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Developmental Biology

मानव भ्रूण स्टेम सेल के एकल सेल संस्कृति का उपयोग कर कुशल तंत्रिका भेदभाव

Published: January 18, 2020 doi: 10.3791/60571
Automatic Translation
1, 2, 1
1Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, 2NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

यहां प्रस्तुत मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की एक एकल कोशिका संस्कृति की पीढ़ी और तंत्रिका जनक कोशिकाओं में उनके बाद भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल है । प्रोटोकॉल सरल, मजबूत, स्केलेबल, और दवा स्क्रीनिंग और पुनर्योजी दवा अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।

Abstract

मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (एचएसईसी) के विट्रो विट्रो विभेदन ने जैविक और आणविक दोनों स्तरों पर मानव विकास का अध्ययन करने की क्षमता को बदल दिया है और पुनर्योजी अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए कोशिकाएं प्रदान की हैं। विभिन्न रोगाणु परतों में भेदभाव के लिए अविभेदित एचएसईसी और भ्रूण शरीर (ईबी) और रोसेट गठन को बनाए रखने के लिए कॉलोनी प्रकार की संस्कृति का उपयोग करके एचएसईसी संस्कृति के लिए मानक दृष्टिकोण अक्षम और समय लेने वाले हैं। यहां प्रस्तुत एक एकल सेल संस्कृति विधि एक कॉलोनी प्रकार संस्कृति के बजाय hESCs का उपयोग कर रहा है । यह विधि अविभेदित एचएसईसी की विशेषता विशेषताओं के रखरखाव की अनुमति देती है, जिसमें कॉलोनी प्रकार के एचईएससी के तुलनीय स्तरों पर एचएसईसी मार्कर की अभिव्यक्ति शामिल है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल एकल सेल प्रकार एचएसईसी से तंत्रिका जनक कोशिका (एनपीसी) पीढ़ी के लिए एक कुशल तरीका प्रस्तुत करता है जो 1 सप्ताह के भीतर एनपीसी का उत्पादन करता है। ये कोशिकाएं कई एनपीसी मार्कर जीन को अत्यधिक व्यक्त करती हैं और डोपमिनर्जिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स सहित विभिन्न तंत्रिका कोशिका प्रकारों में अंतर कर सकती हैं। एचईसी के लिए यह एकल-सेल संस्कृति प्रणाली इन प्रक्रियाओं के आणविक तंत्र, कुछ बीमारियों के अध्ययन और दवा खोज स्क्रीन की जांच करने में उपयोगी होगी।

Introduction

मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (hESCs) में तीन प्राथमिक रोगाणु परतों में अंतर करने की क्षमता होती है, जो तब विभिन्न बहुशक्तिशाली जनक कोशिका वंश में अंतर करती है। ये वंश बाद में मानव शरीर में सभी कोशिका प्रकारों को जन्म देते हैं। इन विट्रो एचएसआईसी संस्कृति प्रणालियों ने मानव भ्रूणीय विकास का अध्ययन करने की क्षमता को बदल दिया है और जैविक और आणविक स्तर पर इन प्रक्रियाओं को विनियमित करने के तरीके में नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में कार्य किया है। इसी प्रकार, मानव रोगियों से अलग किए गए पुनर्प्रोग्रामिंग दैहिक कोशिकाओं से उत्पन्न प्रेरित प्लीरिटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) के अध्ययन विभिन्न रोगों में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इसके अलावा, एचसीईसी से प्राप्त जनक और विभेदित कोशिकाएं स्टेम सेल थेरेपी और दवा स्क्रीनिंग1,2,3,4से जुड़े अनुसंधान के लिए उपयोगी हो सकती हैं।

एचएसईसी को तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एनपीसी) में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, जो एक व्यापक आत्म-नवीकरण क्षमता के साथ बहुसंभावित कोशिकाएं हैं। बाद में, इन कोशिकाओं को न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स5,6में अलग किया जा सकता है। एनपीसी न्यूरोडेवलपमेंटल बायोलॉजी और विभिन्न न्यूरोलॉजिकल बीमारियों के इन विट्रो अध्ययनों के लिए एक सेलुलर प्रणाली भी प्रदान करता है। हालांकि, वर्तमान कॉलोनी प्रकार की संस्कृति विधियां जिनमें एचसीसी और एनपीसी में उनके भेदभाव शामिल हैं, अक्षम हैं और अक्सर सहसंस्कृति के साथ-साथ भ्रूणीय शरीर (ईबी) और रोसेट गठन5,7,8,9शामिल होते हैं। ये प्रोटोकॉल कम जीवित रहने की दर और सहज भेदभाव प्रदर्शित करते हैं और अधिक समय लेने वाले होते हैं।

यहां प्रस्तुत एक बेहतर और मजबूत संस्कृति प्रणाली है जो आसानी से स्केलेबल है और एचईएससी10की उच्च घनत्व एकल-सेल प्रकार संस्कृति का उपयोग करती है। रोह-किनेज (रॉक) अवरोधक को शामिल करने से एचएसईएससी10,11,12,13, 14की एकल कोशिका प्रकार की संस्कृति के दौरान जीवित रहने की दक्षता में काफी वृद्धि हुई । इस संस्कृति प्रणाली में एचईएससी को आसानी से बनाए रखा और विस्तारित किया जा सकता है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल एचईसी की एकल-सेल प्रकार की संस्कृति से एनपीसी उत्पन्न करने के लिए एक कुशल तरीका प्रस्तुत करता है, जो अत्यधिक शुद्ध NPCs के उत्पादन की अनुमति देता है । एएलके अवरोधकों के साथ बीएमपी/टीजीएफ/एक्टिविन सिग्नलिंग पाथवे का अवरोध कुशलतापूर्वक एनपीसी15,16में एकल-सेल प्रकार के एचएसईसी के अंतर को प्रेरित करता है, जिसे तब डोपमिनर्जिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स जैसे कार्यात्मक तंत्रिका वंशों में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है ।

संक्षेप में, एचईसी का उपयोग करके एकल-सेल प्रकार संस्कृति प्रोटोकॉल एनपीसी सहित विभिन्न वंशों में इन कोशिकाओं के भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल आसानी से स्केलेबल है और इसलिए पुनर्योजी चिकित्सा और दवा स्क्रीनिंग से जुड़े अनुसंधान के लिए कोशिकाओं को पैदा करने के लिए उपयुक्त है।

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Protocol

1. एचएसईएससी-योग्य बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों की तैयारी

  1. जेल के गठन से बचने के लिए कम से कम 2-3 घंटे या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एचएसईएससी-योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (सामग्री की तालिकादेखें) धीरे-धीरे गल जाएं।
  2. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटें तैयार करने के लिए, ठंड े DMEM/F12 में मैट्रिक्स को 2% अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करें । पतला मैट्रिक्स समाधान के 1 मिलील के साथ एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से और कोट करें।
  3. कमरे के तापमान (आरटी) पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों को कम से कम 3 घंटे या रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के साथ प्लेटें मैट्रिक्स समाधान को हटाने और प्लेटों का उपयोग करने से पहले 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की जा सकती हैं।

2. सिंगल सेल एचएसईसी कल्चर के लिए कॉलोनी टाइप एचईसी का अनुकूलन

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर उगाए जाने वाले कॉलोनी प्रकार एच9 (WA09) एचईएससी की फीडर-मुक्त संस्कृतियों को पारित करने के लिए, कुओं से मध्यम को एस्पिरेट करें(चित्रा 1ए)9।
  2. डीपीबीएस के 1 mL के साथ 1x धोएं। प्रति अच्छी तरह से dispase समाधान (1 U/mL) के 1 mL जोड़ें और 20 मिन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
  3. dispase निकालें, डीएमईएम/F12 के 2 mL के साथ धीरे से कोशिकाओं 1x धोने, माध्यम को हटाने, और DMEM के 2 mL/
  4. धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके उपनिवेशों को अलग करें और 15 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
  5. 370 x ग्राम पर 2 मिन के लिए छर्रों को अपकेंद्रित करें और मध्यम को एस्पिरेट करें।
  6. सेल छर्रों को एकल कोशिकाओं में अलग करने के लिए, सेल टुकड़ी समाधान (1x एकाग्रता, सामग्री की तालिकादेखें) के 2 mL जोड़ें और 10 वर्ष के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. 370 x ग्राम पर 2 मिन के लिए सेंट्रलाइज कोशिकाएं और टुकड़ी समाधान को हटा दें।
  8. ताजा mTeSR1 मानव ESC माध्यम जोड़ें और कोमल पाइपिंग द्वारा एकल कोशिकाओं में कोशिकाओं को अलग करें ।
  9. एक एकल सेल प्रकार संस्कृति के लिए कॉलोनी प्रकार hESCs अनुकूलन करने के लिए, प्लेट लगभग 1.5-2.0 x 106 hESCs तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के प्रत्येक कुएं में 6 अच्छी तरह से प्लेट mTeSR1 के 2 mL में 24 घंटे के लिए 10 माइक्रोएम रॉक अवरोधक युक्त(चित्रा 1ए)।
  10. 24 घंटे के बाद, एचएसईएससी माध्यम को रॉक अवरोधक के बिना ताजा mTeSR1 के साथ बदलें और एचएसईसी को 3 दिनों के लिए एकल-सेल प्रकार के रूप में विकसित करने की अनुमति दें। रोजाना माध्यम बदलें।
  11. 4 दिन, जब संस्कृतियों लगभग १००% संवर्तन तक पहुंचने, टुकड़ी समाधान में कोशिकाओं को अलग, तो रीप्लेट के रूप में चरण २.६ में वर्णित है ।
    नोट: रॉक अवरोधक एकल सेल प्रकार एचएसईएससी संस्कृति के प्रारंभिक 24 एच के दौरान सेल अस्तित्व में सुधार करता है।

3. भ्रूण शरीर गठन और तीन रोगाणु परतों में भेदभाव(चित्रा 2)

  1. ईबीएस बनाने के लिए, पहले 24 घंटे के दौरान 10 माइक्रोन रॉक अवरोधक के साथ mTeSR1 मध्यम के 3 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, फिर एकत्रीकरण की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 60 मिमी कम लगाव व्यंजनों में रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. 24 घंटे के बाद, छोटे ईबीएस को 15 मिलील ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया जाता है। ईबीएस को ट्यूब के नीचे बसने दें और धीरे-धीरे एक पिपेट के साथ माध्यम को हटा दें। ईबी माध्यम में ईबीएस स्थानांतरित करें (नॉकआउट-डीएमईएम 20% नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन के साथ पूरक, 1x ग्लूटामाइन पूरक [सामग्री की तालिकादेखें], 1% एनईए [गैर-आवश्यक अमीनो एसिड; सामग्री की तालिकादेखें], और 0.2% -मर्काप्टोथेनॉल) और उन्हें 7 दिनों के लिए कम लगाव व्यंजनों में विस्तार करने की अनुमति दें। ऊपर वर्णित(चित्रा 2ए)के रूप में माध्यम को हर दूसरे दिन बदला जा सकता है।
  3. 7 दिन, व्यंजनों से ईबीएस इकट्ठा करें और उन्हें 15 मिलील ट्यूब में स्थानांतरित करें। धीरे-धीरे एक पिपेट के साथ माध्यम को हटा दें और ईबी को एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 6 अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें।
  4. ईबीएस को ईबी माध्यम में 12 दिनों के लिए प्लेट से जुड़ने और इनक्यूबेट करने की अनुमति दें, जिसके दौरान वे तीन रोगाणु परतों(चित्रा 2बी)में अंतर करेंगे। हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
    नोट: कोशिकाओं के एकत्रीकरण के दौरान, कम लगाव पकवान ईबी लगाव से बचने में मदद करता है।

4. एकल सेल प्रकार एचएसएससी का एनपीसी में भेदभाव(चित्रा 3)

  1. एनपीसी भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, टुकड़ी समाधान (1x) के 1 mL के साथ एकल-सेल प्रकार के एचईसी को अलग करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए इनक्यूबेट।
  2. 370 x ग्राम पर 2 मिन के लिए कोशिकाओं को केंद्रित करें और टुकड़ी समाधान अधिनात को हटा दें। DMEM/F12 के 1 mL जोड़ें और कोमल पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ।
  3. एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर प्लेट कोशिकाओं-लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेट 2 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर/
  4. 24 घंटे के बाद, संस्कृति माध्यम को तंत्रिका प्रेरण माध्यम (डीएमईएम के साथ 1% बी 27 माइनस विटामिन ए) के साथ बदलें, जो 1 माइक्रोन डोरसोमॉर्फिन और 5 माइक्रोन एसबी431542 के साथ पूरक है।
  5. तंत्रिका प्रेरण के पहले 4 दिनों के दौरान हर दूसरे दिन माध्यम बदलें, फिर हर दिन 7 दिन(चित्रा 3बी)पर संगम तक पहुंचने तक।
    नोट: (1) डोरसोमॉर्फिन ALK2,3,6 रिसेप्टर्स को लक्षित करके बीएमपी मार्ग को रोकता है और एएमपीके को भी रोकता है; SB431542 ALK5,7 को लक्षित करके टीजीएफ/एक्टिविन मार्ग का अवरोधक है। (2) इसी प्रोटोकॉल का परीक्षण एक अन्य ईएससी लाइन (WA01) के साथ किया गया था, जिसके परिणाम WA0916के समान परिणाम मिले । (3) हमने आम तौर पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के लिए मैट्रिक्स का उपयोग किया है; हालांकि, कोशिकाओं को Geltrex पर सुसंस्कृत किया जा सकता है और फिर कई एनपीसी मार्कर(चित्रा 4डी, ई)की अभिव्यक्ति द्वारा इंगित बहुत समान परिणामों के साथ एनपीसी में अंतर किया जा सकता है। मैक्जेल (सेक्शन 1 देखें) के समान तरीके से गेलट्रेक्स को संभालें।

5. एनपीसी विस्तार और क्रायोप्रिजर्वेशन

  1. तंत्रिका प्रेरण के 7 दिनों के बाद, टुकड़ी समाधान (1x) के 1 mL के साथ अलग कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 min के लिए इनक्यूबेट।
  2. 370 x ग्राम पर 2 मिन के लिए कोशिकाओं को केंद्रित करें और टुकड़ी समाधान अधिनात को हटा दें। एनपीसी विस्तार माध्यम के 1 mL जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) और कोमल पाइपटिंग द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  3. प्लेट 1 x 105 कोशिकाओं में एनपीसी विस्तार माध्यम के 2 mL तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर।
  4. पारित एनपीसी कई बार, आवश्यक के रूप में, जब संस्कृतियों लगभग ९०% प्रवाह तक पहुंच । पहले 3-4 मार्ग के दौरान, सेल मृत्यु को रोकने के लिए प्रारंभिक 24 घंटे के दौरान 10 माइक्रोन रॉक अवरोधक जोड़ें। इन मार्गों के बाद, कोशिकाओं को रॉक अवरोधक के बिना पारित और सुसंस्कृत किया जा सकता है। विस्तार के दौरान हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
  5. जब संस्कृतियां स्थिरता तक पहुंचती हैं तो क्रायोसंरक्षित एनपीसी।
    1. क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए टुकड़ी समाधान (1x) के 1 एमएल में कोशिकाओं को अलग करना, फिर टुकड़ी समाधान को हटाने के लिए 370 x ग्राम पर 2 मिन के लिए अपकेंद्रित्र निलंबन।
    2. सेल फ्रीजिंग समाधान जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) 1 x 106 कोशिकाओं/mL पर विसोसिटेड NPCs के लिए और क्रायोवियल्स को 1 mL aliquots वितरित करें ।
    3. क्रायोवियल्स को फ्रीजिंग कंटेनर में रखें और उन्हें रात भर एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
  6. क्रायोवियल्स को लिक्विड नाइट्रोजन में स्टोर करें।

6. पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीईओ) और लैमिनिन कोटेड प्लेट्स की तैयारी

  1. पीईओ/लेमिनिन कोटेड प्लेटें तैयार करने के लिए पीओएस या पानी में पीलो स्टॉक सॉल्यूशन को 10 μg/mL की अंतिम एकाग्रता में पतला करें । पतला पीलो समाधान के 1 मिलील के साथ एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से और कोट करें।
  2. कम से कम 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. प्रत्येक को पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोलें।
  4. ठंडे पीबीएस या पानी में 10 μg/mL पर पतला लेमिनस्टॉक समाधान । लेमिनिन समाधान को अच्छी तरह मिलाएं। पीबीएस निकालें और तुरंत लेमिनिन समाधान के 1 mL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कोट करें। प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें और 1 सप्ताह के भीतर उपयोग करें। पीबीएस से धोएं और तुरंत कल्चर मीडियम जोड़ें।
    नोट: पीलो/लेमिनिन लेपित प्लेटों को सूखने न दें ।

7. डोपमिनर्जिक न्यूरॉन्स में एचएसईसी-व्युत्पन्न एनपीसी का भेदभाव(चित्र 6ए)

  1. एनपीसी विस्तार माध्यम में पीएलओ/लैमिनिन-लेपित व्यंजनों में प्लेट एनपीसी लगभग ५०% के घनत्व पर ।
  2. 24 घंटे के बाद, माध्यम को DA1 माध्यम (न्यूरोबेसल माध्यम जिसमें 2 mM ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 1x एनईए, 1x B27, 200 एनजी/mL SHH, और 100 एनजी/mL FGF8) में परिवर्तन करें और हर दूसरे दिन माध्यम को बदलें।
  3. जब वे संवर्तन तक पहुंचते हैं तो मार्ग संस्कृतियां। टुकड़ी समाधान (1x) के 1 mL के साथ कोशिकाओं को अलग करना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए इनक्यूबेट।
  4. 370 x ग्राम पर 2 मिन के लिए कोशिकाओं को केंद्रित करें और टुकड़ी समाधान अधिनात को हटा दें। DA1 मध्यम के 1 mL जोड़ें और कोमल पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  5. प्लेट 1 x 105 पीएल पीईओ/लेमिनिन-लेपित 6 अच्छी प्लेटों पर DA1 माध्यम के 2 mL में कोशिकाओं ।
  6. 10 दिनों के बाद, DA2 मध्यम (न्यूरोबेसल माध्यम जिसमें 2 एमएम ग्लूटामाइन सप्लीमेंट, 1x एनईए, 1x बी 27, 200 माइक्रोएम एस्कोबिक एसिड, 20 एनजी/एमएल बीडीएनएफ, और 20 एनजी/एमएल जीएनडीएफ) में परिवर्तन करें और अतिरिक्त 20 दिनों के लिए हर दूसरे दिन मध्यम बदलें(चित्रा 6ए)।
    नोट: DA2 माध्यम के लिए दैनिक ताजा ascorbic एसिड जोड़ें। पहले 14 दिनों के भीतर, विभेदित कोशिकाओं को पारित किया जाना चाहिए जब वे ९०% प्रवाह तक पहुंचते हैं, लेकिन अब उसके बाद नहीं ।

8. एस्ट्रोसाइट्स में ईएससी-व्युत्पन्न एनपीसी का भेदभाव

  1. एनपीसी विस्तार माध्यम में पीएलओ/लैमिनिन-लेपित प्लेटों पर प्लेट तंत्रिका जनक कोशिकाएं लगभग ५०% के घनत्व पर ।
  2. 24 घंटे के बाद मीडियम को एस्ट्रोसाइट मीडियम (डीएमईएम/एफ12 मीडियम में बदलें जिसमें 1:100 एन2, 1:100 बी 27, 200 एनजी/एमएल आईजीएफ, 10 एनजी/एमएल एक्टिविन ए, 10 एनजी/एमएल इसमें गुगुलिन-1, और 8 एनजी/एमएल बीएफएफएफ) और हर दूसरे दिन मीडियम बदलें ।
  3. जब वे संवर्तन तक पहुंचते हैं तो मार्ग संस्कृतियां। टुकड़ी समाधान (1x) के 1 mL के साथ कोशिकाओं को अलग करना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए इनक्यूबेट।
  4. 370 x ग्राम पर 2 मिन के लिए कोशिकाओं को केंद्रित करें और टुकड़ी समाधान अधिनात को हटा दें। एस्ट्रोसाइट माध्यम के 1 mL जोड़ें और कोमल पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  5. प्लेट 1 x 105 कोशिकाओं में एस्ट्रोसाइट माध्यम के 2 mL PLO/laminin-लेपित 6 अच्छी तरह से व्यंजन ।
  6. कुल 5-6 सप्ताह(चित्रा 6बी)के लिए भेदभाव जारी रखने की अनुमति दें।

9. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए ऊपर वर्णित 35 मिमी μ-व्यंजन में संस्कृति कोशिकाएं। मध्यम Aspirate और प्रति डिश 4% पीएफए समाधान के 1 mL जोड़ें और आरटी में 20 मेंस के लिए इनक्यूबेट ।
  2. पीबीएस के साथ 5 मिन के लिए 2x धोएं।
    नोट: एक बार कोशिकाओं को ठीक कर रहे हैं, परख प्लेटों पैराफिल्म के साथ सील किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । निर्धारण के बाद 1 सप्ताह के भीतर एंटीबॉडी के साथ दाग।
  3. 30-60 मिन के लिए आरटी में प्रति डिश और इनक्यूबेट को अवरुद्ध समाधान (पीबीएस में बकरी या गधा सीरम) के 300 माइक्रोन जोड़ें।
  4. डिश 2x को 5 मिन के लिए पीबीएस से धो लें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी(टेबल 1)समाधान (अवरुद्ध समाधान में पतला) के 300 माइक्रोन जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे या रात भर के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  6. 10 मिन के लिए पीबीएस के साथ 2x धोएं।
  7. आरटी में 1 एच के लिए अंधेरे में समाधान और इनक्यूबेट को अवरुद्ध करने में फ्लोरोसेंट-कॉन्जुगेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी(टेबल 1)के 300 माइक्रोन जोड़ें।
  8. पीबीएस के साथ 10 मिन के लिए कोशिकाओं 2x धोएं।
  9. नाभिक दाग करने के लिए Hoechst धुंधला समाधान (पीबीएस में 1 μM अंतिम एकाग्रता) जोड़ें । आरटी में 5 मिन के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  10. 5 मिन के लिए पीबीएस के साथ 1x धोएं और फिर पीबीएस के 500 माइक्रोन जोड़ें। बर्तन को अंधेरे में रखें, फिर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ फ्लोरेसेंस का निरीक्षण करें(चित्रा 2बी, चित्रा 5सी, चित्रा 6ए,और चित्रा 7बी)।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत एचईसी की एकल-सेल प्रकार की संस्कृति के रखरखाव और विस्तार और तंत्रिका जनक कोशिकाओं में उनके कुशल भेदभाव के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल है, जो बाद में विभिन्न डाउनस्ट्रीम तंत्रिका वंशों में अंतर करता है, जिसमें डोपमिनेर्जिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स शामिल हैं।

प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियां एकल-सेल प्रकार संस्कृति(चित्र 1ए)के लिए कॉलोनी प्रकार एचसीएससी के अनुकूलन के दौरान विभिन्न चरणों में सेल आकृति विज्ञान दिखाती हैं। एकल सेल संस्कृति की स्थिति के माध्यम से, यह पाया गया कि अनुकूलित एचईसी उच्च घनत्व पर बनाए रखने में सक्षम थे, फिर शांति तक पहुंचने पर आसानी से और कुशलता से उपसंस्कृति(चित्रा 1ए, बी)। इन कोशिकाओं ने सेल चक्र विशेषताओं (यानी, एक छोटे जी1 चरण और एस चरण में कोशिकाओं का उच्च अनुपात) कॉलोनी प्रकार के एचसीएससी(चित्रा 1सी, डी)के विशिष्ट बनाए रखा। उन्होंने क्यूआरटी-पीसीआर और इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण(चित्रा 7, तालिका 2)द्वारा इंगित कॉलोनी प्रकार के एचईसी के समान स्तरों पर ईएससी मार्कर (यानी, OCT4, TRA 1-81, SOX2 और NANOG) भी व्यक्त किए । इसके अलावा, यह दिखाया गया कि एकल-कोशिका एचएसईसी भ्रूणीय शरीर बनाने में सक्षम थे जिनमें सभी तीन रोगाणु परतों से कोशिकाएं थीं: एंडोडेम (SOX17 अभिव्यक्ति), मेसोडरम (एसएमए अभिव्यक्ति) और एक्टोडर्म (तुज-1 अभिव्यक्ति)(चित्रा 2)।

इसके बाद, यह प्रदर्शित किया गया कि एकल-सेल प्रकार एचएसईसी ने एनपीसी प्रोटोकॉल(चित्रा 3ए)का उपयोग करके तंत्रिका जनक कोशिकाओं में कुशलतापूर्वक अंतर किया, जैसा कि विशिष्ट एचएसएससी आकृति विज्ञान और एनपीसी आकृति विज्ञान(चित्रा 3बी)16के नुकसान से संकेत मिलता है। एनपीसी भेदभाव हस्ताक्षर एनपीसी मार्कर (यानी, SOX1, OTX2, ZIC1, और OTX1) की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति द्वारा समर्थित था; चित्रा 5ए, टेबल 2)और इम्यूनोस्टेनिंग और एफएसीएस विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई है। इसी विश्लेषण से यह भी पता चला है कि 90% से अधिक कोशिकाएं SOX1, PAX6 और NCAM प्रोटीन(चित्रा 5बी, सी)के लिए सकारात्मक सना हुआ। विभिन्न डाउनस्ट्रीम तंत्रिका वंशों में अंतर करने के लिए एकल-सेल एचएसईएससी-व्युत्पन्न एनपीसी की क्षमता की जांच करने के लिए, इन कोशिकाओं के डोपमिनरिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स में अंतर की जांच की गई। जैसा कि चित्र 6ए, बीमें दिखाया गया है, एकल-सेल एचएसईएससी-व्युत्पन्न एनपीसी डोपमिनेर्जिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स में अंतर करने में सक्षम थे, जैसा कि विशेषता मॉर्फोलोजी की उपस्थिति और वंश-विशिष्ट डोपमिनर्जिक मार्कर (यानी, टीएच; चित्रा 6ए)और एस्ट्रोसाइट मार्कर (यानी, GFAP और S100B; चित्रा 6बी)।

Figure 1
चित्रा 1: एकल सेल प्रकार संस्कृति के लिए कॉलोनी प्रकार hESCs का अनुकूलन । (क)2% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित व्यंजनों पर चढ़ाना के बाद अलग-अलग समय पर एच9 एचईसी की एकल कोशिका संस्कृतियों की प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियां। कम (बाएं) और उच्च (दाएं) आवर्धन । शीर्ष पैनल: कॉलोनी प्रकार के एचएसईसी की प्रतिनिधि छवि। अन्य पैनल एकल-सेल प्रकार एचईसी के अनुकूलन के दौरान विभिन्न समयों पर संस्कृतियों की प्रतिनिधि छवियों को दिखाते हैं। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (ख)एच9 एचईसी के विकास घटता एकल कोशिका संस्कृति की स्थिति के दौरान पहले 24 घंटे के लिए 10 माइक्रोन रॉक अवरोधक के साथ 2% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-कोटेड प्लेटों में निगरानी की गई थी । (C,D) फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कॉलोनी प्रकार(सी)और एकल-सेल प्रकार(डी)एच9 एचईसी का सेल चक्र विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अनुकूलित एकल कोशिका प्रकार एचएसएससी के इन विट्रो भेदभाव को तीन रोगाणु परतों में। (क)एचईसी के एकल-सेल प्रकार से प्राप्त भ्रूणीय निकायों (ईबी) के प्रतिनिधि चरण छवियां। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ख)विभेदित एचएसईसी की इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियों ने तीन अलग-अलग रोगाणु परत मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया: SOX17 (एंडोडेम), एसएमए (मेसोडर्म), और तुज-1 (एक्टोडर्म)। नाभिक को डीपीआई से दाग दिया गया। स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एकल कोशिका प्रकार एचएसईसी का अंतर प्रत्यक्ष विभेदन द्वारा तंत्रिका जनक कोशिकाओं में। (A)तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एनपीसी) में एचएसईसी के विभेदन प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध । एचएसईसी को चढ़ाना के 1 दिन बाद डोरसोमॉर्फिन (डीएमएच) और एसबी431542 (एसबी) से इलाज किया गया । (ख)तंत्रिका विभेदन के दौरान सेल आकृति विज्ञान की प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियां। स्केल बार = 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स उत्पादों पर एचएसईएससी संस्कृति। (ए)मातृगेल या गेल्ट्रेक्स पर सुसंस्कृत एचएसईसी ने एनपीसी में बढ़ने और अंतर करने की क्षमता का प्रदर्शन किया जो एकल सेल-संस्कृति के समान था । कोशिकाओं को नेटिन एंटीबॉडी से दाग दिया गया । नाभिक को डीपीआई से दाग दिया गया। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (ख)मातृगेल या गेट्रेक्स पर सुसंस्कृत एचएसईसी ने नेटिन और पैक्स6-सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत द्वारा इंगित एनपीसी में अंतर करने की समान क्षमता दिखाई । कोशिकाओं को एनपीसी भेदभाव के दिन 7 पर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एनपीसी मार्कर की अभिव्यक्ति । (क)तंत्रिका भेदभाव के 7 दिनों के बाद, एनपीसी मार्कर जीन (यानी, OTX1, OTX2, SOX1, और ZIC1) की अभिव्यक्ति QRT-पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया था । मूल्यों को GAPDH को सामान्य किया गया और एचएसईसी (पी एंड एलटी; 0.05) के मूल्यों के सापेक्ष गणना की गई। (ख)SOX1-, NESTIN-, SOX2-, और NCAM-सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत एनपीसी भेदभाव के दिन 7 पर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था । (C)दिन 7 एनपीसी भेदभाव पर, कोशिकाओं को तंत्रिका मार्कर SOX1, NESTIN, NCAM, OTX2, और PAX6 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया । नाभिक को डीपीआई से दाग दिया गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र6: एकल सेल प्रकार एचएसईसी से प्राप्त एनपीसी के डोपमिनेर्गिक न्यूरॉन और एस्ट्रोसाइट भेदभाव। (A)डोपमिनर्जिक न्यूरॉन्स (शीर्ष पैनल) की प्रतिनिधि चरण विपरीत छवि। स्केल बार = 100 माइक्रोन। विभेदित कोशिकाओं को डोपमिनर्जिक न्यूरॉन मार्कर TH (टायरोसिन हाइड्रोक्सीलेस) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था जैसा कि संकेत दिया गया है। नाभिक को डीपीआई से दाग दिया गया। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (ख)एस्ट्रोसाइट्स (शीर्ष पैनल) की प्रतिनिधि चरण विपरीत छवि। स्केल बार = 100 माइक्रोन। विभेदित कोशिकाओं को एस्ट्रोसाइट मार्कर GFAP (ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन) और S100-B (S100 कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन बी) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था, जैसा कि संकेत दिया गया है । नाभिक को डीपीआई से दाग दिया गया। स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एकल सेल प्रकार hESCs का लक्षण वर्णन। (A)एचईसी को क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा ईएससी मार्कर (यानी, OCT4, NANOG और SOX2) की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया था। मूल्यों को गगध (पी एंड एलटी; 0.05) को सामान्य किया गया था। (ख)एमसीएससी की इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां प्लीरेटेंसी मार्कर OCT4, TRA-1-81 और SSEA-1 की अभिव्यक्ति के लिए दागित । नाभिक को डीपीआई से दाग दिया गया। स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्राथमिक एंटीबॉडी प्रजातियां कमजोर पड़ना कैटलॉग नंबर कंपनी
OCT4 माउस 1:1000 अनुसूचित जाति-5279 सांताक्रूज़
टीआरए 1-81 माउस 1:500 अनुसूचित जाति-21706 सांताक्रूज़
SSEA-1 माउस 1:500 अनुसूचित जाति-21702 सांताक्रूज़
SOX1 बकरी 1:500 वायु सेना-3369 आर एंड डी
SOX2 खरगोश 1:1,000 अनुसूचित जाति-20088 सांताक्रूज़
Sma खरगोश 1:500 एबी-5694 एबीसीएएम
तुज1 माउस 1:1000 T8578 सिग्मा
नेस्दीन माउस 1:1000 एबी-22035 एबीसीएएम
OTX2 माउस 1:250 एबी-21990 एबीसीएएम
एचएनसीएएम माउस 1:200 अनुसूचित जाति-106 सांताक्रूज़
एचपीएएक्स6 माउस 1:250 561664 Bd
Th माउस 1:500 T1299 सिग्मा
S100b माउस 1:250 ab4066 एबीसीएएम
जीएफएपी खरगोश 1:1,000 ab7260 एबीसीएएम
माध्यमिक एंटीबॉडी
एंटी-माउस बकरी 1:1,000 वायु सेना 488 या 647 लाइफ टेक्नोलॉजीज
खरगोश विरोधी बकरी 1:1,000 वायु सेना 488 या 647 लाइफ टेक्नोलॉजीज

तालिका 1: इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और एफएसीएस विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी।

प्राइमर नाम प्राइमर सीक्वेंस
OCT4 एफ: GGAAGGTATTCAGAACG
आर: CTCCAGGTTGCCTCTCACTC
नैनोजी एफ: GGTTCCAGAAAAGAATGAGA
आर: ATTGGAAGGTTTAGTCG
SOX1 एफ: CCTTAGTTTCCCCTCTCTTTTT
आर: CAGGCTGAATTCTTCTCTT
OTX1 एफ: AaGATCAACCTGCCGGAGTCT
आर: CGTGAATTGGCCACTGCTTT
OTX2 एफ: TGGAAGCACTGTGTGCCAAG
आर: TAAACCATACCTGCCCTCG
ZIC1 एफ: AaCCCCAAAAAGTCGTGCAAC
आर: TCCTCCCAGAAGCAGATGTGA
गगध एफ: CCCATCACCATCTTCCAGGAG
आर: CTTCTCCATGGTGGTGAAGACG

तालिका 2: क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर की सूची।

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Discussion

विभिन्न वंशों में एचएसईसी के भेदभाव के लिए स्केलेबल और कुशल तरीके और विभेदित कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या का उत्पादन दवा स्क्रीनिंग और स्टेम सेल थेरेपी के लिए महत्वपूर्ण मानदंड हैं। विभिन्न एकल-कोशिका पासिंग विधियां प्रकाशित की गई हैं, जिसमें कोशिकाओं को जीवित रहने में सुधार करने के लिए रॉक अवरोधक या अन्य छोटे अणुओं की उपस्थिति में सुसंस्कृत किया जाता है, लेकिन इन संस्कृति विधियों के अंतिम उत्पाद कॉलोनी प्रकार के एचईसी17,18,19,20, 21हैं। एकल-सेल ईएससी प्रोटोकॉल, जो आंशिक रूप से पहले प्रकाशित तरीकों19,20,21,22पर आधारित है, सफलतापूर्वक एकल सेल-प्रकार एचएसईएससी संस्कृतियों को उत्पन्न और बनाए रखता है और कॉलोनी प्रकार एचएसईएससी संस्कृति को रोकता है। इसमें उच्च घनत्व एकल सेल चढ़ाना, बहुकोशिकीय संघ, मोनोलेयर ग्रोथ और कुशल उपसंस्कृति(चित्रा 1)शामिल हैं। बाद में एचईसीसी की एकल-कोशिका प्रकार की संस्कृति के शुरुआती 24 घंटे के दौरान रॉक अवरोधक के अलावा हासिल किया गया था, जो सेल अस्तित्व17,18,19,20, 21में सुधार करता है। यह प्रोटोकॉल अधिक आसानी से स्केलेबल है और दवा स्क्रीनिंग और स्टेम सेल में चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए इन कोशिकाओं के विस्तार की अनुमति देता है।

यह भी दर्शाया गया है कि एकल-सेल प्रकार के एचईसीईईईईईईई और रोसेट गठन23,24,25जैसे मध्यवर्ती चरण के उपयोग के बिना एनपीसी वंश(चित्रा 3)में कुशलतापूर्वक अंतर कर सकते हैं। एकल-सेल प्रकार एचईएससी से उच्च तंत्रिका रूपांतरण एएलके अवरोधकों, डोरसोमॉर्फिन और एसबी43154215,16,26के साथ उपचार द्वारा बीएमपी/टीजीएफ/एक्टिविन सिग्नलिंग रास्तों के अवरोध के माध्यम से प्राप्त किया गया था । इस प्रोटोकॉल के साथ, अनुकूलित एकल-सेल प्रकार के एचईसी ईबी और रोसेट गठन(चित्रा 5)की आवश्यकता के बिना एनपीसी में कुशलतापूर्वक अंतर कर सकते हैं और या डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स(चित्रा 6)में अंतर करने के लिए प्रेरित हो सकते हैं।

संक्षेप में, एचएसईसी की एकल-कोशिका प्रकार की संस्कृति विभिन्न वंशों के लिए मल्टीस्टेप विभेदन को विनियमित करने वाले आणविक तंत्रों का अध्ययन करने के लिए एक त्वरित और कुशल प्रणाली प्रदान करती है। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल ने एनपीसी का उपयोग किया और उनके बाद के भेदभाव को अतिरिक्त तंत्रिका वंशों में वर्णित किया, जैसे एस्ट्रोसाइट्स और डोपमिनर्जिक न्यूरॉन्स। प्रोटोकॉल जनक और विभेदित कोशिकाओं के सरल, मजबूत और स्केलेबल उत्पादन के लिए एक मंच प्रदान करता है जो पुनर्योजी चिकित्सा में बुनियादी अध्ययन, दवा स्क्रीनिंग और अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।

Acknowledgments

हम FACS विश्लेषण के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ कार्ल डी बोर्टनर (NIEHS) का शुक्रिया अदा करते हैं । इस शोध को राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, Z01-ES-101585 के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा AMJ को समर्थन दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm m-dishes ibidi 81156 Cell culture dish
6-well plates Corning 3516
Accutase Innovative Cell Technologies AT104-500 Cell detachment solution
Activin A R&D system 338-AC-050
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4403
B27 supplement Thermo Fisher 17504044
B27 supplement (-Vit A) Thermo Fisher 12587010
BDNF Applied Biological Materials Z100065
bFGF Peprotech 100-18C
Centrifuge DAMON/ICE 428-6759
CO2 incubator Thermo Fisher 4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) Corning 354277 Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)
Cryostor CS 10 Stemcell Technologies 7930 Cell freezing solution
Dispase Stemcell Technologies 7923
DMEM Thermo Fisher 10569-010
DMEM/F12 Thermo Fisher 10565-018
Dorsomorphin Tocris 3093
EGF Peprotech AF-100-16A
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3007003HI
FGF8 Applied Biological Materials Z101705
GDNF Applied Biological Materials Z101057
Geltrex matrix Thermo Fisher A1569601 Basement membrane matrix
GlutaMax Thermo Fisher 35050061 Glutamine supplement, 100X
H9 (WA09) human embryonic stem cell line WiCell WA09
Heregulin b-1 Peprotech 100-3
IGF Peprotech 100-11
Knockout DMEM Thermo Fisher 10829018
Knockout Serum Replacement Thermo Fisher 10828028
Laminin Sigma Aldrich L2020
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850 hESC culture medium
N2 supplement Thermo Fisher 17502001
NEAA Thermo Fisher 11140050
Neurobasal Thermo Fisher 21103049
Poly-L-ornithine Sigma Aldrich P3655
ROCK inhibitor Tocris 1254
SB431542 Tocris 1614
SHH Applied Biological Materials Z200617
Stemdiff Neural Progenitor medium Stemcell Technologies 5833 NPC expansion medium

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References

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मानव भ्रूण स्टेम सेल के एकल सेल संस्कृति का उपयोग कर कुशल तंत्रिका भेदभाव
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Jeon, K., Park, K., Jetten, A. M.… More

Jeon, K., Park, K., Jetten, A. M. Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (155), e60571, doi:10.3791/60571 (2020).

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