Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In vivo muismodel van spinale implantaatinfectie

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/60560
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 1, 1, 1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles, 2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

ERRATUM NOTICE

Summary

Het protocol beschrijft een nieuw in vivo muismodel van spinale implantaatinfectie waarbij een roestvrijstalen k-draadimplantaat is geïnfecteerd met bioluminescente Staphylococcus aureus Xen36. De bacteriële belasting wordt longitudinaal gemonitord met bioluminescente beeldvorming en bevestigd met kolonievormende eenheidstellingen na euthanasie.

Abstract

Infecties van wervelkolomimplantaten voorspellen slechte resultaten, aangezien de diagnose een uitdaging is en chirurgische uitroeiing op gespannen voet staat met de mechanische stabiliteit van de wervelkolom. Het doel van deze methode is het beschrijven van een nieuw muismodel van spinale implantaatinfectie (SII) dat is gemaakt om een goedkoop, snel en nauwkeurig in vivo hulpmiddel te bieden om potentiële therapieën en behandelingsstrategieën voor spinale implantaatinfecties te testen.

In deze methode presenteren we een model van spinale chirurgie in de posterieure benadering waarbij een roestvrijstalen k-draad wordt gefixeerd in het L4-processus spinosus van 12 weken oude C57BL/6J wildtype muizen en wordt geïnoculeerd met 1 x 103 CFU van een bioluminescente stam van Staphylococcus aureus Xen36-bacteriën. Muizen worden vervolgens longitudinaal in beeld gebracht voor bioluminescentie in vivo op postoperatieve dagen 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 en 35. Bioluminescentiebeeldvorming (BLI)-signalen uit een gestandaardiseerd gezichtsveld worden gekwantificeerd om in vivo de bacteriële belasting te meten.

Om bacteriën te kwantificeren die zich hechten aan implantaten en peri-implantair weefsel, worden muizen geëuthanaseerd en worden het implantaat en het omliggende zachte weefsel geoogst. Bacteriën worden losgemaakt van het implantaat door middel van sonicatie, 's nachts gekweekt en vervolgens worden kolonievormende eenheden (CFU's) geteld. De resultaten van deze methode omvatten longitudinale bacterietellingen zoals gemeten door in vivo S. aureus-bioluminescentie (gemiddelde maximale flux) en CFU-tellingen na euthanasie.

Terwijl eerdere diermodellen van geïnstrumenteerde wervelkolominfectie invasieve, ex vivo weefselanalyse hebben omvat, maakt het muismodel van SII dat in dit artikel wordt gepresenteerd, gebruik van niet-invasieve, real-time in vivo optische beeldvorming van bioluminescente bacteriën om statisch weefselonderzoek te vervangen. Toepassingen van het model zijn breed en kunnen bestaan uit het gebruik van alternatieve bioluminescente bacteriestammen, het opnemen van andere soorten genetisch gemanipuleerde muizen om tegelijkertijd de immuunrespons van de gastheer te bestuderen, en het evalueren van huidige of het onderzoeken van nieuwe diagnostische en therapeutische modaliteiten zoals antibiotica of implantaatcoatings.

Introduction

Het doel van deze methode is om een nieuw muismodel van spinale implantaatinfectie (SII) te beschrijven. Dit model is ontworpen om een goedkoop en nauwkeurig hulpmiddel te bieden om het effect van gastheer-, pathogeen- en/of implantaatvariabelen in vivo flexibel te beoordelen. Het testen van potentiële therapieën en behandelingsstrategieën voor spinale implantaatinfecties in dit model is gericht op het begeleiden van onderzoeksontwikkeling voorafgaand aan toepassing in grotere diermodellen en klinische proeven.

Implantaatgerelateerde infectie na een wervelkolomoperatie is een verwoestende complicatie en komt helaas voor bij ongeveer 3-8% van de patiënten die een electieve wervelkolomoperatie ondergaan 1,2,3,4,5 en tot 65% van de patiënten die een multilevel- of revisieoperatie ondergaan 6. Behandeling van spinale implantaatinfecties vereist vaak meerdere ziekenhuisopnames, meerdere operaties en langdurige antibioticatherapie. SII's voorspellen slechte resultaten voor de patiënt, waaronder neurologische compromittering, invaliditeit en een verhoogd risico op sterfte. Het beheer van SII is extreem duur en kost meer dan $ 900,000 per patiënt7.

Staphylococcus aureus is de meest voorkomende virulente ziekteverwekker van SII 8,9,10,11. Bacteriën kunnen de hardware direct tijdens de operatie zaaien, via de wond tijdens de postoperatieve periode of later via hematogene verspreiding. In aanwezigheid van metalen implantaten vormt S. aureus een biofilm die de bacteriën beschermt tegen antibioticatherapie en immuuncellen. Hoewel het verwijderen van geïnfecteerde hardware kan helpen om een infectie effectief uit te roeien, is dit vaak niet haalbaar in de wervelkolom zonder destabilisatie te veroorzaken en neurologische compromittering te riskeren12.

Bij gebrek aan explantatie van geïnfecteerde hardware zijn nieuwe benaderingen nodig om SII te voorkomen, op te sporen en te behandelen. Historisch gezien zijn er beperkte diermodellen van SII om de veiligheid en werkzaamheid van nieuwe therapieën efficiënt te beoordelen. Eerdere diermodellen van SII vereisen grote aantallen dieren en het verzamelen van datapunten die euthanasie vereisen, waaronder het tellen van kolonies, histologie en cultuur13,14,15. Bij gebrek aan longitudinale in vivo monitoring bieden deze modellen slechts één datapunt per dier en zijn daarom duur en inefficiënt.

Eerder werk dat een muismodel van knieartroplastiekinfectie bestudeerde, stelde de waarde en nauwkeurigheid vast van niet-invasieve in vivo optische beeldvorming om de infectielast longitudinaal te bewaken16. De detectie van bioluminescentie maakt het mogelijk om de bacteriële belasting over een longitudinaal tijdsverloop in een enkel dier humaan, nauwkeurig en efficiënt te kwantificeren. Bovendien hebben eerdere studies een hoge correlatie aangetoond tussen in vivo bioluminescentie en CFU's die aan implantaten hechten17. Het vermogen om infecties in de loop van de tijd te volgen, heeft geleid tot een meer genuanceerd begrip van implantaatgerelateerde infecties. Bovendien heeft het op deze manier monitoren van longitudinale infecties het mogelijk gemaakt om de effectiviteit van antibioticatherapie en nieuwe antimicrobiële stoffen nauwkeurig te beoordelen16,17,18.

Met behulp van deze hulpmiddelen hebben we een model van postoperatieve spinale implantaatinfectie ontwikkeld en gevalideerd. In de gepresenteerde methode gebruiken we een inoculum van bioluminescente S. aureus Xen36 om een in vivo muismodel van SII op te stellen om de bacteriële belasting longitudinaal te monitoren16,17,18. Dit nieuwe model biedt een waardevol hulpmiddel om potentiële detectie-, preventie- en behandelingsstrategieën voor SII efficiënt te testen voordat ze worden toegepast in grotere diermodellen en klinische onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dieren werden behandeld in strikte overeenstemming met goede dierpraktijken zoals gedefinieerd in de federale regelgeving zoals uiteengezet in de Animal Welfare Act (AWA), de 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, PHS Policy for the Humane Care and Use of Laboratory Animals, evenals het beleid en de procedures van de instelling zoals uiteengezet in de Animal Care and Use Training Manual, en al het dierenwerk werd goedgekeurd door de University of California Los Angeles Chancellor's Animal Research Committee (ARC).

1. Keuze van de bioluminescente soort van S. aureus

  1. Gebruik de bioluminescente S. aureus-stam Xen36 als het entmateriaal van belang.
    OPMERKING: Deze stam is afgeleid van de ouderstam S. aureus ATCC-49525, een klinisch isolaat van een septische patiënt. S. aureus Xen36 maakt op unieke wijze gebruik van een luxABCDE-operon, dat is geoptimaliseerd en geïntegreerd in het oorspronkelijke plasmide van de gastheer. 19 Bijgevolg is de Xen36-stam in staat om een blauwgroen bioluminescent licht te produceren met een piekgolflengte-emissie van 490 nm. Dit emissiesignaal wordt alleen geproduceerd door levende metabolisch actieve bacteriële organismen.

2. Bereiding van S. Aureus voor inenting

  1. Voeg 200 μg/ml kanamycine toe aan Luria Broth plus 1,5% agar om S. aureus Xen36 te isoleren van mogelijke verontreinigingen, gebruikmakend van het kanamycineresistentiegen dat is gekoppeld aan het lux-operon19.
  2. Breng de S. aureus Xen36-bacteriën aan op tryptische soja-agarplaten (tryptische sojabouillon [TSB] plus 1,5% agar) en incubeer ze gedurende 12-16 uur bij 37 °C.
  3. Isoleer enkele kolonies van S. aureus Xen36 en kweek individueel in TSB gedurende 12-16 uur bij 37 °C in een schudincubator (200 rpm).
  4. Verdun de resulterende cultuur in een verhouding van 1:50.
  5. Kweek gedurende nog eens 2 uur bij 37 °C om bacteriën in de midlogaritmische fase te isoleren.
  6. Pelleteer, resuspendeer en was bacteriën drie keer in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  7. Meet de extinctie bij 600 nm. De ideale OD600 ligt tussen 0,700 en 0,750, wat overeenkomt met 4x105 CFU/ml. Voer seriële verdunningen uit om het gewenste bacteriële inoculum (1 x 103 kve/2 μl) te bereiken.
    OPMERKING: De optimale concentratie Xen36 voor het vaststellen van een chronische infectie bleek 1 x 103 CFU te zijn. Een lagere dosering van bacteriën werd opgeruimd door het immuunsysteem van de gastheer en een hogere dosering veroorzaakte wondafbraak. Wondafbraak maakt geen onderscheid tussen een diepe implantaatinfectie en een oppervlakkige wondinfectie en wordt daarom vermeden in dit model (Figuur 1)20.

3. Muizen

  1. Gebruik mannelijke C57BL/6J wildtype muizen van 12 weken oud.
  2. Huismuizen in kooien met maximaal 4 tegelijk.
  3. Zorg ervoor dat er te allen tijde water beschikbaar is. Houd een licht/donker-cyclus van 12 uur aan en experimenteer niet tijdens de donkere fase van de cyclus.
  4. Gebruik luzernevrij voer voor het voeren vanwege mogelijke interferentie met fluorescerende signalering.
  5. Laat onderzoeks- of veterinair personeel dagelijks muizen beoordelen om het welzijn van de dieren gedurende het hele experiment te waarborgen.

4. Chirurgische ingrepen bij muizen

  1. Induceer anesthesie door muizen gedurende ongeveer 5 minuten in een isofluraan (2%) kamer te plaatsen. Bevestig de juiste diepte van de anesthesie door de ademhaling te controleren om ritmisch en langzamer te blijven dan wanneer u wakker bent en niet te veranderen als reactie op schadelijke stimuli (bijv. chirurgische manipulatie, teenknijpen).
  2. Breng verdoofde muizen over naar een voorbereidingsstation en verwijder het haar van het heiligbeen naar de bovenste thoracale wervelkolom met een knaagdiertondeuse.
  3. Reinig en steriliseer de huid met drievoudige wasbeurten van afwisselend betadine-oplossing en isopropylalcohol.
  4. Breng verdoofde en gesteriliseerde muizen in buikligging over naar een steriel chirurgisch bed met behoud van anesthesie met toediening van geïnhaleerd isofluraan (2%) via neuskegel.
  5. Buig de heupen maximaal en identificeer de positie van de knie ter hoogte van de wervelkolom om het lumbale 4 wervellichaam te benaderen.
  6. Maak een longitudinale incisie van 2 cm door de huid met een chirurgisch scalpel met 15 mesjes.
  7. Palpeer de processus spinosus om de middellijn te bevestigen en vervolg de incisie tot op het bot.
  8. Ontleed subperiostaal aan de rechterkant van de processus spinosus L4 en strek zich lateraal uit tot aan de processus transversaal.
  9. Breng een resorbeerbare gevlochten hechtdraad maat 5-0 cephalad en caudad door de fascia naar het L4-lichaam en laat open, ter voorbereiding op toekomstige sluiting.
  10. Gebruik een spinale naald van 25 G om de processus spinosus van L4 uit te roeien met behulp van een spinale naald van 25 G en plaats een 0,1 mm diameter, 1 cm lang "L-vormig" chirurgisch chirurgisch implantaat van roestvrij staal langs de lamina met de lange arm die cephalad legt.
  11. Inoculeer het implantaat met 1 x 103 CFU's/2 μL bioluminescente S. aureus Xen36 en zorg ervoor dat alle oplossingen in contact komen met het implantaat.
  12. Wacht ongeveer 10 seconden voordat u de eerder gepasseerde resorbeerbare hechtdraad na inoculatie vastbindt om ervoor te zorgen dat het inoculum op het implantaat wordt vastgehouden.
  13. Sluit de huid op hardloopwijze met resorbeerbare hechtdraad.
  14. Pijnstillers toedienen via subcutane injectie van buprenorfine (0,1 mg/kg) onmiddellijk na de operatie en daarna elke 12 uur gedurende 3 dagen.
  15. Herstel muizen op een verwarmingskussen en controleer of ze terugkeren naar de normale activiteit.
  16. Verkrijg postoperatieve röntgenfoto's om de juiste plaatsing van het implantaat te bevestigen.

5. Longitudinale In vivo bioluminescentie beeldvorming om bacteriële belasting te meten

  1. Verdoof muizen met geïnhaleerde isofluraan (2%). Bevestig de juiste diepte van de anesthesie door de ademhaling te controleren om ritmisch en langzamer te blijven dan wanneer u wakker bent en niet te veranderen als reactie op schadelijke stimuli (bijv. chirurgische manipulatie, teenknijpen).
  2. Verwijder het haar van het heiligbeen tot de bovenste thoracale wervelkolom met een knaagdiertondeuse.
  3. Laad muizen in het gezichtsveld van het bioluminescente beeldvormingsplatform om in vivo bioluminescentiebeeldvorming (BLI) uit te voeren19.
  4. Leg een bioluminescent signaal vast gedurende een acquisitietijd van 5 minuten. Gebruik grote binning-instellingen met een gezichtsveld van 15 cm (B).
  5. Herhaal stap 5.1-5.4 op postoperatieve dagen 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 en 35 (of andere dagen op basis van een specifiek experimenteel ontwerp) om de bacteriële belasting te controleren.
  6. Presenteer BLI-gegevens via kleurenschaal en overlay op een grijswaardenfoto. Isoleer een standaard eivormig interessegebied (ROI) met behulp van BLI-software om BLI te kwantificeren in totale flux (fotonen per seconde) of gemiddelde maximale flux (fotonen/seconde/centimeter2/steradiaal).

6. Kwantificeer bacteriën die zich hechten aan implantaten en omringend weefsel

  1. Euthanaseer muizen op POD 35 of een alternatieve postoperatieve datum naar keuze met blootstelling aan kooldioxide in overeenstemming met de AVMA-richtlijnen. Bevestig euthanasie met secundaire cervicale dislocatie.
  2. Steriliseer de dorsale huid volgens stap 4.3 en plaats de muis liggend op een steriel operatieveld.
  3. Snijd de vorige incisie scherp in met een chirurgisch scalpel met 15 mesjes.
  4. Gebruik een steriele schaar om het processus spinosus L4 botweg te ontleden en het chirurgische implantaat te identificeren.
  5. Gebruik een schroevendraaier om het implantaat voorzichtig te draaien en te verwijderen uit zijn positie in het L4-processus spinosus.
  6. Oogst met een steriele pincet en schaar ongeveer 0,1 g processus spinosus bot en zacht weefsel direct rond het chirurgische implantaat en plaats het in 1 ml PBS in een kleine conische neushoornbuis met 4 scherpe homogeniserende parels.
  7. Registreer het gewicht van zacht weefsel door de conische buis voor en na de oogst te wegen.
  8. Plaats het implantaat in 0,5 ml 0,3% Tween-80 in TSB en sonicaat gedurende 15 minuten.
  9. Vortex de resulterende implantaatsuspensie gedurende 2 minuten en kweek een nacht gedurende 12-16 uur.
  10. Homogeniseer de processen van zacht weefsel en doornuitsteeksel die eerder in 1 ml PBS rond het implantaat zijn geplaatst met behulp van een homogenisator.
  11. Vortex de resulterende suspensie van zacht weefsel gedurende 5 minuten en kweek een nacht gedurende 12-16 uur.
  12. Tel na een nachtelijke kweek de CFU van respectievelijk het implantaat en de omliggende weefsels. Druk de waarde uit als totale geoogste kve/g voor zacht weefsel en kve/ml voor een sonisch implantaat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De hier gepresenteerde procedure werd gebruikt om de werkzaamheid van antibioticaregimes te beoordelen in een in vivo muismodel van SII. In het bijzonder werd de werkzaamheid van combinatietherapie met vancomycine- en rifampicine-antibiotica vergeleken met monotherapie met vancomycine en onbehandelde geïnfecteerde controles.

Voorafgaand aan de operatie werden muizen gerandomiseerd naar combinatietherapie, monotherapie of geïnfecteerde controle. Er werd een statistische poweranalyse uitgevoerd om de steekproefomvang te berekenen. Verwachte gemiddelden van gemiddelde maximale flux 1 x 10 5 ± 3,2 x 10 4 en1,4 x 105 werden gebruikt om de steekproefomvang te bepalen, die in elke groep werden berekend als N=10. Muizen ondergingen chirurgische implantatie, inoculatie met S. aureus Xen36 en werden gemeten voor in vivo S. aureus-bioluminescentie op POD 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 en 35. Op POD 35 werden muizen opgeofferd en werden CFU's voor implantaat-hechtende en omringende weefselbacteriën gekwantificeerd.

Muizen in de monotherapiegroep kregen een therapeutische dosis vancomycine (110 mg/kg tweemaal daags) subcutaan toegediend. Deze dosis werd gekozen om het gebied onder de curve te benaderen voor typische menselijke blootstelling aan vancomycine21,22,23. Muizen in de combinatietherapiegroep kregen een therapeutische subcutane dosis vancomycine (110 mg/kg tweemaal daags) en rifampicine (25 mg/kg per dag)24. Muizen in de geïnfecteerde controlegroep kregen schijninjecties met steriele zoutoplossing. De behandeling voor alle groepen werd uitgevoerd van postoperatieve dag 7 tot 14.

Effect van antibioticatherapie op BLI
Geïnfecteerde controlemuizen hadden BLI-signalen die piekten op POD 10 en die boven 1,0 x 105 fotonen/s/cm 2/sr bleven tot ze werden opgeofferd, waarbij met succes een chronische SII werd gemodelleerd (Figuur 2). Muizen die werden behandeld met vancomycine-monotherapie hadden een significant lager BLI-signaal in vergelijking met de geïnfecteerde controlegroep, met een 2-voudige reductie van POD 10-21 (p<0,03). Na POD 21 was er geen significant verschil in BLI tussen monotherapie en geïnfecteerde controlegroepen. Muizen die werden behandeld met vancomycine-rifampicine combinatietherapie hadden een nog lager BLI-signaal, dat 20 keer lager was dan de geïnfecteerde controle op POD 10. Een significante reductie hield aan tot POD 28 (p<0,01). Na POD 28 was er geen significant verschil in BLI tussen groepen. Er was geen significant verschil in BLI tussen een van de drie groepen bij de uiteindelijke beeldvorming op POD35.

CFU's van implantaten en omringend weefsel
Muizen werden geofferd op POD 35. Implantaten en omringend weefsel werden geoogst en verwerkt voor het tellen van CFU's (Figuur 3). Er werd geen significant verschil waargenomen in CFU's tussen geïnfecteerde controle-, monotherapie- of combinatietherapiegroepen.

Figure 1
Figuur 1: Wondafbraak in hoge dosis S. aureus Xen36 inoculum. Beelden van de dorsale huid van muizen die zijn ingeënt met S. aureus Xen36 tijdens een infectie met een wervelkolomimplantaat. (A) Muis geënt met 1 x 103 kve's en intacte dorsale huid. (B) Muis ingeënt met 1 x 104 CFU's, en tekenen van aanzienlijke wondafbraak. Figuur aangepast en herdrukt met toestemming van Dworsky et al.25Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Meting van bacteriële belasting met behulp van in vivo bioluminescentie. 1 x 103 kve van S. aureus met het bioluminescente construct in een stabiel plasmide (Xen36) werden geïnoculeerd in de processus spinosus L4 van muizen (n = 10 muizen per groep) in aanwezigheid van een roestvrijstalen implantaat. (A) Bacterietellingen zoals gemeten met in vivo S. aureus-bioluminescentie (gemiddelde maximale flux [fotonen/s/cm2/sr] ± sem [logaritmische schaal]), met een stroomdiagram van het experimentele protocol hieronder. Op POD 7 begon de toediening van antibiotica met vancomycine, een combinatie van vancomycine en rifampicine of een steriele zoutoplossing. De toediening van antibiotica werd stopgezet op POD 14. Op POD 35 werden muizen opgeofferd en CFU's van het implantaat en het omliggende weefsel gemeten. (B) Representatieve in vivo S. aureus bioluminescentie op een kleurenschaal bovenop een grijswaardenafbeelding van muizen. Figuur aangepast en herdrukt met toestemming van Hu et al.25Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Bevestiging van bacteriële belasting met behulp van CFU-tellingen. Bij POD 35 werden muizen geofferd, pinnen gesoniseerd, weefsel gehomogeniseerd en bacteriën gekweekt en geteld. Figuur aangepast en herdrukt met toestemming van Hu et al.25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Implantaatgerelateerde infecties in de wervelkolom voorspellen slechte resultaten voor patiënten 1,2,3,4,5. In tegenstelling tot veel andere delen van het lichaam, kan geïnfecteerde hardware in de wervelkolom vaak niet worden verwijderd vanwege het risico op instabiliteit en neurologische compromittering. Deze unieke uitdaging in de setting van biofilmbacteriën die resistent zijn tegen systemische antibioticatherapie vereisen nieuwe benaderingen van de behandeling12. Eerder onderzoek naar nieuwe behandelingen voor SII werd beperkt door dure, inefficiënte diermodellen. Om deze infecties beter te bestuderen en de werkzaamheid van potentiële behandelingen efficiënt te beoordelen, hebben we een niet-invasief longitudinaal muismodel van SII ontwikkeld met behulp van in vivo bioluminescentiebeeldvorming.

Eerdere diermodellen van geïnstrumenteerde wervelkolominfectie vereisten ex vivo weefselanalyse om de resultaten te evalueren, waarvoor grote cohorten nodig waren en waren niet in staat om de infectie in de loop van de tijd te volgen13,14,26. Het muismodel van SII dat in dit artikel wordt gepresenteerd, maakt daarentegen gebruik van BLI om de bacteriële belasting in de loop van de tijd betrouwbaar te bewaken16,17,18. Deze nieuwe aanpak stelt onderzoekers in staat om de reactie van bacteriën en de gastheer op antibiotica, coatings of immuunmodulatie te beoordelen.

Kritieke stappen in het protocol zijn onder meer: juiste bereiding van Xen36 S. aureus en schatting van enkelvoudig inoculum 1 x 103 kve's/2 μL; nauwkeurige chirurgische implantatie, inoculatie en sluiting; in vivo bioluminescente beeldvorming; en bevestiging van bacteriële belasting met behulp van CFU-tellingen.

Wijzigingen in het model kunnen bestaan uit alternatieve bioluminescente bacteriestammen, tijdstippen op langere termijn of het gebruik van integratie van andere soorten genetisch gemanipuleerde muizen, zoals muizen die groen fluorescerend eiwit tot expressie brengen in myeloïde cellen (Lys-EGFP) om gelijktijdig neutrofieleninfiltratie te meten met in vivo fluorescentiebeeldvorming20. Aanvullende methodologieën kunnen worden gebruikt als aanvulling op de methodologieën die in het protocol worden beschreven om processen zoals vertebrale osteolyse, schijfdegeneratie, infectie van zacht weefsel en implantaatbiofilminfectie aan te pakken. Technieken die kwantitatieve resultaten opleveren in deze processen kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot: microcomputertomografie, magnetische resonantiebeeldvorming, real-time kwantitatieve PCR, serologie, histologie, immunohistochemie en/of elektronenmicroscopie met variabele drukscanning.

Dit model heeft verschillende beperkingen. Ten eerste is het model van wervelkolomchirurgie een grove vereenvoudiging in vergelijking met de klinische praktijk. In tegenstelling tot uitgebreide decompressie- en fusieoperaties op meerdere niveaus die typisch zijn voor patiënten met een hoog risico op wervelkolomchirurgie, omvat de modelchirurgie minimale botresectie met een enkel roestvrijstalen implantaat. Aangezien klinische wervelkolomimplantaten meerdere verschillende materialen hebben, kunnen deze verschillende vatbaarheden hebben voor bacteriële infectie en biofilmvorming. Bovendien is, zoals bij alle diermodellen, de reactie van de gastheer op infectie van muizen anders dan die van mensen.

In de toekomst zou dit model kunnen worden gebruikt om de behandeling van SII te beoordelen met andere modaliteiten voor de toediening van antibiotica, waaronder vancomycinepoeder, met antibiotica geladen kralen of gecoate implantaten. Bovendien kan dit model worden gebruikt om de mechanistische basis van de gastheerrespons op SII te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Acknowledgments

De auteurs willen graag de ontvangst erkennen van zowel de Pediatric Orthopaedic Society of North America Biomet Spine Grant als de National Institutes of Health Clinical and Translational Science Institute KL2 Grant, en de HH Lee Surgical Research Grant als belangrijke financieringsbronnen voor deze experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance ME104 Mettler Toledo 30029067 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth Becton Dickinson (BD) BD 211825 BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer Thermo Scientific 840-208300 Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor Thermo Scientific 75003183 Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator) Branson Ultrasonics CPX952217R *similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer Next Advance BBY24M The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500 Electron Microscopy Sciences 66118-10 The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be
used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for
traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine
sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been
designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 51026282 Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System Perkin Elmer CLS148590 The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker Thermo Scientific SHKE4450 Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline Fisher Bioreagents BP24384 PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated Thermo Scientific 75002436 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge Thermo Scientific 75004261 Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36 Perkin Elmer 119243 Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V Heidolph Tuttnauer 23210401 Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80 Fisher Bioreagents BP338-500 Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200 Labnet Internation S0200 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride Pfizer Injectables/Hospira 00409-4888-10 0.9% Sodium Chloride Injection, USP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of neutrophils in experimental septicemia and septic arthritis induced by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 65 (7), 2517-2521 (1997).
  2. Fang, A., Hu, S. S., Endres, N., Bradford, D. S. Risk factors for infection after spinal surgery. Spine. 30 (12), Phila Pa. 1460-1465 (2005).
  3. Levi, A. D., Dickman, C. A., Sonntag, V. K. Management of postoperative infections after spinal instrumentation. Journal of Neurosurgery. 86 (6), 975-980 (1997).
  4. Weinstein, M. A., McCabe, J. P., Cammisa, F. P. Postoperative spinal wound infection: a review of 2,391 consecutive index procedures. Journal of Spinal Disorders. 13 (5), 422-426 (2000).
  5. Picada, R., et al. Postoperative deep wound infection in adults after posterior lumbosacral spine fusion with instrumentation: incidence and management. Journal of Spinal Disorders. 13 (1), 42-45 (2000).
  6. Smith, J. S., et al. Rates of infection after spine surgery based on 108,419 procedures: a report from the Scoliosis Research Society Morbidity and Mortality Committee. Spine. 36 (7), Phila Pa. 556-563 (2011).
  7. Abbey, D. M., Turner, D. M., Warson, J. S., Wirt, T. C., Scalley, R. D. Treatment of postoperative wound infections following spinal fusion with instrumentation. Journal of Spinal Disorders. 8 (4), 278-283 (1995).
  8. Silber, J. S., et al. Management of postprocedural discitis. Spine Journal. 2 (4), 279-287 (2002).
  9. Pappou, I. P., Papadopoulos, E. C., Sama, A. A., Girardi, F. P., Cammisa, F. P. Postoperative infections in interbody fusion for degenerative spinal disease. Clinical Orthopaedics and Related Research. 444, 120-128 (2006).
  10. Sampedro, M. F., et al. A biofilm approach to detect bacteria on removed spinal implants. Spine. 35 (12), Phila Pa. 1218-1224 (2010).
  11. Pull ter Gunne, A. F., Mohamed, A. S., Skolasky, R. L., van Laarhoven, C. J., Cohen, D. B. The presentation, incidence, etiology, and treatment of surgical site infections after spinal surgery. Spine. 35 (13), Phila Pa. 1323-1328 (2010).
  12. Olsen, M. A., et al. Risk factors for surgical site infection in spinal surgery. Journal of Neurosurgery. 98, 2 Suppl 149-155 (2003).
  13. Ofluoglu, E. A., et al. Implant-related infection model in rat spine. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 127 (5), 391-396 (2007).
  14. Guiboux, J. P., et al. The role of prophylactic antibiotics in spinal instrumentation. A rabbit model. Spine. 23 (6), Phila Pa. 653-656 (1998).
  15. Stavrakis, A. I., et al. Current Animal Models of Postoperative Spine Infection and Potential Future Advances. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 34 (2015).
  16. Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection: noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. Journal of Orthopaedic Research. 30 (3), 335-340 (2012).
  17. Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS One. 5 (9), 12580 (2010).
  18. Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and muCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS One. 7 (10), 47397 (2012).
  19. Francis, K. P., et al. Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct. Infection and Immunity. 68 (6), 3594-3600 (2000).
  20. Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
  21. Hegde, S. S., et al. Activity of telavancin against heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) in vitro and in an in vivo mouse model of bacteraemia. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 65 (4), 725-728 (2010).
  22. Crandon, J. L., Kuti, J. L., Nicolau, D. P. Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 5115-5119 (2010).
  23. Reyes, N., et al. Efficacy of telavancin in a murine model of bacteraemia induced by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 58 (2), 462-465 (2006).
  24. Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Alder, J., Eliopoulos, C. T. Efficacy of daptomycin in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (5), 1714-1718 (2003).
  25. Hu, Y., et al. Combinatory antibiotic therapy increases rate of bacterial kill but not final outcome in a novel mouse model of Staphylococcus aureus spinal implant infection. PLoS One. 12 (2), 0173019 (2017).
  26. Poelstra, K. A., Barekzi, N. A., Grainger, D. W., Gristina, A. G., Schuler, T. C. A novel spinal implant infection model in rabbits. Spine. 25 (4), Phila Pa. 406-410 (2000).

Tags

Spinale implantaatinfectie Muismodel In vivo Therapieën Behandelingsstrategieën Spinale chirurgie met posterieure benadering Bioluminescente stam Staphylococcus Aureus Xen36-bacteriën Bioluminescentiebeeldvorming Bacteriële belasting Peri-implantair weefsel Kolonievormende eenheden (CFU's) Diermodellen

Erratum

Formal Correction: Erratum: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection
Posted by JoVE Editors on 05/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. The Authors section was updated from:

Benjamin V. Kelley1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

to:

Benjamin V. Kelley1
Christopher Hamad1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Zeinab Mamouei1
Rene Chun1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Brandon Gettleman3
Autreen Golzar2
Adrian Lin2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles
3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

In vivo muismodel van spinale implantaatinfectie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. … More

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. D., Greig, D., Mamouei, Z., Chun, R., Hori, K., Cevallos, N., Ishmael, C., Hsiue, P., Trikha, R., Sekimura, T., Gettleman, B., Golzar, A., Lin, A., Olson, T., Chaudry, A., Le, M. M., Scaduto, A. A., Francis, K. P., Bernthal, N. M. In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. J. Vis. Exp. (160), e60560, doi:10.3791/60560 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter