Summary
Nedsatt mitokondriell transport och morfologi är involverade i olika neurodegenerativa sjukdomar. Det presenterade protokollet använder inducerad pluripotent stamcellshärledda förhjärnnervceller för att bedöma mitokondriell transport och morfologi i ärftliga spastic paraplegi. Detta protokoll möjliggör karakterisering av mitokondriell handel längs axoner och analys av deras morfologi, vilket kommer att underlätta studiet av neurodegenerativsjukdom.
Abstract
Nervceller har intensiva krav på hög energi för att stödja deras funktioner. Nedsatt mitokondriell transport längs axoner har observerats i mänskliga nervceller, vilket kan bidra till neurodegeneration i olika sjukdomstillstånd. Även om det är utmanande att undersöka mitokondriell dynamik i levande mänskliga nerver, sådana paradigm är avgörande för att studera den roll som mitokondrierna i neurodegeneration. Beskrivs här är ett protokoll för att analysera mitokondriell transport och mitokondriell morfologi i framhjärnan neuron axons härrör från mänskliga inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs). IPSCs är differentierade till telencephalic glutamatergic nervceller med hjälp av väletablerade metoder. Mitokondrierna av nervcellerna är färgade med MitoTracker CMXRos, och mitokondriell rörelse inom axonerna fångas med hjälp av en levande cell imaging mikroskop utrustad med en inkubator för cellkultur. Time-lapse bilder analyseras med hjälp av programvara med "MultiKymograph", "Bioformat importör" och "Makron" plugins. Kymografier av mitokondriell transport genereras, och genomsnittlig mitokondriell hastighet i anterograde och bakåtsträvande riktningar läses från kymgrafen. När det gäller mitokondriell morfologi analys, mitokondriell längd, område och bildförhållande erhålls med hjälp av ImageJ. Sammanfattningsvis tillåter detta protokoll karakterisering av mitokondriell handel längs axoner och analys av deras morfologi för att underlätta studier av neurodegenerativa sjukdomar.
Introduction
Mitokondriellt motilitet och distribution spelar en viktig roll för att uppfylla varierande och specialiserade energiska krav i polariserade nervceller. Nervceller kan förlänga extremt långa axoner för att ansluta med mål genom bildandet av synapser, som kräver höga nivåer av energi för Ca2 + buffring och jonströmmar. Transport av mitokondrierna från soma till axon är avgörande för att stödja axonal och synaptisk funktion av nervceller. Rumsligt och tidsmässigt dynamisk mitokondriell rörelse utförs av snabb axonal transport till priser på flera mikrometer per sekund1.
Specifikt, motor eller adapter proteiner, såsom kinesin och dynein, delta i snabb organell transport längs mikrotubuli för att kontrollera förflyttning av mitokondrierna2,3. Normal neuronal aktivitet kräver korrekt transport av nymonterade mitokondrierna från neuronal soma till distala axon (anterograde axonal transport) och omvänd transport av mitokondrierna från distala axon tillbaka till cellkroppen (bakåtsträvande transport). Nyligen genomförda studier har visat att felaktig mitokondriell tilldelning är starkt förknippad med neuronala defekter och motor neuron degenerativa sjukdomar4,5. Därför, att dissekera rollen som mitokondrierna i neurodegeneration, är det viktigt att fastställa metoder för att undersöka mitokondriell rörelse längs axoner i levande kulturer.
Det finns två huvudsakliga utmaningar i att undersöka och analysera spårning av mitokondrierna: (1) identifiera mitokondrierna från bakgrunden i varje ram, och (2) analysera och generera anslutningar mellan varje ram. För att lösa den första utmaningen används en fluorescensmärkning sett till att skilja mitokondrierna från bakgrunden, såsom MitoTracker färgämne eller transfection av fluorescens-smält mitokondriellt inriktning protein (t.ex. mito-GFP)6,7,8. För att analysera sambandet mellan ramar har flera algoritmer och programvaruverktyg beskrivits i tidigare studier9. I en nyligen publicerad uppsats jämförde forskarna fyra olika automatiserade verktyg (t.ex. Volocity, Imaris, wrMTrck och Difference Tracker) med att kvantifiera mitokondriell transport. Resultaten visade att trots avvikelser i spårlängd, mitokondriell förskjutning, rörelselängd och hastighet, dessa automatiserade verktyg är lämpliga för utvärdering av transportskillnad efter behandling10. Förutom dessa verktyg, en integrerad plugin "Macros" för ImageJ (skriven av Rietdorf och Seitz) har använts ofta för att analysera mitokondriell transport11. Denna metod genererar kymografier som kan användas för att analysera mitokondriell rörelse, inklusive hastighet i både anterograde och bakåtsträvande riktningar.
Mitokondrierna är mycket dynamiska organeller som ständigt förändras i antal och morfologi som svar på både fysiologiska och patologiska tillstånd. Mitokondriell fission och fusion reglerar noggrant mitokondriell morfologi och homeostas. Obalansen mellan mitokondriell fission och fusion kan framkalla extremt korta eller långa mitokondriella nätverk, vilket kan försämra mitokondriell funktion och resultera i onormala neuronala aktiviteter och neurodegeneration. Nedsatt mitokondriell transport och morfologi är involverade i olika neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom och ärftliga spastic paraplegi (HSP)12,13,14,15. HSP är en heterogen grupp av ärftliga neurologiska sjukdomar som kännetecknas av degeneration av kortikospinal tarmkanalen och efterföljande underlåtenhet att kontrollera nedre extremitetsmusklerna16,17. I denna studie används iPSC-härledda förhjärnnervceller för att bedöma mitokondriell transport och morfologi i HSP. Denna metod ger ett unikt paradigm för att undersöka mitokondriell dynamik neuronal axons i levande kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av telencephalic glutamaterga nervceller från iPSCs
OBS: Det detaljerade protokollet för underhåll av iPSCs och deras differentiering i telencephalic glutamatergic nervceller liknar dem som beskrivs tidigare18. Här introduceras och markeras den kritiska processen under differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller.
- Kultur-iPSCs på musembryonalfibroblast (MEF) matare i mänskliga embryonala stamceller (hESC) medium kompletteras med fibroblast tillväxtfaktor (bFGF, 4 ng/ml).
- Efter inkubation med dispase (1 mg/ml) i 3 min, separera iPSCs i små klumpar. Sedan kultur iPSC aggregat i suspension i hESC medium i 4 dagar. Se den här tidspunkten, när iPSCs börjar som suspensionskultur, som dag 1 (D1). Ändra mediet dagligen i 4 dagar.
- Vid D5, samla iPSC aggregat efter centrifugering på 200 x g för 2 min och kultur i neuralinduktionsmedia (NIM) i 3 dagar. Kultur cellen aggregat i suspension i 3 dagar genom att ändra hälften av media varannan dag. Tillsätt DMH-1 (2 μM) och SB431542 (2 μM) till NIM medium för att öka neural induktionseffektivitet.
- Vid D8, samla in iPSC aggregat efter centrifugering på 200 x g för 2 min och låt dem hålla sig till 6 brunnsplattor (ca 20-30 aggregat per brunn av plattan) genom att odla i NIM med 10% FBS (eller med laminin-belagda plattor) över natten. På följande dag, ta bort det gamla mediet och byt till NIM var 2 dagar fram till D17.
OBS: Genereringen av neuroepitelceller, som indikeras av bildandet av kolonnceller med rosettstrukturer, observeras under denna period. - Vid D17 isolerar mekaniskt neuroepitelcellerna i mitten av kolonier (lyfta av direkt genom att tillämpa ett litet tryck på mitten av kolonierna) eller enzymatiskt (behandlas med dispase). Överför de isolerade neuroepitelcellerna till icke-behandlad vävnadsodling T25-kolv som innehåller 8 ml NIM med tillsats av B27 (1x), cAMP (1 μM) och IGF (10 ng/mL).
OBS: Suspensionen kulturen tillåter celler att bilda neurosfärer som berikas med när projektion neurala förfäder. - Efter D35, platta neurosfärerna på poly-ornitin och LDEV-fri reducerad tillväxtfaktor källare membran matris(Table ofMaterials)-belagda 35 mm glas botten rätter för att generera telencefaliska glutamaterga nervceller (kortikal projektion nervceller). Innan plätering, separera neurosfärerna till små kluster genom att ruva med 1 mg/ml cell avlossningslösning i 2 min vid 37 °C.
- Ta bort cellavlossningslösningen genom centrifugering och återsuspend i 1 ml neural differentieringsmedium (NDM). Platta celler på glasbottenskålen (cirka fem kluster i 100 μL medium per maträtt) för att låta dem fästa. Lägg sedan till NDM (1 ml per maträtt) och odla cellerna i NDM som innehåller B27 (1x), cAMP (1 μM), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) och GDNF (10 ng/mL).
OBS: Små kluster är pläterade eftersom de överlever väl och ger upphov till långa projektion nervceller. Alternativt kan celler separeras och pläteras vid en densitet runt 20.000 celler per maträtt för bättre separation. - Karakterisera telencephalic glutamaterga nervceller genom immunfärgning Tbr1 och βIII-tubulin markörer.
2. Undersökning av mitokondriell transport längs axoner av telencephalic glutamatergic nervceller
- Värm upp NDM och slå på inkubatorn för fluorescensmikroskopet som är satt till 37 °C och 5 % CO2.
- För att visualisera mitokondrierna längs axonerna av forebrain nervceller, inkubera nervceller med 50 nM rött fluorescerande färgämne för att fläcka mitokondrierna i levande celler (t.ex. MitoTracker CMXRos) i NDM i 3 min vid 37 °C. Därefter tvätta celler 2x med uppvärmd NDM. Nervcellerna inkuberas i NDM.
- För att spela in mitokondriell transport längs axonerna, ta time-lapse bilder av mitokondriell rörelse med 40x mål med en fluorescens mikroskop.
OBS: För att stabilisera kulturen, utför levande cell avbildning när cellerna inkuberas i inkubatorn i 20 min efter mitokondriell färgning. - Under fasfält, identifiera axonerna baserade på morfologiska egenskaper (direkt fram från neuronal cell kropp, konstant tunna långa neurites utan förgrening). Mitokondrierna rör sig i anterograde (från cellkropp till distala axon) och bakåtsträvande riktningar (från axonal terminal till cellkropp). För att skilja riktningmitokondriell rörelse längs axoner, tydligt identifiera cellkroppar av nervceller. I det här steget fokuserar du axons under fasfält för att minska fotoblekning.
- Efter att ha särat ut cellkroppen och axonen justerar du exponeringstiden och fokus för mitokondrierna i axoner. Fånga sedan transporten av mitokondrierna inom axonerna var 5:s under en total period på 5 min, vilket ger 60 bildrutor. Slumpmässigt fånga minst fem platser för varje maträtt och upprepa 3x för varje grupp.
3. Dataanalys av mitokondriell transport och morfologi i när nervceller
OBS: Analysera insamlade data om mitokondriell transport med hjälp av en bildanalys programvara (t.ex. ImageJ eller MetaMorph19). Eftersom ImageJ är lätt tillgänglig, utföra analysen av mitokondriell transport och morfologi med ImageJ med MultiKymograph, Makron, och analysera partiklar plugins.
- Analysera mitokondriell transport med ImageJ
- Efter att ha fångat time-lapse bilder av mitokondriell tilitet, analysera hastigheten och rörelsen av mitokondrierna med hjälp av MultiKymograph plugin. Bilderna sparas som .tiff-format filer, som analyseras av Fiji programvara efter en tidigare rapporterad metod20.
- Ladda ner Fiji programvara. Ladda ner plugins som kommer att behövas för att analysera mitokondriell rörlig hastighet från kymografier. Ladda ner Bio-format Paket och Kymograph Plugin tillsammans med dessa fyra .class plugins, inklusive: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class och WalkingAverage.class (Table of Materials). Flytta dessa filer till Fiji plugins mappen. Ladda ner "tsp050706.txt" plugins till plugins mappen. Starta om Fiji programvara när filerna flyttas till plugins mappen.
- Öppna Fiji programvara. Välj plugins, sedan importera bilder av .tiff-serien via Bio-Format Importör under Bio-Format. Se till att välja Standard ImageJ i Stack visning,välj Öppna alla serier,kontrollera Autoskala,klicka sedan på OK. Ta del av bildrutenumret och storleken på bilder i pixlar, som visas högst upp i bilden.
OBS: Ta 60 bildrutor per bild. - Överväg att göra bilderna tydligare genom att justera ljusstyrkan/kontrasten under bildmenyn för alla 60 bildrutor.
- Högerklicka på linjeverktyget för att välja segmenterad linje och rita en segmenterad linje som börjar från cellkroppen och slutar vid terminalyxan. Generera kymograph genom att välja MultipleKymograph under Plugins. Valet av linjebredd uppmanas när du har valt MultipleKymograph. Se till att detta är ett udda tal. Välj 1 för linjebredden. En kymograph genereras efter detta steg.
OBS: Flera viktiga bitar av information kan läsas från kymgrafen. Kymgrafens y-axel är varaktighetstiden (5 min) för de 60 bildrutorna. X-axeln representerar positionen för de valda axonerna. - Använd en diagonal linje i kymgrafen för att bestämma rörelseriktningen för mitokondrierna (anterograde, bakåtsträvande eller stabila). En linje som går ner till höger längs y-axeln indikerar till exempel prerograderörelse, och en linje som går ner till vänster längs y-axeln indikerar bakåtsträvande rörelser. En vertikal linje indikerar att det inte fanns någon rörelse i mitokondrionen.
- Mät avstånd, tidsvärden och hastighet för den rörliga mitokondrierna med hjälp av makron plugin i Fiji programvara. Gå till Plugins | Makron | Installera | tsp050607.txt. Rita en segmenterad linje över spår av mitokondriell rörelse på kymgrafen, och dra alltid linjen från den överlägsna till sämre regionen (y-axeln).
- När du har ritat linjen går du till Plugins | Makron | läshastigheter från tsk. Eftersom en segmenterad linje längs spåret dras, läser plugin segmenterade hastigheter som motsvarar linjen.
Enheten för alla data är pixlar. dy sum är den tid som förbrukas från startpunkten, och dx summan anger avståndet för mitokondrion en rörelse i x-axeln. dy nu och DX visar nu tids- och rörelseavstånd för varje segment. den faktiska hastigheten visar hastigheten för varje segment (dx nu/dy nu). medelhastighet anger medelhastigheten för mitokondriellt glidande (dx sum/dy sum). - Ändra enheten av dx nu från pixel till μm som förhållandet mellan pixel i μm genom att mäta skalstången. Konvertera enheten för avstånd från pixel till μm genom att mäta skalstänger i bilder. Använd linjeverktyget för att rita en linje längs skalstrecket och mäta längden på linjen genom att välja Mått under "Analysera. Ändra tiden från pixel till sekunder, som 1 pixel = 5 sekunder i det här experimentet.
- Beräkna den genomsnittliga hastigheten och motsvarande bakåtsträvande eller anterograde-rörelsen i kalkylbladsfilen. Genomsnittlig anterograde eller bakåtsträvande rörelsehastighet.
- Bestäm procentandelen stationära och rörliga mitokondrierna från kymograph. Den prerograde eller bakåtsträvande mitokondrierna definieras som att flytta 5 μm framåt eller bakåt från ursprunget under hela perioden21. Mitokondrierna anses vara stationära om de inte rörde sig mer än 5 μm under 5 min.
- Analys av mitokondriell morfologi med ImageJ
OBS: Bestäm mitokondriell morfologi genom att mäta mitokondriell längd, område och bildförhållande med ImageJ. För att göra det, följ stegen nedan.- För att analysera mitokondriell längd och område inom axoner, ladda ner Straighten_.jar plugin från ImageJ webbplats (se Table of Materials)och flytta den till mappen med plugins. Starta om ImageJ programvara.
- Öppna bilden genom den öppna funktionen under Arkiv och konvertera 32-bitarsbilden till 8 bitar med text under Bild.
- Rita en segmenterad linje längs axonerna. Välj Räta ut under Plugins och ställ in 50 pixlar för bredd av glödtråd / bred linje. Detta kommer att generera en rätad axon.
- Justera tröskelvärdet under Bild och ställ in mätningen under Analysera genom att välja "Område | Perimeter | Passar ellips | Formbeskrivningar.
- Mät skalstången med linjefunktionen och ställ in skalan under Analysera genom att fylla avståndet i pixel, vet avståndoch längdenheten. Välj sedan Global för att ange den här skalinställningen.
- Använd Analysera partiklar under Analysera för att bestämma området. Snabbparametrarna är storlek (pixel^2) = 0,20–oändlighet, cirkuläritet = 0,00–1,00 och visa = ellipser. Välj Visa resultat.
OBS: Mätningen kommer att ge resultaten av flera mitokondriellmorfologi parametrar inklusive område, omkrets, längd (större), bredd (mindre), och bildförhållande (AR). Motsvarande mitokondriellt nummer listas också. - Beräkna mitokondriellt tal per axon (μm) med hjälp av mitokondriellt nummer dividerat med axonal längd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här var mänskliga iPSCs differentieras i telencephalic glutamatergic nervceller, som kännetecknades av immunfärgning med Tbr1 och βIII tubulin markörer (Figur 1A). För att undersöka axonal transport av mitokondrierna, dessa celler var färgade med rött fluorescerande färgämne, och time-lapse imaging utfördes. Eftersom ImageJ är lätt tillgänglig och lättare att få, var mitokondriell transport ytterligare analyseras med "MultiKymograph" och "Macros" ImageJ plugins, visas i figur 1.
Det finns tre respektive tillstånd av mitokondriell rörelse, inklusive statisk, anterograde och bakåtsträvande rörelse(figur 1B,C). En enda mitokondrion kan förbli statisk eller röra sig i anterograde eller bakåtsträvande riktning inom en yxa, och här ritades en segmenterad linje längs spåret av mitokondriell rörelse för att bestämma hastigheten(figur 1D). Hastigheten på mitokondriell rörelse längs axon visas i figur 1E och motsvarar de segmenterade linjerna i figur 1D efter läsning av "Makron" i ImageJ. I likhet med MetaMorph programvara, ImageJ kan användas för att bestämma mitokondriell hastighet och procent av motile mitokondrierna baserat på kymograph genereras av ImageJ(Figur 1F). Med hjälp av kommersiellt tillgänglig analys programvara (t.ex. MetaMorph), tidigare data visade att andelen motile mitokondrierna minskade avsevärt i SPG3A nervceller jämfört med normala nervceller, medan hastigheten inte ändrades19. För att utvärdera ImageJ programvara, andelen rörliga mitokondrierna undersöktes, och en liknande minskning av andelen rörliga mitokondrierna i SPG3A nervceller jämfört med kontroll vild typ (WT) nervceller observerades(Figur 1G).
När det gäller analys av mitokondriell morfologi analyserades mitokondriellt område, längd och AR med hjälp av funktionen "analysera partiklar" i ImageJ. Axons rätades med hjälp av "räta ut" plugin(Figur 2A,B). Mitokondrierna valdes tydligt genom att justera tröskeln(figur 2C,D). Slutligen, mitokondriellt område, längd (större), bredd (mindre), bildförhållande, och omkrets erhölls från rätade axon med hjälp av "Analysera partiklar" plugin(Figur 2E,F). Onormal mitokondriell morfologi observerades (och har tidigare observerats) i HSP iPSC-härledda telencephalic glutamatergic nervceller, inklusive SPG15 celler(Figur 2G,H,I)13,22. Både mitokondrielllängd och bildförhållande minskade signifikant i SPG15 neuron axons jämfört med kontroll WT neuron axons(figur 2G,H,I).
Bild 1: Analys av mitokondriell transport med ImageJ. (A)Immunostaining som visar generering av telencephalic glutamaterga nervceller. Tbr1 (röd), βIII tubulin (grön) och Hoechst (blå). Skalstänger = 50 μm. Denna siffra har ändrats från en tidigare studie19. (B)Mitokondriell transport inom axoner av nervceller. Prerograde mitokondriell rörelse definieras som mitokondrierna flyttar från cellkroppen till distala axon, och bakåtsträvande mitokondriell rörelse härstammar från distala axon och sträcker sig till neuronal cell kroppen. Segmentlinjen dras längs axoner från neuronal cell kropp till distala axonal terminal för att generera kymographs. (C)Kymograph genereras med ImageJ. x-axeln är axonalpositionen och y-axeln är tid. En kontinuerlig vit linje är mitokondrionen rör sig i anterograde riktning (rosa pilspets), bakåtsträvande riktning (blå pilspets), eller statiskt tillstånd (gult pilhuvud). (D)Den segmenterade linjen dras för att läsa hastigheten med hjälp av Makros plugin. Nummer 1–8 beskriver segmentet på raden. Anterograde rörelse (1-4, 6, 8) och statiskt tillstånd (5, 7) kan skiljas från denna förstorade kymograph. (E)Tid och flyttningsavstånd för varje segment, faktisk och genomsnittlig hastighet (i pixlar). (F)Kymograph av mitokondriell transport för WT och SPG3A kortikala PNs med ImageJ. Skalstång = 10 μm. (G) Motile mitokondriellt förhållande i WT och SPG3A-kortikala pN:er med ImageJ (*p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Analysera mitokondriell morfologi med ImageJ. (A)Parametrar för uträtning av axonen. (B)Representanten rätade ut axonen. (C,D) Justering av tröskelvärdet för att välja mitokondrierna. (E,F) Det uppmätta mitokondriellt område, omkrets, längd (större), bredd (mindre) och bildförhållande (AR) som motsvarar den valda mitokondrierna i (E). (G)Representativa bilder av mitokondrierna i WT och SPG15 telencephalic glutamaterga nervceller. Skala barer = 20 μm. (H) Mitokondriell längd i WT och SPG15 nervceller. (I)Bildförhållande mellan mitokondrierna i WT och SPG15 nervceller. **p < 0,01 jämfört med. WT. (G), (H) och (I) ändras från en tidigare studie13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lysrör | Fördelar | Nackdelar | Referenser |
| MitoTracker (på) | MitoTracker är mitokondriellpotential-oberoende och kan användas för att analysera colocalization av mitokondrierna med autophagosome eller lysosome. | MitoTracker är inte photostable nog för långsiktig forskning. | 35 |
| NPA-TPP | Detta färgämne är en ny photostable mitokondriell märkning reagens. | Syntesen och reningsprocessen av detta färgämne är tidskrävande och kostsam. | 23 |
| MitoBADY (på) | Detta färgämne kan användas för mitokondriell visualisering med Raman mikroskopi med hög känslighet och specificitet. | Med hjälp av detta färgämne kräver Raman mikroskop. | 25 |
| TMRE | Detta färgämne är en giftfri, specifik mitokondriell färgning färgämne med låg koncentration och ingen släckningeffekt. | TMRE märkning mitokondrierna beror på mitokondriellmembran potential. | 36, 37 |
| Mitokondrierinriktade fluorescerande proteiner | Mitokondrierna-riktade fluorescerande proteiner är mer specifika och stabila. | Den här metoden behöver transfection och transfection effektivitet är annorlunda för olika celltyper. | 38, 39 |
Tabell 1: Fördelar och nackdelar med vissa lysrörsverktyg för mitokondriell märkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel beskriver en metod för att analysera mitokondriell transport och morfologi i neuronal axons med hjälp av rött fluorescerande färgämne och ImageJ programvara, som båda ger en unik plattform för att studera axonal degeneration och mitokondriell morfologi i neurodegenerativa sjukdomar. Det finns flera kritiska steg i protokollet, inklusive färgning av mitokondrierna, levande cell avbildning, och analysera bilderna. I denna metod användes ett fluorescerande färgämne för att färga mitokondrierna. Eftersom mänskliga iPSC-härledda nervceller är lätt lossnade från skålen, Är det viktigt att lämna någon lösning i skålen och försiktigt lägga neurobasal medium. Tvätten kan utföras tre eller fyra gånger för att ta bort färgämnet. Dessutom kan mitokondrierna märkas med andra reportrar för att mäta sin transport längs axoner, såsom fluorescerande protein smält mitokondrierna inriktning proteiner6. Vid långsiktig spårning, flera sonder (dvs. NPA-TPP, 2,1,3-bensotondiazol [BTD] fluorescerande derivat, och en specifik Raman sond) visade stor potential i långsiktiga mitokondriell spårning och mitokondriell dynamik analys23,24,25. Fördelarna och nackdelarna med olika sonder finns i tabell 1.
Efter mitokondriell färgning utförs levande cellavbildning med ett mikroskop utrustat med en inkubator. För att effektivt fokusera nervceller under avbildning, neurala prover bör hållas i 37 ° C inkubator med 5% CO2 och i en fuktig miljö i minst 15 min. För att minimera out-of-fokus effekter, bilder på olika Z-positioner kan vidtas för att göra en Z-stack, eller autofokus funktion kan användas. Viktigt, för att identifiera riktningmitokondriell transport (anterograde eller bakåtsträvande), fas bilder tas för att skilja neuronal cell kropp och axoner. En annan kritisk fråga är fotoblekning av fluorescerande prover, som måste förhindras för att få effektiva mitokondriellt transporttimelapse-bilder. En effektiv metod för att minimera fotoblekning är att fokusera prover genom okular och ställa in alla bildåtergivningsparametrar under faskanalen, med undantag för exponeringstid. Dessutom kan det automatiska skalningsmönstret minska fotoblekning av fluorescens.
Mitokondrierna är mycket dynamiska organeller och kan röra sig i både anterograde och bakåtsträvande riktningar. I nervceller, några mitokondrierna inom axons stanna stillastående under inspelningen. Bland de rörliga mitokondrierna kan rörelsestatus variera med tiden. Detta fenomen väcker den viktiga frågan om vilken mitokondrierna typ anses stationär eller flytta. Detta kan lösas genom att tröskelvärdet fastställs under mitokondriell axonal transportanalys. För att skilja den statiska mitokondrierna använde Neumann et al. mitokondriellt spårcentrum, som definieras som medelvärdet av dess positionskoordinater över tiden, och ställ sedan in tröskeln till 350 nm/s så att det maximala avvikelseavståndet för mitokondrionfrån sitt spårcentrum är i den första ramen26. I en annan studie, författarna som 50 nm / s som tröskeln för att skilja stationär status från den rörliga status27. En tröskel på 300 nm/s användes här för att särskilja den mikrotubulibaserade transporten som gjorts i tidigare rapporter28,29. Även om tröskeln för stationära och rörliga mitokondrierna är annorlunda, kan fastställandet av tröskeln ge viktig relativ information om mitokondriell rörelse inom axoner mellan vilda typer och degenerativa nervceller.
De flesta protokoll som involverar mitokondriell transportanalys har använt kymogram, som är tvådimensionell representation av positioner kontra tid. Flera automatiserade verktyg har utvecklats för analys av partikelspårning26,30,31,32,33,34. Dessa kan exakt separera varje ram. Förutom den hastighet och rörliga procent som ImageJ kan mäta, kan denna metod mäta rörliga händelser exakt. Dessa är dock inte fria att använda. Här utfördes analysen av mitokondriell transport med ImageJ med plugins "Multikymograph" och "Macros". Dessa plugins kan effektivt mäta mitokondriell rörelse. Fördelen med dessa plugins är deras användarvänlighet och förmåga att ange förändringar i mitokondriell axonal transport i form av kymografier och hastighet över tiden.
Motile mitokondrierna analyserades i SPG3A och kontrollerar nervceller. En liknande minskning av andelen rörliga mitokondrierna observerades med hjälp av två olika analysmetoder, vilket bekräftade nyttan av ImageJ för att analysera axonal transport. Dessutom kan mitokondriell morfologi analyseras med samma uppsättning bilder, vilket ger viktiga avläsningar för att studera mitokondriell dysfunktion i olika neurologiska sjukdomar. Eftersom axonal degeneration och mitokondriell dysfunktion uppstår vanligtvis under tidigare stadier, innan nervceller dör, kan denna metod användas för att undersöka tidiga patologiska förändringar för att identifiera molekylära vägar och skärm therapeutics för att rädda Neurodegeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Spastic Parplegia Foundation, Blazer Foundation och NIH (R21NS109837).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L.
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L.
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H.
