Summary
石英晶体微平衡可为微米或亚微米范围内的薄膜提供精确的质量和粘弹性特性，与生物医学和环境传感、涂料和聚合物科学的研究相关。样品厚度影响可以从与传感器接触的材料中获得哪些信息。
Abstract
在这项研究中，我们提供了各种例子，说明石英晶体微平衡实验的薄膜制备如何为数据的适当建模提供信息，并确定可以量化薄膜的特性。石英晶体微平衡通过观察石英晶体在高频振荡的机械共振变化，为测量应用薄膜的质量变化和/或机械性能提供了一个独特的敏感平台。这种方法的优点包括其实验多功能性、研究各种实验时间长度内性能变化的能力，以及使用小样本尺寸。我们证明，根据沉积在传感器上的层的厚度和剪切模量，我们可以从材料中获得不同的信息。在这里，这一概念被专门用于显示实验参数，从而在膨胀期间对黄金和聚电解质复合物的吸附胶原蛋白进行质量和粘弹性计算，作为盐浓度的函数。
Introduction
石英晶体微平衡 （QCM） 利用石英晶体的压电效应来监测其谐振频率，该频率取决于附着在表面的质量。该技术将 AT 切割石英晶体传感器（通常在 5 MHz 范围内）1在空气或流体中的谐振频率和带宽与薄膜沉积后传感器的频率和带宽进行比较。使用 QCM 研究薄膜特性和界面有几个好处，包括对质量的高灵敏度和潜在的粘弹性特性变化（取决于样品均匀性和厚度），在原位2处进行研究的能力，以及比传统的流变流变学或动态机械分析 （DMA） 更短的流变时间刻度的能力。探测一个较短的流变时间刻度可以观察这个时间尺度的响应在极短（ms）3和长（年）持续时间4中的变化。这种能力有利于研究各种动力学过程，也是传统测变技术5，6的有用延伸。
QCM 的高灵敏度也导致其大量用于研究极小生物分子基本相互作用的生物应用。未涂布或功能化的传感器表面可用于研究蛋白质吸附;更进一步说，通过酶、抗体和贴合剂之间的复杂结合事件进行生物感应，可以根据质量7、8、9的变化进行检测。例如，该技术已经用于了解囊泡到平面脂质双层的转化，作为吸附含液体的囊泡到刚性结构的两相过程，通过观察相关的频率和粘弹性10的变化。近年来，QCM还提供了一个强大的平台来监测囊泡或纳米粒子11的药物输送。在材料工程与分子和细胞生物学的交叉点，我们可以使用QCM阐明材料与蛋白质、核酸、脂质体和细胞等生物活性成分之间的关键相互作用。例如，蛋白质吸附到生物材料中调解下游细胞反应，如炎症，并经常用作生物相容性的积极指标，而在其他情况下，细胞外蛋白附着在涂层上，与血液结合，可诱导血管中危险的凝血。因此，QCM 可用作选择最适合不同需求的候选者的工具。
执行QCM实验的两种常见方法从实验中收集类似的数据：第一种方法记录电导峰值的频率偏移和半带宽（+）。第二种方法，具有耗散的QCM（QCM-D），通过方程1、14记录频率偏移和耗散因子，这与α成正比
(1)
其中D是耗散因子，而 * 是频率。D和+都与薄膜对传感器的阻尼效应有关，后者指示薄膜的刚度。下标n表示频率泛音或谐波，即石英传感器的奇数谐振频率（n = 1、3、5、7...）。在约翰斯曼14和舒尔组15、16、17、18的回顾中，可以进一步讨论使用多谐波来获得薄膜质量和粘弹性特性的模型。
准备 QCM 样品的一个关键考虑因素是如何将薄膜涂在传感器表面。一些常见的方法包括旋转涂层，浸渍涂层，滴涂层，或吸附膜到传感器表面的实验19，20。QCM 样品有四个区域：绍尔布雷极限、粘弹性制度、散装制度和过度阻尼制度。对于足够薄的薄膜，应用 Sauerbrey 限制，其中频率偏移（μ+）提供薄膜的表面质量密度。在Sauerbrey极限内，频率偏移与谐振谐波、n和阻尼因子（D或d+）的变化一般较小。"在此制度下，没有作出其他假设，就没有足够的信息来唯一地确定层的经变性质。此制度中的数据用于计算薄膜的表面质量密度（或厚度，如果密度已知为先验） 。在与晶体接触的介质足够厚的散装体中，消逝的剪切波在被完全阻尼之前传播到介质中。在这里，不能使用α获得质量信息。然而，在这个区域，粘弹性特性是使用β和+15、18的组合可靠地确定的。在散装系统中，如果介质太硬，薄膜会抑制传感器的谐振，从而阻止从 QCM 收集任何可靠数据。粘弹性系统是薄膜足够薄，使剪切波在薄膜中完全传播的中间体，对阻尼因子具有可靠的值。阻尼因子和α可用于确定薄膜的粘弹性特性及其质量。在这里，粘弹性特性由复杂剪切模量的密度和幅度的乘积给出|G|p和由 [ = 弧形 （G' / G'） 给出的相位角度。当薄膜在Sauerbrey极限下制备时，单位面积的质量可以直接根据低于21所示的Sauerbrey方程计算。
(2)
其中μ n是谐振频率的变化，n是感兴趣的泛音，α1是传感器的谐振频率，μm / A是薄膜每个区域的质量，Zq是石英的声学阻抗，对于 AT 切割石英的声阻抗是Zq = 8.84 x 106kg / m2s。 粘弹性系统最适合于聚合物薄膜的研究，体积极限可用于研究粘性聚合物22或蛋白质溶液16。不同的制度取决于感兴趣材料的特性，全粘弹性和质量表征的最佳厚度通常随着薄膜刚度的增加而增加。图 1描述了薄膜的虚密度、复杂剪切模量和相角的四个区域，其中我们假定相角和薄膜刚度之间存在特定关系，已证明与此类材料相关。许多实际感兴趣的薄膜太厚，无法用QCM研究粘弹性特性，例如某些生物膜，其厚度在几十至几百微米23。这种厚膜通常不适合使用QCM进行研究，但可以使用低频率的共振器（如扭转共振器）23进行测量，使剪切波进一步传播到薄膜中。
要确定哪种系统与给定的QCM样品相关，必须了解d/+n参数，即石英晶体传感器（μn）15、16、18的膜厚度（d）与机械振荡的剪切波长之比。理想的粘弹性机制是d / μn = 0.05 - 0.218，其中低于 0.05 的值在 Sauerbrey 限制内，高于 0.2 的值接近散装系统。d /=n的更严格描述在别处提供了15、18，但它是一个定量参数，用于描述 Sauerbrey 极限和粘弹性极限。下面使用的分析程序直接提供此参数。
使用 QCM 分析薄膜还有一些额外的限制。Sauerbrey 和粘弹性计算假定薄膜在整个薄膜厚度和在 QCM 的电极表面横向均质。虽然这一假设使得研究存在空隙或填充物的薄膜变得具有挑战性，但一些QCM对由移植纳米粒子6组成的薄膜进行了一些QCM调查。如果异质性与整体薄膜厚度相比较小，则仍可获得复合材料系统的可靠粘弹性特性。对于更多异构系统，应始终非常谨慎地看待从粘弹性分析中获得的值。理想情况下，从未知异质性系统获得的结果应针对已知均质的系统进行验证。这是我们在本文描述的示例系统中采用的方法。
本文中阐述的一个重要点是，在频域（报告*）中进行的 QCM 测量与时域实验（其中D报告）之间的精确对应关系。介绍了两个不同的QCM实验的结果，一个时域和一个频域，每个实验都涉及一个不同的但概念上相关的模型系统。第一个系统是胶原蛋白附着到传感器上的一个简单示例，用于说明在时域 （QCM-D） 测量期间具有代表性的绑定动力学和随着时间的推移的吸附平衡。胶原蛋白是体内最丰富的蛋白质，以其结合行为和形态的多功能性而闻名。此处使用的胶原蛋白溶液不需要传感器的黄金表面进行额外的功能化，以诱导吸附9。第二个实验系统是一种聚电解质复合物（PEC），由阴离子聚苯乙烯磺酸（PSS）和阳离子聚苯甲酸酯（二甲基氨）（PDADMA）组成，其制备方式与萨德曼等人22号相同。这些材料在盐中膨胀并变得柔软（本例中为KBr），为使用频域方法（QCM-Z）研究聚合物力学提供了一个简单的平台。对于每个协议，准备、获取和分析测量的过程如图2 所示。原理图表明，QCM-Z和QCM-D方法的主要区别在于数据收集步骤和实验中使用的仪器。所有上述样品制备技术都与这两种方法兼容，每种方法都可以分析图1所示的三个区域中的样本。
我们的数据表明，样品的制备，无论是通过传感器涂层在测量之前还是在测量过程中，决定了提取系统粘弹性特性的能力。通过适当地设计实验的早期阶段，我们可以确定在分析步骤中我们可以准确收集哪些信息。
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Protocol
QCM-D 胶原蛋白吸附
1. 样品制备和传感器预清洁
- 准备 20 mL 的 0.1 M 醋酸缓冲液，根据需要使用 HCl 和 NaOH 调节 pHH，以实现 pH = 5.6。
- 在无菌条件下将大鼠尾部胶原蛋白溶液添加到20 mL的醋酸缓冲液中，最终浓度为10微克/mL。
- 清洁镀金石英传感器，去除有机和生物材料25，26。
- 将传感器活动侧向上置于紫外线/臭氧室中，并处理表面约 10 分钟。
- 加热去离子水（dH2O）、氨（25%）的混合物5：1：1和过氧化氢 （30%）到75°C。将传感器放入溶液中 5 分钟。
- 用 dH2O 冲洗传感器，然后用氮气流干燥。
- 将传感器活动侧向上置于紫外线/臭氧室中，并处理表面 10 分钟。
注：在测量之前应立即执行清洁程序，以尽量减少传感器表面的环境污染。
2. QCM-D 测量数据采集
- 打开所有必要的设备进行测量，包括泵、电子装置和计算机软件。
- 从造型室平台上拆量模块，然后拧下大拇指螺钉以打开模块。
- 如果在初始清洁后传感器被遗漏（步骤 1.3.1-1.3.4），则用去离子水 （dH2O） 冲洗传感器，然后用氮气流干燥，以确保表面没有污染物。
- 将传感器安装在外露的 O 形环上的流量模块中，首先用氮气流干燥区域，并检查 O 形环是否平放。传感器应置于有源表面朝下和锚形电极朝向流模块中的标记时。
- 转动拇指螺钉以密封流量模块并将其更换到造型室平台上。将任何必要的 PTFE 泵管连接到流量模块和外部泵。
- 使用适当的计算机软件，将流量模块的温度设置为 37°C。监控变化温度 10-15 分钟，确保温度与所需值平衡。
- 查找传感器的初始谐振频率。如果软件未发现任何谐振频率，请检查流量模块是否正确定位在造型室平台上，或将传感器重新安装在流量模块中，以确保其居中并进行正确的电气接触。
- 将进气泵管放入 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液中。以 25 μL/min 启动外部泵流量，并目视检查油管，确保液体流经管。
注： 通过暂时将流体流速增加到 100 μL/min 或更高，流体流动可能更容易看到。如果液体似乎没有通过管体移动，则很可能流量模块的两个部分没有形成正确的密封。尝试拧紧拇指螺钉，将油管接头拧紧到入口和出口，或重新安装传感器以确保 O 型环是平整的居中。 - 让 1x PBS 的流体流过流模块至少 15 分钟，以正确平衡。
- 在计算机软件中开始测量以开始数据采集。监控频率和耗散值至少 5 分钟，以确保基线稳定。
- 停止泵并将进气管移到胶原蛋白-醋酸缓冲液溶液中，然后恢复流体流动。请注意此事件的时间，以便以后进行分析。
- 允许新的频率和耗散值平衡到稳定值。在这里，我们预计这种稳定发生在8-12小时后。
- 停止泵，将进气管移回 1x PBS 溶液，然后恢复流体流动。请注意此事件的时间，以便以后进行分析。
- 允许新的频率和耗散值平衡到稳定值。在这里，这种稳定发生在30分钟后。
注：步骤2.13和2.14可以在更严格的实验中重复每个新的流体流动期，具有更多的阶段。 - 结束测量的数据采集并保存数据。
- 清洁并拆卸 QCM 设备。
- 将外部泵的流体流速提高到 500 μL/min 或更高，并将进气管放入 2% 的 Hellmanex 清洁溶液中至少 20 分钟。
注：对于其他实验，如果需要对传感器进行进一步分析，请在第 2.16.1 步之前拆下传感器，并在模块中放置另一个清洁传感器。 - 停止泵并将进气管移到 dH2O，然后恢复流体流动以进一步冲洗系统至少 20 分钟。
- 停止流体流动，并将传感器从流量模块中取出。用氮气流干燥传感器和流量模块内部。关闭计算机软件、电子装置和蠕动泵。
注：可正确清洁镀金传感器，如步骤 1.3.1-1.3.4 中所述，并可重复使用以进行多次测量。传感器无法再用于可靠测量的迹象可能包括但不限于初始谐振频率的较大变化和缓冲流的基线测量中的显著漂移。数据可以在首选软件中打开和分析，包括由专门从事 QCM-D 设备的公司提供的数据。
- 将外部泵的流体流速提高到 500 μL/min 或更高，并将进气管放入 2% 的 Hellmanex 清洁溶液中至少 20 分钟。
QCM 聚电解质复合膨胀
3. 样品制备
注：此实验是使用舒尔研究小组中为数据收集和分析开发的 MATLAB 程序进行的。
- 首先，将裸石英晶体传感器放置在连接到矢量网络分析仪和计算机的样品支架中。打开分析仪，向传感器施加振荡电压，并收集空气中传感器的参考电导谱。
- 将样品架浸入充满蒸馏水的无唇 100 mL 烧杯中，并收集水中裸传感器的参考电导谱。
- 制备 0.5 M 溴化钾溶液（KBr）。
- 将 1.79 克 KBr 溶解在 30 mL 蒸馏水中。摇动直到溶解。
- 以一定角度将小硅晶片插入 KBr 溶液中，在退火步骤期间为石英传感器创建幻灯片，以防止薄膜从传感器上脱落。
- 准备传感器以进行旋转涂层。
- 将旋转涂层参数设置为 10，000 rpm、8，000 加速度和 5 s。
- 将传感器插入旋转涂层，然后打开真空。
- 用乙醇盖住传感器表面，然后运行旋转涂层以清洁传感器表面。
- 添加 PEC （PSS：PDADMA） 的编制方式与萨德曼等人中详述的相同。22） 到传感器表面。
- 如果复合物分为两个阶段（聚合物富集和聚合物贫乏），则缓慢地将移液插入溶液中。通过吹气泡来排空移液器，同时将移液器移入更稠密的聚合物富集阶段。
- 在聚合物富集相中释放一对夫妇气泡后，将0.5-0.75 mL的聚合物富集溶液放入移液管中。保持移液灯泡上的压力，不要让聚合物不良相进入移液管，将移液管从溶液中抽出。
- 使用 Kimwipe 擦拭移液器的外部。在石英传感器表面加入足够的溶液，以完全覆盖表面。确保传感器表面的溶液中没有可见的气泡。
- 旋转涂层 PEC 样品并立即将传感器浸入 0.5 M KBr 溶液中，以防止薄膜上出现盐结晶。
注： 此步骤有时难以协调。释放 KBr 解决方案正上方的传感器，以获得最佳效果。 - 让薄膜退火至少12小时。
注：为了便于执行实验，请在晚上准备步骤 4，让胶片在一夜之间退火。
4. 空气和水膜的测量
- 将传感器转移到装满蒸馏水的烧杯中，以清除传感器薄膜和背面多余的 KBr。将传感器留在溶液中 30-60 分钟。
- 测量空气中的薄膜。参考空气中的裸露传感器。允许胶片数据平衡。
- 将干燥的硫酸钙插入 100 mL 无唇烧杯中，测量完全干燥的薄膜厚度。从烧杯中取出硫酸钙，用蒸馏水冲洗烧杯。
- 在 100 mL 无唇烧杯中填充 30 mL 蒸馏水。插入搅拌杆，确保水在薄膜周围循环。在水中测量薄膜约 30-45 分钟或直到胶片数据得到平衡。参考水中裸露传感器。
- 在蒸馏水中制备 3 M KBr 的 15 mL 溶液。将 5.35 g KBr 测量到一个分级气缸中，用蒸馏水填充到 15 mL。旋转直到溶解。
- 将 KBr 溶液加入烧杯，以 0.1 M 的增量蒸馏水。表 1概述了 3 M KBr 解决方案的 mL 中的 0.1 M 增量。将薄膜从 KBr 溶液添加到水中的位置移开，使薄膜不会溶解。在添加另一个 KBr 解决方案之前，请确保系统已平衡。
- 获取所有数据后，从支架中取出薄膜，放入蒸馏水烧杯中。让盐离开薄膜（30-60 分钟），然后晾干薄膜。
- 要从传感器中清洁 PEC 薄膜，请向烧杯中添加 KBr 并轻轻旋转溶液。等待静坐 5-10 分钟。重复此过程 2-3 次，然后用蒸馏水冲洗传感器。
注：如果传感器的响应仍然良好，则可以清洁和重复使用传感器。这可以通过传感器检查，其绝对带宽读数小，用于感兴趣的谐波（<100 Hz）。
5. 数据分析
- 打开由萨德曼（https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI）27创建的 QCM-D 数据分析 MATLAB GUI。通过选择"加载 QCM"打开空气数据文件中的胶片。
注：Shull组已经开发了一个类似的PythonGUI，用于QCM（https://github.com/shullgroup/rheoQCM）的数据收集和分析。在补充信息中提供了分析代码的一部分，用于分析数据并生成本文中的数据。 - 选择所需的计算（3，5，3或3，5，5），伽玛，和空气图标中的胶片。单击"绘制 QCM"。
- 使用实验中最平衡的数据点（通常是最后一个数据点）确定干膜的厚度。记录此值。
- 在水数据文件中打开胶片。选择与步骤 5.2 中的相同参数，但水中的胶片（而不是空气中的胶片）除外。
- 膨胀实验各平衡步骤后，确定膜厚度、复杂剪切模量和粘弹性相角。记录这些值以及离子强度（以 0.1 M 为增量从 0-1 M 不等）。
- 确定肿胀百分比
(3)
其中dp是从溶液的薄膜厚度，dp干燥是干膜厚度。
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Representative Results
图3A-B所示，蛋白质吸附过程中频率随时间的变化呈现出特征曲线和高原。在裸传感器表面对 1x PBS 进行初始缓冲液洗涤只会引起可忽略的频率变化，从而提供稳定的基线，作为未来数据点的参考。胶原蛋白溶液的引入导致蛋白质吸附开始，观察为随着时间的推移频率稳步下降，直到粘附胶原蛋白高原的密度在稳定的基线（图3A）。确切的频率和质量值将高度依赖于传感器的纯度和表面能量。鉴于这些参数，最终缓冲液仅从传感器表面去除少量未粘附的蛋白质，导致频率略有增加。在这段时间内，我们应始终只预期质量会略有下降，这表明与传感器结合的蛋白质量稳定（图3B）。
每个周期实现稳定频率测量的重要性怎么强调也不为过。温度、湿度和溶液浓度等环境变量的轻微波动可能导致原始数据存在可观察到的差异。因此，在至少 5-10 分钟的稳定频率和耗散因子测量之前更改这些变量可能会歪曲频率和耗散的确切变化。一个次优数据集的示例如图 3 C-D所示。此处，相同的溶液浓度和流速参数与图A-B相同，但在开始测量之前不允许仪器环境进行平衡。传感器振荡频率的自然沉降与温度和流体浓度的变化同时发生，从而掩盖了任何可作为参考的潜在基线（图3C）。相反，我们被迫选择整个动态频率范围的平均值作为参考。最后，在开始最终的 PBS 洗涤之前，胶原蛋白流不允许以稳定的质量平衡，PBS 进入系统之前仍在变化的频率变化就可以看出这一点。此操作不会影响质量的计算，但不能完全描述传感器上蛋白质的吸附电位（图 3D）。
在胶原蛋白吸附实验的早期阶段，薄膜处于Sauerbrey系统，由与n无关的α/n值表示，图3中为2小时）。随着实验的进行，薄膜进入粘弹性系统，以不再重叠的μ+/n值指示（t > 2.5 h）。认识到这种行为变化，从胶原蛋白实验中获得的数据被分析为使用两种不同的方法观察真实质量和粘弹性特性。第一个使用由 Shull 组编译的 Python 脚本。此脚本具有与用于 PEC 实验的 MATLAB 数据收集和分析软件相同的数学基础。它使用功率法模型来考虑相邻谐波15处的属性差异，并在补充信息中提供。第二种方法使用从商业软件包中的粘弹性模型确定的值来计算胶原膜的真质量、复杂剪切模量和相角。该软件的粘弹性模型报告厚度 （d）、弹性模量 （*） 和粘度 （*）。弹性模量和粘度是开尔文-沃伊格特模型的元素，并通过以下表达式转换为复杂模量的大小和相位：
(4)
(5)
其中 [n ] = 2°n=1 ，其中 ±1是石英传感器的基本频率 （5 MHz）。图 4显示了根据第三次和第五次谐波的μ_n和+Dn值计算出的胶原蛋白吸附的粘弹性特性。图 5将图 4中的属性与从商业软件结果转换的属性进行比较。如图5所示，商业软件值报告影片比Python脚本更柔和。
