Summary
אנחנו מציגים פרוטוקול להפקת. קרום המוח של מורציטים פרוטוקול זה הינו כלי רב ערך עבור מחקרים בלתי מתורבת המספקים טוהר גבוה ותשואה גבוהה, ובכך מקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות.
Abstract
בשנים האחרונות הפכו כיום למרכז מחקר נרחב בביולוגיה ובפתולוגיה של כלי הדם. החשיבות של קרום הלב במבנה מחסום הדם והפיזיולוגיה מומחש כעת, אך הבסיס המולקולרי שלו נותר ברובו לא ידוע. כתפקיד הפתופסולוגי של קרום הלב המוחית בהפרעות נוירולוגיות מרתקת ובעלת חשיבות רבה, מודלים בלתי מתורבת לא רק מתאים מספיק אלא גם מסוגל לשלב טכניקות שונות למחקרים אלה. מספר שיטות הוצעו כמודלים של מבחנה להפקת קרום הלב, למרות שפרוטוקול ללא אנטיביוטיקה עם תפוקה גבוהה רצוי. החשוב ביותר, שיטה כי יש מוגברת תפוקה לכל החילוץ מפחית את השימוש של בעלי חיים נוספים.
כאן, אנו מציעים שיטה פשוטה ויעילה להפקת קרום הלב מוחין עם תפוקה גבוהה מספיק. רקמת המוח העכבר המגון מעורבב עם פתרון BSA-dextran להפרדה של פסולת רקמות וכלה מיקרונימי. אנו מציעים הפרדה של שלושה צעדים ולאחר מכן סינון כדי להשיג filtrate עשיר מיקרוכלי. עם שיטה זו, את כמות שברי מיקרוכלי דם שהתקבלו מ 10 עכברים מספיק זרעים 9 בארות (9.6 ס מ2 כל אחד) של צלחת 6-היטב. מעניין ביותר עם פרוטוקול זה, המשתמש יכול להשיג 27 בארות עשיר כלציט (9.6 ס מ2 כל אחד) במעבר 2. הטוהר של התרבויות לקרום הלב מאושרות עם ביטוי של סמנים לקרום הלב הקלאסי: NG2, PDGFR-β ו CD146. שיטה זו ממחישה את הכלי היעיל והריאלי לחקר החוץ של המחקרים הפיזיולוגיים והפתופיזילוגיים על כקרום הלב.
Introduction
קרום הלב הם מרכיב חיוני של היחידה נוירונימי (NVU), אשר כוללת יחידה תפקודית עם תאי המוח מוחין של מכשול המוח בדם (BBB), תאי גליה, מטריקס מטריתאי ונוירונים. כולציטים הם חלק חיוני בתפקוד מוסדר של מערכת העצבים המרכזית (CN) כפי שהם משמשים כאחד הממשקים עבור חילופי מידע מולקולרי ותאי.
קרום המוח מוטבע בצד האבלומיאלי של כלי המיקרו-כלים, והם חיוניים להקמת1 ולשמירה על2 הפיזיולוגיה של bbb. מספר יצירות האחרונות הדגישו גם את תפקידה של קרום הלב המוח באנגיוגנזה3 והתבגרות הספינה4, אנדותל מורבגנזה5 והישרדות6, ובשליטה על מטבוליזם המוח כולסטרול7. וחשוב מכך, הדיסרגולציה בכל אחד מהתהליכים הללו מהווה הסימנים ההיכר של מחלות ניווניות.
אכן, קרום הלב הם הכרח פונקציונלי לתפקוד BBB נורמלי והגנה שלה מפני ההתקדמות של מחלות נוירולוגיות מספר. הפיזיולוגיה וההפסד של קרום המוח הם המכנה המשותף של מחלת האלצהיימר8, אובדן עצבי במהלך בתפקוד החומר הלבן9, טרשת נפוצה10, ספיגה אנצפלופתיה11, בשלב אקוטי שבץ מוחי12 ובהפרעות נוירולוגיות אחרות. קרום הלב הם גם אינסטרומנטלי הגידול גרורות13. מעניין, קרום הלב הוכחו גם להפגין תפקיד החילוץ לאחר טראומה והפרעות נוירולוגיות: ב reמיאלונציה במוח1, משיחת איסכמי, פגיעה בחוט השדרה14 וקידום אנגיוגנזה15. הרגישות של קרום הלב כדי לחזק את הביטוי הפתופסולוגי של טראומה נוירולוגית והפרעות הופך אותם מטרה טיפולית פוטנציאלית16.
במודלים של מחקר בתחום הפריולוציטים בבית BBB הם כלים חשובים לניהול מחקרים נרחבים. מודלים אלה מספקים פלטפורמה למחקרים משוכללים יותר על ידי ייצוג דגמי העבודה של BBB ועוד. לדוגמה, ניתן להשתמש במודלים אלה כדי להבין את הפיזיולוגיה התאית בתוך קרום הלב ובין סוגי תאים אחרים של NVU. כמו כן, במודלים של חוץ גופית הם כלי חקירה ממקור ראשון לבדיקת ההשפעה הפרמקולוגית של תרופות חדשות ומולקולות על כלציטים. מודלים אלה יכולים לשמש גם כדי להבין את התפקיד הפתופסולוגי של קרום הלב ביחס להפרעות נוירולוגיות. למרות זאת, התפתחות במודלים של מבחנה דורשת תפוקה מוגברת כדי לאפשר חופש ניסיוני. מודלים אלה אמורים להיות קלים ומהירים, ולהקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות. בנוסף, היכולת לפתח מודלים כאלה לתוך מודלים של תרבות תא כפול ומשולש רצוי.
קיימים פרוטוקולים רבים שפותחו. הפרוטוקולים המוצעים על ידי תיגבור ואח '17, חן ואח '18, תומסן ואח '19, יאצאקי ואח '20, ו קראוץ ' ו doetsch21 הם גישות ראוי לספק את רוב הצרכים. כל השיטות הללו מפיקות תוצאות אפקטיביות, אך התלות במספר רב של בעלי חיים ניסיוניים נותרה מכנה משותף לפרוטוקולים אלה. לכן, זה הופך להיות הכרחי כדי לפתח שיטת פלט גבוהה שיכולה לבודד ולטהר את קרום הלב עם היעילות המירבית האפשרית. בפרוטוקול זה, טוהר התאים שהתקבלו לאחר מעבר שני מאומת עם מספר סמנים לקרום הלב. בדקנו עבור טסיות נגזר מקדם הצמיחה קולטן-β (PDGFR-β), אשר משמש כסמן קלאסי של קרום הלב17, ועבור NG2 (תא העצב-glial אנטיגן 2), שהוא סמן של כריתת קרום המוח בתיווך מורפולגנזה22 ו vascularization23. בדקנו גם עבור אשכול של בידול 146 (CD 146), אשר דווחה כאחת המולקולות מבוטא בקרום הלב17,18.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת קרום הלב העיקרי מעכברים (סוג פראי או transgenics) כי יספק את כל הדרישות הנ ל עם תפוקה גבוהה. אנו מעסיקים אנטיביוטיקה וimmunopanning שיטה מבוססת בחירה חינם של התפשטות עבור קרום הלב הראשי המוח, אשר יוכיח את עצמו מודל יעיל לניהול לימודי מבחנה.
Protocol
כל הניסויים נערכו בעקבות הנחיות המכון לשימוש וטיפול בבעלי חיים. בהתאם לחקיקה הצרפתית, אושרה מתקן בעלי החיים באוניברסיטת Artois על ידי הרשויות המקומיות (התייחסות: B62-498-5). בהתאם לחקיקה של האיחוד האירופי (הוראה 2010/63/האיחוד האירופי), כל ההליכים אושרו על-ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים והשימוש (קומיא ד'אתאן, הכוונה: C2EA 75) ומשרד המחקר הצרפתי (התייחסות: 2015090115412152).
1. הכנת פתרונות
- להכין 500 mL של מאגר כביסה A (WBA): 10 מ"מ פתרון HEPES בתמיסה מלח מאוזן של האנק (HBSS). חנות ב -4 ° c.
- הכינו 500 מ ל של מאגר כביסה B (WBB): 0.1% בסרום שיבמין (BSA) עם פתרון של 10 מ"מ HEPES ב HBSS. חנות ב -4 ° c.
- הכינו 300 mL של 30% הפתרון תוספי ב wba על ידי ערבוב את הפתרון לילה בטמפרטורת החדר. אוטוקלב את הפתרון ב 110 ° c עבור 30 דקות לפני השימוש. לאחר אוטוקלינג, תן את הפתרון לנוח בטמפרטורת החדר עבור 2-3 h. אחסן את הפתרון ב-4 ° c.
- הכינו 100 mL של 0.1% bsa פתרון בפתרון תוספי קר. טלטל במרץ עבור 3-4 דקות ולאחסן ב -4 ° c.
- הכינו מדיה מלאה של הנשר השונה ביותר של Dulbecco (DMEM) על ידי המסת 20% סרום עגל, 2 מ"מ גלוטמין, 50 μg/mL בג, 1% ויטמינים, 2% חומצות אמינו בסיס הנשר הבזאלי (BME) במדיה DMEM בסיס וחנות ב 4 ° c. להוסיף 1 ng/mL בסיסי הצמיחה פיברוהפיצוץ גורם (bFGF) לפני השימוש.
- הכנת מדיית כלציט מלאה על-ידי הוספת תוספי גדילה (בתנאי מדיה לכליים) ו -20% סרום לעגל עוברי (FCS) בתוך התקשורת הבזכית והחנות ב -4 ° c.
2. התאוששות מרקמת המוח והסרת מניגס
- לעקביות, להשתמש בעכברים של גיל דומה ומגדר זהה בכל קבוצה של חילוץ. השתמש במקלט לבעלי חיים נטול הפתוגן ומספק גישה למים מבית מודעות. כדי להבטיח יעילות ושימוש מינימלי של בעלי חיים, להימנע מאובדן של חומר רקמה.
- המתת חסד C57BL/6J, בת 4-6 שבועות, עכברים זכרים (מעבדות יאנייה, לה ג'נסט-סאינט-האי, צרפת).
- הבלו במהירות את רקמת המוח בתנאים סטריליים, למנוע כל נזק לרקמות. בזהירות מניחים את הרקמה ב 40 mL של תמיסת מלח קר פוספט מאגור (PBS).
- העבר את רקמת המוח ב-PBS הקרה לצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ).
- מניחים את רקמת המוח על מנגב סטרילי נטול-סיבים יבשים עם מלקחיים תשר מעוקל, להסיר את המוח החצי, הסטריאטום ואת העצבים העורף.
- להסיר את כל משחת הקרום הגלויים עם מספוגית כותנה. מניחים את רקמת המוח הפוך ולפתוח את האונות עם ספוגית כותנה באמצעות משיכות אור כלפי חוץ. להסיר את כל כלי הדם הגלויים.
- מניחים את רקמת המוח חינם בצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) עם 15 מ ל של WBB קר.
3. הומוגון
- העבר את הרקמה לצינור מרגמה מטחנת רקמות Dounce ולהוסיף 3-4 mL של WBB עם מלקחיים.
- החמול את הרקמה עם ' משוחרר ' כתש 55 פעמים. שטפו את הפסל הרופף באמצעות WBB. עכשיו, הגבר את הבשלה. "
- לחלק את התערובת באופן שווה לתוך 2 50 מ"ל צינורות ולהוסיף 1.5 x נפח של קר 30% BSA-dextran, במרץ לטלטל את צינורות לערבב את השקר.
4. בידוד של שבר כלי הדם
- לאחר לטלטל במרץ את הצינורות, צנטריפוגה את הצינורות עבור 25 דקות ב 3,000 x g ו 4 ° c.
- להעביר את supernatant (יחד עם שכבת המיאלין העליון) כדי 2 צינורות חדשים, ו צנטריפוגה את הצינורות עבור 25 דקות ב 3,000 x g ו 4 ° c. לשמר את כדורי מצנטריפוגה הראשון על ידי הוספת 3 מ ל של WBB קר (לשמור את הגלולה ב 4 ° c).
- חזור על שלב 4.2 ושמור בזהירות את כדורי מ 2nd צנטריפוגה.
- להיפטר תוספי ואת המיאלין עם פסולת רקמות מן הצינורות משלב 4.3. שמור על כדורי ב-WBB קר.
- הבריכה את התוכן של צינור 1 ו-tube 2 משלב 4.1 ולפצות על הנפח הסופי של 10 mL עם קר WBB.
- חזור על שלב זה עבור צינורות משלב 4.2 וצעד 4.3.
הערה: לבסוף, יש 3 צינורות מ 3 centrifugations. - הנתק את הגלולה עם 6 למעלה ולמטה משיכות באמצעות הצינורות 10 מ"ל, עד לא הגושים הגלויים של כדורי נותרים.
- בעזרת מסנן ואקום מסנן רשת שינוי ניילון, לסנן את השעיות התא של כל צינור.
הערה: שלב סינון זה חשוב כדי להסיר כלי זמן ארוכים יותר/גדולים יותר דרך מסנן רשת השינוי. - לשחזר ולהשעות מחדש את נימי ידי גירוד המסנן בעזרת מלקחיים עצה שטוחה או מגרד ב WBB בטמפרטורת החדר. לסנן את ההשעיה עם מסנן טרי כדי לשחזר נימים יותר
- לחלק את פילטרט באופן שווה לשתי שפופרות ו צנטריפוגה עבור 7 דקות ב 1,000 x g ו RT.
הערה: במהלך צעד צנטריפוגה זה, הכן את הפתרון האנזימטי. קבע את עוצמת ה-WBB הדרושה בהתאם למספר בעלי החיים בהם נעשה שימוש (ראה טבלת חומרים). להוסיף 1x של DNase 1 ו-1x של טוסיל-L-לייסיל-כלורמתאן הידרוכלוריד (TLCK) (ראה טבלת חומרים) ב wbb ו-לחמם מראש עד 37 ° c. - לאסוף את כדורי משלב 4.10 בצינור אחד עם WBB מראש מחומם עם אנזימים. הוסף/י/י/י/י מחמם מחומם מראש. מניחים את הצינור באמבט מים שולחן לרעוד ב 37 ° c עבור בדיוק 33 דקות.
- הפסיקו את תגובת האנזים על ידי הוספת 30 מ ל של WBB קר. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 7 דקות ב 1,000 x ו RT.
- להיפטר supernatant בזהירות לנתק את הגלולה ב-WBB עם 6 למעלה ולמטה משיכות באמצעות צינורות 10 מ"ל. שלב זה צריך להיות קפדני פחות יחסית מהר יותר.
- צנטריפוגה את ההשעיה עבור 7 דקות ב 1,000 x ו RT.
הערה: במהלך שלב זה, להשליך את הציפוי מתוך מנות התרבות ולשטוף אותם פעם אחת עם DMEM בטמפרטורת החדר. מנות תרבות תא המעיל עבור לפחות 1 h ב RT. - להיפטר supernatant מן הצינור שהושג בשלב 4.14, ו הנתק את הגלולה במדיה חדשה DMEM הצלחת התאים (יום 0, P0) ב 9 בארות של 6-היטב צלחות (1 גם של 9.6 ס"מ2 כל).
5. התפשטות קרום הלב המוחית
- שמרו על תרביות תאים ב-37 ° c ו -5% CO2 באינקובטור סטרילי. החלף את מדיית התרבות לאחר 24 שעות (יום 1) של ציפוי התאים על ידי הסרת הפסולת בזהירות. לאחר יום 1, לשנות את מדיית התרבות בכל 48 h.
- צפו בתרבית התאים לפחות 7-8 ימים. בשלב זה, גידולים סלולריים על החלק העליון של unilayer אנדותל צריך להיות נצפה.
- העבר את התאים ביום 8-10 (בהתאם לשטף) בתווך תרבות קרום המוח למעבר 1 (P1) על לוחות תרבות מצופים ג'לטין. . לשנות את מדיית התרבות בכל יומיים שימו לב לתאים במשך 6-7 ימים. תאים מפוצלים ברציפות שוב למעבר 2 (P2) ביום 17 [ומעבר 3 (P3) ביום 24 רק אם נדרש], גדל במדיום כלציט בצלחות מצופה ג'לטין.
הערה: התאים יהיו מוכנים לניסויים/התבוננות בכמעט 80-90% שליטה.
Representative Results
פרוטוקול זה (איור 1) מניב ביעילות 9 בארות (מתוך 6 צלחות) בזמן זריעה ב-P0 (איור 2א (P0: יום 1)).
מ P0 כדי P2, יש מאפיינים מורפולוגיים ספציפיים שבהם תאי האנדותל (מסומנים על ידי חיצים לבנים) ו-s עלייה הדרגתית בקרום הלב (מצוין על ידי חיצים שחורים) ניתן לצפות. ב P0, התאים האנדותל מוארך המתפתחים ממיקרוכלים הם בשפע (איור 2A, P0: יום 3), בעוד שפע של תאים מאורכים כאלה מופחת ב P1 ונעדר ב P2. להיפך, קרום הלב מופיעים כתאים מרובע אשר שופע P2 (איור 2A, P2: יום 18).
כדי לאשר את טוהר תרבות קרום הלב ב P2, בדקנו את הביטוי של NG2, CD146 ו pdgfr-beta כמו סמנים לקרום הלב באמצעות ה-PCR כמותי (איור 2B), אימונוציטוטוכימיה (איור 2ג), ואת הכתם המערבי (איור 3). קרום הלב ב P2 לבטא רמות גבוהות יותר של CD146, NG2 ו PDGFR-β בהשוואה לביטוי במוח העכבר הכולל (Ms Br) תמצית. כפקד, ביטוי של סמנים אנדותל הסגר CD31, האסטרוציטים לסמן glial fibrillary חלבון חומצי (gfap) ו מיקרוגלייה סמן CD11b נצפו גם נעדרים ב P2.
איור 1: סיכום הפרוטוקול. חלוקה לרמות זו מייצגת צעדים קריטיים להפקת כלציט, המתחיל בהתפוררות רקמות עם מטחנת זכוכית ולאחריה הפרדה של 3 צעדים ב דקטרן וסינון. פרוטוקול זה מעסיק את שלב העיכול של 33 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מורפולוגיה תאים וביטוי סמנים. (א) הניגודיות הפאזה תמונות של קרום הלב ב P0, P1 ו P2 בשלבים של התפשטות. תאים שופע אנדותל ב P0 מצוינים על ידי חיצים לבנים. המספר שלהם ירד ב P1 והם נעלמו ב P2. החיצים השחורים מציינים את קרום הלב. (ב) אנליזה של CD146, NG2 ו-PDGFR-β ביטוי על ידי PCR בקרום המוח ב P2 עם קרום הלב בתוך P1 ומוח העכבר (Ms Br) דגימות. (ג) דמויות מייצגות של קרום הלב ב P2 מציג חיסוני חיובי של CD146, PDGFR-β ו, NG2. סרגל קנה מידה: 50 יקרומטר (הגדלה 20x) ו-20 יקרומטר (הגדלה 40x). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: טוהר הנציגים של תרביות התא. ניתוח של CD146, PDGFR-β, NG2, סגר, GFAP, CD31, CD11b וביטוי טובולין על ידי בלוק המערבי בקרום הלב P2 והמוח העכבר (Ms Br) דגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואה מייצגת של שיטות שונות של התפוררות רקמות, טיהור, העשרה ועיכול אנזימטי. כל פרוטוקול שפורסם מסוכם באמצעות אינדיקציות על מספר בעלי החיים המשמשים עבור כל פרוטוקול. התפוקות מצוינות גם ביחס למספר הבארות שהתקבלו בעת זריעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
קרום הלב מוחין הוא חלק אינטגרלי של NVU ולשחק תפקיד פעיל אינדוקציה ותחזוקה של BBB24. באופן דומה, התפקיד של תאים אלה בהפרעות ניווניות שונים הפתווגיות כלי דם הוא מסקרן. מכאן, מודל תא מרכזי להפקת פלט יעיל יספק פלטפורמה יעילה למחקרים בעלי מבחנה.
ישנם פרוטוקולים שונים שהוצעו לבידוד של קרום הלב העיקרי (איור 4). טיגס ואח '17 הציע שיטה כולל רקמה קורטיקלית עם מניגס. גישה זו היא הטפיקציה של רקמות מ 6 עכברים (37 ° c, 70 דקות העיכול עם אנזימים papain/DNase) ואחריו צעד התפוררות באמצעות 21 G ו 18 G מחטים. פרוטוקול זה מציע הפרדה של צעד אחד (צנטריפוגה בתוך 22% BSA/ערוץ PBS) התשואות לפחות 2 קולגן אני מצופה בארות של צלחת 6-היטב. התאים מתוחזקים במדיום צמיחת התאים האנדותל (ECGM) עד מעבר 3 ומאוחר יותר באמצעי גדילה (PGM) עבור תאי המעבר כדי לקדם התפשטות כריתת קרום המוח. בגישה דומה אחרת, צ'ן ואח '18 הדיסוציאציה של רקמת העור על ידי קוצצת את הרקמה עם להב תער מעוקר ואת העיכול רקמות עם קולגן וכלי/dnase עבור 90 דקות ב 37 ° c. בעקבות הפרדה של צעד אחד (צנטריפוגה ב -22% BSA) של התאים, שכבת המיאלין מוסרת והגלולה נשטפה פעמיים ב-ECGM. כלי המיקרו מצופים ב -3 בארות של קולגן שאני מכוסה בצלחות בנות 6. לאחר שהגיעו למפגש, התאים מגיעים פעמיים ומאוחר יותר מתוחזקים PGM. בסופו של דבר, אם התאים מועברים ביחס של 3, אנחנו יכולים להשיג 27 וולס של לוחיות 6-טוב רק בשימוש של 10 עכברים בתחילת הפרוטוקול.
בתומסן ואח ', המחברים ממליצים על בידוד קרום הלב של המוח באמצעות העיכול האנזים בעל שני השלבים19. . ודגימות מוח נחתכו לחתיכות קטנות החלקים רקמה לעבור את תגובת האנזים הראשון ב-כלקולאז/DNase I עבור 75 דקות ב 37 ° c, בעקבות צעד אחד של הפרדה 20% BSA. הגלולה נאסף ועוד מתעכל ב-קולגן/dispase/DNase I עבור 50 דקות ב 37 ° c. שלב זה מלווה בהפרדה של 33% חלחול ושטף עוד פעם אחת. כלי המיקרו מצופים במנות מצופות 35 מ"מ בקולגן הרביעי/fibronectin. התפשטות קרום הלב היא המועדף על 10% FCS ו gentamicin סולפט ב DMEM עבור 10 ימים. בגישה נוספת לעיכול של שני צעדים, יאמאצאקי ואח '. מראים מחדש את הרקמההמחפירהב-dmem הקרה. בתגובת האנזים הראשון, הדגימות מטופלות עם הקולאז/DNase I עבור 75 דקות ב 37 ° c. בעקבות צעד אחד צנטריפוגה, את הגלולה הוא שטף שוב פעם אחת תגובת האנזים השני הוא יזם בשנת הקולגן/dispase עבור 60 דקות ב 37 ° c. בעקבות הפרדה של צעד אחד, הגלולה הוא מושעה מחדש ו centrifuged בפתרון BSA 22%. לבסוף, הגלולה מיקרוכלי דם מושהה. ומצופה בצלחת של 6 מטרים עבור 5 מוחות העכבר, 1 טוב של צלחת 6-באר יכול להיות מצופה. כדי להשיג את קרום הלב, תרבויות אנדותל הם החוצה שלוש פעמים בזמן שנשמר במוח העכבר תא אנדותל (mBEC) בינונית II. קראוץ ' ו Doetsch20 מציעים שיטת טיהור כלציט על ידי facs. דגימות רקמה מקליפת המוח-אזור תת-חדרית של מוחי העכבר הם מיקרו-גזור ובטחון ביסודיות עם אזמל. לאחר הקולגן/הדגירה האנזים במשך 30 דקות ב 37 ° c, הרקמה מתעכל מופרד מאלין ופסולת centrifuged ב 22% v/v הפתרון חלחול. השעיית התא הוא לאחר מכן מודענב נוגדנים מצובזות בשנת פלואורוסקופים ניתוח ומיון של FACS. התאים ממוינים מצופה קולגן מצופה בארות של 24 צלחת הבאר. הוא הציע כי קליפת אחד מניב מספיק תאים עבור ציפוי אחד ב 1 היטב של צלחת 24.
גם אם פרודוקטיבי, שיטות אלה מגיעות עם מספר מגבלות, מן השימוש של מספר רב של בעלי חיים עבור בידוד אצווה אחת כמות מוגבלת מאוד של פלט.
במהלך הפיתוח של הפרוטוקול המוצע, הצלחנו להשיג תפוקה גבוהה: 9 בארות של צלחת 6-היטב מתוך מעטים כמו 10 עכברים. למטרה זו, הסרת הקרום מבטיח את ההסרה צעד אחד של כלי גדול מן הרקמה. מטחנת הרקמה של הדיאונקיה מתאימה יותר לרקמות רכות כגון המוח. הוא גם מבטיח הפחתת דגימה עם הפילינג הרופף, הומוגון עם הפסל הצמוד, ומונע נזקים סלולאריים מיותרים. אחת המטרות העיקריות בפרוטוקולי תרבות התא הראשוני היא בזבוז מינימלי של רקמות ושליפה מורחבת של ואצלב המוח. בפרוטוקול המוצג, זה מושגת על ידי צנטריפוגה חוזרים של dextran-BSA רקמה המרקמת העור אכל. גישה שלושה שלבים צנטריפוגה מסייעת לשחזר כמויות גדולות של ואצלב מן רקמת המגון ate. זה מספק 3x התאוששות משופרת של כלי מיקרו. בעקבות הפרדה, סינון הוא הצעד החיוני הבא, אשר מעדיף את החרגה של תא שריר חלק הקשורים כלי גדול. כפי שהוזכר לפני שילוב של אנזימים שונים הוצע לעיכול אנזימטי. בעוד DNase ו הקולגן/dispase משמשים כדי להפחית את הגושים של תאים ולבודד תאים יחיד בהתאמה, חשוב מאוד למנוע מוות של תאים בסביבה פולשנית כגון זה מונע על ידי TLCK, אשר ובכך מגביר את התשואה הסופית. בתחילה, המעבר הראשון מותר לגדל מונאולייר אנדותל, שמאוחר יותר תומך בצמיחת קרום הלב הצמוד בunilayer. כיוון שהישרדותה של תאי האנדותל הראשוניים מופחתת על-ידי הפסחתה, היא מגבירה את ההסתברות לאיחזור כדוריות דם. כמו-כן, פרוטוקול זה מעסיק מעבר נוסף המבטיח הימנעות מזיהום תאי האנדותל. יש לציין כי עם מספר גבוה יותר של תאים מ P2, את התלות בהמשך ההתיישנות של התאים מופחת. בנוסף, הוא מפחית את האפשרות של צמיחה קרום המוח שהוא השיג בתאי שריר חלקה, אשר מתרבים בקצב גבוה בהרבה.
על מנת להשיג תפוקה גבוהה יותר, ישנם מספר שלבים קריטיים ויש לבצע אותם באופן מדויק ביחס לטמפרטורה וזמן. ערבוב של רקמת הומוזה לתוך BSA-dextran צריך להיות מהיר. הדיסוציאציה גלולה לאחר השלבים צנטריפוגה צריך להיות מהיר כדי למנוע מוות תאים. יתר על כן, 33 מינימום של עיכול אנזימטי צריך להיעשות בדיוק ובטיפול. אחת המגבלות עבור פרוטוקול זה היא המשך היום 7-8 שunilayer אנדותל מותר לצמוח ולהקל עוד יותר את התפתחותם של קרום המוח. ככל הנראה, הבידוד של כלי הדם הוא btter, הצמיחה של unilayer הוא מהיר יותר, ולכן יש מספר מוגבר של קרום הלב. מומלץ לא להשתמש פחות מ 10 עכברים בכל חילוץ כדי להבטיח מספר הולם של שברים microvascular כדי לתמוך בצמיחה קרום הלב עוד. אם הנקודות הנ ל מעקב בזהירות, צפיפות התא הרצויה עבור תרבות קרום המוח ניתן להשיג בקלות.
במודלים של חוץ גופית מספקים פלטפורמה אפשרית לפיתוח מודלים נגזרים לקבלת מידע נוסף על הרלוונטיות הפתופסולוגית ותקשורת בין התאים האחרים של NVU במהלך הפרעות נוירולוגיות. ניתן לשלב בין כדוריות הקרום הבודדות בתרבות דו-תאית (עם תאי אנתל או גליאל) ובתרבות תלת-תאית (תאי האנדותל וגליאל). התפתחות מודלים אלה לא נדונה כאן. לסיכום, פרוטוקול זה מספק גישה אחת לבידוד של תאים ראשוניים עם תפוקה גבוהה יותר ופלטפורמה טובה יותר למחקר מתורבת הקשור לביולוגיה מוחית קרום הלב.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
LT ו-FG ניתנו על ידי סוכנות הידיעות הלאומית דה לה רצ'רצ'ה (ANR, ANR-15-JPWG-0010) במסגרת התוכנית המשותפת של האיחוד האירופי – מחקר מחלת ניווניות (JPWG) עבור פרויקט כדור שלג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
| Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
| BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
| Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
| Dextran | Sigma | 31398 | |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
| Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
| Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
| Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
| HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
| HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
| Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
| Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
| Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
| Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
| Equipment Requirements | |||
| Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
| Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
| Water bath with agitator | |||
| Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
| Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
| Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches | |||
| Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches | |||
| Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
| Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |
References
- Azevedo, P. O., et al. Pericytes modulate myelination in the central nervous system. Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Gianni-Barrera, R., et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).
- Teichert, M., et al. Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation. Nature Communications. 8, 16106 (2017).
- Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain. Developmental Cell. 44 (6), 665-678 (2018).
- Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression. Blood. 118 (10), 2906-2917 (2011).
- Saint-Pol, J., et al. Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (3), 489-503 (2012).
- Sagare, A. P., et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice. Nature Communications. 4, 2932 (2013).
- Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
- Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis. Acta Neuropathologica. 90 (3), 228-238 (1995).
- Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
- Yang, S., et al. Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke. Current Neuropharmacology. 15 (6), 892-905 (2017).
- Yang, Y., et al. The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages. Nature Communications. 7, 11385 (2016).
- Hesp, Z. C., et al. Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice. Journal of Neuroscience. 38 (6), 1366-1382 (2018).
- Guo, P., et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Chen, J., et al. CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).
- Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier. Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).
- Yamazaki, Y., et al. Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown. Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis. Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).
- Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression. Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).
- Armulik, A., et al.
