Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Applicering av membran och cellvägg selektiva fluorescerande färgämnen för levande cell avbildning av trådformiga svampar

Published: November 28, 2019 doi: 10.3791/60613
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, University of Innsbruck

Summary

Vitala fluorescerande färgämnen är viktiga verktyg för levande-cell Imaging analyser i modern svamp cellbiologi. Detta papper Detaljer tillämpningen av etablerade och mindre kända fluorescerande färgämnen för att spåra plasmamembran dynamik, endo-/exocytos och cellvägg morfogenes i trådformiga svampar.

Abstract

Tillämpningen av membran och cellvägg selektiva fluorescerande färgämnen för levande cell Imaging analyser av organell dynamik i svampceller startade för två decennier sedan och sedan dess fortsätter att bidra kraftigt till vår förståelse av trådformiga svamp Livsstil. Detta papper ger en praktisk vägledning för utnyttjande av de två membran färgämnen FM 1-43 och FM 4-64 och de fyra cellväggen fläckar Calcofluor vit M2R, Solofenyl Flavine 7GFE 500, Pontamin snabb Scarlet 48 och kongorött. Fokus ligger på deras lågdos applikation för att fastställa artefakter-fri färgning, deras co-Imaging egenskaper, och deras kvantitativa utvärdering. De presenterade metoderna är tillämpliga på alla filamentösa svamp prov som kan förberedas på de beskrivna sätten. De grundläggande infärgnings metoderna kan tjäna som utgångspunkt för anpassningar till arter som kan kräva olika odlingsförhållanden. Första, biofysiska och biokemiska egenskaper granskas eftersom deras förståelse är avgörande för att använda dessa färgämnen som verkligt viktiga fluorescerande fläckar. För det andra, steg-för-steg-protokoll presenteras som detalj utarbetandet av olika svamp provtyper för fluorescerande levande cell avbildning. Slutligen illustrerar exempel experiment olika metoder för att: (1) identifiera defekter i den spatiala-temporal organisationen av endocytos i genetiska mutanter, (2) jämförelsevis karakterisera delad och distinkt samlokalisering av GFP-märkta målproteiner i den endocytiska vägen, (3) identifiera morfogenetiska cellvägg defekter i en genetisk Mutant, och (4) Monitor cell Wall biogenes i realtid.

Introduction

För tjugo år sedan, det sätt på vilket hyphal morfogenes och den underliggande molekylära cellbiologi kunde visualiseras i trådformiga svampar revolutionerades av tillämpningen av membranet selektiv fluorescerande FEI Mao Dye FM 4-641. Senare, fördelen med Chitin-bindande färgämne Calcofluor vit som vitala fluorescerande markör för svamp cell väggdynamik realiserades2. Sedan dess har både färgämnen och varianter därav blivit en naturlig del av levande cell avbildning analyser av organell dynamik i svampar, och fortsätter att ge oöverträffad insikt i den trådformiga svamp livsstil. Detta papper Detaljer tillämpningen av etablerade och mindre kända fluorescerande färgämnen för att spåra plasmamembran dynamik, endo-och exocytos och cellvägg morfogenes i trådformiga svampar. Endocytos tracking analyser möjliggör olika cellbiologiska frågor relaterade till den allmänna studien av endocytos som skall behandlas3. För detta, lokalisering, snabbhet och följd av färgade fack på FM Dye tillägg registreras av tidsfördröjning mikroskopi och kvantitativt jämfört mellan de testade svampstammar4. Cellväggen färgämnen avgränsa den yttre gränsen av cellen och tillåta spårning av morfogenetiska händelser, inklusive polariserad hyphal spets tillväxt2, hyphal förgrening5, hyphal fusion6,7 och septum formation8. Dessutom underlättar de kvantifieringen av lokaliserad cell vägg deposition och identifiering av defekter under cell Wall biogenes9. Eftersom detaljerad kunskap om de biokemiska och biofysiska egenskaperna hos någon fluorescerande markör är en grundläggande förutsättning för dess framgångsrika in vivo-applikation, sammanfattas dessa egenskaper först för de sex färgerna som visas i denna artikel.

Membran selektiva färgämnen
FM (FEI Mao) styryl färgämnen är små amfifila molekyler som inte kan passera men reversibelt associera med den yttre broschyren av lipidbilayer av biologiska membran10. De är praktiskt taget icke-fluorescerande i vattenlösning, men blir intensivt fluorescerande på plasmamembran integration, genererar utmärkt signal-till-brus (S/N)-nyckeltal11. Dessa egenskaper gör dem idealiska för att visualisera plasmamembran och intracellulär organell dynamik, inklusive spårning av endo-och exocytos12. Den grön-fluorescerande FM 1-43 och den röd-fluorescerande FM 4-64 är de två mest använda fluorescerande membran markörer för dessa ändamål. SynaptoGreen C4 och Synapserade C2 är generiska molekyler från alternativa leverantörer som kan användas omväxlande i stället för FM 1-43 och FM 4-64, respektive.

Styryl färgämnen består av tre viktiga strukturella regioner: (1) den lipofila svansen som underlättar införandet av färgämnet i lipidbilayer, (2) den fluorophore kärna som bestämmer de spektrala egenskaperna hos färgämnet och utgörs av två aromatiska ringar sammankopplade med en till tre dubbelbindningar, och (3) positivt laddade hydrofila huvudet som förhindrar fullständig insättning och genomträngning av färg genom membranet (figur 1a).

Ju längre lipofila svans, den högre är Dye vattenavvisande egenskaper och därmed bindning samhörighet med membranet, men den lägre är dess vattenlöslighet och membran de-färgning hastighet. Följaktligen, olika FM-färgvarianter producera olika färgning dynamik och mönster. Den högre hydrofobicitet av den C4-tailed FM 1-43 ger en starkare och stabilare fluorescenssignal vid plasmamembran och inre organeller snabbare än den kortare C2-tailed FM 4-64, när den appliceras på ekvimolära koncentrationer (figur 2).

Viktigt, den konstanta och hög Association/dissociation priser av både FM färgämnen11 med genomsnittliga retentionstider på 1 – 6 s per individuell färg molekyl13 minska chanserna för lokaliserade störningar av membran funktion, till exempel genom modifiering av membran smidighet eller påtvingad permanent interaktion av membranproteiner. Detta är förmodligen den viktigaste anledningen till att dessa molekyler kan användas som vitala färgämnen. Icke desto mindre, fm Dye koncentrationer över 50 μm är giftiga för svamp-och växtceller2,14, och bevis från by-2 tobak protoplasts indikerar att mer än 20 μm FM färgämne leda till plasmamembran mättnad14. Det är därför tillrådligt att inte överskrida denna gräns, särskilt med tanke på att utmärkt avbildning har uppnåtts med så lite som 2 – 5 μm15,16.

Särskilt, de spektrala egenskaperna hos FM färgämnen varierar kraftigt beroende på den särskilda membran mikromiljö (omdömet14). Generellt, excitation och emission spektra av FM-färgämnen i ren lösningsmedels lösningar (som vanligtvis anges i produktinformationen) skiljer sig avsevärt från det i cellulära miljöer och kan i de flesta fall inte direkt konsulteras för att välja Live-cell Imaging inställningar. Excitation/emission Maxima av FM 1-43 och FM 4-64, till exempel, blir blåskiftade med 37/46 nm och 43/64 nm, respektive, när de är bundna till svamp membran i jämförelse med deras lösningar i metanol (tabell 1).

De banbrytande grunderna för användning av FM 4-64 och FM 1-43 för att spåra plasmamembran, endo-/exocytosis och organelledynamik, inklusive spitzenkörper och mitokonbenerna, har redan utförligt dokumenterats för ett brett spektrum av filamentösa svamparter tidigare2,4,17,18,19. Rekommenderade bildinställningar för både FM-färgämnen som fungerar i olika filamentösa svamparter avbildas i figur 1b. Tekniska begränsningar av tillgänglig utrustning eller särskilda cellulära och experimentella förhållanden, såsom odlingsmedium, pH eller temperatur, kan dock kräva vissa anpassningar. Lyckligtvis, FM färgämnen fungerar över ett brett spektralområde, och mycket bra bildresultat uppnås genom spännande FM 1-43 med 514 nm eller FM 4-64 med 488 nm. Därför måste de optimala bildinställningarna bestämmas individuellt för varje prov typ och avsedd tillämpning.

Den avsevärda Stoke förskjutning av mer än 135 Nm i FM 4-64 tillåter utmärkt, samtidig Co-avbildning med fluoroforer avger grönt ljus; detta utnyttjas ofta för att utvärdera den intracellulära lokalisering dynamik av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta fusions proteiner i förhållande till plasmamembranet och den rutt vägen9,20.

Cell Wall-selektiva färgämnen
Calcofluor White M2R (CFW), även marknadsförs som fluorescerande Brightener 28, är förmodligen den mest kända fluorescerande färgämne som används för att färga cellväggarna av bakterier, svampar, alger, högre växter och insekter. Inledningsvis används som optisk Whitening agent i papper, textil-och tvättmedel industrin, dess fördelar för den kliniska diagnosen av svampinfektioner realiserades tidigt21,22. Eftersom CFW intercalates oåterkalleligt i begynnande Chitinen kedjan det stör normal Chitinen microfibril församling under cellväggen biogenes därigenom generera cell Wall stress23. Detta i sin tur utlöser en cell vägg skador reparationsmekanism som leder till lokalt förhöjd cellvägg deposition som ett resultat av glukan och Chitinen syntas aktiveringen24,25. Detta fenomen kan inträffa med någon färg som fungerar genom stabilt bindande för cellväggen polymerer, är koncentrationsberoende och är mest märkbar vid hyphal tips som representerar de mest produktiva växande och därmed känsligaste delarna av mycel (figur 3). En omfattande sammanfattning av den molekylära maskiner som reagerar på skador cellväggen har nyligen lämnats26.

Överdoserat färgämne i kombination med fototoxicitet kan leda till snabb cell Lys av hyphal fack (film 1). Icke desto mindre, ökad känslighet för färgämnes koncentrationer som är "vitala" i den vilda typen kan utnyttjas för att identifiera defekter i cellväggen biosyntes av gen förlust av funktion mutanter9. För CFW och Kongo-Brazzaville (CR), en annan textilfärg ämne även känd som Direct Red 28 och anställd som α-och β-Chitinen-specifik cell vägg fläcken för svampar och insekter27,28, tröskelkoncentrationer som starkt inducerar chitinsynthaser har fastställts med > 60 μm CFW och > 70 μm CR, medan koncentrationer <15 μm av antingen färg inte förändrar eller hämmar svamp tillväxt29,30,31. Hickey et al. placerade denna tröskelkoncentration för CFW vid 25 μM2. Därför är det tillrådligt att använda färgkoncentrationer ≤ 5 μm för att utesluta stressrelaterade artefakter och se till att använda dessa molekyler som verkligt "vitala fluorescerande färgämnen"2,32. Detta gäller lika för Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) och Pontamine fast Scarlet 4B (PFS), synonymt med direkt gul 86 och direkt röd 23, respektive, två andra användbara cellväggen färgämnen vars ansökan om svampar har rapporterats för första gången mer än ett decennium sedan33. Men trots deras anmärkningsvärda spektralegenskaper34,35, har användningen av båda färgerna sedan dess varit mycket begränsad36,37. Som tidigare visats för 1,5 μM CFW2, 2 μm SPF är tillräckliga för att lösa cellväggen dynamik under inhemska förhållanden med mycket hög temporala upplösning (film 2). Samma resultat kan erhållas med 2 μM CR eller PFS.

Tillsammans består dessa fyra färgämnen, CFW, SPF, PFS och CR, av en uppsättning cell Väggs selektiva fluorescerande markörer som täcker nästan hela synligt ljusspektrum (400 – 700 nm) som används på moderna fluorescerande Mikroskop (figur 4). Den signifikanta ökningen av fluorescensintensiteten vid bindning till cell Väggs polymerer är inneboende i alla fyra och genererar utmärkta S/N-nyckeltal. Detta i sin tur tillstånd att hålla färgämnes koncentrationer och excitation ljusintensitet mycket låg och gör det möjligt att utföra cellväggen färgning som "låg dos" Live-cell Imaging Technique2. Eftersom dessa cellväggen färgämnen är plasmamembran impermeable, de fungerar samtidigt som levande/döda fläckar. På grund av deras extremt breda utsläpps ljusspektrum måste vissa begränsningar i fråga om Co-Imaging-egenskaperna hos CFW och SPF med andra fluoroforer noga övervägas.

Protocol

1. beredning av svamp prov

  1. Svamp för kulturer
    1. Inokulera den önskade stammen på ett lämpligt fast agar medium, såsom potatis dextros agar (PDA) för Trichoderma atroviride eller Vogel ' s minimal medium (VMM) för neurospora crassa. Lägg till en lämplig markerings markör när du arbetar med transformerande stammar.
    2. Inkubera för kulturen på organismens optimala temperatur. Till exempel T. atroviride vid 25 ° c och N. crassa vid 30 ° c, och 12 h/12 h ljus/mörker cykler tills en sporbildare mycel har utvecklats men ännu inte nått kanten av plattan. På en standardstorlek petriskål (9,2 cm Ø), tar detta Wild-typ T. atroviride på 4 – 6 dagar genomsnitt, medan N. crassa Wild typ når detta skede efter 3 – 4 dagar i genomsnitt.
  2. Odling av svampkolonier
    1. Med hjälp av en steril skalpell, klippa en liten 3 mm x 3 mm agar block som transporterar icke-sporulerande mycel från kolonin kanten av för kulturen.
    2. Placera agarblocket i mitten av en ny solid mediumplåt för att Inokulera den experimentella kulturen.
    3. Inkubera den experimentella kulturen enligt det utvecklingsstadium som är avsett att undersökas. Till exempel kräver Wild-typ T. atroviride 20 – 22 timmar vid 25 ° c i mörkret för att utveckla kolonier med ca 2 cm i diameter på PDA, medan Wild-typ N. crassa når kolonin diametrar på ca 4 cm efter 14 – 16 h inkubering vid 30 ° c i mörkret på VMM.
      Obs: inkubering i mörker förhindrar bildandet av pigment som kan introducera autofluorescence. För att eliminera medium bakgrund fluorescens från den experimentella kulturen, ersätta agar med 1,5% w/v av en transparent stelnar agent (se tabellen av material), och alla komplexa medium med en definierad minimal medium.
  3. Odling av solida germling kulturer
    1. Använd 5 ml steril fysiologisk saltlösning (0,9% w/v NaCl) för att skörda spridnings sporer från för odlingsplattan och samla upp den resulterande spor suspensionen i ett 15 ml skruvlock rör.
    2. Blanda Spore suspensionen väl genom kraftig vortexa och därefter filtrera den över en 1 cm x 5 cm remsa av sterila filter tyg (se tabellen av material) lätt instoppad i en 1 ml pipett spets (både monterade och autoklaverade i förväg) i en ny steril tub.
    3. Bestäm spor tätheten med en cell räknings kammare och Förbered en 1 x 107 celler/ml Spore suspension med fysiologisk saltlösning.
      Spore-fjädringen kan hållas vid 4 ° c i upp till två veckor.
    4. Förbered en standardstorlek petriskål (9,2 cm Ø) med 20 mL fast medium och tillsätt 15 – 20 sterila glaspärlor (3 mm Ø) ovanpå.
    5. Pipettera 200 μL av Spore-fjädringen på medel plattan och fördela cellerna jämnt över hela plattan genom att skaka försiktigt. Samla glaspärlor i en bägare med 70% etanol för återanvändning.
    6. Inkubera den experimentella kulturen enligt det utvecklingsstadium som är avsett att undersökas. Exempelvis kräver T. atroviride Wild typ 5 – 6 h vid 25 ° c i mörkret för att utveckla spridnings germlings på PDA, medan N. crassa Wild Type utvecklar spridnings germlings efter 3 – 4 h inkubering vid 30 ° c i mörkret på VMM.
      Anmärkning: för att eliminera alla medel bakgrund fluorescens från experimentell kultur, ersätta agar med 1,5% w/v av en transparent stelnar agent, och alla komplexa medium med en definierad minimal medium.
  4. Odling av flytande germling kulturer
    1. Fyll 190 μL flytande odlingssubstrat i varje brunn i en 8-brunn kambered mikro-Slide.
    2. Tillsätt 10 μL av en 1 x 107 cells/ml Spore-lösning (bereds i steg 1.4.1 – 1.4.3) och blanda genom att försiktigt Pipettera upp och ned några gånger. Det resulterande totala antalet celler är 1 x 105 per brunn.
    3. Inkubera den experimentella kulturen enligt det utvecklingsstadium som är avsett att undersökas. Till exempel, den vilda typ T. atroviride kräver 5 – 6 h vid 25 ° c i mörker för att utveckla spridnings germlings i potatis dextros buljong (PDB), medan den vilda typ N. crassa utvecklar spridnings germlings efter 3 – 4 h inkubation vid 30 ° c i mörkret i flytande VMM.

2. beredning av Dye arbetslösningar

  1. För att garantera full löslighet av varje färgämne, Förbered 2 mM stamlösningar i dimetylsulfoxid (DMSO) genom att tillsätta lämplig mängd (se exakta vikter i tabell 1) till 1 ml 100% DMSO och blanda väl genom vortexing.
    FÖRSIKTIGHET: se till att ta DMSO från en septum försluten flaska; Det bör vara en klar transparent vätska. Vid kontakt med luft, DMSO blir brun-förmodligen på grund av oxidation av spår orenheter-och kan negativt påverka celltillväxt eller färga färgning.
  2. Filter sterilisera stamlösningen genom ett 0,2 μm spruta membranfilter till ett nytt sterilt 1,5 mL reaktionsrör. För att minimera färgblekning, Linda röret i aluminiumfolie.
    Anmärkning: färgämne stamlösning kan aliciteras i mindre volymer för att undvika upptinning/frysning cykler, och hålls vid 4 ° c i flera månader.
  3. Bered en arbetslösning på 20 μM vattenhaltiga färgämnen genom att lösa upp 2 μL färglager lösning i 198 μL sterilt destillerat vatten i ett färskt sterilt 1,5 mL reaktionsrör. För att minimera färgblekning, Linda röret i aluminiumfolie.
    Anmärkning: Dye arbetslösning bör förberedas nyligen på dagen för experimentet.
  4. Under prov monteringen (se avsnitt 3), kommer färgen arbetslösning att vara standardmässigt utspädd 1:10, vilket resulterar i en slutlig färgämnes koncentration på 2 μm och 0,1% w/v slutlig DMSO koncentration.
    Obs: välja olika utspädningsfaktorer genom att helt enkelt ändra volymförhållandet mellan Dye arbetslösning och monterings vätska, gör det möjligt att enkelt anpassa den önskade slutliga färgen koncentration.
    FÖRSIKTIGHET: för att förhindra oönskade effekter på grund av färg eller DMSO-toxicitet bör utspädningsfaktorn inte falla under 1:4 för att resultera i maximala slutliga koncentrationer på 5 μM färg och 0,4% w/v DMSO. Högre färgkoncentrationer kommer snabbt att mätta systemet och förhindra tillförlitlig signal kvantifiering, medan mer än 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO kan försämra cell utveckling38.

3. provberedning för mikroskopi

  1. Montera prover från svampkolonier (steg 1,2) eller solida germlings kulturer (steg 1,3) med den inverterade agarblockmetoden.
    1. Håll en ren 24 mm x 60 mm glas täckslip (#1 = 0,13-0.16 mm tjocklek) klar och tillsätt 18 μL flytande minimalt medium (VMM eller M9) eller fysiologisk saltlösning på mitten.
    2. Tillsätt 2 μL av den 20 μM färg arbetslösningen till 18 μL vätska och blanda väl genom att Pipettera upp och ner flera gånger, samtidigt som man undviker produktionen av luftbubblor.
      Obs: när du arbetar med flera prover, är det lämpligt att förbereda en Master Mix av vätska-Dye lösning för alla för att säkerställa lika färg koncentration hela experimentet.
    3. Med en ren skalpell, skär ut en 15 mm x 15 mm prov från periferin av kolonin eller solid germling kultur och placera den vertikalt bredvid medellång droppe på locket slip.
    4. Använda skalpell för att stödja den övre kanten av blocket och ett finger för att hålla baksidan av blocket på plats, sakta sänka den sida som transporterar mycel eller germlings på vätskan. Provet är nu klart för överföring till Mikroskop stadiet.
      FÖRSIKTIGHET: det är viktigt att göra detta långsamt och mycket noggrant för att minimera mekanisk påfrestning på cellerna och för att undvika att luftbubblor fastnar mellan prov och täckslip.
  2. Montera flytande germling kulturer från steg 1,4.
    Obs: mest bekvämt, flytande germling kulturer i kamrar mikro-och diabilder kan överföras direkt och ytterligare manipuleras på mikroskopet skede.
    1. Tillsätt 22 μL färg arbetslösning till 200 μL flytande medium för att resultera i standard slutkoncentration på 2 μM färg och 0,1% w/v DMSO.
      Anmärkning: flytande germling kulturer har den stora fördelen att fluorescerande färgämnen (eller andra kemikalier, såsom hämmare) kan läggas till någon önskad tidpunkt av experimentet, även under inspelningen. I så fall måste särskild försiktighet iakttas för att administrera vätskan sjunker mycket långsamt för att inte störa cellerna. System vibrationer och Brownian motion kan redan introducera vissa cell rörelser.

4. levande-cell Mikroskop

  1. Justera de grundläggande bild anskaffnings inställningarna. Följande bild anskaffnings inställningar gör det möjligt att fånga färgdynamik i enskilda hyfer och är tillämpliga på båda följande analyser
    1. Applicera 5 – 10% lasereffekt på 20% av den fulla uteffekten hos enheten.
    2. Använd en plan APO 60x – 63x glycerol eller vatten nedsänkning mål med en hög numerisk bländare ≥ 1,2.
    3. Begränsa bild förvärvs området till konturen av hyfer genom att ställa in en bildstorlek på 1024 x 256 pixlar och med hjälp av en optisk zoomfaktor på 2 – 3.
    4. Använd dubbelriktad skanning med 400 Hz. Justera hålstorleken till 1 luftig enhet.
    5. Ställ in känsligheten för den känsligaste detektorn till 100%.
    6. För tid varv inspelning, starta bild förvärv med en bildruta var 15 s för att möjliggöra rimlig tidsupplösning utan att producera färgblekning eller foto stress.
    7. För 3D-inspelning, ange den övre och undre rumsliga gränsen till gränsen för hyfer och rymden optiska avsnitt 1 μm isär för att möjliggöra rimlig rumslig upplösning.
      Obs: på grund av den snabba tillväxten av hyfer, hög rumslig upplösning i Z-axeln har ofta offrats för hög temporala upplösning i X/Y-axeln eller tvärtom. Endast mycket moderna konfokala laserscanning Mikroskop är tillräckligt snabba för att tillfredsställa båda kraven.
  2. Endocytos upptag analyser
    1. Konsultera figur 1 och tabell 1 för att identifiera de bästa inställningarna för excitation/emission för FM 1-43 och/eller FM 4-64 som finns på mikroskopi-systemet och justera därefter.
      Anmärkning: med den rekommenderade 2 μM koncentrationen, införlivande av FM-färg i plasmamembranet är omedelbar i normala friska celler. Hela processen från initial plasmamembran färgning till färgämne utseende i tubulär vakuoler är vanligtvis avslutas inom 30 – 45 min vid rumstemperatur. Öka FM-färgkoncentrationen ökar S/N-förhållandet och därmed ger högre kontrast bilder snabbare. Emellertid, det snabbar också upp märkningsprocessen gör det svårare att skilja den kronologiska följden av organell färgning.
    2. Starta bildinspelning med de ovan rekommenderade grundläggande bild anskaffnings inställningarna och utvärdera resultaten.
    3. Optimera bild anskaffnings inställningarna till den rumsliga och temporala upplösningen som krävs för att fånga upp aspekten av plasmamembranet eller endocytos dynamik experimentet är fokuserat på.
    4. Till exempel, för att fånga mycket snabb dynamik i X/Y, minska den totala bildstorleken, bilden bara ett fokalplan och öka skanningshastigheten till 1 fps. För högre upplösning i Z-axeln, minska upplösningen i X/Y, minska bildstorleken och minska avståndet mellan optiska sektioner till 0,5 μm.
  3. Cell Väggs dynamik
    1. Konsultera figur 4 och tabell 1 för att identifiera de bästa excitation/utsläpp inställningar för tillämpad cell vägg färgämne som finns på mikroskopi systemet och justera därefter.
      Obs: på grund av deras breda emissions spektra är CFW och SPF inte väl lämpade för samtidig samavbildning med andra fluoroforer, övervägande GFP. Vissa restriktioner gäller även för sekventiell avbildning metoder med dessa färgämnen, och därmed måste optimeras individuellt.
    2. Starta bildinspelning med de ovan rekommenderade grundläggande bild anskaffnings inställningarna och utvärdera resultaten.
      Anmärkning: med den rekommenderade 2 μM koncentration, införlivande av färg i cellväggen är inte nödvändigtvis omedelbar men rimligen snabb. Hela processen med septumbildning, till exempel, tar i genomsnitt ca 5 – 7 min vid rumstemperatur20. Öka cellväggen färgämnes koncentrationen ökar S/N-förhållandet och därmed ger högre kontrast bilder snabbare. Men, det också snabbt introducerar artefakter på grund av inducerad cellväggen skador reparation.
    3. Optimera bild anskaffnings inställningarna till den rumsliga och temporala upplösningen som krävs för att fånga aspekten av cellvägg morfogenes experimentet är fokuserat på, som beskrivs i avsnitt 4.2.3.

Representative Results

Kvantitativ bildanalys
Förutom "bara" visualisera cellulära processer, tillåter Live-cell Imaging att extrahera kvantitativ information från inspelade data. Generellt är kvantitativ bildanalys ett komplext ämne vars ordentlig diskussion är långt bortom tillämpningsområdet för denna artikel, därför är läsaren hänvisas till dedikerade läroböcker och artiklar39,40,41. Vissa grundläggande riktlinjer som är kopplade till följande exempeldata tillhandahålls dock. Flera viktiga förutsättningar måste uppfyllas för att möjliggöra bildkvantifiering, inklusive: (1) definierade molariteter av fluorescerande färgämnen måste tillämpas på alla prover för att möjliggöra noggrann Relativ jämförelse; (2) bild anskaffnings inställningarna måste justeras på ett sådant sätt att utsläpps ljus detektorerna aldrig är mättade, annars är de maximala intensiteterna avskurna. (3) bild anskaffnings inställningarna måste förbli fastställda under loppet av en sammanhängande försöks uppsättning, annars införs artificiella intensitet. (4) bilddata måste sparas i ett informationsförlustfritt filformat tillsammans med den meta-information som innehåller alla instrumentinställningar; och (5) bildanalys bör begränsas till det minimala antalet efter bearbetning steg som krävs för att extrahera önskad kvantitativ information.

Vanligtvis är definierade standarder som möjliggör absolut kvantifiering av inspelade signaler inte tillgängliga i den levande cellen. I sin enklaste form förlitar sig därför kvantitativ bildanalys på den relativa jämförelsen av pixel intensiteter inom samma bild eller mellan olika bilder som spelats in med identiska inställningar. Tillverkarens Mikroskop kontrollprogramvara normalt innehåller grundläggande verktyg för bild efter bearbetning och kvantitativ analys, eller kan uppgraderas med ytterligare funktioner för bildsegmentering, Thresholding, ratio Imaging, etc. Flera plattformar för bildbehandling med öppen källkod, som är olika lämpade för olika typer av avbildningsdata, finns tillgängliga, inklusive ImageJ (https://imagej.net; https://imagej.nih.gov/ij/), Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/), CMEIAS bioImage informatik (http://cme.msu.edu/cmeias/) och Wimasis (https://www.wimasis.com/en/).

De presenterade exempeldata behandlades och analyserades med hjälp av ImageJ-plattformen. Kortfattat, specifika regioner i cellen, såsom hyphal spets Apex eller septa, är markerade med betydande område markeringsverktyg, och intensiteten av alla innehöll pixlar är avläsning med programvaran implementerade "mätverktyg". Intensitetsdata från kontroller och experimentella prover överförs till en kalkylbladsfil som matematiskt analyseras och förbereds som diagram. Mer information finns i de citerade originalpublikationerna.

Exempeldata 1: FM 4-64 upptag analyser
Svampprover odlades som kolonier (steg 1,2) och monterades med den inverterade agarblockmetoden (steg 3,1). Den slutliga koncentrationen av FM 4-64 var 1,67 μM. bildbehandlings inställningar: HCX PL APO 63x/1.3 NA glycerinnedsänkning mål på en inverterad konfokal laser scanning Mikroskop (se tabellen av material); FM 4-64 excitation vid 488 nm och emission vid 600 – 700 nm; en ram varje minut i upp till 150 min. FM 4-64 upptag analyser identifierade defekter i den spatio-temporal organisationen av endocytos i gendeletion och genen överuttrycker mutanter av svampspecifika Sur7-familjen protein 2 (Sfp2) av T. atroviride9 (figur 5).

Exempeldata 2: FM 4-64 Co-färgning av fluorescerande fusions proteiner riktade mot endocytiska fack
Svampprover odlades som kolonier (steg 1,2) och monterades med den inverterade agarblockmetoden (steg 3,1). Den slutliga koncentrationen av FM 4-64 var 2 μM. bildinställningar: CFI plan APO VC 60x/1.2 NA XC vattensänkning mål på en inverterad konfokal laser scanning Mikroskop (se tabellen av material); GFP excitation vid 488 nm och emission vid 500 – 530 nm, FM 4-64 excitation vid 488 nm och emission vid 600 – 700 nm, och ljus-fält med genomlysning av ljus detektor, alla samtidigt; en bildruta var 15: e i upp till 15 min. FM4-64 Co-färgning var anställd för att relatera den subcellulära distributionen av de två förbättrade gröna fluorescerande protein (egfp)-märkta transmembranproteiner Sfp2 och Gpr1 till rutt vägen i T. atroviride (figur 6, film 3, film 4).

Exempeldata 3: FM 4-64 Co-färgning för identifiering av morfogenetiska skillnader
Svampprover odlades som kolonier (steg 1,2) och monterades med den inverterade agarblockmetoden (steg 3,1). Den slutliga koncentrationen av FM 4-64 var 2 μM. Imaging inställningar: plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil Immersion mål på en inverterad konfokal laser scanning Mikroskop (se tabellen av material); GFP excitation vid 488 nm och emission vid 505 – 550 Nm, FM 4-62 excitation vid 488 nm och emission vid 574 – 691 nm, och ljus-fält med genomlysning av ljus detektor, alla samtidigt; en ram varje 8,5 s i upp till 15 min. FM4-64 Co-färgning får relatera den subcellulära lokalisering dynamik Fluorescent märkt BUD-6 polarisome Complex protein för att endosome människohandel beroende processer, såsom bildandet av septa och polariserad hyphal spets tillväxt, och kännetecknas skillnader i subcellulära organisation och hyphal arkitektur mellan vild typ och Mutant stammar av N. crassa (figur 7, film 5).

Exempeldata 4: cell Väggs färgning avslöjar morfogenetiska skillnader
Svampprover odlades som kolonier (steg 1,2) och monterades med den inverterade agarblockmetoden (steg 3,1). Slutliga koncentrationer på 2 μM CFW, 20 μM SPF och 100 μM CR användes. Imaging inställningar: CFI plan APO VC 60x/1.2 NA XC vatten nedsänkning mål på en inverterad konfokal laser scanning Mikroskop (se tabellen av material); CFW och SPF excitation vid 405 nm och emission vid 430 – 470 nm, CR excitation vid 543 nm och emission vid 580 – 620 nm. De olika interaktions egenskaperna hos CFW, SPF och CR med cell Väggs polymerer belyser morfogenetiska skillnader mellan Δsfp2 Mutant och den vildtyp stam av T. atroviride9. Ökande cellväggen stress som tillfogats av förhöjda färgkoncentrationer inträffar snabbare och mer uttalad i Mutant jämfört med den vilda typen. Dessutom gör samma bilder det möjligt att kvantifiera morfogenetiska skillnader avseende hyphal diameter och septal avstånd mellan båda stammarna (figur 8).

Exempeldata 5: Real tidsövervakning av cell Väggs biosyntes
Germlings odlades som flytande kultur (steg 1,4) i 8-brunn kamrar mikro--glidbanor (kliva 3,2). Den slutliga CFW-koncentrationen var 0,12 μM. bildinställningar: CFI plan APO VC 60x/1.2 NA XC vatten sänkning mål på en inverterad konfokal laser scanning Mikroskop; CFW excitation vid 405 nm och emission vid 420 – 470 nm; en ram var 20: or i upp till 35 min. Den mycket låga CFW koncentrationen förhindrar mättnad av cellväggen med färg molekyler och möjliggör kvantitativ realtidsövervakning av cell Väggs biosyntes. Detta avslöjar att nedfallet av nya cellväggen material inte är enhetliga, men svarar mycket snabbt på lokaliserade fysiska påfrestningar till följd av den relativa förskjutningen av en cell på cell-cell Attachment före germling fusion i N. crassa (figur 9, film 6).

Figure 1
Figur 1: biokemiska och biofysiska egenskaper hos FM-färgämnen. A) kemiska strukturer för FM 1-43/SynaptoGreen C4 och FM 4-64/Synapktoriserade C2. Babsorptions-och emissions spektra av båda FM-färgämnen, överlagda med optimala bildinställningar för membranbundna färgämnen i trådformiga svampar: 445 – 495 nm blått ljus kommer att EXCITERA FM 1-43 med 100 – 80% verkningsgrad, medan 488 nm i en argonlaser kommer att excitera färgämnet med 91% effektivitet. På grund av den blå förskjutningen vid membran bindning (*) är det optimala detektionsområdet för FM 1-43-emission mellan 520 – 590 Nm. På samma sätt är de optimala bildinställningarna för FM 4-64 i svampar 471 – 541 nm (100 – 80% verkningsgrad) vid användning av en polykromatisk exciteringsljuskällor eller 514 nm (99% verkningsgrad) vid användning av en argon-laser, och 650 – 750 nm för detektion av utsläpps ljus. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: samtidig samtidig avbildning av fm 1-43 och fm 4-64. En ekvimolära blandning av båda färgämnen tillfogades till en flytande germling kultur av N. crassa som ger en final koncentration av 10 μm. Vid 25 min efter färgning tillägg, har FM 1-43 målat plasmamembranet och redan samlats i inre membran, inklusive starkt färgade mitokondrierna (m) men till stor del exklusive vakuolär membran (v), och är mer än åtta gånger starkare jämfört med FM 4-64 (genomsnittliga fluorescens intensiteter 176 till 21, respektive), vars lägre hydrofobicitet/högre hydrofilicitet saktar ner sin internalisering takt som leder till en förlängd bostad tid vid plasmamembranet. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: cell Väggs Stress-inducerad deposition av cellväggen polymerer vid spetsen Apex innebär ofta cell autolysis. Hyfer av T. atroviride uttrycker CYTOPLASMISKA GFP färgas med 10 ΜM Solofenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) och avbildas omedelbart vid monteringen. Icke-betonade hyfer (a), betonade hyfer med något ökad glukan/Chitin deposition i spetsen och fortskrider autolys (b), och kraftigt betonade hyfer med uttalad apikala glukan/Chitin Cap (asterisk) och Terminal autolys (c) framgår av den totala förlusten av GFP fluorescens och omfattande vakuolisering. Skalstapel = 10 μm. Se film 1 för hel tids kurs sekvens. Observera att de tre hyfer var verkligen ligger bredvid varandra. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: biokemiska och biofysiska egenskaper hos cell Väggs selektiva färgämnen. Kemiska egenskaper som ges är de natriumsalter av varje färgämne. Absorptions-och emissions spektra motsvarar dem i cellulära miljöer. Indikerade monokromatiska laserexciteringslinjer (skrivna i färg), polykromatiska exciteringsintervall som gäller för epifluorescensmikroskop, och utsläpps ljus detekterings områden är de som rekommenderas för avbildning i trådformiga svampar. Två laser magnetisering linjer indikeras när båda fungerar lika bra. (*) Utsläppet spektrum av cell Wall-bunden PFS är betydligt mer rödförskjuten än tidigare noteras33, dock, vilket resulterar i mycket goda S/N-förhållanden med lägre färgkoncentrationer än vad som används tidigare. Det kompletta spektrumet av CR är för närvarande inte tillgänglig, därav det av Nile Red (CAS-nr: 7385-67-3) visas som den närmaste matchen. Detaljerad information om CR-spektrala egenskaper finns någon annanstans42. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: påverkan av Sfp2 på det endocytiska upptaget av FM4-64. Tre på varandra följande viktiga stadier av upptag av FM-färg är lätta att urskilja i vildtyp (WT). Steg i: exklusivt plasmamembran färgning, steg II: första framträdande av FM-färg i rutt blåsor, och steg III: exklusiv färgning av rutt blåsor och endomembranes. Likvärdiga infärgnings mönster visas vid den tidigaste tidpunkten för utseendet. I jämförelse med T. atroviride Wild typ, endocytos är något accelererad i sfp2 över-uttrycker Mutant (OEsfp2), medan Dye upptag är dramatiskt försenad i sfp2 radering Mutant (Δsfp2). Till exempel, Dye upptag i plasmamembranet sker omedelbart i OEsfp2 men tar 2 min i den vilda typen; och fullständig internalisering av FM-färg från plasmamembranet inträffar 10X snabbare i OEsfp2 jämfört med Δsfp2. Skalstreck = 5 μm. Figuren återges från Atanasova et al.9 i samförstånd med Creative Commons-licensen (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: samtidig färgning av EGFP-märkta membranproteiner med FM 4-64 underlättar differentiering av distinkta subcellulära lokaliserings dynamik i T. atroviride. (A) den fyra-Transmembran domän protein Sfp2 Co-LOCALIZES med FM4-64 märkta organeller, inklusive plasmamembranet och septa, den Spitzenkörper (SPK; pil) och presumerbara rörformiga vakuoler. Bdet GPCR-liknande sju-transmembranproteinet Gpr1 samlokaliserar med FM4-64 till samma organeller som Sfp2, utom SPK. skalstreck, 10 μm. Se film 3 och film 4 för Heltidskurs sekvenser. Figuren har modifierats från Atanasova et al.9 i samförstånd med Creative Commons-licensen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: FM 4-64 färgning skiljer Δbud-6 Mutant från Wild typ, och LOKALISERAR bud-6 vid septal ringen. (A) fm 4-64 färgning av hyfer av N. crassa Wild Type (pilar indikerar septa; pilspetsar indikerar SPK). (B) septa och SPK är frånvarande i ∆bud-6. Skalstreck, 50 μm. (c och D) Närbild av hyphal Apex och subapex av Wild Type (c) och ∆bud-6 (D). SPK (Arrowhead) skiljer i vildtyp men inte ∆bud-6. Parenteser indikerar den nukleära uteslutnings zonen som inte är etablerad i ∆bud-6. Skalstreck = 5 μm. (E) bud-6-GFP rekrytering till begynnande septation plats före plasmamembran invagination (pilspetsar) och medföljande septal sammandragning. Skalstreck = 5 μm. Se Movie 5a och Movie 5b för kompletta tids kurssekvenser. Figuren har reproducerats med modifikationer från Lichius et al.16 i samförstånd med Creative Commons-licensen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: strykning av sfp2 ändrar nedfallet mönstret av cellväggen material och påverkar hyphal morfogenes av T. atroviride. A) CFW och SPF-färgning avslöjar ökad cell Väggs deposition i Δsfp2 (pilar) jämfört med vildtyp (WT). CR-färgning inducerar omfattande spets svullnad endast i Δsfp2 (pilspetsar). Skalstreck = 10 μm.B) morfogenetiska defekter i Δsfp2 inkluderar signifikant reducerade Septumavstånd (Δsfp2 = 26,0 μm, vildtyp = 85 μm; n = 60; ANOVA PR < 2 − 16) och mindre hyphal diametrar (∆sfp2 = 5,6 μm, vildtyp = 12,6 μm; n = 100; ANOVA PR < 2 − 16). C) ökad färg fluorescens i spetsen Apex jämfört med subapex. Skalstapel = 5 μm. (D) intensitetskodad 3D-ytdiagram (C). (E) kvantifiering av relativa fluorescensintensiteter i Δsfp2 och vildtyp (n = 55). Figuren har reproducerats från Atanasova et al.9 i samförstånd med Creative Commons-licensen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Real tidsövervakning av cell Väggs biosyntes. A) fusion av barr träds rör (CAT) mellan germlings av N. crassa. Fysisk kontakt blir uppenbar genom germling vridmoment svar (21 – 28 min). Intensitet färgkodad CFW fluorescens indikerar regioner med liten (mörkblå) och intensiv (gul) cell vägg deposition. Den inledningsvis ofärgade homing spets (Arrowhead), insättningar ny cell väggmaterial vid spetsen kontakt och i området upplever den största fysiska stressen (Arrow). Skalstapel = 5 μm. Se film 6 för hel tids kurs sekvens. Figur som återges från38 med tillstånd. (B) projektion av (a) som anger fyra cirkulära regioner där fluorescensintensiteter mättes. Skalstapel = 5 μm. (C) Plot av de angivna regionerna visar den snabba ökningen av lokaliserad cell vägg biosyntes som svar på fysisk stress (Cat 1, Arrow). I bakterie röret (GT) och Spore förkroppsligar (conidium), cell vägg biosyntes förhöjningar stadigt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Movie 1
Film 1: Dye-inducerad cell Wall stress. 10 μM SPF (cyan) lades till T. atroviride hyfer uttrycker CYTOPLASMISKA GFP (magenta). Omfattande spets färgning sker omedelbart, följt av snabb lys av hyphal fack inom 2 min; uppenbar genom försvinnandet av GFP-fluorescens. Vänligen klicka här för att ladda ner filmen.

Movie 2
Film 2: Vital SPF färgning. 2 μM SPF (cyan) gör det möjligt att spåra spets tillväxt av T. atroviride hyfer med hög spatial och temporal upplösning utan att inducera cell Wall stress artefakter på spetsen Apex. Vänligen klicka här för att ladda ner filmen.

Movie 3
Film 3: FM 4-64 Co-färgning av Sfp2-GFP. Co-färgning av T. atroviride uttrycker Sfp2-megfp (grön) med 1,67 μm FM 4-64 (röd) avslöjar överlappande och distinkt lokalisering av membranproteinet med rutt vägen. Vänligen klicka här för att ladda ner filmen.

Movie 4
Film 4: FM 4-64 Co-färgning av Gpr1-GFP. Co-färgning av T. atroviride uttrycker Gpr1-megfp (grön) med 1,67 μm FM 4-64 (röd) avslöjar överlappande och distinkt lokalisering av membranproteinet med rutt vägen. Vänligen klicka här för att ladda ner filmen.

Movie 5
Film 5: FM 4-64 Co-färgning av bud-6-GFP. (5a) Co-färgning av N. CRASSA uttrycker bud-6-GFP (grön) med 2 μm FM 4-64 (röd) tillåter spårning av knopp-6 dynamik under septumbildning i förhållande till den associerade plasmamembran invagination. (5b) beskuren och sammanfogning bild av (5a). Vänligen klicka här för att ladda ner Movie 5a
Vänligen klicka här för att ladda ner Movie 5b.

Movie 6
Film 6: Real tidsövervakning av cell Väggs biosyntes. N. crassa germlings uttrycker Mak-1-GFP (grön) var Co-färgade med 0,12 μm CFW (blå) för att avslöja lokaliserad cell Wall biogenes under Cat-medierad germling fusion. Observera att det finns vissa utfall genom CFW signalen i GFP kanalerna, illustrerar att SPF eller CR är bättre val som sekventiella och samtidiga Co-Imaging färgämnen för GFP, respektive. Vänligen klicka här för att ladda ner filmen.

Tabell 1: egenskaper på membran-och cell Väggs selektiva fluorescerande färgämnen. * = mg/mL-värden korrigerade för den reducerade renhetsgraden/färgämnes halten för att resultera i alla lösningar. n.i.a. = ingen information tillgänglig. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

Denna artikel fortsätter den banbrytande arbete som etablerat användningen av olika fluorescerande färgämnen som vitala organell markörer för trådformiga svampar i början av 2000-talet2,4,43, och försök att diskutera foto fysikaliska och cellbiologiska egenskaper av FM-färgämnen och valda cellväggen färgämnen i större detalj än tidigare. Särskilt när det gäller oönskade cellulära effekter, såsom membranmättnad eller skador cellväggen, som förekommer över vissa färgämnes koncentrationer. Det som tidigare ansetts vara giftfritt på cellnivå betraktas nu som giftigt på molekylär nivå. Även om dessa effekter kan vara mycket subtila och inte direkt framgår av uppenbara förändringar i organell eller cell beteende, alla möjliga störningar av färgämne ansökan än visualisering måste minimeras för utredning av infödda molekylära funktion. Lyckligtvis, förbättrad känslighet och Quantum effektivitet moderna detektorer, såsom Silicon Avalanche fotodiod detektorer (SI-APDS)44 eller airyscan område detektor45, underlätta användningen av ännu lägre färgämne belopp än tidigare. En annan viktig målsättning med artikeln är att exemplifiera Co-Imaging egenskaper hos dessa färgämnen med andra fluoroforer, viktigast av allt, de av GFP som den mest använda fluorescerande protein i biologi. Detta bör hjälpa utformningen av bild experiment som syftar till att korrelera den subcellulära lokalisering dynamiken i fluorescerande fusions proteiner till de av svamp cellväggen, plasmamembranet eller endo-och exocytos vägen etc.

Avbildning under naturliga och stressfria förhållanden är avgörande för förvärvet av tillförlitliga data. Några praktiska överväganden när det gäller odlingssubstrat och provberedning syftar till att ge en utgångspunkt för att hitta de optimala förhållanden som medger en artefakt-fri, lång tid observation av friska, ostressade celler med det högsta S/N-förhållandet möjligt för ett givet prov. Det finns inget universellt sätt att uppnå pålitliga och meningsfulla bildresultat. Det är inneboende i det tillvägagångssätt som biologisk variation av provet, subjektivitet och förväntningar microscopist, liksom bild efter bearbetning har betydande inflytande på datainsamling och tolkning, respektive. Därför, den praktiska erfarenheten av microscopist, hennes/hans intima kunskaper om cellbiologi av svampen under utredning, samt skicklig provberedning för att skapa förutsättningar som "naturliga" och ostörd som möjligt i en laboratoriemiljö, är av största vikt för att förvärva och utvärdera Imaging data som sanningsenligt återspeglar de studerade cellulära fenomen. Som en tumregel, förekomsten av oönskade biverkningar av fluorescerande färgämnen, allt från den subtila och därmed inte uppenbarligen synlig aktivering av plasmamembran eller cell Wall re-modellering stress reaktionsvägar till den enkla cytotoxiska induktion av cell autolysis, kan endast förhindras säkert genom att tillämpa låga färgkoncentrationer ≤ 2 μM.

Tillämpningen av fluorescerande färgämnen är enkel, men deras särdrag är dåligt kännetecknas. En viktig styrka med att använda fluorescerande färgämnen är den förberedande enkelheten i experimentella protokoll. Odling och provtagning av svampen, tillsats av färgämne (s), och montering på mikroskopet skede är (med praktiken) okomplicerad. Justering av grundläggande bildinställningar, inklusive excitation och emission våglängder, exponeringstider, inställningar tid kurs etc., följ enkla biofysiska regler för mikroskopet och biologiska regler för de använda fluorescerande färgämnen inuti cellerna. Tabell 1 avser att stödja identifieringen av den lämpligaste färg-eller färg kombinationen för experimenterande. Dessutom, fluorescerande färgämnen är rimligt prissatta, lätt tillgängliga med tillförlitlig hög kvalitet och därmed säkerställa mycket reproducerbara ansökan.

Två stora restriktioner för att använda membran eller cellväggen selektiva fluorescerande färgämnen är (ofta) begränsad kunskap om deras exakta färgning egenskaper, som i de flesta fall är icke-specifika på organell och molekylär nivå, och deras koncentrationsberoende oönskade biverkningar. FM-färgämnen är specifika för lipidbilayers som deltar i endo-och exocytos. Men exakt vilka subcellulära organeller blir successivt märkt under de testade förhållandena är inte omedelbart uppenbar och kräver jämförelse av olika FM-färgvarianter, och co-märkning med ytterligare organell-specifika markörer. Preferensen av FM 1-43 för mitokondriella membran, i jämförelse med FM 4-64, är ett exempel. Cellväggen selektiva färgämnen uppvisar varierande specificitet för de tre stora polymerer av svamp cellväggen. CFW tros vara en icke-specifik fläck för β-glukaner och Chitin, SPF tros vara mest selektiv för β-1, 4-glukaner, och CR tros vara mycket selektiv för α-och β-chitins. Information om den bindande specificiteten för PFS till svamp cells vägg polysackarider är inte tillgänglig för närvarande. Till vilket förhållande som svamp cellväggen polymer är mest effektivt märkt vid en viss färg koncentration i svamparter under utredning är inte lätt att besvara, och tillämpningen av detaljerade mätningar som förvärvats in vitro eller in vivo i andra organismer eller andra svamparter måste beaktas mycket noggrant. Tyvärr är denna information glesa och mycket utspridda i litteraturen35,42,46. Nyare poster som skulle följa på tidigare studier33 för att ge nya insikter i exakt färgning egenskaper av de utvalda färgämnen specifikt i svampar är inte tillgängliga för närvarande.

Imaging-kontroller är nödvändiga för att utvärdera infärgnings mönster och cellulära svar korrekt. Förmodligen den mest utmanande delen, dock, är att känna till cellbiologi av svampen så väl att de inspelade förändringarna i den subcellulära lokalisering av membran och cellväggen selektiv fluorescerande färgämnen, förändringar i cellulära arkitektur eller hyphal tillväxtmönster kan uteslutande och tryggt vara relaterade till de avsedda effekterna av experimentell behandling. För detta är det viktigt att ha bra kontroller tillsammans med alla nya Live-cell Imaging experiment. Dessa inkluderar obehandlad vildtyp som negativ avbildning kontroll för att utesluta bakgrund autofluorescence och detektor brus från den förvärvade bilden, och att ha en morfologisk komparator när man arbetar med mutanter. Dessutom är en positiv avbildning kontroll, till exempel en stam som uttrycker GFP eller RFP i cytoplasman eller annan välkänd fluorescerande markör protein, viktigt att ställa excitation ljusintensitet till det minimum som krävs och har en cell vitalitet kontroll. När dessa kontroller är inställda, är användningen av fluorescerande färgämnen inte begränsad till visualisering uppgifter endast, men deras koncentrationsberoende färgning dynamik, liksom koncentrationsberoende biverkningar kan analytiskt utnyttjas; till exempel, för att kvantitativt övervaka cell Väggs biosyntes i realtid eller för identifiering av mutantspecifika fenotyper i känslighetsanalyser47.

Förbättrade framtida tillämpningar beror på en detaljerad funktionell analys av färg färgning egenskaper. En stor pågående utmaning är att ytterligare förbättra och automatisera kvantitativa bildanalyser för att främja funktionell utvärdering av den subcellulära dynamiken i membran och cell Väggs selektiva fluorescerande färgämnen i trådformiga svampar. För denna, omfattande, kvantitativa Co-lokalisering studier av dessa färgämnen med kända organell och cellvägg polymer markörer i kombination med muterade stammar bristfällig i synnerhet transportvägar eller som saknar specifika strukturella komponenter krävs först. Flera endocytos markörer för jämförande analyser med FM-färgämnen finns tillgängliga48,49, och med avseende på de fortfarande dåligt karaktäriserade bindande särdragen hos cell Väggs färgämnen i svampar, kan tillämpningen av fluorescerande-märkta GLUCAN-specifika antikroppar50 ge en möjlighet att ta itu med denna fråga.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen och inget att avslöja.

Acknowledgments

Tack vare den tyrolska vetenskaps fonden (TWF) för att ge bidrag #256524 till AL, till Wien Science and Technology Fund (WWTF) för att ge bidrag #LS13-086 till SZ, och till Publikationsfond vid universitetet i Innsbruck för att stödja Open Access publikation. Författarna tackar också Institutionen för zoologi vid universitetet i Innsbruck för att tillhandahålla Leica TCS SP5 II konfokala laser scanning Mikroskop.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BRAND cell counting chamber Merck BR718005 Thoma format
Calcofluor White M2R Merck/Sigma-Aldrich F3543 cell wall dye
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI Nikon MRD07602 water immersion objective
Congo Red Merck/Sigma-Aldrich C6277 cell wall dye
Dimethyl sulfoxide VWR 8,36,73,230 organic solvent
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit Nikon custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5
FM 1-43 Merck/Sigma-Aldrich S6814 membrane dye
FM 4-64 Merck/Sigma-Aldrich S6689 membrane dye
Glass beads Rettberg 1340691030 3 mm glass beads
Glass cover slips Thermo Fisher Scientific BB02400600A113MNT0 24 x 60 # 1 glass cover slips
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc Leica 15506353 glycerol immersion objective
LSM 510 Meta Zeiss custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3
M9 Minimal Medium Merck/Sigma-Aldrich M6030 generic fungal growth medium
Micro-slide 8-well ibidi 80826 ibiTreat #1.5 polymer coverslip
Miracloth Merck/Millipore 475855-1R polyester filtration material
Petri dish Sarstedt 8,21,472 92 x 16 mm culture dish w/o cams
Phytagel Merck/Sigma-Aldrich P8169 transparent gelling agent
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC Zeiss 440762-9904-000 oil immersion objective
Pontamine Fast Scarlet 4B Merck/Sigma-Aldrich 212490 cell wall dye
Potato Dextrose Agar (PDA) BD Difco 213400 fungal growth medium for T. atroviride
Potato Dextrose Broth (PDB) BD Difco 254920 fungal growth medium for T. atroviride
Reaction tube Sarstedt 72,706 1.5 mL SafeSeal tube
Scalpel B.Braun 5518016 Cutfix sterile scalpel #23
Screw cap tube Sarstedt 6,25,54,502 15 mL polypropylene tube
Solophenyl Flavine 7GFE 500 CIBA 1485385V6 cell wall dye
SynaptoGreen C4 Biotum 70020 membrane dye
SynaptoRed C2 Biotum 70021 membrane dye
Syringe membrane filter Thermo Fisher Scientific 723-9945 0.45 µm SFCA syringe filter
TCS SP5 II Leica custom configuration inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1
Vogel's Minimal Medium (VMM) FGSC Fungal Genetics Stock Centre fungal growth medium for N. crassa

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Read, N. D., Fischer, S., Parton, R. M. Imaging Spitzenkörper, pH and calcium dynamics in growing fungal hyphae. Pesticide Science. 54 (2), 179-181 (1998).
  2. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell imaging of filamentous fungi using vital fluorescent dyes and confocal microscopy. Microbial Imaging. , Elsevier. 63-87 (2004).
  3. Jelínková, A., et al. Probing plant membranes with FM dyes: tracking, dragging or blocking. The Plant Journal. 61 (5), 883-892 (2010).
  4. Fischer-Parton, S., et al. Confocal microscopy of FM4-64 as a tool for analysing endocytosis and vesicle trafficking in living fungal hyphae. Journal of Microscopy. 198 (3), 246-259 (2000).
  5. Harris, S. D. Branching of fungal hyphae: regulation, mechanisms and comparison with other branching systems. Mycologia. 100 (6), 823-832 (2008).
  6. Roca, M. G., Arlt, J., Jeffree, C. E., Read, N. D. Cell biology of conidial anastomosis tubes in Neurospora crassa. Eukaryotic Cell. 4 (5), 911-919 (2005).
  7. Becker, Y., et al. The fungal cell-wall integrity MAPK cascade is crucial for hyphal network formation and maintenance of restrictive growth of Epichloë festucae in symbiosis with Lolium perenne. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 69-85 (2015).
  8. Justa-Schuch, D., Heilig, Y., Richthammer, C., Seiler, S. Septum formation is regulated by the RHO4-specific exchange factors BUD3 and RGF3 and by the landmark protein BUD4 in Neurospora crassa. Molecular Microbiology. 76 (1), 220-235 (2010).
  9. Atanasova, L., et al. The Gpr1-regulated Sur7 family protein Sfp2 is required for hyphal growth and cell wall stability in the mycoparasite Trichoderma atroviride. Scientific Reports. 8 (1), 12064 (2018).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  11. Wu, Y., Yeh, F. L., Mao, F., Chapman, E. R. Biophysical characterization of styryl dye-membrane interactions. Biophysical Journal. 97 (1), 101-109 (2009).
  12. Betz, W. J., Mao, F., B, S. C. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6, 365-371 (1996).
  13. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
  14. Bolte, S., et al. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. Journal of Microscopy. 214, Pt 2 159-173 (2004).
  15. Riquelme, M., et al. Spitzenkorper localization and intracellular traffic of green fluorescent protein-labeled CHS-3 and CHS-6 chitin synthases in living hyphae of Neurospora crassa. Eukayotic Cell. 6 (10), 1853-1864 (2007).
  16. Lichius, A., Yáñez-Gutiérrez, M. E., Read, N. D., Castro-Longoria, E. Comparative live-cell imaging analyses of SPA-2, BUD-6 and BNI-1 in Neurospora crassa reveal novel features of the filamentous fungal polarisome. PloS one. 7 (1), 30372 (2012).
  17. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
  18. Dijksterhuis, J., Molenaar, D. Vesicle trafficking via the Spitzenkörper during hyphal tip growth in Rhizoctonia solani. Antonie van Leeuwenhoek. 103 (4), 921-931 (2013).
  19. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Medical Mycology. 47, 110-119 (2009).
  20. Delgado-Álvarez, D. L., Bartnicki-García, S., Seiler, S., Mouriño-Pérez, R. R. Septum development in Neurospora crassa: the septal actomyosin tangle. PLoS One. 9 (5), 96744 (2014).
  21. Hageage, G. J., Harrington, B. J. Use of Calcofluor White in clinical mycology. Laboratory Medicine. 15 (2), 109-112 (1984).
  22. Monheit, J. E., Cowan, D. F., Moore, D. G. Rapid detection of fungi in tissues using Calcofluor White and fluorescence microscopy. Archives of Pathology and Laboratory. 108 (8), 616-618 (1984).
  23. Herth, W., Schnepf, E. The fluorochrome Calcofluor White binds oriented to structural polysaccharide fibrils. Protoplasma. 105 (1-2), 129-133 (1980).
  24. Elorza, M. V., Rico, H., Sentandreu, R. Calcofluor White alters the assembly of chitin fibrils in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans cells. Journal of General Microbiology. 129 (5), 1577-1582 (1983).
  25. Lagorce, A., et al. Genome-wide analysis of the response to cell wall mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20345-20357 (2003).
  26. Sanz, A. B., García, R., Rodríguez-Peña, J. M., Arroyo, J. The CWI Pathway: regulation of the transcriptional adaptive response to cell wall stress in yeast. Journal of Fungi. 4 (1), (2017).
  27. Slifkin, M., Cumbie, R. Congo Red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
  28. Michels, J., Büntzow, M. Assessment of Congo Red as a fluorescence marker for the exoskeleton of small crustaceans and the cuticle of polychaetes. Journal of Microscopy. 238 (2), 95-101 (2010).
  29. Pancaldi, S., Poli, F., Dall'Olio, G., Vannini, G. L. Morphological anomalies induced by Congo Red in Aspergillus niger. Archives of Microbiology. 137 (3), 185-187 (1984).
  30. Roncero, C., Durán, A. Effect of Calcofluor White and Congo Red on fungal cell wall morphogenesis: in vivo activation of chitin polymerization. Journal of Bacteriology. 163 (3), 1180-1185 (1985).
  31. Kopeck, M., Gabriel, M. The influence of Congo Red on the cell wall and (1,3)- β-d-glucan microfibril biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Microbiology. 158 (2), 115-126 (1992).
  32. Heilmann, C. J., et al. Surface stress induces a conserved cell wall stress response in the pathogenic fungus Candida albicans. Eukayotic Cell. 12 (2), 254-264 (2013).
  33. Hoch, H. C., Galvani, C. D., Szarowski, D. H., Turner, J. N. Two new fluorescent dyes applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia. 97 (3), 580-588 (2005).
  34. Liesche, J., Ziomkiewicz, I., Schulz, A. Super-resolution imaging with Pontamine Fast Scarlet 4BS enables direct visualization of cellulose orientation and cell connection architecture in onion epidermis cells. BMC Plant Biology. 13, 226 (2013).
  35. Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
  36. Knight, N. L., Sutherland, M. W. A rapid differential staining technique for Fusarium pseudograminearum in cereal tissues during crown rot infections. Plant Pathology. 60 (6), 1140-1143 (2011).
  37. Fajardo-Somera, R. A., et al. Dissecting the function of the different chitin synthases in vegetative growth and sexual development in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 75, 30-45 (2015).
  38. Lichius, A. Cell Fusion in Neurospora crassa. , The University of Edinburgh. Edinburgh (UK). Doctor of Philosophy (Ph.D.) (2010).
  39. Chen, W., Li, W., Dong, X., Pei, J. A Review of Biological Image Analysis. Current Bioinformatisc. 13 (4), 337-343 (2018).
  40. Live cell imaging: A laboratory manual. Goldman, R. D., Swedlow, J., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
  41. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  42. Zemanek, G., Jagusiak, A., Chłopaś, K., Piekarska, B., Stopa, B. Congo Red fluorescence upon binding to macromolecules - a possible explanation for the enhanced intensity. Bio-Algorithms and Med-Systems. 13 (2), 1187 (2017).
  43. Hickey, P. C., Jacobson, D. J., Read, N. D., Louise Glass, N. Live-cell imaging of vegetative hyphal fusion in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 37 (1), 109-119 (2002).
  44. Hamamatsu Si APD - high sensitivity photodiodes having an internal gain mechanism: Avalanche photodiode selection guide 2019. , Available from: https://www.hamamatsu.com/resources/pdf/ssd/si_apd_kapd0001e.pdf (2019).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
  46. Thomas, J., Idris, N. A., Collings, D. A. Pontamine Fast Scarlet 4B bifluorescence and measurements of cellulose microfibril angles. Journal of Microscopy. 268 (1), 13-27 (2017).
  47. Ram, A. F. J., Klis, F. M. Identification of fungal cell wall mutants using susceptibility assays based on Calcofluor White and Congo Red. Nature Protocols. 1 (5), 2253-2256 (2006).
  48. Toshima, J. Y., et al. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proceedings of the National Academy of Science of the USA. 103 (15), 5793-5798 (2006).
  49. Kilaru, S., Schuster, M., Latz, M., Guo, M., Steinberg, G. Fluorescent markers of the endocytic pathway in Zymoseptoria tritici. Fungal Genetics and Biology. 79, 150-157 (2015).
  50. Fu, C., Tanaka, A., Free, S. J. Neurospora crassa 1,3-α-glucan synthase, AGS-1, is required for cell wall biosynthesis during macroconidia development. Microbiology. 160, Pt 8 1618-1627 (2014).

Tags

Biologi fluorescerande vitala färgämnen Live-cell Imaging trådformiga svampar Trichoderma atroviride neurospora crassa cellväggen färgning plasmamembran färgning endocytos spårning konfokala laserscanning mikroskopi kvantitativa bildanalyser
Applicering av membran och cellvägg selektiva fluorescerande färgämnen för levande cell avbildning av trådformiga svampar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lichius, A., Zeilinger, S.… More

Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. J. Vis. Exp. (153), e60613, doi:10.3791/60613 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter