tests supplémentaires. Cette variation procédurale est considérée comme susceptible d’élargir la portée de la présente procédure, car elle suggère la possibilité de tests combinés à la peur instrumentale. Cependant, les études utilisant uniquement des tests de conditionnement de la peur ne nécessiteront pas de privation de nourriture.
  3. Assigner au hasard des sujets à l’un des groupes suivants : test émotionnel 6 semaines après l’entraînement (n = 6); test émotionnel 48 h après l’entraînement (n = 6).
  4. Effectuer des entraînements et des tests à des heures similaires, pendant la phase de lumière du cycle de lumière sombre. Assigner les animaux dans la même chambre expérimentale et maintenir le même ordre d’animaux pendant l’entraînement et les essais.
    REMARQUE : Un contrôle supplémentaire qui pourrait être mis en œuvre est de contrebalancer l’ordre des animaux pendant les phases d’entraînement et d’essai. Nous recommandons d’utiliser cette technique lorsque des groupes multiples sont évalués, ou différentes tâches sont appliquées à travers des expériences, pour réduire un effet possible de l’ordre des tâches sur le comportement.

2. Réglage de l’appareil et étalonnage des chocs

  1. Nettoyez toutes les surfaces internes de la chambre expérimentale et du plancher de réseau en acier inoxydable avec 10% d’éthanol. Répétez la opération avant de tester chaque animal.
  2. Connectez l’équipement à un ordinateur à l’aide d’un câble USB et démarrez l’équipement du système de détection de congélation : le processeur, l’armoire de contrôle, la lumière infrarouge, le stimulateur/scrambler aversif et le calibrateur d’intensité de choc.
    REMARQUE : Bien que ce protocole ait été exécuté à l’aide d’instruments disponibles dans le commerce(Table des matériaux),l’équipement et les logiciels de différentes marques peuvent être utilisés. L’appareil se compose d’une chambre carrée acrylique interne (29,53 cm x 23,5 cm x 20,96 cm, appelée chambre expérimentale) encastrée dans une boîte en bois recouverte de formique plastique. Les portes extérieures permettent l’isolation du son, du bruit ou de la lumière (portes de boîte atténuantes). La caméra est située latéralement dans la partie interne de la porte externe. La boîte acrylique interne avec grilles métalliques de plancher (36 tiges en acier inoxydable, chacune de 3 mm de diamètre et espacée de 8 mm, centre au centre) permet la livraison de coups de pied. Dans l’un des murs internes-latéraux, un haut-parleur est situé à 6 cm du sol pour présenter un signal auditif.
  3. Connectez les clips rouges et noirs du calibrateur d’intensité de choc (c.-à-d. les connecteurs positifs et négatifs) à deux tiges différentes sur le plancher de la grille. Connectez le câble USB au port correspondant de l’ordinateur. Assurez-vous de connecter les clips rouges et noirs aux barres séparées par une autre barre.
    REMARQUE : Cette section décrit le processus d’étalonnage de l’intensité des chocs à l’aide d’une marque spécifique d’équipement mentionnée dans le Tableau des matériaux. Toutefois, le processus d’étalonnage peut être effectué à l’aide de différentes marques d’équipement. Il est recommandé de calibrer l’intensité du choc dans trois secteurs du plancher du réseau pour vérifier qu’il est cohérent. En outre, toujours enlever les résidus fécaux et d’urine du plancher de la grille pour éviter les interférences pendant la livraison du choc.
  4. Démarrez le logiciel d’étalonnage d’intensité de choc (Table des matériaux). Choisissez une intensité de 1,0 mA dans l’application en cliquant sur la flèche de plage. Ensuite, modifiez le commutateur Exécuter/Arrêter pour exécuter.
    NOTE: Nous proposons 1,0 mA basé sur nos études avec des modèles de rongeurs dans notre laboratoire et la littérature qui rapporte une gamme de 0,75 mA à 1,5 mA comme adéquat pour les études de conditionnement de la peur33,34,35.
  5. Allumez le stimulateur aversif ou l’équipement utilisé pour livrer les chocs de pied et regardez l’intensité de choc affichée sur le panneau de l’application. Si nécessaire, ajuster l’intensité à 1,0 mA à l’aide du bouton sur le stimulateur aversif.
    REMARQUE : Le stimulateur aversif doit être défini sur « OUT » pour tester, calibrer et exécuter l’expérience de manière appropriée.

3. Étalonnage du système de détection de congélation

  1. Fermez la chambre expérimentale et les portes de la boîte atténuantes. N’introduisez pas l’animal à ce stade, car il sera placé dans la chambre une fois l’étalonnage du système de détection de congélation terminé. Vérifiez que l’intensité lumineuse à l’intérieur de la boîte se situe entre 20 et 30 lux.
  2. Démarrez le logiciel du système de détection de congélation et ouvrez la fenêtre de dialogue d’installation d’expérience. Entrez les détails de chaque sujet (tel que le numéro d’identification du sujet, la date et le groupe) et chargez le fichier intitulé « Protocole de formation VFC.pro » (disponible à http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
    REMARQUE : Les tests de contexte et de repère utilisent une configuration de programme différente ; ainsi, assurez-vous d’utiliser le fichier correct sur chaque test. À ce stade, le fichier correct correspond à « Protocole de formation VFC.pro ». N’oubliez pas que pendant les phases de test, le fichier correspondant sera différent de la session de formation.
  3. Choisissez les appareils photo(s) correspondants et vérifiez l’option Enregistrer la vidéo (si nécessaire). Définissez le seuil de mouvement à 100 et min freeze duration à 30 images.
    REMARQUE : Cette valeur de seuil de mouvement est basée sur la taille de l’espèce utilisée (en fonction du nombre de pixels). La valeur minimale de la durée de gel est recommandée par le fabricant. Ces valeurs sont utilisées pour assurer une bonne reconnaissance de l’animal dans la chambre.
  4. Vérifiez que le flux en direct de la ou des caméras choisies apparaît à l’écran, ainsi que le graphique du seuil de mouvement et la chronologie des différents stimuli qui sont présentés pendant la formation (p. ex., le son et le choc).
    REMARQUE : À l’aide d’une autre marque, l’installation de l’équipement devrait offrir la possibilité de mesurer les mouvements de l’animal afin de détecter un « ndic » de mouvement qui devrait permettre des comparaisons sur la durée pendant laquelle l’animal se déplace ou gèle. Une autre possibilité est d’utiliser un logiciel qui, avec seulement la source vidéo (pendant ou après l’expérience) peut détecter la quantité de temps que l’animal est en mouvement ou de congélation, comme le logiciel libre ImageFZ13, boîte à outils open-source dans Matlab14, ou un classificateur libre de comportement animal comme JAABA15.
  5. Cliquez trois fois sur l’option Calibrer, tout en vérifiant que l’index de mouvement reste inférieur à 100 (seuil). Ensuite, réglez l’équipement à verrouiller en cliquant sur le bouton correspondant sur l’écran.
    REMARQUE : Cette section décrit un processus d’étalonnage du système de détection de congélation à l’aide d’une marque spécifique d’équipement répertorié dans le tableau des matériaux. Comme il a été mentionné précédemment, le processus d’étalonnage peut être effectué à l’aide de différentes marques d’équipement (pour un examen des différentes options dans l’équipement et les logiciels voir Anagnostaras et al. 2010)16.

4. Formation prolongée de conditionnement de peur

  1. Transportez les rats dans leurs cages, recouvertes d’un chiffon, de l’établissement de soins aux animaux à la salle d’entraînement comportemental du laboratoire. Évitez l’exposition au bruit ou aux conditions génératrices de stress pendant le transport des animaux à la salle d’entraînement comportementale. Si plusieurs animaux sont transportés en même temps, n’apportez que les animaux à tester et maintiennent d’autres rats dans une salle de détention afin d’améliorer le contrôle expérimental. Manipuler délicatement les animaux pendant 2 min avant de commencer l’entraînement.
    REMARQUE : Dans le protocole, les animaux ont été manipulés chaque jour pendant 2 minutes avant l’entraînement comportemental. Après manipulation, les animaux ont été introduits dans la chambre expérimentale. Nous avons recommandé de manipuler les animaux pour que les rats s’habituent au chercheur.
  2. Introduisez le rat dans la chambre expérimentale. Manipuler doucement par la base de sa queue et le placer sur le milieu de la chambre. Fermez la chambre expérimentale et les portes de la boîte atténuantes.
  3. Démarrez la session en cliquant sur le bouton Enregistrer. Laissez le rat s’acclimater à la chambre pendant 3 min. Cette période de 3 min est la norme recommandée par l’équipementier et sert de temps de référence et d’accoutumance à la chambre.
  4. Offrez vingt-cinq paires de chocs tonus (essais) avec un intervalle inter-essais de 60 s (INI), à partir de la minute 3 de la session. Présenter le ton (stimulus conditionné – CS; 90 dB SPL, 2000 Hz, 50 ms Rise Time) au cours des 10 dernières années de chaque INI, et le choc (stimulus non conditionné – US) au cours des 2 dernières années de chaque INI.
    REMARQUE : L’activation du bouton Enregistrement est conditionnelle au fait que les caméras sont correctement calibrées et verrouillées.
  5. Retirer le rat de la chambre expérimentale lorsque la session de 28 min est terminée. Renvoyez les animaux dans la cage de la maison respective. Transportez les rats dans leurs cages intérieures recouvertes d’un chiffon de la salle d’entraînement comportementale jusqu’à l’établissement de soins aux animaux.
  6. Étalonnage répété du système de détection de congélation (étapes 3.1-3.5) et conditionnement de la peur (étapes 4.1 et 4.3) pour former tous les sujets.
    REMARQUE : Nous recommandons fortement de recalibrer le système de détection pour chaque animal afin de s’assurer que le logiciel maintient les mêmes paramètres lorsqu’il traite des informations pour la détection de congélation.
  7. Période de repos : Pendant cette période, faites reposer les animaux individuellement dans leurs cages. Surveiller le poids des animaux deux fois par semaine pendant les 6 semaines de la période d’incubation. Manipuler doucement chaque animal pendant deux minutes pendant qu’ils sont pondérés.

5. Test de contexte – session unique de 10 min

  1. Après la phase d’entraînement, exposer les animaux au premier test de mémoire appelé test de contexte. Au cours de cette phase de 10 min, exposer les rats au même contexte dans lequel la formation a eu lieu, mais ne présentent pas de repères ou de chocs. Transporter les rats dans leurs cages couvertes (p. ex., avec un chiffon) de l’établissement de soins aux animaux à la salle d’entraînement comportementale. Gardez à l’esprit que les animaux ont été divisés en groupes, donc un groupe est testé 48 h après la phase d’entraînement et l’autre groupe est testé 6 semaines après l’entraînement (voir figure 1).

Figure 1
Figure 1 : Chronologie de l’expérience. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Nettoyez toutes les surfaces internes de la chambre expérimentale et du plancher de réseau en acier inoxydable avec 10% d’éthanol. Répétez la opération avant de tester chaque animal.
  2. Étalonnage répété du système de détection de congélation (étapes 3.1 à 3.5). Ouvrez la fenêtre de dialogue d’installation d’expérience et chargez le fichier nommé « Test de contexte protocol.pro », disponible à partir de http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    REMARQUE : Ce fichier contient la configuration de cette phase expérimentale qui ne se compose d’aucun choc ou tonalité.
  3. Présentez l’animal à la chambre expérimentale. Manipuler doucement par la base de sa queue et le placer sur le milieu de la chambre. Fermez la chambre expérimentale et les portes de la boîte atténuantes.
  4. Démarrez la session en cliquant sur le bouton Enregistrer. Au cours de cette seule séance de test de contexte de 10 min, aucun stimulus n’est présenté (choc ni son).
  5. Retirez le sujet de la chambre expérimentale lorsque la session de 10 min est terminée. Renvoyez les animaux dans leurs cages respectives et transportez les rats dans leurs cages couvertes de la salle d’entraînement comportementale jusqu’à l’établissement de soins aux animaux. Répétez les étapes 5.2-5.5 pour tester tous les sujets.

6. Test de cue – session simple de 13 min

  1. Un jour après le test de contexte, les animaux ont-ils subi le deuxième test de mémoire appelé test de repère. Au cours de cette phase, les rats seront dans un contexte différent de formation pendant 13 min.; repères (tons) sont présentés, mais aucun choc n’est délivré. Transportez les rats dans leurs cages d’origine couvertes d’une couverture de l’établissement de soins aux animaux jusqu’à la salle d’entraînement comportementale. Testez un groupe 72 h après l’entraînement de conditionnement de la peur, et testez un autre groupe 6 semaines et un jour après l’entraînement (figure 1).
    REMARQUE : Un système de transport différent (de l’établissement de soins aux animaux à la salle expérimentale) pourrait être mis en place pour différencier davantage le contexte et les tests de repère. Étant donné que les animaux ont été transportés à la séance d’entraînement et à la séance d’essai contextuelle dans leurs cages d’accueil, une cage de transport différente, une literie et/ou une couverture pourraient être utilisées pendant le transport jusqu’à la séance d’essai de repère.
  2. Nettoyez toutes les surfaces internes de la chambre expérimentale et du plancher de réseau en acier inoxydable avec 10% d’éthanol. Répétez la opération avant de tester chaque animal.
  3. Pour modifier le contexte visuel, insérez le mur entourant le plastique dans la chambre expérimentale.
  4. Pour changer le contexte olfactif, appliquez 1% d’acide acétique à un écouvillon à pointe de coton, et placez-le dans le plateau métallique sous le plancher de la grille17,18,19.
  5. Répétez l’étalonnage du système de détection de congélation (étapes 3.1-3.5). Chargez le fichier nommé fichier « Cue test protocol.pro » fichier, qui est disponible à partir de http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    REMARQUE : Ce fichier contient la configuration de cette phase expérimentale, qui consiste en la livraison des mêmes tonalités présentées pendant la phase de formation (CS), mais en l’absence de chocs (US).
  6. Présentez l’animal à la chambre expérimentale. Manipuler doucement par la base de sa queue et le placer sur le milieu de la chambre. Fermez la chambre expérimentale et les portes de la boîte atténuantes.
  7. Démarrez la session en cliquant sur le bouton Enregistrer. Au cours de la seule séance d’essai de 13 minutes, le stimulus CS (tone) est présenté 10 fois, à partir de la minute 3 de la session.
    REMARQUE : Les 3 premières minutes correspondent à la ligne de base de cette session, suivies de 10 essais de repère (c’est-à-dire 10 s chacun) livrés avec 50 ITT en l’absence de chocs. La livraison des tons est automatique, via l’utilisation du fichier précédemment chargé.
  8. Retirer l’animal de la chambre expérimentale lorsque la séance de 13 min est terminée. Renvoyer les animaux dans la cage respective et les transporter à l’établissement de soins pour animaux. Répétez les étapes 6.2 à 6.5 pour tester tous les sujets.

7. Analyse des données

  1. Obtenez l’index d’activité générale (c.-à-d. l’index de mouvement) qui est dérivé du flux vidéo à l’aide du logiciel du système de détection de congélation. Ce logiciel transforme automatiquement l’index de mouvement pour fournir le pourcentage de temps de congélation par session et le nombre d’épisodes de congélation. Définissez le seuil de congélation sur le paramètre durée minimale de gel par défaut du système (1 s = 30 images).
  2. Utilisez le programme supplémentaire sur mesure (fichier disponible à partir de http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ)pour obtenir :
    1. Utilisez le programme pour déterminer le pourcentage de congélation pendant les trois premières minutes de la séance d’entraînement (c.-à-d. le gel de base, puisqu’aucun choc ou tonalité n’a été présenté avant ou pendant cette période de 3 minutes) et pendant les trois premières minutes de la séance d’essai de repère.
    2. Utilisez le programme pour déterminer le pourcentage de congélation pour chacun des huit bacs de 3 minutes de la séance de formation.
    3. Utilisez le programme pour déterminer le pourcentage de congélation pendant les présentations de repères (c.-à-d. le gel pendant les tons) et les périodes sans repère (intervalles intertrials; UIT), pour les séances de formation et de cue-test.
  3. Pour obtenir ces données, ouvrez le logiciel du système de détection de congélation.
    1. Sélectionner le fichier | Rapports | Résumé du composant de lot.
    2. Sélectionnez le fichier avec l’extension . CMP disponible à partir de http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    3. Nommez le fichier de sortie et modifiez le seuil de mouvement en 100. Ensuite, cliquez sur OK.
    4. Sélectionnez les fichiers à analyser (extension . RAW). Ces fichiers sont générés automatiquement à partir du logiciel du système de détection de congélation lorsque la session est terminée et correspondent aux données brutes de chaque session. Initialement, les fichiers sont enregistrés dans le bureau de l’ordinateur, mais ils peuvent être stockés dans un dossier personnalisé (par exemple, Documents-Fear conditionnement) pour faciliter leur identification ultérieure et l’ouverture quand ils ont besoin d’être analysés.
    5. Ouvrez les fichiers de sortie (extension . CSV). Ils peuvent être édités dans un logiciel de feuille de calcul pour une analyse plus approfondie. Ce fichier contient les résultats du gel pendant la session expérimentale.
      REMARQUE : Pour obtenir le pourcentage total de congélation, divisez le temps que le sujet a passé immobile au cours du temps total de la session. Le nombre d’épisodes de congélation peut être calculé en comptant le nombre d’événements de congélation au cours de la session. Dans les deux cas, il est nécessaire de définir un seuil de mouvement fondé sur une durée minimale de gel. C’est le critère temporel qui définit si un épisode de gel est enregistré. Les systèmes automatisés d’enregistrement peuvent utiliser certaines images par seconde (fps) comme mesure de la durée minimale de gel. Par exemple, avec un taux d’échantillonnage de 30 fps, une durée minimale de gel de 15 images enregistrera comme gel d’une instance d’immobilité qui dure pendant 30 s.
  4. Calculer la durée moyenne de chaque épisode de congélation pour chaque session (entraînement et les deux tests, contexte et repère) en divisant la durée totale de congélation (en secondes) sur le nombre total d’épisodes de congélation.

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Representative Results

Les variations du pourcentage de temps de congélation au cours des différentes étapes de la session de formation ont été analysées pour tous les sujets (n = 12) à l’aide d’un test t dépendant (tableau 1). Les animaux étaient actifs et ont exploré la chambre expérimentale pendant les trois premières minutes de la séance d’entraînement (premier jour du protocole), période pendant laquelle aucune tonalité ou choc n’a été livré (c.-à-d. baseline-BL). Comme le montre la figure 2A, pourcentage de temps de congélation au cours des 25 paires de chocs tonéaux suivantes (M = 48,88; SE = 4,37) était significativement plus élevé que pendant bl (M = 14,65; SE = 4,05), ce qui est supposé être une indication de l’acquisition de la peur.

Test statistique Figure Phases
Test t dépendant 2A t (11) = -6,21, p < 0,001, d = 2,34
Bacs de 3 min
Mesures répétées ANOVA 2B F (3,75, 41,32) = 11,19, p < 0,001, ηp2 = 0,50.
Phases Groupe Phases X Groupe
ANOVA mixte 2C F(3, 30) = 14,21, p < .001, ηp2 =.58 F(3, 30) = 4,63, p < .05, ηp2 =.31 F(1, 10) = 2,06, p >.05,ηp 2 =.17
ANOVA à sens unique 3A F(1, 10) = 6,91, p < .05, ηp2 =.40
ANOVA à sens unique 3B F(1, 10) = 10,30, p < .05, ηp2 =.50
ANOVA à sens unique 3C F(1, 10) = 5,83, p <. 05, ηp2 =.36
ANOVA mixte 4A F(2, 20) = 29,28, p < .001, ηp2 =.74 F(2, 20) = 2,33, p >.05, ηp2 =.18 F(1, 10) = 2,14, p >.05,ηp 2 =.17
ANOVA mixte 4B F(1, 10) = 1,53, p >.05,ηp 2 =.13 F(1, 10) = 3,98, p < .05, ηp2 =.28 F(1, 10) = 0,23, p >.05,ηp 2 =.02
ANOVA mixte 4C F(1, 10) = 25,43, p < .001, ηp2 =.71 F(1, 10) = 6,17, p < .05, ηp2 =.38 F(1, 10) = .22, p >.05,ηp 2 =.02

Tableau 1 : Statistiques utilisées dans l’analyse des données. Pour la figure 2A, le pourcentage moyen de congélation de tous les sujets (n = 12) au cours des 3 premières minutes de la séance d’entraînement (correspondant à la ligne de base, BL) a été comparé au pourcentage de congélation au cours des 25 minutes restantes de la session (25 essais de choc ton) montrant une différence significative et une grande tailled’effet (Cohen d = 2,34). Pour la figure 2B, une comparaison a été effectuée dans des bacs de 3 minutes montrant une différence significative dans un test ANOVA à mesures répétées (BL et huit bacs de 3 min). Pour la figure 2C, des comparaisons entre le pourcentage moyen de congélation de chaque groupe de rats au cours de la ligne de base (BL, 3 premières minutes de la séance d’entraînement), la période d’entraînement (25 appariements ton-choc), la session d’essai de contexte et la séance d’essai de repère ont été effectuées par l’intermédiaire d’un ANOVA mixte avec le facteur entre sujets du groupe (48 h ou 6 semaines) et les sujets à l’intérieur des facteurs des phases (BL, formation, test de contexte et test de cue). Des différences entre les phases et le groupe, mais pas dans les phases d’interaction*Groupe ont été trouvées. La figure 3A – 3B affiche les données sur l’activité (panneau 3A, indice de mouvement), le gel (panneau 3B, congélation moyenne en quelques secondes) et la durée des épisodes (panneau 3C, épisodes de congélation moyen en quelques secondes). Ces données ont été analysées à l’aide d’un ANOVA à sens unique, qui indiquait des différences entre les groupes dans toutes les mesures. Enfin, pour la figure 4A – 4C, un ANOVA mixte a été effectué pour chaque panel (A, B et C), ayant comme facteur entre sujets le groupe (48 h ou 6 semaines) et les sujets à l’intérieur du facteur des phases (BL, formation, test de contexte et test de cue).

Figure 2
Figure 2 : Phase de formation d’un protocole prolongé de conditionnement de la peur cued. Les données sont affichées sous la forme moyenne (barres) et sem (barres d’erreur) de la réponse de congélation. ( A ) montrelepourcentage moyen de congélation de tous les sujets (n = 12) au cours des 3 premières minutes de la séance d’entraînement, au cours de laquelle aucun choc ou tonalité n’a été présenté (ligne de base, BL), et les 25 minutes restantes de la session (25 essais de choc sonore, avec intervalle intertrial, INI, de 60 s); = différent de BL (p < .001). (B) montre le temps de congélation moyen de tous les animaux (n = 12) au cours de la période de base de 3 min (BL, pas de chocs ou de tons livrés) et les bacs suivants de 3 min de la séance d’entraînement; = différent de tous les bacs restants (p < .001). (C) montre le pourcentage moyen de congélation de chaque groupe de rats (test 48 h après l’entraînement; test 6 semaines après l’entraînement) au cours de la ligne de base (BL, première 3 min de la séance d’entraînement), de la période d’entraînement (25 appariements ton-choc), de la séance d’essai de contexte et de la séance d’essai de repère; * = différent des essais après 48 h(contexte moyen de diffContext = -34,95, SE = 14,99, p < .05, Cohen’s d = 1,34); a = différent de la période d’entraînement(moyenne diffTraining48h = 42,51; SE = 7,28; p < 0,05; Cohen’s d = 3,03); b = différent de la période d’entraînement(moyenne diffTraining6Weeks = 25,94; SE = 7,28; p < 0,05; Cohen’s d = 1,77), test de contexte(moyenne diffContext6Weeks = 50,36; SE = 10,58; p < 0,01; Cohen’s d = 3.13), et test de repère(moyenne diffCue6Weeks = 55,86; SE = 10,25; p < 0,01; Cohen’s d = 2,47). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Une analyse de la réponse de congélation tout au long de l’acquisition a été effectuée en segmentant la séance de formation dans huit bacs de 3 min (figure 2B). Ces données montrent que le temps moyen alloué à cette réponse atteint l’asymptote près ou à 180 s au cours des trois premiers essais de choc ton (c.-à-d. le bac 1). Cette constatation a été considérée dans des recherches antérieures comme une indication de surentraînement11. Les mesures répétées ANOVA ont révélé des différences significatives constantes entre les bacs de référence et tous les bacs subséquents, avec de grandes taillesd’effet ( tableau 1 et tableau 2).

Comparaison Différence moyenne Erreur standard valeur p Cohen’s d
Base de base du bac vs bac 1 -60.075* 12,243 < .05 1.95
Base de base du bac vs bin 2 -69.053* 16,220 < .05 1.89
Base de base du bac vs bin 3 -66.197* 13,706 < .05 1.91
Base de base du bac vs bin 4 -68.595* 11,969 < .05 2.08
Base de base du bac vs bin 5 -65.475* 10,991 < .05 2.15
Base de base du bac vs bin 6 -65.795* 13,509 < .05 2.06
Base de base du bac vs bin 7 -72.900* 12,231 < .05 2.53
Base de base du bac vs bin 8 -78.633* 8,692 < .001 3.37

Tableau 2 : Différence moyenne, erreur standard et taille d’effet pour les bacs de 3 min de la figure 2B. Ce tableau montre les comparaisons entre le compartiment de référence et chacun des bacs suivants (Figure 2B). La différence moyenne, l’erreur standard et la valeur pet le d de Cohen sont signalés comme un indice de la taille de ces différences (taille de l’effet).

Un ANOVA mixte a été effectué pour tester les différences de pourcentage de congélation au cours de la tâche, ayant des phases (BL, formation, test de contexte et test de repère) comme facteur et groupe à l’intérieur du sujet (48 h et 6 semaines) comme facteur entre sujets (tableau 1). Le pourcentage de congélation de tous les animaux pendant la période d’entraînement était significativement plus élevé qu’au cours de la période de référence (voir la figure 2C). Aucune différence significative n’a été observée entre le pourcentage de congélation pendant les tests de mémoire et la période d’entraînement(ps > .05).

Aucune différence significative entre les deux groupes (48 h et 6 semaines) n’a été observée dans le pourcentage de congélation pendant le BL, l’entraînement et le test de repère (ps > .115; voir figure 2C). Inversement, les animaux testés 6 semaines après l’entraînement ont montré des pourcentages significativement plus élevés de congélation au cours de l’essai de contexte que les animaux testés à 48 h, avec une grande taille d’effet (voir la figure 2C). Dans l’ensemble, la figure 2C montre que le gel pendant les tests de contexte retardé à long terme et les tests de repère (c.-à-d. 6 semaines après l’entraînement) était globalement beaucoup plus élevé que pendant la séance d’entraînement. La tendance à la baisse inverse a été observée dans le groupe d’animaux qui ont été testés 48 h après l’entraînement. Toutefois, ces différences dans le groupe de 48 h n’étaient pas statistiquement significatives(ps > .05). Enfin, bien que le niveau de congélation ait montré des différences entre les différentes phases, ils pouvaient être considérés comme faibles par rapport à d’autres protocoles. Une explication pourrait être les différences méthodologiques inhérentes entre les laboratoires ou le seuil d’indice de mouvement établi au cours du processus d’étalonnage, ce qui rend difficile la comparaison des données entre les laboratoires.

La réponse de gel conditionnée des deux groupes de sujets au cours de l’essai de contexte a été explorée plus avant par l’analyse d’autres mesures, à savoir l’activité moyenne (c.-à-d., indice de mouvement), le temps de congélation total et le temps de congélation par épisode. Un ANOVA à sens unique a été utilisé pour tester les différences entre ces variables (Tableau 1). L’activité des sujets testés 6 semaines après l’entraînement était significativement inférieure à celle des animaux testés 48 h après la séanced’entraînement ( figure 3A). Par conséquent, le temps de congélation total des animaux testés peu de temps après l’entraînement était nettement inférieur à celui des animaux testés 6 semaines après (figure 3B). Enfin, une analyse de la durée moyenne de chaque épisode de congélation a révélé que les animaux testés 6 semaines après l’entraînement présentaient des épisodes de congélation plus longs que les animaux testés 48 h aprèsl’entraînement ( figure 3C). Au total, ces résultats indiquent un effet d’incubation de la peur.

Figure 3
Figure 3 : Effets d’un protocole prolongé de conditionnement de la peur cued sur la réponse de congélation des rats.
Les données sont affichées sous la forme moyenne (barres) et sem (barres d’erreur) de la réponse de congélation. ( A ) montrel’activité(c.-à-d. l’indice de mouvement) de chaque groupe de sujets (test 48 h après l’entraînement; test 6 semaines après l’entraînement) pendant le test de contexte; * = différent de 6 semaines. (B) indique le temps de congélation total moyen (en secondes) de chaque groupe de sujets au cours de l’essai de contexte; * = différent de 6 semaines. (C) indique la durée moyenne de chaque épisode de congélation (en secondes) pour chaque groupe de sujets au cours de l’essai de contexte; * = seulement différent de 6 semaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Un examen plus approfondi des performances au cours de la séance d’essai de repère a été effectué par des analyses de a) pourcentages de congélation pendant les périodes de référence (BL Training et BL Cue Test) et pendant l’ensemble du test de repère de 10 minutes (dix présentations de tonalité de 10 s et dix ITT de 50 s - Figure 4A), b) temps de congélation moyen spécifiquement pendant les présentations de 10 s du signal (ton), pour les séances de formation et de test cue (figure 4B),et c) temps de congélation moyen (en secondes) pendant les intervalles intertrials de 50 s (IBI; c.-à-d. périodes sans tonalité seulement – Figure 4C). Un ANOVA mixte a été utilisé pour analyser chacune de ces mesures dépendantes, en supposant que les phases (formation BL, test bl cue et test de cue) comme facteur et groupes de sujets intérieurs (48 h et 6 semaines) comme facteur entre les sujets (tableau 1). Comme le montre la figure 4A, le groupe de rats testés 6 semaines après l’entraînement a considérablement augmenté leur pourcentage de congélation au cours de la ligne de base de la session d’essai de cue (test de cue de BL; premier 3 min de la session) et pendant le test de cue de 10 minutes, par rapport à l’entraînement bl (c.-à-d. avant toute exposition aux tons et aux chocs). Aucune différence analogue entre la formation BL et BL Cue n’a été observée pour le groupe de rats testés après 48 h(p > .05). Pour les deux groupes de rats, le pourcentage de congélation au cours de l’essai cue de 10 min était plus élevé que pendant la période de base correspondante de cette même session (BL Cue Test), ce qui suggère un effet de récupération. Aucune différence n’a été observée entre les groupes de rats sur le pourcentage de congélation au cours des différentes périodes (ps > .05).

La figure 4B montre une comparaison du temps de congélation moyen (en secondes) spécifiquement pendant les présentations de tonalité de 10 s à travers la formation (appariements de choc de tonalité) et le test de cue (seulement des présentations de tonalité). Seuls les rats testés 6 semaines après l’entraînement ont considérablement augmenté la quantité de temps de congélation pendant le signal.

Enfin, comme le montre la figure 4C, seul le groupe de rats testés 48 h après l’entraînement a considérablement diminué le temps de congélation pendant les ITT de la session d’entraînement au test Cue. Aucune différence dans le temps de congélation pendant les ITT n’a été observée entre les deux groupes de rats (ps >.05).

Figure 4
Figure 4 : Effets d’un protocole de conditionnement de la peur à cuisson prolongée sur la réponse de congélation pendant l’essai de repère.
Les données sont affichées sous la forme moyenne (barres) et sem (barres d’erreur) de la réponse de congélation. (A) montre le pourcentage de congélation de chaque groupe de sujets (test 48 h après l’entraînement; test 6 semaines après l’entraînement) au cours des 3 premières minutes de la séance d’entraînement (BL, ligne de base), les 3 premières minutes de la session d’essai de repère (BL Cue) et les 10 min du test de repère (Test cue); a = différent de l’essai Cue après 48 h (moyenne diffBLTraining-Cue48h = 32,84; SE = 10,25; p < 0,05; Cohen’s d = 1,52); b = différent de BL Cue Test(moyenne diffBLCue-BL6Weeks = 33,98; SE = 8,36; p < 0,05; Cohen’s d = 1,59) et Cue Test(moyenne diffCue-BL6Weeks = 55,86; SE = 10,25; p < 0,05; Cohen 's d = 2.47); c = différent de Cue Test après 48 h (moyenne diffBLCue-Cue48h = 18,99; SE = 5,17; p < 0,05; Cohen 's d = .67); d = différent de Cue Test après 6 semaines (moyenne diffBLCue-Cue6Weeks = 21,87; SE = 5,17; p < 0,05; Cohen d = .88). (B) indique le temps de congélation moyen (en secondes) pendant le signal (ton) de chaque groupe de sujets pendant l’entraînement et le test cue; * = différent de 6 semaines pendant la période d’essai du test cue(moyenne diffTraining-Cue6Weeks = -3,14; SE = 1,37; p < 0,05; Cohen’s d = 1,64). (C) montre le temps de congélation moyen (en secondes) pendant les intervalles intertrials (INI) de la session d’entraînement (10 accords ton-choc) et le test Cue (10 présentations ton-seulement) entre les deux groupes de rats (48 h et 6 semaines); = différent de la formation pour le groupe de rats testés 48 h après l’entraînement(moyenne diffTraining-Cue48h = 506,16; SE = 95,08; p < .001; Cohen d = 2,48). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le protocole de conditionnement de la peur étendu actuel est une approche efficace et valide pour évaluer la mémoire émotionnelle à travers les périodes courtes (48 h) et à long terme (6 semaines). Ainsi, le protocole permet d’étudier les phénomènes de surentraînement et d’incubation de la peur chez les rats. Parmi les différents avantages de ce protocole sont les suivants. Il offre deux types de tests de mémoire, à savoir le contexte et le repère, qui permettent d’identifier l’effet différentiel de deux retards (48 h et 6 semaines) à travers le contexte et les manipulations de repères. Deuxièmement, la tâche implique une seule séance de formation de 28 minutes, qui à son tour produit des effets à long terme qui s’étendent sur plusieurs semaines. Cet avantage est remarquable, étant donné que certaines versions de conditionnement de la peur prolongée ont besoin d’au moins 100 chocs à travers 10 sessions de formation11. Troisièmement, le protocole offre plusieurs alternatives de mesure, qui sont calculées automatiquement. En outre, il existe de plus en plus de preuves pharmacologiques, physiologiques et anatomiques qui appuient la validité de ce paradigme pour l’évaluation des phénomènes de mémoire émotionnelle15,16.

Comparativement à d’autres paradigmes de conditionnement de la peur avec de brèves séances de formation (c.-à-d. peu d’essais), les protocoles étendus qui entraînent des effets de surentraînement ont reçu moins d’attention. Cependant, des tâches prolongées de conditionnement de la peur ont été essentielles à la compréhension des processus comportementaux et neurobiologiques sous-jacents de l’incubation de la peur, y compris sa relation avec d’autres phénomènes psychologiques (p. ex., syndrome de stress post-traumatique retardé)11,12,13. Le protocole actuel de conditionnement de la peur produit de manière fiable l’incubation de la peur. Cela est démontré avec des temps de congélation plus élevés et des indices de mouvement plus faibles chez les animaux évalués 6 semaines après l’entraînement, par rapport aux animaux testés 48 h après l’entraînement. En outre, cet effet pourrait être observé différemment dans chacun des types d’essais; plus précisément, des épisodes de congélation plus longs pendant le test de contexte 6 semaines après l’entraînement et des incréments de congélation pendant les présentations de repère 6 semaines après l’entraînement. En ce qui concerne ce dernier effet (c.-à-d. des augmentations de congélation pendant les présentations de repères 6 semaines après la formation), il semble que la nouveauté de la situation expérimentale (c.-à-d. un nouveau contexte) puisse être écartée, puisque les niveaux de congélation de base au cours de cette même session étaient significativement inférieurs à ceux des présentations suivantes.

Bien qu’une tendance à l’apprentissage de la peur ait été évidente dans les deux groupes (c.-à-d. des différences entre la base de 3 min et l’entraînement), les animaux qui ont été testés après 48 h (contexte) et 72 h (cue) n’ont pas montré de différences significatives dans le niveau de congélation au cours des deux tests. Cela peut être considéré comme une limitation du protocole, qui semble le résultat d’une forte variabilité comportementale dans le groupe de 48 h (voir la figure 2C). Un changement méthodologique qui peut être mis en œuvre afin de réduire la variabilité et d’améliorer la procédure est d’effectuer le contexte et le test de repère 24 h après l’entraînement, ce qui est commun dans certaines procédures de conditionnement de la peur.

Le présent protocole pourrait être appliqué dans la recherche clinique23. La forte trace de mémoire et l’effet d’incubation qui résultent de sa mise en œuvre peut permettre de tester les effets des médicaments régulièrement utilisés pour le traitement des pathologies psychologiques et psychiatriques (p. ex., traitements anxiolytiques ou régulateurs de l’humeur24) sur les phénomènes de mémoire émotionnelle (p. ex., extinction de la peur)25,26,27. Le protocole pourrait ainsi permettre de mesurer l’influence des médicaments sur la trace de mémoire à travers différentes périodes, y compris les corrélations biologiques telles que les neurotransmetteurs et les molécules liées à l’entretien de la mémoire28,29. Le protocole pourrait également être pertinent pour la recherche avec une perspective translationnelle, qui a proposé que les paradigmes de peur pourraient être utiles pour tester des modèles précliniques de thérapies comportementales30 et des études comparatives sur la peur entre les espèces21,22. Enfin, d’un point de vue neurobiologique, le protocole actuel est un modèle robuste pour étudier les mécanismes cérébraux, les communications entre les structures, les réseaux ou les ensembles neuronaux impliqués dans l’acquisition à long terme, la consolidation et le stockage de la mémoire émotionnelle, ou les effets de l’incubation au cours du développement32.

D’autres aspects du protocole méritent d’être discutés. La privation de nourriture a été utilisée tout au long de l’expérience. Cette décision a été adoptée parce que d’autres tests comportementaux basés sur des récompenses alimentaires (p. ex., des techniques opérentes ou instrumentales)33,34,35 peuvent être intégrés avec des changements minimaux, ce qui rend le protocole actuel une technique plus polyvalente. Par exemple, nous avons intégré avec succès ce protocole avec des protocoles d’exercice à roues et des tâches de mémoire en T-maze. Un autre aspect est lié à la taille du groupe (n=6) implémentée dans ce protocole. Bien qu’il s’agisse d’un échantillon relativement petit et que des échantillons plus importants soient certainement recommandés, la taille de l’effet d’incubation compense cette limitation (voir le tableau 1). Cela pourrait être considéré comme un avantage de ce protocole, en particulier en ce qui concerne les recommandations des comités des animaux fondées sur le principe de réduction. Une limite du protocole était que l’exposition minimale ou nulle aux chocs de pied et au cours de temps de l’incubation de crainte n’ont pas été évaluées. Un groupe de contrôle supplémentaire avec les conditions avant pourrait augmenter la rigueur de la conception expérimentale.

Les recommandations finales pour la meilleure mise en œuvre et les résultats de ce protocole comprennent le nettoyage correct de la chambre expérimentale, en particulier le plancher de la grille, l’étalonnage des intensités de choc avant la formation de chaque sujet (p. ex., les excréments et l’urine réduisent souvent la fiabilité de l’intensité de choc dans les différentes zones de la chambre) et l’étalonnage du système de détection de congélation (la fiabilité des mesures de congélation dépend de la fixation appropriée du seuil de mouvement et de la durée minimale de congélation).

Ce protocole pourrait être testé avec d’autres souches de rats ou d’autres rongeurs (p. ex., souris ou gerbilles mongoles), ce qui élargirait le champ d’application. Dans ces cas, il est important d’ajuster l’intensité des chocs, ainsi que les seuils de mouvement et de durée. L’intensité de choc utilisée dans les protocoles de conditionnement de la peur avec des souris varie généralement de 0,4 mA à 1,5 mA, avec 0,75 mA une intensité efficace souvent signalée16,36,37,38 et 1,5 mA la plus élevée intensité signalée39. La gerbille mongole est un modèle de rongeur moins fréquemment choisi pour la recherche de conditionnement de peur ; cependant, les gerbilles mongoles ont été utilisées avec succès pour modéliser les rythmes circadiens chez les mammifères40. En conséquence, le protocole actuel pourrait être mis en œuvre pour étudier les relations potentielles entre les rythmes circadiens et la mémoire émotionnelle, tous deux pertinents dans des pathologies telles que la dépression, l’anxiété ou l’altération de l’humeur41,42. Dans le cas des gerbilles, une plage efficace d’intensité de choc pour ce protocole et analogue de conditionnement aversif est comprise entre 1,0 et 4,0 mA43,44,45,46. Enfin, il est important de noter que les seuils de mouvement et de durée doivent être ajustés en fonction des espèces choisies47. Ces seuils sont les limites établies sur le logiciel de suivi des mouvements, au-dessus duquel le comportement animal est enregistré comme mouvement et en dessous duquel le logiciel enregistre le gel. Dans les études de conditionnement aversive avec des souris et des gerbilles, les seuils de mouvement et de durée efficaces signalés ont été de 25 et 30 fps (c.-à-d. minimum 1 s immobilité), respectivement30,35.

Pour assurer un contrôle adéquat de la stimulation aversive (coups de pied), tous les secteurs du plancher de la grille doivent fournir la même intensité. Il est recommandé de calibrer l’intensité du choc dans trois secteurs du plancher du réseau pour vérifier qu’il est cohérent. Cela empêche les animaux d’apprendre à réduire l’exposition aux chocs en se déplaçant à un endroit dans la boîte qui émet une intensité inférieure. Si l’étalonnage montre que la grille métallique ne fournit pas la même intensité dans tous les secteurs, retirez la grille du sol, nettoyez les tiges et remplacez la grille dans la chambre. Le plancher du réseau doit être correctement inséré dans la chambre pour assurer la meilleure transmission électrique du dispositif de stimulation aversive au plancher du réseau.

La mise au point et l’ouverture de la caméra du système de détection de congélation est calibrée par le fabricant. Toutefois, si un étalonnage supplémentaire est nécessaire, desserrer le setcrew sur l’anneau de mise au point, ajuster jusqu’à ce qu’une image claire est atteint, puis serrer le setcrew sur l’anneau de mise au point. Le fabricant recommande de verrouiller l’ouverture de la lentille dans la position ouverte maximale. Pour atteindre ce paramètre, assurez-vous que le point blanc de l’anneau d’ouverture est aligné avec le numéro 1.4 sur le canon de lentille. Il est recommandé de consulter le manuel du fabricant. Notez que si le focus de la caméra a été ajusté, l’étalonnage de la caméra à l’aide du logiciel correspondant doit également se produire. L’étalonnage de la caméra nécessite un ajustement de la luminosité, du gain et de l’obturateur. Il est recommandé de consulter le manuel du fabricant pour obtenir des instructions précises sur le processus d’étalonnage de la caméra.

En conclusion, le protocole permet de tester la mémoire émotionnelle à travers des périodes courtes et à long terme et produit l’incubation à long terme de la peur. Cet effet d’incubation de la peur est généré par un surentraînement en une seule session, qui montre les effets 6 semaines plus tard dans le contexte et les tests de repère. Cela suggère une forte trace de mémoire émotionnelle. Le protocole actuel est une approche efficace et valide pour explorer les composantes de la mémoire émotionnelle chez les rats.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Le soutien financier à cette recherche a été fourni par fundación Universitaria Konrad Lorenz - numéro de subvention 9IN15151. Les auteurs tiennent à remercier le département des communications de l’Université Konrad Lorenz pour leur aide dans l’enregistrement et l’édition de la vidéo, en particulier Natalia Rivera et Andrés Serrano (Producteurs). Aussi, Nicole Pfaller-Sadovsky et Lucia Medina pour leurs commentaires sur le manuscrit, et Johanna Barrero, doyenne à Corporacion Universitaria Iberoamericana, pour la collaboration institutionnelle. Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (ethanoic acid) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid
Aversive Stimulation Current Package MED Associates Inc ENV-420 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Contextual test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Cue test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Curved Wall Insert MED Associates Inc VFC-008-CWI https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Data processing.zip http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
NIR/White Light Control Box MED Associates Inc NIR-100
Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse MED Associates Inc ENV-005FPU-M https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Small Tabletop Cabinet and Power Supply MED Associates Inc SG-6080D https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) MED Associates Inc ENV-414S https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standard Fear Conditioning Chamber MED Associates Inc VFC-008 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Training protocol VFC.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Video Fear Conditioning Package for Rat MED Associates Inc MED-VFC-SCT-R https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Comportement Numéro 162 mémoire émotionnelle conditionnement de la peur incubation de la peur surentraînement gel mémoire contextuelle mémoire de repère
Incubation de la peur à l’aide d’un protocole étendu de conditionnement de la peur pour les rats
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Acevedo-Triana, C., Rico, J. L.,… More

Acevedo-Triana, C., Rico, J. L., Ortega, L. A., Cardenas, M. A. N., Cardenas, F. P., Rojas, M. J., Forigua-Vargas, J. C., Cifuentes, J., Hurtado-Parrado, C. Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats. J. Vis. Exp. (162), e60537, doi:10.3791/60537 (2020).

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