图6描述了在以前的QCM实验中观察到的关系3，22，显示了粘弹性相角和复杂剪切模量的对数之间的线性关系。绿线表示这种线性关系，具有牛顿流体（如水）的端点（*G|p = 105Pa = g/cm3和 + 90° ， 在 +3 = 15 mHz）和弹性固体或玻璃聚合物 （*G|p = 109Pa = g/cm3和 + = 0°）。许多使用QCM研究的聚合物材料遵循了这一一般的经验趋势，即使用PSS：PDADMA复杂系统22进行量化。由于PEC受到盐浓度较高的溶液的影响，样品从刚性、玻璃状样品过渡到更粘稠和液体状的样品;这一系列属性落在绿线上。为了进行比较，使用Python脚本计算平衡胶原蛋白薄膜的属性也如图6所示。|G|p和 α 对于两个系统都相同，因为两个系统都是玻璃聚合物，与水肿胀。薄膜的含水量决定了曲线上的特定点。在这里，具有最接近胶原蛋白系统的机械性能的PEC系统对应于20 wt%聚合物溶液。我们从这个比较推断，吸附胶原胶膜中的聚合物浓度也接近20wt.%。这个结果是非常有用的，在我们的案例中，通过比较从两个适当设计的QCM实验得到的结果。其中一个实验是时域（QCM-D，胶原蛋白）实验，另一个是频域（QCM-Z，PEC）实验，但这些类型的实验是完全可互换的，无论哪种方案都令人窒息。
图1：绍尔布雷、粘性弹性、散装和过阻的政权的图解。该图显示了根据样品质量（与厚度相关）和粘弹性特性，可以从QCM数据中获得不同类型的信息的制度。蓝线下方是 Sauerbrey 制度，仅计算样品的厚度。对于中间区域，可以计算样品的质量和质量弹性特性。在图的左上角的散装系统中，可以获得粘弹性信息，但实验对样品厚度不再敏感。在右上角，过阻的制度表示样品太厚，无法进行 QCM 测量。在图中，假设三次谐波的粘弹性相位角与复杂剪切模量的对数（图6中的绿线）之间的线性关系。散装系统被定义为厚度是剪切波衰变长度两倍以上的区域。Sauerbrey 系统被定义为 [+/3] 和+/5差异小于 10 Hz 的区域，而过阻器系统是指+5大于 20，000 Hz（D5 > 1600 ppm）的政权。 请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：QCM 测量中主要步骤的流程图。QCM-Z 或 QCM-D 实验的原理图。第一步的图表是一个 QCM 传感器（灰色），其上带有金色电极（金色）和薄膜（紫色），采用不同的技术将薄膜应用于传感器表面。薄膜的厚度d表示。第二步重点介绍来自 QCM-Z（顶部）和 QCM-D（底部）实验协议的数据。第三步是确定可分析样本的区域。第四步显示来自给定分析区域的结果数据。请点击此处查看此图的较大版本。
图3："好"和"坏"QCM-D数据胶原蛋白吸附。胶原蛋白吸附实验的频率和阻尼因子的图。（A）均衡频率偏移，（B）平衡阻尼因子偏移，（C）非均衡频率偏移，和（D）非平衡阻尼因子偏移。在（B）和（D）中，阻尼因子偏移绘制为耗散因子 D 和带宽[，因为同一参数由两个偏移测量。频率和伽马偏移归一化为各自的谐波（n = 3 或 5）。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：使用功率定律模型对胶原蛋白进行粘性弹性分析。（A）胶原体吸附实验的a：aa质量、（B）复杂剪切模量和（C）粘弹性相角。前 10 小时显示胶原蛋白到传感器表面的主要吸附阶段，10 到 20 之间的周期显示缓冲液洗涤在 20 h 之前的平衡阶段。误差条表示厚度和粘弹性特性计算的不确定性，假设误差在[] 和α中等于±的 1%。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：使用功率定律模型和商业软件模型对胶原蛋白进行粘性弹性分析。（A）胶原体吸附实验的a：aa质量、（B）复杂剪切模量和（C）粘弹性相角。使用来自实验数据的+和+D值使用 Python 脚本确定*值，而D值则从商业软件的粘弹性模型结果转换。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：胶原蛋白和PSS：PDADMA数据的修正后的Van Gurp-Palmen图。使用QCM可测量的一般样品范围内粘弹性相角和复杂剪切模量的图。绿线表示在图1开发中假设的两个属性之间的线性关系。PSS：PDADMA聚电解质复合物（PEC）的数据经萨德曼等人许可重印。22， 版权所有 2017 美国化学学会.请点击此处查看此图的较大版本。
| 解决方案的摩尔性 （M） | mL 的 3 M KBr |
| 0.1 | 1 |
| 0.2 | 1.1 |
| 0.3 | 1.2 |
| 0.4 | 1.3 |
| 0.5 | 1.4 |
| 0.6 | 1.5 |
| 0.7 | 1.6 |
| 0.8 | 1.8 |
| 0.9 | 1.9 |
| 1 | 2 |
表1：PEC膨胀实验的摩尔增量。膨胀实验所需的3M溴化钾溶液的量（以mL）增加0.1M的水溶液的摩尔度。
补充文件：Python 代码。请点击此处下载此文件。
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Discussion
胶原蛋白吸附结果跨越绍尔布雷和粘弹性机制。通过绘制标准化到相应谐波数的频率偏移图，我们观察到 Sauerbrey 限值在大约测量的前 2 小时内适用。然而，随着传感器质量的增大，第三次和第五次谐波的标准化频率变化开始彼此偏离（t > 2 h），表明能够确定吸附膜的粘弹性特性。
软件的粘弹性建模结果与 Shull 组中的功率定律建模之间的直接比较表明计算材料属性存在显著差异。在测量过程中，来自商业软件的粘性弹性建模数据代表一个更厚、更软的层，具有较低的复杂剪切模量（图5）。这些模型之间的粘弹性特性差异是由于每个系统的计算中所做的假设。一个区别涉及一个假设，即需要对粘弹性特性的频率依赖性做出假设。需要做出一些假设，因为给定谐波（例如 n = 3）的频率响应取决于三个参数（pd， =G=3|p， [3） ] 但只测量两个独立量 （+ +3和+ =n = dn） 。由于这种差异，我们需要从额外的谐波中至少获得一个额外的数量（频率偏移或耗散），而不会为问题添加额外的未知数。厚度和密度显然不取决于频率，但复杂的剪切模量则取决于。功率定律基于这样一个事实，即在小频率范围内，我们可以假设相位角是恒定的，具有的河变反应相当于在频率15、16、18的更大范围内具有功率定律行为的材料。幂法指数 [] 不是可调参数，但等于 +/ 90°，以度表示 *。使用功率定律假设，我们有 #3 = + 
5 和 。对于定量粘弹性建模，功率定律模型代表了准确性和简单性的最佳组合，比其他常见方法（包括开尔文-Voigt 模型）提供更可靠的结果，其中G'假定与n和G 无关，假定其随n线性增加。
考虑到PSS：PDADMA数据的实验设置，进行了批量实验和粘弹性系统，以生成图6中的数据。该协议详细介绍了粘弹性系统实验的样品制备，通过观察传感器对存在PEC、盐和水的溶液的响应，进行批量实验。为了准备粘弹性系统实验的样品，必须了解在粘弹性系统内保持的目标厚度范围，并避免过度阻尼传感器的响应。对于 PSS：PDADMA 系统，此理想范围为 ±0.8 - 1.6 μm。由于PEC最初在水膨胀时厚度增加45-50%，因此此行为必须计入初始薄膜厚度中，使初始样品厚度达到±0.45 - 0.65 μm的目标范围。在实验中很好地掌握薄膜的行为对于了解最佳目标厚度范围以及样品制备的最佳方法非常重要。
无论确切的仪器设置如何，这些过程都表明在开始 QCM 实验之前考虑样品制备的重要性。所应用图层的厚度决定了可以从测量数据中提取的信息。在开始任何测量之前，研究人员必须考虑实验中最需要哪些信息，并了解该技术的局限性。在确定正确的样品厚度和制备方法时，了解薄膜的粘弹性特性很有帮助。对于适当的样品，时域和频域 QCM 仪器可以熟练地用于为各种应用收集准确数据。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 NSF （DMR-1710491， OISE-1743748） 的支持。J.R. 和 E.S. 感谢 NSF （DMR-1751308） 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | For collagen adsorption |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228 | For collagen adsorption |
| Aqueous QCM probe | AWSensors | CLS 00050 A | For polyelectrolyte swelling |
| Collagen I Rat Protein, Tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | For collagen adsorption |
| Distilled water | Sigma-Aldrich | EM3234 | For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 793175-1GA-PB | For polyelectrolyte swelling |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | For collagen adsorption |
| Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | For collagen adsorption |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | For collagen adsorption |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666A | For polyelectrolyte swelling |
| NP2K VNA | Makarov Instruments | For polyelectrolyte swelling | |
| Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000 | Sigma-Aldrich | 409022 | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water | Sigma-Aldrich | 561967-500G | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Potassium Bromide | Sigma-Aldrich | 793604-1KG | For polyelectrolyte swelling |
| QSense QCM Explorer System | Biolin Scientific | For collagen adsorption | |
| Sodium acetate, anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | For collagen adsorption |
| Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP | Laurell technologies | For polyelectrolyte swelling |
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