脊椎インプラント感染のin vivoマウスモデル

Summary

プロトコルはステンレス鋼kワイヤー インプラントが生物発光黄色 ブドウ球 菌Xen36と感染する脊髄インプラント伝染の新しい生体内のマウス モデルを記述する。細菌負荷は、生物発光イメージングで縦断的に監視され、安楽死後のコロニー形成ユニット数で確認されます。

Abstract

脊椎インプラント感染症は、診断が困難であり、外科的根絶が機械的脊椎の安定性と相反するため、予後不良の前兆です。この方法の目的は、脊椎インプラント感染症の潜在的な治療法と治療戦略をテストするための安価で迅速、かつ正確なin vivoツールを提供するために作成された脊椎インプラント感染症(SII)の新しいマウスモデルを説明することです。

この方法では、12週齢のC57BL/6J野生型マウスのL4棘突起にステンレス鋼のkワイヤーを固定し、黄色ブドウ球菌Xen36細菌の生物発光株の1 x 10³ CFUを接種する後方アプローチ脊椎手術のモデルを提示します。次に、マウスを術後0、1、3、5、7、10、14、18、21、25、28、および35日目のin vivoで生物発光について縦断的に画像化します。標準化された視野からの生物発光イメージング(BLI)信号を定量化して、in vivoの細菌負荷を測定します。

インプラントやインプラント周囲組織に付着した細菌を定量するために、マウスを安楽死させ、インプラントや周囲の軟部組織を採取します。バクテリアは超音波処理によってインプラントから分離され、一晩培養され、次にコロニー形成単位(CFU)がカウントされます。この方法から得られた結果には、in vivo 黄色ブドウ球菌 の生物発光によって測定された縦断的細菌数(平均最大フラックス)と安楽死後のCFU数が含まれます。

これまでの脊椎感染症の動物モデルには、侵襲的なex vivo組織分析が含まれていましたが、この論文で紹介するSIIのマウスモデルは、生物発光細菌の非侵襲的でリアルタイムのin vivo光学イメージングを活用して、静的組織研究に取って代わります。このモデルの用途は多岐にわたり、代替の生物発光細菌株の利用、宿主の免疫応答を同時に研究するための他の種類の遺伝子改変マウスの組み込み、抗生物質やインプラントコーティングなどの新しい診断および治療モダリティの現在または調査が含まれます。

Introduction

この方法の目的は、脊椎インプラント感染症(SII)の新しいマウスモデルを記述することです。このモデルは、in vivoで宿主、病原体、および/またはインプラント変数の影響を柔軟に評価するための安価で正確なツールを提供するように設計されています。このモデルで脊椎インプラント感染症の潜在的な治療法と治療戦略をテストすることは、より大きな動物モデルや臨床試験に適用する前に研究開発を導くことを目的としています。

脊椎手術後のインプラント関連の感染症は壊滅的な合併症であり、残念ながら、選択的脊椎手術を受けている患者の約3〜8%に発生します1,2,3,4,5およびマルチレベルまたは^{再手術を受けている}患者の最大65%6。脊椎インプラント感染症の治療には、多くの場合、複数回の入院、複数回の手術、および長期の抗生物質療法が必要です。SIIは、神経学的障害、障害、死亡リスクの増加など、患者の転帰不良の前兆です。SIIの管理は非常に費用がかかり^、患者1人あたり90万ドル以上の費用がかかります7。

黄色ブドウ球菌は、SII 8,9,10,11の最も一般的な病原体です。細菌は、手術中に直接、術後の傷口から、または後に血行性の広がりを介してハードウェアに種をまく可能性があります。金属インプラントの存在下で、黄色ブドウ球菌は抗生物質療法や免疫細胞から細菌を保護するバイオフィルムを形成します。感染したハードウェアの除去は、感染を効果的に根絶するのに役立つ可能性がありますが、これは、不安定化を引き起こし、神経学的障害のリスクを冒さずに脊椎で実行できないことがよくあります¹²。

感染したハードウェアを摘出できない場合、SIIを予防、検出、治療するための新しいアプローチが必要です。歴史的に、新しい治療法の安全性と有効性を効率的に評価するためのSIIの動物モデルは限られていました。SIIの以前の動物モデルでは、多数の動物と、コロニーカウント、組織学、培養など、安楽死を必要とするデータポイントの収集が必要でした13,14,15。これらのモデルは、縦断的なin vivoモニタリングを欠いているため、1匹の動物につき1つのデータポイントしか提供しないため、高価で非効率的です。

人工膝関節置換術感染のマウスモデルを研究した以前の研究では、感染負荷を縦断的に監視するための非侵襲的in vivo光学イメージングの価値と精度が確立されました¹⁶。生物発光の検出により、1匹の動物の細菌負荷を縦断的に、人道的、正確、効率的に定量化することができます。さらに、以前の研究では、in vivo生物発光とインプラントに接着したCFUとの間に高い相関関係があることが実証されています¹⁷。感染を経時的に追跡する能力は、インプラント関連の感染のより微妙な理解につながりました。さらに、このように縦断的感染を監視することで、抗生物質療法と新規抗菌薬の有効性を正確に評価できるようになりました16,17,18。

これらのツールを活用して、術後の脊椎インプラント感染のモデルを開発し、検証しました。提示された方法では、生物発光黄色ブドウ球菌Xen36の接種物を利用して、細菌負荷を縦断的に監視するためのSIIのin vivoマウスモデルを確立します16,17,18。この新しいモデルは、より大きな動物モデルや臨床試験に適用する前に、SIIの潜在的な検出、予防、および治療戦略を効率的にテストするための貴重なツールを提供します。

Protocol

すべての動物は、動物福祉法(AWA)、1996年の実験動物のケアと使用に関するガイド、実験動物の人道的なケアと使用に関するPHSポリシー、および動物の飼育と使用に関するトレーニングマニュアルに記載されている機関の方針と手順に規定されている連邦規制に定義されている適正動物慣行に厳密に従って取り扱われました。 また、すべての動物実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物研究委員会(ARC)によって承認されました。

1. 黄色ブドウ球菌 の生物発光株の選択

1. 生物発光 黄色ブドウ球菌 Xen36株を目的の接種物として使用します。
   注:この株は、敗血症患者からの臨床分離株である親株黄色 ブドウ球菌 ATCC-49525に由来しました。 黄色ブドウ球菌 Xen36は、最適化され、宿主のネイティブプラスミドに組み込まれた ルクスABCDEオペロンを独自に利用しています。¹⁹ その結果、Xen36株は、ピーク波長発光が490nmの青緑色の生物発光光を生成することができる。この発光シグナルは、生きている代謝活性細菌によってのみ生成されます。

2. S.の準備接種のための黄色ブドウ球菌

1. ルリアブロスに200 μg/mLのカナマイシンと1.5%寒天を加えて、ルクスオペロンに結合したカナマイシン耐性遺伝子を利用して、黄色ブドウ球菌Xen36を潜在的な汚染物質から単離します¹⁹。
2. 黄色 ブドウ球菌 Xen36細菌をトリプシン大豆寒天プレート(トリプシン大豆ブロス[TSB]と1.5%寒天培地)にストリークし、37°Cで12〜16時間インキュベートします。
3. 黄色ブドウ球菌Xen36の単一コロニーを単離し、振とうインキュベーター(200rpm)で37°Cで12〜16時間TSBで個別に培養します。
4. 得られた培養液を1:50の比率で希釈します。
5. 37°Cでさらに2時間培養し、中対数期の細菌を単離します。
6. ペレット化、再懸濁、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でのバクテリアの洗浄を3回行います。
7. 600nmでの吸光度を測定します。理想的なOD600は0.700〜0.750で、これは4x10⁵ CFU/mLに相当します。段階希釈を行い、目的の細菌接種(1 x 10³ CFU/2 μL)を達成します。
   注:慢性感染症の確立のためのXen36の最適濃度は、1 x 10³ CFUであることがわかりました。バクテリアの投与量が少ないと宿主の免疫系によって除去され、投与量が多いと創傷破壊を引き起こしました。創傷の破壊は、深部インプラント感染と表在性創傷感染を区別しないため、このモデルでは回避されます(図1)²⁰。

3.マウス

1. 12週齢の雄のC57BL/6J野生型マウスを使用。
2. ハツカネズミを一度に最大4匹のケージに入れます。
3. 常に水を利用できるようにしてください。12時間の明暗サイクルを維持し、サイクルの暗期には実験を行わないでください。
4. 給餌にはアルファルファを含まないチャウを使用し、蛍光シグナル伝達に干渉する可能性があるため、給餌に使用してください。
5. 研究スタッフまたは獣医スタッフにマウスを毎日評価してもらい、実験全体を通してマウスの健康状態を確保します。

4. マウスの外科的処置

1. マウスをイソフルラン(2%)チャンバーに約5分間入れて麻酔を誘発します。呼吸が覚醒時よりもリズミカルでゆっくりと保たれ、有害な刺激(外科的操作、つま先のつまみなど)に反応して変化しないように呼吸を監視することにより、適切な麻酔深度を確認します。
2. 麻酔をかけたマウスを調製ステーションに移し、げっ歯類のバリカンで仙骨から上部胸椎までの毛を取り除きます。
3. ベタジン溶液とイソプロピルアルコールを交互に3回洗浄して皮膚を洗浄および滅菌します。
4. 腹臥位で麻酔および滅菌したマウスを、鼻錐形を介して吸入イソフルラン(2%)を投与して麻酔を維持した無菌手術用ベッドに移します。
5. 腰を最大限に曲げ、脊椎の高さで膝の位置を特定して、腰椎4椎体に近づけます。
6. 15枚刃の外科用メスで皮膚を縦方向に2cm切開します。
7. 棘突起を触診して正中線を確認し、骨まで切開を続けます。
8. L4棘突起の右側を骨膜下的に解剖し、横突起まで横方向に伸ばします。
9. 吸収性の編組縫合糸サイズ5-0のセファラッドとコーダッドを筋膜を通してL4ボディに通し、将来の閉鎖に備えて開いたままにします。
10. 25Gの脊椎針を使用して、25Gの脊椎針を使用してL4の棘突起をリームし、長い腕の産卵頭を持つ椎弓に沿って直径0.1mm、長さ1cmの「L字型」の外科用グレードのステンレス鋼インプラントを挿入します。
11. 1 x 10³ CFU/2 μLの生物発光 黄色ブドウ球菌 Xen36をインプラントに接種し、すべての溶液がインプラントに接触するように注意します。
12. 約10秒待ってから、接種後に以前に通過した吸収性縫合糸を結び、インプラントに接種物を確実に封じ込めます。
13. 吸収性縫合糸でランニングファッションで肌を閉じます。
14. ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)の皮下注射により鎮痛剤を直ちに投与し、その後3日間は12時間ごとに投与します。
15. 加熱パッドでマウスを回収し、通常の活動に戻るのを監視します。
16. 術後のX線写真を入手して、インプラントの適切な配置を確認します。

5. 細菌量測定のための縦断的生体内生物発光イメージング

1. マウスに吸入イソフルラン(2%)を麻酔する。呼吸が覚醒時よりもリズミカルでゆっくりと保たれ、有害な刺激(外科的操作、つま先のつまみなど)に反応して変化しないように呼吸を監視することにより、適切な麻酔深度を確認します。
2. げっ歯類のバリカンで仙骨から胸椎の上部まで毛を取り除きます。
3. マウスを生物発光イメージングプラットフォームの視野にロードして、in vivo生物発光イメージング(BLI)^{を実行します19}。
4. 5分間の取得時間で生物発光シグナルを捕捉します。視野角15cm(B)の大きなビニング設定を利用します。
5. 術後0、1、3、5、7、10、14、18、21、25、28、および35日目(または特定の実験デザインに基づく他の日)に手順5.1〜5.4を繰り返して、細菌負荷を監視します。
6. BLIデータをカラースケールで表示し、グレースケール写真に重ね合わせます。BLIソフトウェアを使用して標準的な卵形関心領域(ROI)を分離し、総フラックス(フォトン/秒)または平均最大フラックス(フォトン/秒/センチメートル²/ステラジアン)のBLIを定量化します。

6. インプラントや周辺組織に付着した細菌の定量化

1. AVMAガイドラインに従って、POD 35または選択した代替の術後日でマウスを安楽死させます。二次性子宮頸部脱臼を伴う安楽死を確認します。
2. ステップ4.3に従って背側皮膚を滅菌し、マウスを無菌手術野にうつ伏せにします。
3. 15枚刃の外科用メスを使用して、前の切開部を鋭く切開します。
4. 滅菌ハサミを使用して、L4棘突起を鈍く解剖し、外科的インプラントを特定します。
5. ニードルドライバーを使用して、インプラントを静かにひねり、L4棘突起の位置から取り外します。
6. 滅菌鉗子とハサミを使用して、外科用インプラントのすぐ周囲の約0.1 gの棘突起骨と軟部組織を採取し、4つの鋭い均質化ビーズを備えた小さな円錐形のサイチューブに1 mLのPBSを入れます。
7. 収穫前と収穫後に円錐形チューブを計量することにより、軟部組織の重量を記録します。
8. インプラントを0.5 mLの0.3% Tween-80 in TSBに入れ、15分間超音波処理します。
9. 得られたインプラント懸濁液を2分間ボルテックスし、12〜16時間一晩培養します。
10. ホモジナイザーを使用して、インプラントを囲む 1 ml PBS に以前に配置した軟部組織と有棘突起を均質化します。
11. 得られた軟部組織懸濁液を5分間ボルテックスし、12〜16時間一晩培養します。
12. 一晩培養した後、インプラントと周囲の組織からCFUをそれぞれカウントします。軟部組織では収穫された総CFU/g、超音波処理されたインプラントではCFU/mLとして値を表現します。

Representative Results

ここで紹介する手順は、SIIのin vivoマウスモデルにおける抗生物質レジメンの有効性を評価するために使用されました。具体的には、バンコマイシンとリファンピンの併用抗生物質療法の有効性を、バンコマイシン単剤療法および未治療の感染対照と比較した。

手術に先立ち、マウスは併用療法、単剤療法、または感染対照のいずれかに無作為に割り付けられた。サンプルサイズを計算するために統計的検出力分析を実行しました。平均最大フラックス 1 x 10 5 ± 3.2 x 10 4 および^1.4 x 10⁵ の予想平均を使用してサンプル サイズを決定し、各グループで N=10 として計算しました。マウスを外科的移植し、黄色ブドウ球菌Xen36を接種し、POD 0、1、3、5、7、10、14、18、21、25、28、および35のin vivo黄色ブドウ球菌生物発光を測定した。POD 35では、マウスを屠殺し、インプラント接着性および周辺組織細菌のCFUを定量した。

単剤療法群のマウスは、治療用量のバンコマイシン(110 mg / kgを1日2回)皮下投与されました。.この用量は、バンコマイシン^21、22、23の典型的なヒト曝露の曲線下面積を近似するように選択されました。.併用療法群のマウスは、バンコマイシン(110 mg/kgを1日2回)とリファンピン(25 mg/kgを1日2回)の皮下投与を受けました²⁴。感染した対照群のマウスは、滅菌生理食塩水の偽注射を受けました。すべてのグループの治療は、術後7日目から14日目まで行われました。

BLIに対する抗生物質療法の効果
感染した対照マウスのBLIシグナルはPOD 10でピークに達し、犠牲になるまで1.0 x 10⁵光子/s/cm 2/sr以上にとどまり、慢性SIIのモデル化に成功しました(図2)。バンコマイシン単剤療法で治療されたマウスは、感染した対照と比較してBLIシグナルが有意に低く、POD 10-21から2倍減少しました(p<0.03)。POD 21後、単剤療法群と感染対照群の間でBLIに有意差は認められなかった。バンコマイシンとリファンピンの併用療法で治療されたマウスは、POD10の感染対照よりもBLIシグナルがさらに低く、20倍低かった。有意な減少はPOD 28(p<0.01)まで持続した。POD 28後、群間のBLIに有意差は認められなかった。POD35での最終画像診断では、3群のいずれにもBLIに有意差は認められなかった。

インプラントおよび周辺組織からのCFU
マウスはPOD 35で犠牲にされた。インプラントと周囲の組織を採取し、CFUカウントのために処理しました(図3)。CFUでは、感染対照群、単剤療法群、または併用療法群の間で有意差は認められなかった。

図1:高用量黄色ブドウ球菌Xen36接種の創傷破壊。脊椎インプラント感染時に黄色ブドウ球菌Xen36を接種したマウスの背側皮膚の画像。(A)1 x 10³ CFUを接種したマウスで、背側の皮膚は無傷。(B)マウスに1 x 10⁴ CFUを接種し、かなりの創傷破壊の証拠。図はDworsky et ^al.25の許可を得て改載・転載 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:in vivo生物発光を用いた細菌負荷の測定。 安定したプラスミド(Xen36)に生物発光コンストラクトを有する黄色ブドウ球菌の1 x 10³ CFUを、ステンレス鋼インプラントの存在下でマウス(グループあたりn = 10匹のマウス)のL4棘突起に接種しました。(A)in vivo 黄色ブドウ球菌の生物発光(平均最大フラックス[光子/s/cm2/sr]±SEM[対数スケール])で測定した細菌数と、以下の実験プロトコルのフロー図。POD 7では、抗生物質の投与は、バンコマイシン、バンコマイシンとリファンピンの組み合わせ、または滅菌生理食塩水コントロールで開始されました。抗生物質投与はPOD14で中止された。POD 35では、マウスを屠殺し、インプラントおよび周囲の組織からのCFUを測定した。(B)マウスのグレースケール画像の上に重ね合わせたカラースケール上の代表的なin vivo黄色ブドウ球菌の生物発光。図はHu et ^al.25の許可を得て改載したものです。

図3:CFUカウントを用いた細菌量の確認。 POD 35では、マウスを屠殺し、ピンを超音波処理し、組織をホモジナイズし、細菌を培養してカウントした。図はHu et ^al.25の許可を得て翻案し、転載したものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Discussion

脊椎のインプラント関連の感染症は^{、患者の転}帰不良の前兆です1,2,3,4,5。体内の他の多くの領域とは異なり、脊椎の感染したハードウェアは、不安定性や神経学的障害のリスクがあるため、取り除くことができないことがよくあります。全身抗生物質療法に耐性のあるバイオフィルム細菌の設定におけるこのユニークな課題には、治療への新しいアプローチが必要です¹²。SIIの新しい治療法に関するこれまでの研究は、高価で非効率的な動物モデルによって制限されてきました。これらの感染症をよりよく研究し、潜在的な治療法の有効性を効率的に評価するために、in vivo生物発光イメージングを使用して、SIIの非侵襲的縦断マウスモデルを開発しました。

器具による脊椎感染症の以前の動物モデルでは、結果を評価するためにex vivo組織分析が必要であり、大規模なコホートが必要であり、感染を経時的に監視することはできませんでした13,14,26。対照的に、この論文で提示されたSIIのマウスモデルは、BLIを利用して、経時的な細菌負荷を確実に監視します16,17,18。この新しいアプローチにより、研究者は抗生物質、コーティング、または免疫調節に対する細菌と宿主の反応を評価することができます。

プロトコルの重要なステップには、Xen36 S. aureus の適切な調製と単一接種の推定が含まれます 1 x 10³ CFU/2 μL;正確な外科的移植、接種、および閉鎖。in vivo生物発光イメージング;CFUカウントを使用した細菌負荷の確認。

モデルへの修正には、代替の生物発光細菌株、より長期的な時点、または好中球浸潤をin vivo蛍光イメージングと同時に測定するための骨髄細胞で緑色蛍光タンパク質を発現するマウス(Lys-EGFP)などの他のタイプの遺伝子改変マウスの統合の使用が含まれる場合があります²⁰.追加の方法論は、脊椎骨溶解、椎間板変性、軟部組織感染、およびインプラントバイオフィルム感染などのプロセスに対処するために、プロトコルに記載されているものを補完するために利用され得る。これらのプロセスで定量的結果を提供する技術には、マイクロコンピュータ断層撮影、磁気共鳴画像法、リアルタイム定量PCR、血清学、組織学、免疫組織化学、および/または可変圧力走査型電子顕微鏡が含まれますが、これらに限定されません。

このモデルにはいくつかの制限があります。第一に、脊椎手術のモデルは、臨床診療と比較して大幅に単純化されています。ハイリスクの脊椎手術患者に典型的な大規模な減圧手術や多段階固定術とは対照的に、モデル手術では、単一のステンレス鋼インプラントで最小限の骨切除を行います。臨床用脊椎インプラントには複数の異なる材料が含まれているため、細菌感染やバイオフィルム形成に対する感受性が異なる可能性があります。さらに、すべての動物モデルと同様に、マウスの感染に対する宿主の応答はヒトのそれとは異なります。

将来的には、このモデルを使用して、バンコマイシン粉末、抗生物質を装填したビーズ、コーティングされたインプラントなど、他の抗生物質送達モダリティによるSIIの治療を評価することができます。さらに、このモデルは、SIIに対するホスト応答のメカニズムを研究するために使用できます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)	Branson Ultrasonics	CPX952217R	*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
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Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP