Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

في الجسم الحي نموذج الماوس من عدوى زرع العمود الفقري

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/60560
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 1, 1, 1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles, 2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

ERRATUM NOTICE

Summary

يصف البروتوكول نموذجا جديدا في الجسم الحي لعدوى زرع العمود الفقري حيث تصاب غرسة الأسلاك الكورية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ بالمكورات العنقودية الذهبية Xen36 ذات الإضاءة الحيوية. تتم مراقبة العبء البكتيري طوليا باستخدام التصوير الحيوي وتأكيده بتعداد وحدات تشكيل المستعمرات بعد القتل الرحيم.

Abstract

تنذر التهابات زرع العمود الفقري بنتائج سيئة حيث أن التشخيص يمثل تحديا والاستئصال الجراحي يتعارض مع استقرار العمود الفقري الميكانيكي. الغرض من هذه الطريقة هو وصف نموذج فأر جديد لعدوى زرع العمود الفقري (SII) تم إنشاؤه لتوفير أداة غير مكلفة وسريعة ودقيقة في الجسم الحي لاختبار العلاجات المحتملة واستراتيجيات العلاج لعدوى زرع العمود الفقري.

في هذه الطريقة ، نقدم نموذجا لجراحة العمود الفقري ذات النهج الخلفي حيث يتم نقل سلك K من الفولاذ المقاوم للصدأ إلى العملية الشائكة L4 للفئران البرية C57BL / 6J البالغة من العمر 12 أسبوعا وتلقيحها ب 1 × 103 CFU من سلالة مضيئة بيولوجيا من بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية Xen36. ثم يتم تصوير الفئران طوليا للتلألؤ البيولوجي في الجسم الحي في أيام ما بعد الجراحة 0 و 1 و 3 و 5 و 7 و 10 و 14 و 18 و 21 و 25 و 28 و 35. يتم قياس إشارات تصوير التلألؤ الحيوي (BLI) من مجال رؤية موحد لقياس العبء البكتيري في الجسم الحي.

لتحديد كمية البكتيريا الملتصقة بالغرسات والأنسجة المحيطة بالزرع ، يتم القتل الرحيم للفئران ويتم حصاد الغرسة والأنسجة الرخوة المحيطة. يتم فصل البكتيريا عن الزرع عن طريق صوتنة ، وزرعت بين عشية وضحاها ومن ثم يتم حساب وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs). تشمل النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الطريقة العد البكتيري الطولي كما تم قياسه بواسطة التلألؤ الحيوي في الجسم الحي S. aureus (متوسط التدفق الأقصى) وعدد CFU بعد القتل الرحيم.

في حين أن النماذج الحيوانية السابقة لعدوى العمود الفقري الآلية قد تضمنت تحليلا غازيا للأنسجة خارج الجسم الحي ، فإن نموذج الفئران ل SII المقدم في هذه الورقة يستفيد من التصوير البصري غير الجراحي في الوقت الفعلي في الجسم الحي للبكتيريا المضيئة بيولوجيا ليحل محل دراسة الأنسجة الثابتة. تطبيقات النموذج واسعة النطاق وقد تشمل استخدام سلالات بكتيرية بديلة ذات إضاءة حيوية ، ودمج أنواع أخرى من الفئران المعدلة وراثيا لدراسة الاستجابة المناعية للمضيف بشكل متزامن ، وتقييم الطرائق التشخيصية والعلاجية الحالية أو التحقيق في الطرائق التشخيصية والعلاجية الجديدة مثل المضادات الحيوية أو الطلاء المزروع.

Introduction

الغرض من هذه الطريقة هو وصف نموذج فأر جديد لعدوى زرع العمود الفقري (SII). تم تصميم هذا النموذج لتوفير أداة غير مكلفة ودقيقة لتقييم تأثير متغيرات المضيف و / أو الممرض و / أو الزرع في الجسم الحي بمرونة. يهدف اختبار العلاجات المحتملة واستراتيجيات العلاج لعدوى زرع العمود الفقري في هذا النموذج إلى توجيه تطوير البحث قبل التطبيق في النماذج الحيوانية الأكبر والتجارب السريرية.

تعد العدوى المرتبطة بالزرع بعد جراحة العمود الفقري من المضاعفات المدمرة وتحدث للأسف في حوالي 3-8٪ من المرضى الذين يخضعون لجراحة العمود الفقري الاختيارية1،2،3،4،5 وما يصل إلى 65٪ من المرضى الذين يخضعون لجراحة متعددة المستويات أو مراجعة6. غالبا ما يتطلب علاج التهابات زرع العمود الفقري دخول المستشفى عدة مرات ، وعمليات جراحية متعددة ، وعلاج بالمضادات الحيوية لفترات طويلة. تنذر SIIs بنتائج سيئة للمرضى بما في ذلك التسوية العصبية والإعاقة وزيادة خطر الوفاة. إدارة SII مكلفة للغاية ، حيث تكلف ما يزيد عن 900,000 دولار لكل مريض7.

المكورات العنقودية الذهبية هي أكثر مسببات الأمراض الخبيثة شيوعا في SII8،9،10،11. يمكن للبكتيريا أن تزرع الأعضاء مباشرة أثناء الجراحة ، أو من خلال الجرح خلال فترة ما بعد الجراحة ، أو لاحقا عن طريق انتشار الدم. في وجود غرسات معدنية ، تشكل المكورات العنقودية الذهبية غشاء حيويا يحمي البكتيريا من العلاج بالمضادات الحيوية والخلايا المناعية. في حين أن إزالة الأجهزة المصابة قد تساعد في القضاء على العدوى بشكل فعال ، إلا أن هذا غالبا ما يكون غير ممكن في العمود الفقري دون التسبب في زعزعة الاستقرار والمخاطرة بالتسوية العصبية12.

في غياب زرع الأجهزة المصابة ، هناك حاجة إلى أساليب جديدة لمنع SII واكتشافه وعلاجه. تاريخيا ، كانت هناك نماذج حيوانية محدودة من SII لتقييم سلامة وفعالية العلاجات الجديدة بكفاءة. تتطلب النماذج الحيوانية السابقة ل SII أعدادا كبيرة من الحيوانات وجمع نقاط البيانات التي تتطلب القتل الرحيم بما في ذلك عد المستعمرات والأنسجة والثقافة13،14،15. تفتقر هذه النماذج إلى المراقبة الطولية في الجسم الحي ، وتوفر نقطة بيانات واحدة فقط لكل ، وبالتالي فهي باهظة الثمن وغير فعالة.

أثبت العمل السابق الذي يدرس نموذج فأر لعدوى رأب مفاصل الركبة قيمة ودقة التصوير البصري غير الباضع في الجسم الحي لمراقبة عبء العدوى طوليا16. يسمح الكشف عن التلألؤ الحيوي بقياس العبء البكتيري على مدار زمني طولي في واحد بشكل إنساني ودقيق وفعال. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة وجود علاقة عالية بين التلألؤ الحيوي في الجسم الحي ووحدات CFU الملتصقة بالغرسات17. أدت القدرة على تتبع العدوى بمرور الوقت إلى فهم أكثر دقة للعدوى المرتبطة بالزرع. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مراقبة العدوى الطولية بهذه الطريقة ، سمحت بتقييم فعالية العلاج بالمضادات الحيوية ومضادات الميكروبات الجديدة بدقة16،17،18.

بالاستفادة من هذه الأدوات ، قمنا بتطوير نموذج لعدوى زرع العمود الفقري بعد العملية الجراحية والتحقق من صحته. في الطريقة المقدمة ، نستخدم لقاحا من S. aureus Xen36 المضيئة بيولوجيا لإنشاء نموذج فأر في الجسم الحي من SII لمراقبة الحمل البكتيري طوليا16،17،18. يوفر هذا النموذج الجديد أداة قيمة لاختبار استراتيجيات الكشف والوقاية والعلاج المحتملة بكفاءة ل SII قبل تطبيقها في النماذج الحيوانية الأكبر والتجارب السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم التعامل مع جميع الحيوانات بما يتفق بدقة مع الممارسات الحيوانية الجيدة على النحو المحدد في اللوائح الفيدرالية على النحو المنصوص عليه في قانون رعاية الحيوان (AWA) ، ودليل عام 1996 لرعاية واستخدام المختبر ، وسياسة PHS للرعاية الإنسانية واستخدام المختبر ، وكذلك سياسات وإجراءات المؤسسة على النحو المنصوص عليه في دليل التدريب على رعاية الحيوان واستخدامه ، وتمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية من قبل لجنة أبحاث الحيوان بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (ARC).

1. اختيار سلالة S. aureus bioluminescent

  1. استخدم سلالة S. aureus Xen36 ذات الإضاءة الحيوية كلقاح مهم.
    ملاحظة: تم اشتقاق هذه السلالة من السلالة الأبوية S. aureus ATCC-49525 ، وهي عزلة سريرية من مريض إنتاني. المكورات العنقودية الذهبية يستخدم Xen36 بشكل فريد أوبرون ABCDE lux، والذي تم تحسينه ودمجه في البلازميد الأصلي للمضيف. 19 نتيجة لذلك ، فإن سلالة Xen36 قادرة على إنتاج ضوء إضاءة بيولوجي أزرق أخضر مع انبعاث ذروة الطول الموجي 490 نانومتر. يتم إنتاج إشارة الانبعاث هذه فقط بواسطة الكائنات البكتيرية الحية النشطة في التمثيل الغذائي.

2. إعداد S. أوريوس للتلقيح

  1. أضف 200 ميكروغرام / مل كاناميسين إلى مرق لوريا بالإضافة إلى 1.5٪ أجار لعزل S. aureus Xen36 عن الملوثات المحتملة ، باستخدام جين مقاومة الكانامايسين المرتبط بلوكس أوبرون19.
  2. قم بتجميع بكتيريا S. aureus Xen36 على ألواح أجار الصويا التربتيك (مرق الصويا التربتي [TSB] بالإضافة إلى 1.5٪ أجار) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  3. عزل المستعمرات المفردة للمكورات العنقودية الذهبية Xen36 والاستزراع الفردي في مكتب تقييس الاتصالات لمدة 12-16 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزازية (200 دورة في الدقيقة).
  4. تمييع الثقافة الناتجة بنسبة 1:50.
  5. استزراع لمدة 2 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية لعزل بكتيريا الطور اللوغاريتمي المتوسط.
  6. حبيبات ، إنعاش ، وغسل البكتيريا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثلاث مرات.
  7. قياس الامتصاص عند 600 نانومتر. يتراوح OD600 المثالي بين 0.700 و 0.750 وهو ما يتوافق مع 4x105 CFU / mL. إجراء التخفيفات التسلسلية لتحقيق اللقاح البكتيري المطلوب (1 × 103 CFU / 2 ميكرولتر).
    ملاحظة: تم العثور على التركيز الأمثل ل Xen36 لإنشاء عدوى مزمنة ليكون 1 × 103 CFU. تم إزالة جرعات أقل من البكتيريا من قبل الجهاز المناعي المضيف وتسببت الجرعات العالية في انهيار الجرح. لا يفرق انهيار الجرح بين عدوى الزرع العميق وعدوى الجرح السطحي ، وبالتالي يتم تجنبه في هذا النموذج (الشكل 1)20.

3. الفئران

  1. استخدم ذكور الفئران من النوع البري C57BL / 6J البالغة من العمر 12 أسبوعا.
  2. الفئران المنزلية في أقفاص بحد أقصى 4 في وقت واحد.
  3. حافظ على توفر المياه في جميع الأوقات. حافظ على دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ولا تقم بإجراء التجارب خلال المرحلة المظلمة من الدورة.
  4. استخدم الطعام الخالي من البرسيم للتغذية بسبب التداخل المحتمل مع إشارات الفلورسنت.
  5. اطلب من موظفي البحث أو الطب البيطري تقييم الفئران يوميا لضمان رفاهية الحيوانات طوال فترة التجربة.

4. العمليات الجراحية للفأر

  1. حث التخدير عن طريق وضع الفئران في غرفة إيزوفلوران (2٪) لمدة 5 دقائق تقريبا. تأكد من عمق التخدير المناسب من خلال مراقبة التنفس ليظل إيقاعيا وأبطأ مما كان عليه عند الاستيقاظ ولا يتغير استجابة للمنبهات الضارة (على سبيل المثال ، التلاعب الجراحي ، قرصة إصبع القدم).
  2. نقل الفئران المخدرة إلى محطة التحضير وإزالة الشعر من العجز إلى العمود الفقري الصدري العلوي مع كليبرز القوارض.
  3. تنظيف وتعقيم الجلد مع يغسل ثلاثة من محلول بيتادين بالتناوب وكحول الأيزوبروبيل.
  4. نقل الفئران المخدرة والمعقمة في وضعية الانبطاح إلى سرير جراحي معقم مع الحفاظ على التخدير مع إعطاء الأيزوفلوران المستنشق (2٪) عبر مخروط الأنف.
  5. قم بثني الوركين إلى أقصى حد وحدد موضع الركبة على مستوى العمود الفقري لتقريب الجسم الفقري القطني 4.
  6. قم بعمل شق طولي 2 سم عبر الجلد باستخدام مشرط جراحي مكون من 15 شفرة.
  7. جس العمليات الشائكة لتأكيد خط الوسط واستمر في الشق وصولا إلى العظام.
  8. تشريح تحت السمحاق على الجانب الأيمن من عملية L4 الشائكة ، وتمتد أفقيا إلى العملية المستعرضة.
  9. مرر خياطة مضفرة قابلة للامتصاص بحجم 5-0 سيفالاد وذيول إلى جسم L4 من خلال اللفافة واتركها مفتوحة ، استعدادا للإغلاق في المستقبل.
  10. باستخدام إبرة شوكية 25 G ، أعد العملية الشائكة ل L4 باستخدام إبرة شوكية 25 G وأدخل غرسة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 0.1 مم وطول 1 سم "على شكل حرف L" على طول الصفيحة مع وضع الذراع الطويل الرأس.
  11. قم بتلقيح الغرسة ب 1 × 103 CFUs / 2 ميكرولتر من التوهج الحيوي S. aureus Xen36 ، مع الحرص على التأكد من ملامسة جميع المحلول للزرع.
  12. انتظر حوالي 10 ثوان قبل ربط الخيط القابل للامتصاص الذي تم تمريره مسبقا بعد التلقيح لضمان احتواء اللقاح على الغرسة.
  13. أغلق الجلد بطريقة الجري مع خياطة قابلة للامتصاص.
  14. تطبيق دواء الألم عن طريق حقن البوبرينورفين تحت الجلد (0.1 ملغ/كغ) فورا ثم كل 12 ساعة لمدة 3 أيام بعد ذلك.
  15. استعادة الفئران على وسادة التدفئة ومراقبة للعودة إلى النشاط الطبيعي.
  16. الحصول على الصور الشعاعية بعد العملية الجراحية لتأكيد الموضع المناسب للزرع.

5. التصوير الطولي في الجسم الحي لقياس العبء البكتيري

  1. تخدير الفئران مع استنشاق الأيزوفلوران (2 ٪). تأكد من عمق التخدير المناسب من خلال مراقبة التنفس ليظل إيقاعيا وأبطأ مما كان عليه عند الاستيقاظ ولا يتغير استجابة للمنبهات الضارة (على سبيل المثال ، التلاعب الجراحي ، قرصة إصبع القدم).
  2. إزالة الشعر من العجز إلى العمود الفقري الصدري العلوي مع كليبرز القوارض.
  3. قم بتحميل الفئران على مجال رؤية منصة التصوير الحيوي لإجراء تصوير التلألؤ الحيوي في الجسم الحي (BLI) 19.
  4. التقط إشارة التوهج الحيوي على مدى 5 دقائق من وقت الاستحواذ. استخدم إعدادات التجميع الكبيرة مع مجال رؤية 15 سم (B).
  5. كرر الخطوات 5.1-5.4 في أيام ما بعد الجراحة 0 و 1 و 3 و 5 و 7 و 10 و 14 و 18 و 21 و 25 و 28 و 35 (أو أيام أخرى بناء على تصميم تجريبي محدد) لمراقبة العبء البكتيري.
  6. اعرض بيانات BLI عبر مقياس الألوان والتراكب على صورة فوتوغرافية بتدرج الرمادي. عزل منطقة بيضاوية قياسية ذات أهمية (ROI) باستخدام برنامج BLI لتحديد BLI في التدفق الكلي (الفوتونات في الثانية) أو متوسط التدفق الأقصى (الفوتونات / الثانية / السنتيمتر2 / الاستراديان).

6. تحديد كمية البكتيريا الملتصقة بالغرسات والأنسجة المحيطة بها

  1. القتل الرحيم للفئران على POD 35 أو تاريخ بديل بعد الجراحة مع التعرض لثاني أكسيد الكربون وفقا لإرشادات AVMA. تأكيد القتل الرحيم مع خلع عنق الرحم الثانوي.
  2. تعقيم الجلد الظهري وفقا للخطوة 4.3 ووضع الماوس عرضة في مجال جراحي معقم.
  3. شق الشق السابق بحدة باستخدام مشرط جراحي مكون من 15 شفرة.
  4. استخدم مقصا معقما لتشريح العملية الشائكة L4 بصراحة وتحديد الغرسة الجراحية.
  5. استخدم محرك إبرة للف الغرسة وإزالتها برفق من موضعها في عملية L4 الشائكة.
  6. باستخدام ملقط ومقص معقم ، احصد ما يقرب من 0.1 جرام من عظم العملية الشوكية والأنسجة الرخوة المحيطة مباشرة بالزرع الجراحي وضعه في 1 مل من PBS في أنبوب وحيد القرن المخروطي الصغير مع 4 حبات متجانسة حادة.
  7. سجل وزن الأنسجة الرخوة عن طريق وزن الأنبوب المخروطي قبل وبعد الحصاد.
  8. ضع الغرسة في 0.5 مل من 0.3٪ Tween-80 في TSB وصوتنيكات لمدة 15 دقيقة.
  9. دوامة تعليق الزرع الناتج لمدة 2 دقيقة والثقافة بين عشية وضحاها لمدة 12-16 ساعة.
  10. تجانس الأنسجة الرخوة والعمليات الشائكة التي سبق وضعها في 1 مل PBS المحيطة بالزرع باستخدام الخالط.
  11. دوامة تعليق الأنسجة الرخوة الناتجة لمدة 5 دقائق والثقافة بين عشية وضحاها لمدة 12-16 ساعة.
  12. بعد الثقافة بين عشية وضحاها ، عد CFU من الزرع والأنسجة المحيطة ، على التوالي. قيمة صريحة كإجمالي CFU / g التي تم حصادها للأنسجة الرخوة و CFU / mL للزرع الصوتي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام الإجراء المقدم هنا لتقييم فعالية أنظمة المضادات الحيوية في نموذج فأر في الجسم الحي من SII. على وجه التحديد ، تمت مقارنة فعالية الجمع بين العلاج بالمضادات الحيوية للفانكومايسين والريفامبين مع العلاج الأحادي للفانكومايسين والضوابط المصابة غير المعالجة.

قبل الجراحة ، تم اختيار الفئران بشكل عشوائي إما للعلاج المركب أو العلاج الأحادي أو السيطرة على المصابين. تم إجراء تحليل إحصائي للطاقة لحساب حجم العينة. تم استخدام المتوسطات المتوقعة لمتوسط التدفق الأقصى 1 × 10 5 ± 3.2 × 10 4 و1.4 × 105 لتحديد حجم العينة ، والتي تم حسابها على أنها N = 10 في كل مجموعة. خضعت الفئران لعملية زرع جراحية ، وتلقيح مع S. aureus Xen36 ، وتم قياسها للتلألؤ الحيوي في الجسم الحي S. aureus على POD 0 و 1 و 3 و 5 و 7 و 10 و 14 و 18 و 21 و 25 و 28 و 35. في POD 35 ، تم التضحية بالفئران وتم تحديد كمية وحدات CFU لبكتيريا الأنسجة الملتصقة بالزرع والمحيطة.

تلقت الفئران في مجموعة العلاج الأحادي جرعة علاجية من فانكومايسين (110 ملغم / كغم مرتين يوميا) تعطى تحت الجلد. تم اختيار هذه الجرعة لتقريب المنطقة الواقعة تحت المنحنى للتعرض البشري النموذجي للفانكومايسين21،22،23. تلقت الفئران في مجموعة العلاج المركب جرعة علاجية تحت الجلد من فانكومايسين (110 مغ/كغ مرتين يوميا) وريفامبين (25 مغ/كغ يوميا)24. تلقت الفئران في المجموعة الضابطة المصابة حقنا زائفة من محلول ملحي معقم. تم إجراء العلاج لجميع المجموعات من أيام ما بعد الجراحة من 7 إلى 14.

تأثير العلاج بالمضادات الحيوية على BLI
كان لدى الفئران المصابة إشارات BLI بلغت ذروتها على POD 10 والتي ظلت أعلى من 1.0 × 105 فوتونات / ثانية/ سم 2 / sr حتى التضحية ، بنجاح نمذجة SII المزمن (الشكل 2). كان لدى الفئران التي عولجت بالعلاج الأحادي للفانكومايسين إشارة BLI أقل بكثير مقارنة بالسيطرة المصابة ، مع انخفاض بمقدار ضعفين من POD 10-21 (p<0.03). بعد POD 21 ، لم يكن هناك فرق كبير في BLI بين العلاج الأحادي ومجموعات التحكم المصابة. كان لدى الفئران التي عولجت بالعلاج المركب فانكومايسين-ريفامبين إشارة BLI أقل ، والتي كانت أقل بمقدار 20 ضعفا من السيطرة المصابة على POD 10. استمر الانخفاض الكبير حتى POD 28 (p<0.01). بعد POD 28 ، لم يكن هناك فرق كبير في BLI بين المجموعات. لم يكن هناك فرق كبير في BLI بين أي من المجموعات الثلاث في التصوير النهائي على POD35.

وحدات CFU من الغرسات والأنسجة المحيطة بها
تم التضحية بالفئران على POD 35. تم حصاد الغرسات والأنسجة المحيطة ومعالجتها لحساب CFU (الشكل 3). لم يلاحظ فرق كبير في وحدات CFU بين مجموعات السيطرة المصابة أو العلاج الأحادي أو العلاج المركب.

Figure 1
الشكل 1: انهيار الجرح بجرعة عالية من لقاح S. aureus Xen36. صور للجلد الظهري للفئران الملقحة ب S. aureus Xen36 أثناء عدوى زرع العمود الفقري. (أ) فأر ملقح ب 1 × 103 CFUs ، وجلد ظهري سليم. (ب) فأر ملقح ب 1 × 104 CFUs ، ودليل على انهيار كبير للجرح. تم تعديل الشكل وإعادة طباعته بإذن من Dworsky et al.25يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: قياس الحمل البكتيري باستخدام التلألؤ الحيوي في الجسم الحي. تم تلقيح 1 × 103 CFU من S. aureus التي تمتلك بنية التوهج الحيوي في بلازميد مستقر (Xen36) في العملية الشائكة L4 للفئران (n = 10 فئران لكل مجموعة) في وجود غرسة من الفولاذ المقاوم للصدأ. (أ) الأعداد البكتيرية كما تم قياسها بواسطة التلألؤ الحيوي للمكورات العنقودية الذهبية في الجسم الحي (متوسط التدفق الأقصى [الفوتونات / ثانية / سم 2 / sr] ± sem [مقياس لوغاريتمي]) ، مع مخطط تدفق للبروتوكول التجريبي أدناه. في POD 7 ، بدأ إعطاء المضادات الحيوية بالفانكومايسين ، وهو مزيج من الفانكومايسين والريفامبين أو التحكم في محلول ملحي معقم. تم إيقاف إعطاء المضادات الحيوية على POD 14. في POD 35 ، تم التضحية بالفئران وتم قياس CFUs من الزرع والأنسجة المحيطة. (ب) التلألؤ الحيوي التمثيلي في الجسم الحي للمكورات العنقودية الذهبية على مقياس ألوان متراكب فوق صورة ذات تدرج رمادي للفئران. تم تعديل الشكل وإعادة طباعته بإذن من Hu et al.25يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تأكيد العبء البكتيري باستخدام عدد CFU. في POD 35 ، تم التضحية بالفئران ، وتم صوتنة الدبابيس ، وتم تجانس الأنسجة ، وتم استزراع البكتيريا وعدها. تم تعديل الشكل وإعادة طباعته بإذن من Hu et al.25. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تنذر الالتهابات المرتبطة بالزرع في العمود الفقري بنتائج سيئة للمرضى1،2،3،4،5. على عكس العديد من المناطق الأخرى في الجسم ، لا يمكن إزالة الأجهزة المصابة في العمود الفقري بشكل متكرر بسبب خطر عدم الاستقرار والتسوية العصبية. هذا التحدي الفريد في إعداد بكتيريا الأغشية الحيوية المقاومة للعلاج بالمضادات الحيوية الجهازية يتطلب مناهج جديدة للعلاج12. كانت الأبحاث السابقة في العلاجات الجديدة ل SII محدودة بسبب النماذج الحيوانية باهظة الثمن وغير الفعالة. لدراسة هذه العدوى بشكل أفضل وتقييم فعالية العلاجات المحتملة بكفاءة ، قمنا بتطوير نموذج فأر طولي غير جراحي ل SII باستخدام التصوير الحيوي في الجسم الحي.

تطلبت النماذج الحيوانية السابقة لعدوى العمود الفقري الآلية تحليل الأنسجة خارج الجسم الحي لتقييم النتائج ، مما يتطلب مجموعات كبيرة ولم يتمكنوا من مراقبة العدوى بمرور الوقت13،14،26. في المقابل ، فإن نموذج الماوس ل SII المقدم في هذه الورقة يستفيد من BLI لمراقبة الحمل البكتيري بشكل موثوق بمرور الوقت16،17،18. يمكن هذا النهج الجديد الباحثين من تقييم استجابة البكتيريا والمضيف للمضادات الحيوية أو الطلاء أو التعديل المناعي.

وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول ما يلي: التحضير المناسب للقاح Xen36 S. aureus وتقدير اللقاح الوحيد 1 × 103 CFUs / 2 ميكرولتر. الزرع الجراحي الدقيق والتلقيح والإغلاق ؛ التصوير الحيوي في الجسم الحي ؛ وتأكيد العبء البكتيري باستخدام عدد CFU.

قد تشمل التعديلات على النموذج سلالات بكتيرية بديلة ذات إضاءة حيوية ، أو نقاط زمنية طويلة المدى ، أو استخدام تكامل أنواع أخرى من الفئران المعدلة وراثيا ، مثل تلك التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر في الخلايا النخاعية (Lys-EGFP) لقياس تسلل العدلات بشكل متزامن مع التصوير الفلوري في الجسم الحي20. يمكن استخدام منهجيات إضافية لاستكمال تلك الموصوفة في البروتوكول لمعالجة عمليات مثل انحلال العظام الفقري ، وتنكس القرص ، وعدوى الأنسجة الرخوة ، وعدوى الأغشية الحيوية المزروعة . قد تشمل التقنيات التي توفر نتائج كمية في هذه العمليات على سبيل المثال لا الحصر: التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، والتصوير بالرنين المغناطيسي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، والأمصال ، وعلم الأنسجة ، والكيمياء الهيستولوجية المناعية ، و / أو المجهر الإلكتروني الماسح بالضغط المتغير.

هذا النموذج له العديد من القيود. أولا ، نموذج جراحة العمود الفقري هو تبسيط إجمالي مقارنة بالممارسة السريرية. على عكس جراحات تخفيف الضغط والانصهار متعددة المستويات النموذجية لمرضى جراحة العمود الفقري عالية الخطورة ، تتضمن الجراحة النموذجية الحد الأدنى من استئصال العظام باستخدام غرسة واحدة من الفولاذ المقاوم للصدأ. نظرا لأن غرسات العمود الفقري السريرية تحتوي على مواد مختلفة متعددة ، فقد يكون لها قابلية مختلفة للعدوى البكتيرية وتكوين الأغشية الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، كما هو الحال مع جميع النماذج الحيوانية ، تختلف استجابة المضيف لعدوى الفئران عن استجابة البشر.

في المستقبل ، يمكن استخدام هذا النموذج لتقييم علاج SII بطرق توصيل المضادات الحيوية الأخرى بما في ذلك مسحوق الفانكومايسين أو الخرز المحمل بالمضادات الحيوية أو الغرسات المغلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الأساس الميكانيكي لاستجابة المضيف ل SII.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يقروا باستلام كل من منحة جمعية جراحة عظام الأطفال في أمريكا الشمالية Biomet Spine Grant ومنحة معهد KL2 للمعاهد الوطنية للصحة والعلوم السريرية والانتقالية ، ومنحة HH Lee للبحوث الجراحية كمصادر تمويل رئيسية لهذه التجارب.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance ME104 Mettler Toledo 30029067 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth Becton Dickinson (BD) BD 211825 BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer Thermo Scientific 840-208300 Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor Thermo Scientific 75003183 Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator) Branson Ultrasonics CPX952217R *similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer Next Advance BBY24M The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500 Electron Microscopy Sciences 66118-10 The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be
used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for
traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine
sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been
designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 51026282 Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System Perkin Elmer CLS148590 The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker Thermo Scientific SHKE4450 Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline Fisher Bioreagents BP24384 PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated Thermo Scientific 75002436 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge Thermo Scientific 75004261 Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36 Perkin Elmer 119243 Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V Heidolph Tuttnauer 23210401 Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80 Fisher Bioreagents BP338-500 Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200 Labnet Internation S0200 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride Pfizer Injectables/Hospira 00409-4888-10 0.9% Sodium Chloride Injection, USP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of neutrophils in experimental septicemia and septic arthritis induced by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 65 (7), 2517-2521 (1997).
  2. Fang, A., Hu, S. S., Endres, N., Bradford, D. S. Risk factors for infection after spinal surgery. Spine. 30 (12), Phila Pa. 1460-1465 (2005).
  3. Levi, A. D., Dickman, C. A., Sonntag, V. K. Management of postoperative infections after spinal instrumentation. Journal of Neurosurgery. 86 (6), 975-980 (1997).
  4. Weinstein, M. A., McCabe, J. P., Cammisa, F. P. Postoperative spinal wound infection: a review of 2,391 consecutive index procedures. Journal of Spinal Disorders. 13 (5), 422-426 (2000).
  5. Picada, R., et al. Postoperative deep wound infection in adults after posterior lumbosacral spine fusion with instrumentation: incidence and management. Journal of Spinal Disorders. 13 (1), 42-45 (2000).
  6. Smith, J. S., et al. Rates of infection after spine surgery based on 108,419 procedures: a report from the Scoliosis Research Society Morbidity and Mortality Committee. Spine. 36 (7), Phila Pa. 556-563 (2011).
  7. Abbey, D. M., Turner, D. M., Warson, J. S., Wirt, T. C., Scalley, R. D. Treatment of postoperative wound infections following spinal fusion with instrumentation. Journal of Spinal Disorders. 8 (4), 278-283 (1995).
  8. Silber, J. S., et al. Management of postprocedural discitis. Spine Journal. 2 (4), 279-287 (2002).
  9. Pappou, I. P., Papadopoulos, E. C., Sama, A. A., Girardi, F. P., Cammisa, F. P. Postoperative infections in interbody fusion for degenerative spinal disease. Clinical Orthopaedics and Related Research. 444, 120-128 (2006).
  10. Sampedro, M. F., et al. A biofilm approach to detect bacteria on removed spinal implants. Spine. 35 (12), Phila Pa. 1218-1224 (2010).
  11. Pull ter Gunne, A. F., Mohamed, A. S., Skolasky, R. L., van Laarhoven, C. J., Cohen, D. B. The presentation, incidence, etiology, and treatment of surgical site infections after spinal surgery. Spine. 35 (13), Phila Pa. 1323-1328 (2010).
  12. Olsen, M. A., et al. Risk factors for surgical site infection in spinal surgery. Journal of Neurosurgery. 98, 2 Suppl 149-155 (2003).
  13. Ofluoglu, E. A., et al. Implant-related infection model in rat spine. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 127 (5), 391-396 (2007).
  14. Guiboux, J. P., et al. The role of prophylactic antibiotics in spinal instrumentation. A rabbit model. Spine. 23 (6), Phila Pa. 653-656 (1998).
  15. Stavrakis, A. I., et al. Current Animal Models of Postoperative Spine Infection and Potential Future Advances. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 34 (2015).
  16. Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection: noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. Journal of Orthopaedic Research. 30 (3), 335-340 (2012).
  17. Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS One. 5 (9), 12580 (2010).
  18. Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and muCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS One. 7 (10), 47397 (2012).
  19. Francis, K. P., et al. Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct. Infection and Immunity. 68 (6), 3594-3600 (2000).
  20. Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
  21. Hegde, S. S., et al. Activity of telavancin against heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) in vitro and in an in vivo mouse model of bacteraemia. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 65 (4), 725-728 (2010).
  22. Crandon, J. L., Kuti, J. L., Nicolau, D. P. Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 5115-5119 (2010).
  23. Reyes, N., et al. Efficacy of telavancin in a murine model of bacteraemia induced by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 58 (2), 462-465 (2006).
  24. Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Alder, J., Eliopoulos, C. T. Efficacy of daptomycin in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (5), 1714-1718 (2003).
  25. Hu, Y., et al. Combinatory antibiotic therapy increases rate of bacterial kill but not final outcome in a novel mouse model of Staphylococcus aureus spinal implant infection. PLoS One. 12 (2), 0173019 (2017).
  26. Poelstra, K. A., Barekzi, N. A., Grainger, D. W., Gristina, A. G., Schuler, T. C. A novel spinal implant infection model in rabbits. Spine. 25 (4), Phila Pa. 406-410 (2000).

Tags

عدوى زرع العمود الفقري ، نموذج الفأر ، في الجسم الحي ، العلاجات ، استراتيجيات العلاج ، جراحة العمود الفقري ذات النهج الخلفي ، سلالة التوهج الحيوي ، بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية Xen36 ، تصوير التلألؤ الحيوي ، العبء البكتيري ، الأنسجة المحيطة بالزرع ، وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs) ، النماذج الحيوانية

Erratum

Formal Correction: Erratum: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection
Posted by JoVE Editors on 05/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. The Authors section was updated from:

Benjamin V. Kelley1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

to:

Benjamin V. Kelley1
Christopher Hamad1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Zeinab Mamouei1
Rene Chun1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Brandon Gettleman3
Autreen Golzar2
Adrian Lin2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles
3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

في الجسم الحي نموذج الماوس من عدوى زرع العمود الفقري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. … More

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. D., Greig, D., Mamouei, Z., Chun, R., Hori, K., Cevallos, N., Ishmael, C., Hsiue, P., Trikha, R., Sekimura, T., Gettleman, B., Golzar, A., Lin, A., Olson, T., Chaudry, A., Le, M. M., Scaduto, A. A., Francis, K. P., Bernthal, N. M. In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. J. Vis. Exp. (160), e60560, doi:10.3791/60560 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter