Summary
Målet med detta protokoll är att detalj en ny metod för bedömning av segmental hjärt funktion i embryonala zebrafisk under både fysiologiska och patologiska förhållanden.
Abstract
Zebrafish används alltmer som en modell organism för kardiomyopatier och förnyelse. Nuvarande metoder som utvärderar hjärtfunktion misslyckas med att tillförlitligt upptäcka segmental mekanik och är inte lätt genomförbart i zebrafisk. Här presenterar vi en halvautomatiserad, öppen källkod metod för kvantitativ bedömning av fyrdimensionell (4D) segmentell hjärt funktion: förskjutning analys av hjärtinfarkt mekanisk deformation (DIAMOND). Transgena embryonala zebrafiskar avbildades in vivo med hjälp av ett fluorescensmikroskopi med 4D-hjärtrörelsesynkronisering. Förvärvade 3D digitala hjärtan rekonstruerades vid end-systole och end-diastole, och ventrikeln var manuellt segmenterad i binära dataset. Sedan var hjärtat omorienteras och isotropically omsamplas längs den sanna korta axeln, och ventrikeln var jämnt uppdelad i åtta delar (I-VIII) längs den korta axeln. På grund av de olika omsamplingsplan och matriser i slutet-systole och end-diastole, en omvandling matris tillämpades för bildregistrering för att återställa den ursprungliga rumsliga förhållandet mellan de omsamplade systoli skaoch diastolic bild matriser. Efter bildregistrering beräknades förskjutningsvektorn för varje segment från ändstolstal till änddiastole baserat på förskjutningen av masscentrooider i tre dimensioner (3D). DIAMOND visar att basala hjärtinfarkt segment intill atrioventricular kanalen genomgår den högsta mekaniska deformation och är de mest mottagliga för doxorubicin-inducerad hjärtskada. Totalt ger DIAMOND nya insikter i segmental hjärtmekanik i zebrafisk embryon utöver traditionella utmatning fraktion (EF) under både fysiologiska och patologiska förhållanden.
Introduction
Kemoterapi-inducerad hjärt toxicitet och efterföljande hjärtsvikt är en av de främsta orsakerna till kemoterapi utsättande1. Därför spelar hjärtfunktionell bedömning en avgörande roll i identifieringen av hjärttoxicitet och, ännu viktigare, i förutsägelsen av tidig hjärtskada efter kemoterapi2. Nuvarande metoder för hjärtfunktionell bedömning stöter dock på begränsningar. Metoder såsom vänster ventrikulärt utkast fraktion (LVEF) ger endast globala och ofta fördröjd hjärtmekanik efter skada3,4. Vävnad Doppler imaging ger segmentell hjärtinfarkt deformation information men lider av betydande intraobserver och interobserver variabilitet, delvis på grund av ultraljud strålvinkel beroende5. Tvådimensionell (2D) speckle spårning använder B-läge ekokardiografi, som teoretiskt eliminerar vinkelberoendet, men dess noggrannhet begränsas av out-of-plane rörelse6. Därför saknas en rigorös metod för kvantifiering av segmental cardiac-funktion i både forskning och kliniska inställningar.
I detta sammanhang utvecklade vi en 4D kvantifieringsmetod för analys av segmentell hjärtfunktion som vi namngav förskjutningsanalys av hjärtinfarkt mekanisk deformation (DIAMOND), för att bestämma förskjutningsvektorerna för hjärtinfarkt masscentrooider i 3D-utrymme. Vi applicerade DIAMOND för in vivo bedömning av hjärtfunktion och doxorubicin-inducerad hjärt toxicitet med zebrafisk(Danio rerio)som djurmodell, väljs på grund av deras regenererande hjärtmuskeln och mycket bevarade utvecklingsgener7. Vi jämförde vidare segmental DIAMOND förskjutning med global utkast fraktion (EF) beslutsamhet och 2D stam efter doxorubicin behandling. Genom att integrera DIAMOND förskjutning med 4D ljusplåt fluorescerande mikroskopi (LSFM) förvärvat rendering av embryonala zebrafisk hjärtan, DIAMOND visar att de basala hjärtinfarkt segment intill atrioventricular kanalen genomgår den högsta mekaniska deformation och är de mest mottagliga för akut doxorubicin hjärtskada8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av UCLA Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), och experiment utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av UCLA Office of Animal Research.
1. Avel Tg(cmlc2:mCherry) zebrafisk och insamling av embryon
- Följ de intags-, avels- och embryoinsamlingsförfaranden som beskrivs i tidigare etablerade djurhållnings- och häckningsmetoder. För mer information, se Messerschmidt et al.9.
- Behandla de insamlade embryona med 0,003% 1-fenyx-2-tia (PTU) i E3 medium 18 h postfertilization för att upprätthålla transparensen hos embryona för LSFM-avbildning.
2. Doxorubicin behandling för att inducera hjärtskada
- Vid 3 dagar efterbefruktning (dpf), behandla embryona med doxorubicin vid en koncentration av 10 μM i E3 fiskvattenmedium. Efter en 24 h behandling till 4 dpf, ersätta doxorubicin medium med färska E3 medium.
VARNING: Doxorubicin är en kemoterapi medicin. Lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) krävs och avfallet bör bortskaffas i behållare för avfall som orsakas av biologiskt risk.
3. Notch vägmodulering
- Behandla zebrafiskembryon med notch-spridningsvägarna (2S)-N-[(3,5-difluorifenyl)acetyl]-L-alanyl-2-fenyl]glycin 1,1-dimetyltylester (DAPT) vid en koncentration av 10 μM i E3 fiskvattenmedium från 3–6 dpf.
- Microinject the Notch nedströms effektorer Notch intracellulära domän (NICD) och Neuregulin-1 (Nrg-1) mRNA vid koncentrationer av 10 pg/nL respektive 5 pg/nL i de 1-cellsstadiet zebrafiskembryon8,10.
Mikroinjektionen utförs under ett mikroskop med stöd av en luftpump för att exakt kontrollera den volym som injiceras. MRNA-mikroinjektionen i cellen görs när det befruktade ägget är i det första cellsteget. För detaljer om beredningoch sekvens av mRNAs, se Chen et al.8. För detaljer om mikroinjektion och beredning av injektionsnålar, se Rosen et al.10.
4. LSFM-avbildning och synkronisering efter bildframställning
- För LSFM-avbildningstekniker och synkroniseringsalgoritm efter bildbehandling finns i information i tidigare publikationer9,11.
OBS: Kort, vårt system använder en kontinuerlig våg laser som belysning källa för att avbilda alla transgena zebrafisk linjer. Detektionsmodulen består av två vetenskapliga kompletterande metalloxidhalvledare (sCMOS) kameror och två uppsättningar filter för tvåkanalig bildbehandling. Detektionsmodulen installeras vinkelrätt på belysningsplanet. Varje LSFM-ram förvärvas inom en exponeringstid på 20 sekunder, medan upplösningskraften i tvärsnittet är ~0,65 μm och stegstorleken mellan på varandra följande ramar är ~2 μm. En 589 nm laser användes för att excitera mCherry lysrör.
5. Rekonstruktion av 3D-systoliskt och diastoliskt hjärta
- Öppna mappen som skapats av postsynkroniseringsalgoritmen och öppna sedan mappen "Utdata". Välj mittenplanet i hjärtat och ladda hela mappen i ImageJ. Hitta den första diastoliska och systoliska fasen och registrera ramnumret.
- Öppna mappen "Utdata/efter tillstånd" och hitta mapparna som har samma nummer som bildrutenumren som just spelat in. Konvertera bilderna i mappen till 3D TIFF (taggade bildfilformat) filer och namnge dem "diastole.tif" och "systole.tif".
6. Segmentering av ventrikeln
- Öppna programvaran för bildanalys (se Materialförteckning). Klicka på Arkiv | Öppna data, och ladda "diastole.tif" och "systole.tif". Ange voxel-storleken enligt bildåtergivningsinställningarna.
OBS: För det LSFM-system som används är den typiska voxelstorleken 0,65 μm x 0,65 μm x 2 μm. - Klicka på panelenSEGMENTATIONoch segmentera manuellt den ventrikeldelen av hjärtat. Det inbyggda "tröskelvärdet" som kan välja alla regioner över en viss intensitet kan underlätta den här processen. Ventrikeln är den tjockare kammaren med en starkare fluorescens.
OBS: Se till att ta bort atrioventricular kanalen och utflödet tarmkanalen i segmenterade ventrikeln, eftersom detta påverkar förskjutninganalys. - När segmenteringen är klar klickar du på panelen"Projekt". Högerklicka på "diastole. Labels.tif" och "systole. Labels.tif" flikar i konsolen och klicka på "Exportera data som" för att spara data som 3D TIFF-filer.
7. Skapande av rektangulära parallellepipeder för bildregistrering
- Kör "prepImage_1.m" i programmeringsmiljön (se Materialtabell). Öppna "prepImage_1.m", "ImPath" i rad 5 så att mappen innehåller de ursprungliga och segmenterade TIFF-filerna och ändra "segment" i linje 4 till antalet segment av 3D-tif-filerna.
- När koden har körts genererar den fem nya 3D TIFF-filer ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" och "sysLabel200.tif") samt två nya mappar ("resample_dia" och "resample_sys").
8. Sampla om systoliskt och diastoliskt 3D-hjärtan längs det korta axelplanet
- Importera alla fem 3D TIFF-filer till bilden analysera programvara (se Table of Materials).
Voxel-storleken är oförändrad. - Gå till MULTIPLANAR-panelen. Välj "diastole_200.tif" som primärdata. Rikta in X-axeln (den gröna linjen i XY-planet) med ventrikelns vertikala långa axel och justera Z-axeln (den röda linjen i YZ-planet) med ventristens horisontella långa axel.
DEN vertikala långa axeln bestäms genom att hitta den längsta axeln som förbinder spetsen och utflödeskanalen i XY-planet, och den horisontella långa axeln bestäms genom att hitta den längsta axeln som förbinder toppen och utflödeskanalen i YZ-planet. Rotera axeln genom att placera markören i slutet av axeln. - Välj tre slumpmässiga punkter från det sneda YZ-planet (det korta axelplanet) på ett moturs sätt och registrera sina 3D-positionskoordinater.
OBS: Se till att punkterna väljs på ett motsols sätt. - Upprepa steg 8.2 och 8.3 för "systole_200.tif".
- Klicka på"PROJECT"panelen. Skapa ett "Segment" objekt för "diastole_200.tif" genom att högerklicka på "diastole_200.tif" och söka efter "Slice" objekt. Vänster klicka på segmentobjektet som just skapats och på egenskapspanelen | Alternativ, kontrollera "Set Plane" och välj tre punkter i "Plane Definition". Ange koordinaterna för de tre punkterna från steg 7.3.
- Upprepa steg 8.5 för "systole_200.tif".
Det segmentobjekt som skapas ska ha namnet "Segment 2". - Högerklicka på "diastole_200.tif" och sök efter "Sampla om transformerad bild" och skapa objektet. Välj "Segment" som "Referens" på panelen Egenskaper och klicka på Använd. Detta bör generera ett objekt som heter "diastole_200.transformed".
- Högerklicka på "diastole_200.transformed" och sök efter "Samplas om" och skapa objektet. Välj "Voxel Size" som "Mode" och ändra "Voxel Size" för att vara x = 1, y = 1 och z = 1 i egenskapspanelen.
- Klicka på "Ansök". Detta bör generera ett objekt med namnet" diastole_200.resampled". Högerklicka på "diastole_200.resampled" och spara den som en 3D TIFF-fil.
- Upprepa samma steg för "diaLabel.tif" och "test.tif". Spara "diaLabel.resampled" och "test.resampled" som 3D TIFF-filer. Upprepa samma steg för "systole_200.tif", "sysLabel.tif" och "test.tif" med"Slice 2"som referens och spara "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" och "test2.resampled" som 3D TIFF-filer.
Se till att det finns totalt sex TIFF-filer som sparats i det här steget.
9. Uppdelning av det omsamplade hjärtat
- Importera alla sex omsamplade filer från steg 8 till ImageJ. Välj en skiva "systole_200.resampled" där atrioventricular kanalen är tydligt visualiserad. Registrera numret på segmentet.
- Använd "Image | Transformera | Rotera" imageJ:s funktion så att den atrioventricular kanalen är vertikal. Använd samma rotation på alla filer. Stäng alla fönster och spara alla ändringar.
- Flytta "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled" och "test.resampled" till "resample_dia" mappen och flytta "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" och "test2.resampled" till "resample_sys" mappen.
- Öppna "divider_2_8_pieces.m". Ändra "ImPath" i linje 5 och "ImPath" i linje 395 till bildkatalogen. Ändra variabeln"Middle"i linje 22 och linje 411 till segmentnumren där atrioventricular kanalen är tydligt visualiserad i "systole_200.resampled" och "diastole_200.resampled".
- Kör koden och klicka en gång i mitten av ventrikeln och klicka en gång i mitten av atrioventricular kanalen. Detta måste göras två gånger för både systole och diastole bilder.
10. Registrering av systoliska och diastoliska bildmatriser
- Öppna "register_3.m" och ändra "ImPath" i rad 4 till bildmappssökvägen. Det kan ta 5–20 min att köra den här koden beroende på systemets beräkningskraft.
OBS: De artificiellt skapade rektangulära parallellepipederna i steg 7 används för 3D-styv registrering som bevarar avståndet mellan två punkter och vinklar som prenumererar på tre punkter. När änddiastole rektangulär parallelepiped (röd) är registrerad på änd-systole rektangulär parallelepiped (grön), tillåter den efterföljande dämpning 3D-platsen härledning av en unik matris av styv omvandling bestående av rotation och översättning från end-diastole matris till änd-systole matris(figur 1H). Vi utför registreringen och regelbunden energi minimering för att denoise matrisen efter omvandlingen med hjälp av en bildbehandling verktygslåda (se Table of Materials). För en detaljerad matematisk beskrivning, se Chen et al.8.
11. Utflöde av förskjutningsvektorerna
- Öppna "displacement_4.m" och ändra "ImPath" i rad 4 till bildmappssökvägen.
- Kör"displacement_4.m", som genererar en "vector8.txt"-fil i mappen "vektorer". När filen "vector8.txt" är öppen kommer det att finnas en 8 x 4 matris. Varje rad i matrisen har fyra tal, som är storleken på X-komponenten, Y-komponenten, Z-komponenten och SUM-storleken på förskjutningsvektorn för ett visst segment av ventrikeln.
OBS: Förskjutningsvektorn erhålls genom beräkning av förskjutningen av masscentroiden för varje segment i 3D-rymden. Vi
beräknar koordinaterna 3D masscentroid (PS och PD)(där k anger X-, Y- eller Z-koordinaten) respektive) i varje segmenteringsdatauppsättning från systole till diastole(figur 1J). Vi definierar masscentroid i 3D-utrymme enligt följande:
där Cx = X, Cy = Y och Cz = Z, Mi = massan för varje segment (I ≤ i ≤ VI), m = antalet voxels för varje segment, och ρ = densitetsfunktionen som segmenterad region är 1 medan resten är 0. L2-normen för sub-förskjutning vektorer längs X-, Y-, och Z-axlar och summan förskjutning vektor beräknas under hjärtcykeln. Det finns totalt åtta rader i matrisen. Den första raden och den åttonde raden innehåller atrioventricular kanalen och ignoreras därmed i vår analys. Segment I till VI representeras av den andra raden till den sjunde raden.
beräknar koordinaterna 3D masscentroid (PS och PD)(där k anger X-, Y- eller Z-koordinaten) respektive) i varje segmenteringsdatauppsättning från systole till diastole(figur 1J). Vi definierar masscentroid 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den process genom vilken DIAMOND utvecklades för att bedöma 3D segmental hjärt funktion presenteras i figur 1. Efter LSFM bildförvärv och återuppbyggnad i 3D av embryonala zebrafisk hjärta(figur 1A),den verkliga kort axel plan fastställdes som planet vinkelrätt mot vertikala och horisontella långa axlar, som båda bestäms i en multiplane viewer(Figur 1B). Hjärtat var sedan resampled längs den korta axeln planet(Figur 1C), och delas in i åtta lika segment som utgörs av jämna vinklar enligt en virtuell division linje (röd prickade linje) som förbinder mitten av den endocardialventrikulärt hålighet till mitten av atrioventricular kanalen(Figur 1E). 3D-skildringarna av de identifierade segmenten illustreras i ett tvärsnittsläge(figur 1F)och i jämförelse med rådata(figur 2). Segment VII och VIII togs bort från analysen eftersom de omfattar atrioventricular kanalen och därmed innehåller mindre hjärtmuskeln jämfört med andra segment. De olika omsamplingsplanen för end-systole (HS)och end-diastole (HD)leder till distinkta koordinatsystem för end-systolic och end-diastolic matriser, som måste registreras för att återställa sin ursprungliga rumsliga relation(figur 1G). Koordinatsystemet för slutsystolisk matris valdes som referens för konsekvens. För att bestämma omformningsmatrisen (Tm)från end-diastolic-matrisen till end-systoliska matrisen skapades en matris med tre parallellepipeder, som är asymmetrisk i 3D och har samma dimension som den ursprungliga bildmatrisen, praktiskt taget. Parallellepipederna omsågs två gånger, först i den korta axeln plan av slutet-systole matris, och sedan i den korta axeln planet i änddiastole matris, vilket leder till olika omvandlas parallelepipeds för end-systole (grön) och end-diastole (röd)(figur 1H).
De gröna och röda parallellepipederna registrerades sedan tillsammans av en styv kroppsregistreringsalgoritm och Tm beräknades och applicerades på end-diastole-matrisen för att återställa koordinaterna(figur 1I). Denna process tillåter efterföljande spårning i 3D-rymden av förskjutningvektorer av massa centroider från alla segment av ventrikeln under hjärtcykeln(figur 1J). DIAMOND förskjutning av Ventrikulärt segment I-VI kan spåras under flera tidpunkter i hjärtcykeln(figur 1K), som kan förenklas för kvantitativ analys till två tidpunkter från end-systole till slut-diastole(figur 1L). Segmenten som genereras av DIAMOND kan visualiseras i figur 2, där varje färg representerar ett hjärtsegment.
Med DIAMOND upptäckte vi segmentell heterogenitet av hjärtfunktion och mottaglighet för doxorubicin-inducerad hjärtskada i zebrafisk. Efter en 24 h behandling med 10 μM doxorubicin från 3–4 dpf(figur 3A),jämförde vi DIAMOND förskjutning av ventrikulärt segment mellan kontroll och kemoterapi-behandlade grupper(figur 3B)och 48 h efter behandling(figur 3C). Alla DIAMOND-figurer följer samma grafiska mönster som de omsamplade ventriklarna längs den korta axeln(figur 1E). Uppgifterna presenteras som procentsatser genom att normalisera L2-normen för förskjutningvektorn till hjärtats inre omkrets, med X (gröna), Y (blå) och Z-komponenter (orange) illustrerade som deras vägda bidrag. Vid 4 dpf varierade den genomsnittliga L2-normen för segmentalförskjutningsvektorerna i kontrollfisk en 6,6–11,3 μm, eller 3,8–6,6 % efter normalisering. Våra resultat visar att under kontrollförhållanden, de basala segmenten I och VI genomgår de största förskjutningarna och är de som är mest mottagliga för doxorubicin inducerad hjärtskada(figur 3B,29% minskning från 6,6–4,7%, n = 10 kontroll och n = 8 doxorubicin, p < 0,01). Vid 6 dpf varierade den genomsnittliga L2-normen för segmentalförskjutningsvektorerna i kontrollfisken från 6,8–14 μm, eller 3,9–8 % efter normalisering. Vid 6 dpf, de basala segmenten I och VI återhämtade DIAMOND förskjutning till kontrollnivåer, vilket tyder segmental regenerering(Figur 3C, n = 10 kontroll och n = 8 doxorubicin). Samtidigt observerades en försämring av 2D basal stam från -53 till -38% vid 4 dpf efter doxorubicin behandling, följt av en återgång till kontrollnivåer vid 6 dpf, bekräftar DIAMOND förskjutning resultat(figur 3D, 3E). En parallell minskning av den globala utskjutningsfraktionen som svar på doxorubicin vid 4 dpf med återhämtning vid 6 dpf observerades också (figur 3F, 3G).
Vi applicerade sedan DIAMOND under doxorubicin behandling och Notch väg modulering med Hackhämmare DAPT och räddning med Notch nedströms effektorer NICD och NRG1 mRNA(Figur 4A). NICD och NRG1 mRNA mikroinjektion räddade minskningen av DIAMOND förskjutning och EF efter akut kemoterapi-inducerad skada vid 4 dpf(Figur 4B, 4D). Exponering för Notch-hämmaren DAPT tillsammans med doxorubicin ledde till en mer diffus minskning av DIAMOND-förskjutningen, utöver de basala segmenten I och VI (figur 4B). Dessutom hindrade hämning av notch-banan efter kemo-inducerad skada ytterligare återvinning en DIAMANTförskjutning av basalsegmenten och EF vid 6 dpf. Hämningen räddades av notch nedströms effektorer NICD och NRG1 (Figur 4C, 4E).
Figur 1: 4D DIAMOND förskjutning utveckling. (A)Råa bilder fångades av ljusarkslysrör. (B och C)Rekonstruerat 3D-hjärta har samplas om längs den verkliga korta planvyn. (D)Schematisk illustration av embryonala zebrafiskhjärta. (E och F) 2D- och 3D-illustrationer av ventrikelns delning i åtta segment utom segmenten VII och VIII. (G)De olika koordinatsystemen för end-systole och end-diastole efter omsampling. (H)En grupp rektangulära parallellepipeder skapades för generering av en omvandlingsmatris (Tm). (I)Registrerade end-systoliska och end-diastolic koordinatsystem genom att tillämpa Tm. (J)Förskjutningvektor för segmentemasscentroid från end-systole till end-diastole. (K)DIAMOND förskjutning av ventrikulärt segment I-VI spåras under flera tidpunkter i hjärtcykeln. (L)DIAMOND förskjutning av ventrikulärt segment I–VI från end-systole till end-diastole. Denna siffra från Chen et al.8 återges med tillstånd från American Society for Clinical Investigation (ASCI). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: DIAMOND segmentering av embryonala zebrafiskhjärta jämfört med rådata i 3D. Det embryonala zebrafiskhjärtat delades in i sex segment (volymer) som avbildas här i olika färger för beräkning av DIAMOND-förskjutningar (vänster). Förskjutningsvektorn för varje segment som beräknas av DIAMOND representerar dess segmentalcardiacfunktion. Atriumet och utflödet togs bort under segmentering. Skala bar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: DIAMOND unravels segmental heterogenitet i hjärtfunktion och mottaglighet för kemoterapi-inducerad skada. (A)Experimentellt schema för doxorubicin behandling. (B och C)Segmental jämförelse av DIAMOND förskjutning vektorer normaliseras till den inre hjärtinfarkt spån mellan kontroll och doxorubicin-behandlade grupper vid 4 och 6 dpf (t tester, **p < 0,01, n = 8-10 per grupp). (D och E)Bedömning av stam i ventrikulärt basen som visar ett liknande skade- och regenereringsmönster som DIAMOND-fördrivningsvektorerna (*p < 0,05, n = 6–8 per grupp). (F och G) Minskning av utmatningsfraktionsom svar på doxorubicin vid 4 dpf med återhämtning vid 6 dpf, efter ett mönster som liknar segmental DIAMOND-förskjutningar på den globala ventrikulärt nivån (t-tester, **p < 0,01, felstänger SEM, n = 6–10 per grupp). Denna siffra från Chen et al.8 återges med tillstånd från ASCI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: DIAMOND mekanik för bedömning av Notch-medierad hjärtinfarkt återhämtning efter doxorubicin-inducerad skada. (A)Experimentellt schema. (B och C) NICD och NRG1 Notch nedströms effektorer räddade minskningen av DIAMOND förskjutning i segment I och VI på 4 dpf. Vid 6 dpf, hämning av Notch signalering av DAPT nedsatt återställande av segmental hjärt funktion (ANOVA, **p < 0,01 Dox vs kontroll; †p < 0,05, ††p < 0.01, Dox + DAPT vs. kontroll, n = 6–10 per grupp). (D och E)Ejektionsfraktion bekräftar DIAMANTmekanik på global nivå (ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01, felstänger SEM, n = 5–11 per grupp). Denna siffra från Chen et al.8 återges med tillstånd från ASCI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En rigorös strategi för kvantifiering av segmental hjärtinfarkt funktion är avgörande för att bedöma hjärtmekanik utöver traditionella EF, känd för att vara en okänslig och fördröjd indikator på hjärtinfarktskada 1,4,12. Därför har det funnits ett växande intresse för markörer för tidiga hjärtinfarktförändringar, och en växande mängd litteratur stöder hjärtinfarkt deformation parametrar som en tidig indikator på prognos Ventrikulärt dysfunktion4,13. Echocardiographic mätning av vänster Ventrikulärt (LV) stam ger en etablerad metod för hjärtinfarkt deformation mätning13. Vävnad Doppler-baserade stamavbildning lider dock av ett antal brister på grund av vinkelberoende och intraobserver och interobserver variabilitet14. Speckle spårning ekokardiografi (STE) kan lösa vinkeloberoende 2D och 3D vävnad deformation, men noggrannheten i 2D speckle spårning påverkas av genom-plan rörelse6, medan 3D speckle spårning kräver överlägsen rumslig upplösning för att lösa positiva ultraljud störningsmönster (fläckar) i 3D och hög tidsmässig upplösning för att spåra fläckar mellan ramar15. I det nuvarande protokollet beskriver vi DIAMOND förskjutning som en ny hjärtinfarkt deformation parameter för in vivo kvantifiering av 4D segmental hjärt funktion i zebrafisk. Jämfört med EF och 2D-stam som referensstandarder ger DIAMOND ytterligare segmentell deformationsinformation utan att påverkas av rörelse genom plan. Genom att integrera DIAMOND med 4D LSFM kan vår teknik bedöma förskjutningsvektorn för ett hjärtsegment 20–30 μm i bredd, vilket för närvarande är omöjligt för även det mest avancerade 3D STE-systemet, som har millimeterintervallsupplösning16.
För att applicera DIAMOND är det viktigt att ha en omfattande förståelse för den embryonala zebrafiskhjärtats anatomiska struktur. Under bildsegmentering är det viktigt att atrioventricular kanalen och utflödeskanalen identifieras korrekt och segmenteras ut från resten av hjärtmuskeln när användaren utför steg 6 i protokollet. Dessutom måste ventristens horisontella och vertikala långa axlar bestämmas noggrant för att härleda det verkliga kortaxelplanet för bildomsampling i steg 8.
Den viktigaste hastighetsbegränsande faktorn för att tillämpa DIAMOND är den manuella segmenteringen av ventrikeln, som blir tidskrävande när flera faser under hjärtcykeln kan behöva utvärderas. Med främjandet av maskininlärning och neurala nätverk, en automatiserad hjärt segmentering metod17,18,19,20 kan integreras med DIAMOND för att ge övervakning av segmental hjärt funktion under hela hjärtcykeln. Ytterligare tillämpningar av DIAMOND omfattar också integration med ekokardiografi, mikro-CT eller mikro-MRI, lämplig i större djurmodeller för multiskalsbedömning av hjärtskada och regenerering21. Men metoden kommer först att kräva anpassning till förekomsten av hjärtinfarkt fibrer som leder till mer komplexa hjärtdeformation inklusive vridning hos däggdjur22,23.
Sammantaget ger DIAMOND en ny metod för att utvärdera segmentell hjärtfunktion i embryonala zebrafiskar under både fysiologiska och patologiska tillstånd och kan användas som en plattform för hög genomströmning in vivo screening av vägar i samband med kemoterapi-inducerad hjärt toxicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har förklarat att det inte finns någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Det nuvarande arbetet finansierades av American Heart Association bidrag 16SDG30910007 och 18CDA34110338, och av National Institutes of Health bidrag HL083015, HL111437, HL118650 och HL129727.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira6 | FEI | Image analyzing software | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Programming environment | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MathWorks | Image processing toolbox |
References
- Ewer, M. S., Ewer, S. M.
- Thavendiranathan, P., Wintersperger Bernd, J., Scott, F. D., Thomas D, M. H. Cardiac MRI in the Assessment of Cardiac Injury and Toxicity From Cancer Chemotherapy. Circulation: Cardiovascular Imaging. 6 (6), 1080-1091 (2013).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Thavendiranathan, P., et al. Use of Myocardial Strain Imaging by Echocardiography for the Early Detection of Cardiotoxicity in Patients During and After Cancer Chemotherapy. A Systematic Review. 63 (25), Part A 2751-2768 (2014).
- Collier, P., Phelan, D., Klein, A. A Test in Context: Myocardial Strain Measured by Speckle-Tracking Echocardiography. Journal of the American College of Cardiology. 69 (8), 1043-1056 (2017).
- Hanekom, L., Cho, G. Y., Leano, R., Jeffriess, L., Marwick, T. H. Comparison of two-dimensional speckle and tissue Doppler strain measurement during dobutamine stress echocardiography: an angiographic correlation. European Heart Journal. 28 (14), 1765-1772 (2007).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Chen, J., et al. Displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND) reveals segmental susceptibility to doxorubicin-induced injury and regeneration. JCI Insight. 4 (8), e125362 (2019).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Journal of Visualized Experiments. (138), e57763 (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Lenneman, C. G., Sawyer, D. B. Cardio-Oncology: An Update on Cardiotoxicity of Cancer-Related Treatment. Circulation Research. 118 (6), 1008-1020 (2016).
- Geyer, H., et al. Assessment of Myocardial Mechanics Using Speckle Tracking Echocardiography: Fundamentals and Clinical Applications. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (4), 351-369 (2010).
- Castro, P. L., Greenberg, N. L., Drinko, J., Garcia, M. J., Thomas, J. D. Potential pitfalls of strain rate imaging: angle dependency. Biomedical Sciences Instrumentation. 36, 197-202 (2000).
- Seo, Y., Ishizu, T., Aonuma, K. Current Status of 3Dimensional Speckle Tracking Echocardiography: A Review from Our Experiences. Journal of Cardiovascular Ultrasound. 22 (2), 49-57 (2014).
- Amzulescu, M. S., et al. Improvements of Myocardial Deformation Assessment by Three-Dimensional Speckle-Tracking versus Two-Dimensional Speckle-Tracking Revealed by Cardiac Magnetic Resonance Tagging. Journal of the American Society of Echocardiography. 31 (9), 1021-1033 (2018).
- Wolterink, J. M., Leiner, T., Viergever, M. A., Išgum, I. Reconstruction, Segmentation, and Analysis of Medical Images. Zuluaga, M. A., et al. , Springer International Publishing. 95-102 (2016).
- Avendi, M. R., Kheradvar, A., Jafarkhani, H. A combined deep-learning and deformable-model approach to fully automatic segmentation of the left ventricle in cardiac MRI. Medical Image Analysis. 30, 108-119 (2016).
- Packard, R. R. S., et al. Automated Segmentation of Light-Sheet Fluorescent Imaging to Characterize Experimental Doxorubicin-Induced Cardiac Injury and Repair. Scientific Reports. 7 (1), 8603 (2017).
- Jay Kuo, C. C., Chen, Y.
- Natarajan, N., et al. Complement Receptor C5aR1 Plays an Evolutionarily Conserved Role in Successful Cardiac Regeneration. Circulation. 137 (20), 2152-2165 (2018).
- Zhukov, L., Barr, A. H. IEEE Visualization VIS 2003. , 597-602 (2003).
- Nielles-Vallespin, S., et al. In vivo diffusion tensor MRI of the human heart: Reproducibility of breath-hold and navigator-based approaches. Magnetic Resonance in Medicine. 70 (2), 454-465 (2013).
