Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

במודל עכבר Vivo של זיהום שתל בעמוד השדרה

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/60560
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 1, 1, 1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles, 2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

ERRATUM NOTICE

Summary

הפרוטוקול מתאר מודל עכבר in vivo חדשני של זיהום שתל בעמוד השדרה שבו שתל חוט K מפלדת אל-חלד נגוע בסטפילוקוקוס אאורוס Xen36 ביולומינסנטי. עומס חיידקי מנוטר לאורך עם הדמיה ביולומינסנטית ומאושר עם ספירת יחידות יוצרות מושבה לאחר המתת חסד.

Abstract

זיהומים בשתלי עמוד השדרה מבשרים תוצאות גרועות מכיוון שהאבחון מאתגר ומיגור כירורגי מנוגד ליציבות המכנית של עמוד השדרה. מטרת שיטה זו היא לתאר מודל עכברי חדשני של זיהום שתל עמוד השדרה (SII) שנוצר כדי לספק כלי invivo זול, מהיר ומדויק לבדיקת טיפולים פוטנציאליים ואסטרטגיות טיפול בזיהומים של שתלי עמוד השדרה.

בשיטה זו, אנו מציגים מודל של ניתוחי עמוד שדרה בגישה אחורית שבו חוט k מפלדת אל-חלד מועתק לתהליך עמוד השדרה L4 של עכברי בר בני 12 שבועות מסוג C57BL/6J ומחוסן ב-1 x 103 CFU של זן ביולומינסנטי של חיידקי Staphylococcus aureus Xen36. לאחר מכן עכברים מצולמים לאורך, עבור bioluminescence in vivo בימים 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ו-35. אותות דימות ביולומינסנציה (BLI) משדה ראייה סטנדרטי מכומתים כדי למדוד עומס חיידקי in vivo.

כדי לכמת חיידקים הנצמדים לשתלים ולרקמה הפרי-שתלית, ממיתים עכברים וקוצרים את השתל ואת הרקמה הרכה שמסביבו. חיידקים מנותקים מהשתל על ידי סוניקציה, מתורבתים במשך הלילה ולאחר מכן יחידות יוצרות מושבה (CFUs) נספרות. התוצאות המתקבלות משיטה זו כוללות ספירות חיידקים אורכיות כפי שנמדדו על ידי in vivo S. aureus bioluminescence (שטף מרבי ממוצע) וספירות CFU לאחר המתת חסד.

בעוד שמודלים קודמים של בעלי חיים של זיהום מכשור בעמוד השדרה כללו ניתוח פולשני של רקמות ex vivo, מודל העכבר של מכון התקנים המוצג במאמר זה ממנף הדמיה אופטית לא פולשנית בזמן אמת in vivo של חיידקים ביולומינסנטיים כדי להחליף מחקר רקמות סטטיות. היישומים של המודל הם רחבים ועשויים לכלול שימוש בזני חיידקים ביולומינסנטיים חלופיים, שילוב סוגים אחרים של עכברים מהונדסים גנטית כדי לחקור בו זמנית את התגובה החיסונית של המאכסן, והערכת שיטות אבחון וטיפול חדשות או חקירה כגון אנטיביוטיקה או ציפויי שתלים.

Introduction

מטרת שיטה זו היא לתאר מודל עכברי חדשני של זיהום שתל בעמוד השדרה (SII). מודל זה תוכנן לספק כלי זול ומדויק להערכה גמישה של ההשפעה של משתנים מארחים, פתוגנים ו / או שתלים in vivo. בחינת טיפולים פוטנציאליים ואסטרטגיות טיפול לזיהומים של שתלי עמוד השדרה במודל זה נועדה להנחות את פיתוח המחקר לפני היישום במודלים גדולים יותר של בעלי חיים ובניסויים קליניים.

זיהום הקשור לשתלים לאחר ניתוח בעמוד השדרה הוא סיבוך הרסני ולמרבה הצער מתרחש בכ-3-8% מהמטופלים שעברו ניתוח אלקטיבי בעמוד השדרה 1,2,3,4,5 ועד 65% מהמטופלים שעברו ניתוח רב-שלבי או רוויזיה 6. טיפול בזיהומים של שתלי עמוד השדרה דורש לעתים קרובות אשפוזים מרובים, ניתוחים מרובים וטיפול אנטיביוטי ממושך. מכון התקנים מבשר על תוצאות גרועות של מטופלים, כולל פגיעה נוירולוגית, נכות וסיכון מוגבר לתמותה. ניהול מכון התקנים יקר ביותר ועולה למעלה מ-900,000 דולר למטופל7.

סטפילוקוקוס זהוב הוא הפתוגן האלים הנפוץ ביותר של מכון התקנים 8,9,10,11. חיידקים יכולים לזרוע את החומרה ישירות במהלך הניתוח, דרך הפצע בתקופה שלאחר הניתוח, או מאוחר יותר באמצעות התפשטות hematogenous. בנוכחות שתלי מתכת, S. aureus יוצרים ביופילם המגן על החיידקים מפני טיפול אנטיביוטי ותאים חיסוניים. בעוד הסרת חומרה נגועה עשויה לסייע במיגור יעיל של זיהום, זה לעתים קרובות לא אפשרי בעמוד השדרה מבלי לגרום לערעור יציבות ולהסתכן בפגיעה נוירולוגית12.

בהיעדר שתילה של חומרה נגועה, נדרשות גישות חדשניות למניעה, גילוי וטיפול במכון התקנים. מבחינה היסטורית, היו מודלים מוגבלים של בעלי חיים של מכון התקנים כדי להעריך ביעילות את הבטיחות והיעילות של טיפולים חדשניים. מודלים קודמים של בעלי חיים במכון התקנים דורשים מספר רב של בעלי חיים ואיסוף נקודות נתונים הדורשות המתת חסד כולל ספירת מושבות, היסטולוגיה ותרבות13,14,15. בהיעדר ניטור אורכי in vivo, מודלים אלה מספקים נקודת נתונים אחת בלבד לכל בעל חיים ולכן הם יקרים ולא יעילים.

עבודה קודמת שחקרה מודל עכברי של זיהום ארתרופלסטי בברך ביססה את הערך והדיוק של הדמיה אופטית לא פולשנית in vivo לניטור אורכי של עומס זיהום16. זיהוי ביולומינסנציה מאפשר לכמת את העומס החיידקי על פני מסלול זמן אורכי בחיה אחת באופן הומני, מדויק ויעיל. יתר על כן, מחקרים קודמים הדגימו מתאם גבוה בין ביולומינסנציה in vivo לבין CFUs הדבקים בשתלים17. היכולת לעקוב אחר זיהום לאורך זמן, הובילה להבנה מורכבת יותר של זיהום הקשור לשתלים. בנוסף, ניטור זיהום אורכי בדרך זו, איפשר את היעילות של טיפול אנטיביוטי ומיקרוביאלים חדשים להיות מוערך במדויק16,17,18.

תוך מינוף כלים אלה, פיתחנו ותיקפנו מודל של זיהום בשתל עמוד השדרה לאחר הניתוח. בשיטה שהוצגה, אנו משתמשים בחיסון של S. aureus Xen36 ביולומינסנט כדי לבסס מודל עכבר in vivo של מכון התקנים לניטור אורכי של עומס חיידקי16,17,18. מודל חדשני זה מספק כלי רב ערך לבדיקה יעילה של אסטרטגיות זיהוי, מניעה וטיפול פוטנציאליות עבור מכון התקנים לפני יישומן במודלים גדולים יותר של בעלי חיים ובניסויים קליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל בעלי החיים טופלו בהתאם קפדנית לנוהג טוב של בעלי חיים כמוגדר בתקנות הפדרליות כמפורט בחוק רווחת בעלי חיים (AWA), המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה משנת 1996, מדיניות PHS לטיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה, כמו גם המדיניות והנהלים של המוסד כמפורט במדריך ההדרכה לטיפול ושימוש בבעלי חיים, וכל עבודת בעלי החיים אושרה על ידי ועדת המחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (ARC).

1. בחירת זן S. aureus bioluminescent

  1. השתמש בזן S. aureus Xen36 הביולומינסנטי כחיסון המעניין.
    הערה: זן זה נגזר מהזן ההורי S. aureus ATCC-49525, שהוא מבודד קליני מחולה ספיגה. ס. אוראוס Xen36 משתמש באופן ייחודי באופרון LuxABCDE, אשר ממוטב ומשולב בפלסמיד המקורי של המארח. 19 כתוצאה מכך, זן Xen36 מסוגל לייצר אור ביו-לומינסנטי כחול-ירוק עם פליטת שיא של אורך גל של 490 ננומטר. אות פליטה זה מיוצר רק על ידי אורגניזמים חיידקיים חיים פעילים מטבולית.

2. הכנת ס. אאורוס לחיסון

  1. הוסף 200 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין למרק לוריא בתוספת 1.5% אגר כדי לבודד S. aureus Xen36 ממזהמים פוטנציאליים, תוך שימוש בגן עמידות לקנמיצין הקשור ללוקס אופרון19.
  2. פזרו את חיידקי S. aureus Xen36 על צלחות אגר סויה טריפטיות (ציר סויה טריפטי [TSB] בתוספת 1.5% אגר) ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 12-16 שעות.
  3. בודד מושבות בודדות של S. aureus Xen36 ותרבית בנפרד ב- TSB למשך 12-16 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד (200 סל"ד).
  4. לדלל את התרבית המתקבלת ביחס של 1:50.
  5. תרבית למשך שעתיים נוספות ב-37°C לבידוד חיידקי השלב המידלוגריתמי.
  6. כדור, השהיה מחדש ושטיפת חיידקים במי מלח חוצצים פוספט (PBS) שלוש פעמים.
  7. מדוד את הספיגה ב- 600 ננומטר. OD600 האידיאלי הוא בין 0.700 ל 0.750 אשר מתאים 4x105 CFU/mL. בצע דילול סדרתי כדי להשיג את החיסון החיידקי הרצוי (1 x 103 CFU/2 μL).
    הערה: הריכוז האופטימלי של Xen36 ליצירת זיהום כרוני נמצא 1 x 103 CFU. מינון נמוך יותר של חיידקים נוקה על ידי מערכת החיסון של המאכסן ומינון גבוה יותר גרם להתמוטטות פצעים. פירוק פצעים אינו מבדיל בין זיהום עמוק בשתל לבין זיהום פצע שטחי, ולכן נמנע במודל זה (איור 1)20.

3. עכברים

  1. השתמשו בעכברי בר זכרים בני 12 שבועות מסוג C57BL/6J.
  2. עכברי בית בכלובים עם מקסימום של 4 בכל פעם.
  3. יש לשמור על זמינות המים בכל עת. שמור על מחזור אור/חושך של 12 שעות ואל תבצע ניסויים במהלך השלב החשוך של המחזור.
  4. השתמשו בצ'או ללא אספסת להאכלה עקב הפרעה אפשרית לאיתות פלואורסצנטי.
  5. בקש ממחקר או צוות וטרינרי להעריך עכברים מדי יום כדי להבטיח את רווחתם של בעלי החיים לאורך כל הניסוי.

4. הליכים כירורגיים בעכבר

  1. יש להשרות הרדמה על ידי הנחת עכברים בתא איזופלורן (2%) למשך כ-5 דקות. ודא עומק הרדמה מתאים על ידי ניטור הנשימה כדי להישאר קצבית ואיטית יותר מאשר כאשר ער ולא משתנה בתגובה לגירויים מזיקים (למשל, מניפולציה כירורגית, צביטת בוהן).
  2. מעבירים עכברים מורדמים לתחנת הכנה ומסירים שיער מהעצה לעמוד השדרה החזי העליון בעזרת קוצצי מכרסמים.
  3. נקו ועיקרו את העור בשטיפות משולשות של תמיסת בטדין לסירוגין ואלכוהול איזופרופיל.
  4. העברת עכברים מורדמים ומעוקרים במצב נוטה למיטת ניתוח סטרילית תוך שמירה על הרדמה עם מתן איזופלורן בשאיפה (2%) דרך חרוט האף.
  5. כופף באופן מקסימלי את הירכיים וזהה את מיקום הברך בגובה עמוד השדרה כדי לדמות בקירוב את גוף החוליה המותני 4.
  6. בצע חתך אורכי של 2 ס"מ דרך העור עם אזמל כירורגי 15 להבים.
  7. למשש את התהליכים בעמוד השדרה כדי לאשר את קו האמצע ולהמשיך את החתך עד העצם.
  8. לנתח subperiosteally בצד ימין של תהליך עמוד השדרה L4, הרחבת לרוחב לתהליך הרוחבי.
  9. מעבירים תפר קלוע נספג במידה 5-0 וקאודאד לגוף L4 דרך הפאשיה ומשאירים פתוחים, לקראת סגירה עתידית.
  10. באמצעות מחט עמוד שדרה 25 G, בצע את התהליך הספינוסי של L4 באמצעות מחט עמוד שדרה 25 G והכנס שתל נירוסטה "בצורת L" בקוטר 0.1 מ"מ ובאורך 1 ס"מ לאורך הלמינה עם הזרוע הארוכה המניחה את הצפלדה.
  11. חסן את השתל עם 1 x 103 CFUs/2 μL bioluminescent S. aureus Xen36, תוך הקפדה על כך שכל התמיסה תבוא במגע עם השתל.
  12. יש להמתין כ-10 שניות לפני קשירת התפר הנספג שעבר קודם לכן לאחר החיסון כדי להבטיח הכלה של החיסון על השתל.
  13. סגור את העור באופנת ריצה עם תפר נספג.
  14. מתן תרופות כאב באמצעות הזרקה תת עורית של buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) מיד postop ולאחר מכן כל 12 שעות במשך 3 ימים לאחר מכן.
  15. יש לשחזר עכברים על כרית חימום ולפקח על החזרה לפעילות רגילה.
  16. השג צילומי רנטגן לאחר הניתוח כדי לאשר את המיקום המתאים של השתל.

5. הדמיה ביולומינסנציה אורכית In vivo למדידת עומס חיידקי

  1. מרדימים עכברים עם איזופלורן בשאיפה (2%). ודא עומק הרדמה מתאים על ידי ניטור הנשימה כדי להישאר קצבית ואיטית יותר מאשר כאשר ער ולא משתנה בתגובה לגירויים מזיקים (למשל, מניפולציה כירורגית, צביטת בוהן).
  2. הסר שיער מן העצה אל עמוד השדרה החזי העליון עם קוצץ מכרסמים.
  3. העמיס עכברים על שדה הראייה של פלטפורמת הדמיה ביולומינסנטית כדי לבצע דימות ביולומינסנציה in vivo (BLI)19.
  4. לכוד אות ביולומינסנטי על פני זמן רכישה של 5 דקות. השתמש בהגדרות binning גדולות עם שדה ראייה של 15 ס"מ (B).
  5. חזור על שלבים 5.1-5.4 בימים 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ו- 35 (או ימים אחרים בהתבסס על תכנון ניסוי ספציפי) כדי לפקח על עומס חיידקי.
  6. הצג נתוני BLI באמצעות סקאלת צבעים ושכבת-על על תצלום בגווני אפור. בודד אזור עניין סטנדרטי (ROI) באמצעות תוכנת BLI כדי לכמת BLI בשטף כולל (פוטונים לשנייה) או בשטף מרבי ממוצע (פוטונים/שנייה/סנטימטר2/סטרדיאן).

6. כימות חיידקים הנצמדים לשתלים ולרקמות הסובבות אותם

  1. יש להרדים עכברים ב-POD 35 או בתאריך חלופי לאחר הניתוח עם חשיפה לפחמן דו-חמצני בהתאם להנחיות AVMA. לאשר המתת חסד עם נקע צוואר הרחם משני.
  2. לעקר את העור הגבי לפי שלב 4.3 ולמקם את העכבר הנוטה לשדה ניתוחי סטרילי.
  3. חותכים בחדות את החתך הקודם באמצעות אזמל כירורגי בעל 15 להבים.
  4. השתמש במספריים סטריליים כדי לנתח בבוטות את תהליך עמוד השדרה L4 ולזהות את השתל הניתוחי.
  5. השתמש בדרייבר מחט כדי לסובב ולהסיר בעדינות את השתל ממקומו בתהליך עמוד השדרה L4.
  6. באמצעות מלקחיים ומספריים סטריליים, קוצרים כ-0.1 גרם של עצם תהליך ספינוסי ורקמות רכות סביב השתל הניתוחי ומניחים ב-1 מ"ל PBS בצינור קרנף חרוטי קטן עם 4 חרוזים הומוגניים חדים.
  7. רשום משקל של רקמה רכה על ידי שקילת צינור חרוטי לפני ואחרי הקציר.
  8. הניחו את השתל ב-0.5 מ"ל של 0.3% Tween-80 ב-TSB ובצעו סוניקציה למשך 15 דקות.
  9. מערבלים את מתלה השתל שנוצר למשך 2 דקות ותרבית לילה למשך 12-16 שעות.
  10. הומוגניזציה של הרקמה הרכה ותהליכים בעמוד השדרה שהונחו בעבר ב- PBS של 1 מ"ל סביב השתל באמצעות הומוגנייזר.
  11. מערבלים את מתלה הרקמות הרכות המתקבל למשך 5 דקות ותרבית לילה למשך 12-16 שעות.
  12. לאחר תרבית לילה, יש לספור CFU מהשתל ומהרקמות הסובבות אותו, בהתאמה. ערך מפורש כסך CFU/g שנקצר עבור רקמות רכות ו-CFU/mL עבור שתל סוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההליך המוצג כאן שימש להערכת היעילות של משטרי אנטיביוטיקה במודל עכבר in vivo של מכון התקנים. באופן ספציפי, היעילות של טיפול אנטיביוטי משולב vancomycin ו rifampin הושוותה מונותרפיה vancomycin ובקרות נגועות לא מטופלות.

לפני הניתוח, עכברים חולקו באקראי לטיפול משולב, מונותרפיה או בקרה נגועה. ניתוח כוח סטטיסטי בוצע כדי לחשב את גודל המדגם. אמצעים צפויים של שטף מרבי ממוצע 1 x 10 5 ± 3.2 x 10 4 ו-1.4 x 105 שימשו לקביעת גודל המדגם, אשר חושבו כ- N=10 בכל קבוצה. עכברים עברו השתלה כירורגית, חיסון עם S. aureus Xen36, ונמדדו עבור in vivo S. aureus bioluminescence על POD 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ו-35. ב-POD 35 הוקרבו עכברים וכומתו CFUs עבור חיידקי הרקמה הדבקים בשתלים וברקמות הסובבות אותם.

עכברים בקבוצת המונותרפיה קיבלו מינון טיפולי של ונקומיצין (110 מ"ג/ק"ג פעמיים ביום) שניתן תת עורית. מינון זה נבחר כדי להעריך את האזור מתחת לעקומה עבור חשיפה אנושית טיפוסית עבור vancomycin21,22,23. עכברים בקבוצת הטיפול המשולב קיבלו מינון תת-עורי טיפולי של ונקומיצין (110 מ"ג/ק"ג פעמיים ביום) וריפמפין (25 מ"ג/ק"ג ביום)24. עכברים בקבוצת הביקורת הנגועה קיבלו זריקות דמה של מי מלח סטריליים. הטיפול בכל הקבוצות בוצע מימים 7 עד 14 לאחר הניתוח.

השפעת הטיפול האנטיביוטי על BLI
לעכברי ביקורת נגועים היו אותות BLI שהגיעו לשיא ב-POD 10 שנשארו מעל 1.0 x 105 פוטונים/s/cm 2/sr עד להקרבה, והצליחו למדל SII כרוני (איור 2). עכברים שטופלו במונותרפיה של ונקומיצין היו בעלי אות BLI נמוך משמעותית בהשוואה לקבוצת ביקורת נגועה, עם ירידה של פי 2 מ- POD 10-21 (p<0.03). לאחר POD 21, לא היה הבדל משמעותי ב- BLI בין מונותרפיה לקבוצות ביקורת נגועות. עכברים שטופלו בטיפול משולב של ונקומיצין-ריפמפין היו בעלי אות BLI נמוך עוד יותר, שהיה נמוך פי 20 מבקרת הזיהום ב- POD 10. ירידה משמעותית נמשכה עד POD 28 (עמ<0.01). לאחר POD 28, לא היה הבדל משמעותי ב-BLI בין הקבוצות. לא היה הבדל משמעותי ב-BLI בין אף אחת משלוש הקבוצות בהדמיה הסופית ב-POD35.

CFUs משתלים ומהרקמה שמסביב
עכברים הוקרבו על POD 35. שתלים והרקמה שמסביב נקצרו ועובדו לצורך ספירת CFU (איור 3). לא נצפה הבדל משמעותי ב-CFUs בין קבוצות בקרה נגועות, מונותרפיה או טיפול משולב.

Figure 1
איור 1: התמוטטות פצעים בחיסון S. aureus Xen36 במינון גבוה. תמונות של העור הגבי של עכברים שחוסנו ב- S. aureus Xen36 במהלך זיהום בשתל עמוד השדרה. (A) עכבר מחוסן ב-1 x 103 יחידות יוצרות מושבה (CFU), ועור גבי שלם. (B) עכבר מחוסן ב-1 x 104 יחידות יוצרות מושבה (CFU), ועדות להתמוטטות פצעים משמעותית. האיור הותאם והודפס מחדש באישור Dworsky et al.25אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מדידת עומס חיידקי באמצעות ביולומינסנציה in vivo. 1 x 103 CFU של S. aureus בעל המבנה הביולומינסנטי בפלסמיד יציב (Xen36) חוסנו בתהליך L4 Spinous של עכברים (n = 10 עכברים לקבוצה) בנוכחות שתל נירוסטה. (A) ספירות חיידקים כפי שנמדדו על ידי in vivo S. aureus bioluminescence (שטף מרבי ממוצע [פוטונים/s/cm2/sr] ± sem [סולם לוגריתמי]), עם דיאגרמת זרימה של פרוטוקול הניסוי להלן. ב-POD 7 החלה מתן אנטיביוטיקה עם ונקומיצין, שילוב של ונקומיצין וריפמפין או בקרת מלח סטרילית. מתן אנטיביוטיקה הופסק על POD 14. ב-POD 35 הוקרבו עכברים ונמדדו CFUs מהשתל ומהרקמה שמסביב. (B) נציג in vivo S. aureus bioluminescence בסקאלת צבעים על גבי תמונה בגווני אפור של עכברים. איור מותאם והודפס מחדש באישור Hu et al.25אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אישור עומס חיידקי באמצעות ספירות CPU. ב-POD 35 הוקרבו עכברים, הניקו סיכות, הרקמות עברו הומוגניות, וחיידקים תורבתו ונספרו. האיור הותאם והודפס מחדש באישור Hu et al.25. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זיהומים הקשורים לשתלים בעמוד השדרה מבשרים תוצאות גרועות עבור חולים 1,2,3,4,5. שלא כמו אזורים רבים אחרים בגוף, חומרה נגועה בעמוד השדרה לעתים קרובות לא ניתן להסיר בשל הסיכון של חוסר יציבות ופגיעה נוירולוגית. אתגר ייחודי זה בהגדרת חיידקי ביופילם עמידים לטיפול אנטיביוטי סיסטמי מחייב גישות חדשניות לטיפול12. מחקרים קודמים בטיפולים חדשניים למכון התקנים הוגבלו על ידי מודלים יקרים ולא יעילים של בעלי חיים. כדי לחקור טוב יותר זיהומים אלה ולהעריך ביעילות את יעילותם של טיפולים פוטנציאליים, פיתחנו מודל עכבר אורכי לא פולשני של מכון התקנים באמצעות הדמיה ביולומינסנציה in vivo.

מודלים קודמים של בעלי חיים של זיהום מכשור בעמוד השדרה דרשו ניתוח רקמות ex vivo כדי להעריך תוצאות, מה שדרש קבוצות גדולות ולא הצליחו לעקוב אחר זיהום לאורך זמן13,14,26. לעומת זאת, מודל העכבר של מכון התקנים המוצג במאמר זה ממנף את BLI לניטור אמין של עומס חיידקי לאורך זמן16,17,18. גישה חדשנית זו מאפשרת לחוקרים להעריך את תגובת החיידקים והפונדקאי לאנטיביוטיקה, ציפויים או אפנון חיסוני.

שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים: הכנה מתאימה של Xen36 S. aureus ואומדן של חיסון יחיד 1 x 103 CFUs/2 μL; השתלה כירורגית מדויקת, חיסון וסגירה; הדמיה ביולומינסנטית in vivo; ואישור עומס חיידקי באמצעות ספירת CFU.

שינויים במודל עשויים לכלול זני חיידקים ביולומינסנטיים חלופיים, נקודות זמן ארוכות טווח, או שימוש בשילוב של סוגים אחרים של עכברים מהונדסים גנטית, כגון אלה המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאים מיאלואידים (Lys-EGFP) כדי למדוד בו זמנית חדירת נויטרופילים עם הדמיה פלואורסצנטית in vivo20. ניתן להשתמש במתודולוגיות נוספות כדי להשלים את אלה המתוארות בפרוטוקול כדי לטפל בתהליכים כגון אוסטאוליזה של חוליות, ניוון דיסק, זיהום ברקמות רכות וזיהום ביופילם של שתלים. טכניקות המספקות תוצאות כמותיות בתהליכים אלה עשויות לכלול אך אינן מוגבלות ל: טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת, דימות תהודה מגנטית, PCR כמותי בזמן אמת, סרולוגיה, היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה ו / או מיקרוסקופ אלקטרונים סורק לחץ משתנה.

למודל זה מספר מגבלות. ראשית, המודל של ניתוחי עמוד שדרה הוא פישוט גס בהשוואה לפרקטיקה הקלינית. בניגוד לניתוחי דקומפרסיה נרחבים ואיחוי רב-שכבתי האופייניים למטופלים בסיכון גבוה בניתוחי עמוד שדרה, ניתוח המודל כולל כריתת עצם מינימלית עם שתל נירוסטה יחיד. מכיוון שלשתלי עמוד שדרה קליניים יש מספר חומרים שונים, אלה עשויים להיות רגישים שונים לזיהום חיידקי והיווצרות ביופילם. בנוסף, כמו בכל המודלים של בעלי חיים, תגובת המארח להדבקה של עכברים שונה מזו של בני אדם.

בעתיד, מודל זה יכול לשמש להערכת הטיפול במכון התקנים עם שיטות אחרות למתן אנטיביוטיקה כולל אבקת ונקומיצין, חרוזים עמוסי אנטיביוטיקה או שתלים מצופים. בנוסף, מודל זה עשוי לשמש לחקר הבסיס המכניסטי של תגובת המארח למכון התקנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להכיר בקבלת מענק Biomet Spine של האגודה האורתופדית לילדים בצפון אמריקה והמכון הלאומי לבריאות, קליני ומדעי תרגום KL2, ומענק המחקר הכירורגי HH Lee כמקורות מימון עיקריים לניסויים אלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance ME104 Mettler Toledo 30029067 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth Becton Dickinson (BD) BD 211825 BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer Thermo Scientific 840-208300 Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor Thermo Scientific 75003183 Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator) Branson Ultrasonics CPX952217R *similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer Next Advance BBY24M The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500 Electron Microscopy Sciences 66118-10 The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be
used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for
traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine
sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been
designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 51026282 Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System Perkin Elmer CLS148590 The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker Thermo Scientific SHKE4450 Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline Fisher Bioreagents BP24384 PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated Thermo Scientific 75002436 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge Thermo Scientific 75004261 Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36 Perkin Elmer 119243 Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V Heidolph Tuttnauer 23210401 Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80 Fisher Bioreagents BP338-500 Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200 Labnet Internation S0200 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride Pfizer Injectables/Hospira 00409-4888-10 0.9% Sodium Chloride Injection, USP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of neutrophils in experimental septicemia and septic arthritis induced by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 65 (7), 2517-2521 (1997).
  2. Fang, A., Hu, S. S., Endres, N., Bradford, D. S. Risk factors for infection after spinal surgery. Spine. 30 (12), Phila Pa. 1460-1465 (2005).
  3. Levi, A. D., Dickman, C. A., Sonntag, V. K. Management of postoperative infections after spinal instrumentation. Journal of Neurosurgery. 86 (6), 975-980 (1997).
  4. Weinstein, M. A., McCabe, J. P., Cammisa, F. P. Postoperative spinal wound infection: a review of 2,391 consecutive index procedures. Journal of Spinal Disorders. 13 (5), 422-426 (2000).
  5. Picada, R., et al. Postoperative deep wound infection in adults after posterior lumbosacral spine fusion with instrumentation: incidence and management. Journal of Spinal Disorders. 13 (1), 42-45 (2000).
  6. Smith, J. S., et al. Rates of infection after spine surgery based on 108,419 procedures: a report from the Scoliosis Research Society Morbidity and Mortality Committee. Spine. 36 (7), Phila Pa. 556-563 (2011).
  7. Abbey, D. M., Turner, D. M., Warson, J. S., Wirt, T. C., Scalley, R. D. Treatment of postoperative wound infections following spinal fusion with instrumentation. Journal of Spinal Disorders. 8 (4), 278-283 (1995).
  8. Silber, J. S., et al. Management of postprocedural discitis. Spine Journal. 2 (4), 279-287 (2002).
  9. Pappou, I. P., Papadopoulos, E. C., Sama, A. A., Girardi, F. P., Cammisa, F. P. Postoperative infections in interbody fusion for degenerative spinal disease. Clinical Orthopaedics and Related Research. 444, 120-128 (2006).
  10. Sampedro, M. F., et al. A biofilm approach to detect bacteria on removed spinal implants. Spine. 35 (12), Phila Pa. 1218-1224 (2010).
  11. Pull ter Gunne, A. F., Mohamed, A. S., Skolasky, R. L., van Laarhoven, C. J., Cohen, D. B. The presentation, incidence, etiology, and treatment of surgical site infections after spinal surgery. Spine. 35 (13), Phila Pa. 1323-1328 (2010).
  12. Olsen, M. A., et al. Risk factors for surgical site infection in spinal surgery. Journal of Neurosurgery. 98, 2 Suppl 149-155 (2003).
  13. Ofluoglu, E. A., et al. Implant-related infection model in rat spine. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 127 (5), 391-396 (2007).
  14. Guiboux, J. P., et al. The role of prophylactic antibiotics in spinal instrumentation. A rabbit model. Spine. 23 (6), Phila Pa. 653-656 (1998).
  15. Stavrakis, A. I., et al. Current Animal Models of Postoperative Spine Infection and Potential Future Advances. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 34 (2015).
  16. Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection: noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. Journal of Orthopaedic Research. 30 (3), 335-340 (2012).
  17. Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS One. 5 (9), 12580 (2010).
  18. Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and muCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS One. 7 (10), 47397 (2012).
  19. Francis, K. P., et al. Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct. Infection and Immunity. 68 (6), 3594-3600 (2000).
  20. Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
  21. Hegde, S. S., et al. Activity of telavancin against heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) in vitro and in an in vivo mouse model of bacteraemia. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 65 (4), 725-728 (2010).
  22. Crandon, J. L., Kuti, J. L., Nicolau, D. P. Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 5115-5119 (2010).
  23. Reyes, N., et al. Efficacy of telavancin in a murine model of bacteraemia induced by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 58 (2), 462-465 (2006).
  24. Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Alder, J., Eliopoulos, C. T. Efficacy of daptomycin in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (5), 1714-1718 (2003).
  25. Hu, Y., et al. Combinatory antibiotic therapy increases rate of bacterial kill but not final outcome in a novel mouse model of Staphylococcus aureus spinal implant infection. PLoS One. 12 (2), 0173019 (2017).
  26. Poelstra, K. A., Barekzi, N. A., Grainger, D. W., Gristina, A. G., Schuler, T. C. A novel spinal implant infection model in rabbits. Spine. 25 (4), Phila Pa. 406-410 (2000).

Tags

זיהום שתל עמוד השדרה מודל עכבר In Vivo טיפולים אסטרטגיות טיפול ניתוחי עמוד שדרה בגישה אחורית זן ביולומינסנטי חיידקי סטפילוקוקוס אאורוס Xen36 הדמיית ביולומינסנציה עומס חיידקי רקמת פרי שתל יחידות יוצרות מושבה (CFU) מודלים של בעלי חיים

Erratum

Formal Correction: Erratum: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection
Posted by JoVE Editors on 05/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. The Authors section was updated from:

Benjamin V. Kelley1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

to:

Benjamin V. Kelley1
Christopher Hamad1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Zeinab Mamouei1
Rene Chun1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Brandon Gettleman3
Autreen Golzar2
Adrian Lin2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles
3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

במודל עכבר Vivo של זיהום שתל בעמוד השדרה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. … More

Kelley, B. V., Hamad, C., Zoller, S. D., Greig, D., Mamouei, Z., Chun, R., Hori, K., Cevallos, N., Ishmael, C., Hsiue, P., Trikha, R., Sekimura, T., Gettleman, B., Golzar, A., Lin, A., Olson, T., Chaudry, A., Le, M. M., Scaduto, A. A., Francis, K. P., Bernthal, N. M. In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection. J. Vis. Exp. (160), e60560, doi:10.3791/60560 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter