Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için Leishmania amazonensis ile Vivo Enfeksiyon

Published: February 20, 2020 doi: 10.3791/60617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

Summary

Burada, Leishmania amazonensisile farelerin kutanöz enfeksiyon değerlendirmek için derlenmiş bir protokol sıyoruz. Bu parazit virülans çalışma için güvenilir bir yöntemdir, enfeksiyona omurgalı konak yanıtı sistemik bir görünüm sağlayan.

Abstract

Leishmania spp. leishmaniases neden protozoan parazitler, kutanöz visseral lezyonlar için klinik bulgular geniş bir yelpazede mevcut hastalıklardır. Şu anda, 12 milyon kişi Leishmania dünya çapında enfekte olduğu tahmin edilmektedir ve 1 milyardan fazla insan enfeksiyon riski altında yaşıyor. Leishmania amazonensis Orta ve Güney Amerika'da endemik ve genellikle doğrudan bir hayvan modelinde görselleştirilmiş olabilir hastalığın kutanöz formuna yol açar. Bu nedenle, L. amazonensis suşları kutanöz leishmaniasis çalışmaları için iyi modeller de kolayca in vitro yetiştirilen çünkü. C57BL/6 fareler insanlarda gözlenen L. amazonensisgüdümlü hastalık ilerlemesini taklit eder ve kutanöz leishmaniasis için en iyi fare suşları modeli olarak kabul edilir. Omurgalı konak, bu parazitler bu hücrelerin savunma mekanizmaları rağmen makrofajlar yaşıyor. Çeşitli çalışmalarda farklı koşullar altında parazit enfekte değerlendirmek için in vitro makrofaj enfeksiyonu testleri kullanın. Ancak, in vitro yaklaşım organizmanın tepkisini göz ardı izole bir hücre sistemi ile sınırlıdır. Burada, konak-parazit etkileşimine sistemik fizyolojik bir bakış sağlayan in vivo murine enfeksiyonu yöntemini derlemekteyiz. L. amazonensis ile C57BL/6 farelerin in vivo enfeksiyonu için ayrıntılı protokol enfektif amastigotlar, fareler ayak takımı kutanöz inokülasyon, lezyon gelişimi ve parazit yük tayini içine parazit farklılaşması nı kapsar. Bu köklü yöntemi, konakçının immün ve metabolik yanıtlarının kutanöz leishmaniasis'e karşı fizyolojik çalışmalar için en uygun yöntem olarak öneriyoruz.

Introduction

Leishmaniases gelişmekte olan ülkelerde önemli sorunları temsil eden dünya çapında yaygın paraziter bulaşıcı hastalıklar ve Dünya Sağlık Örgütü1,2tarafından en önemli ihmal tropikal hastalıklardan biri olarak kabul edilmektedir. Leishmaniases kutanöz ile karakterizedir, mukozal, ve / veya visseral belirtileri. Kutanöz leishmaniasis genellikle L. amazonensisneden olur , L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica ve L. aethiopica3. Hastalığın Bu formu genellikle koruyucu hücresel immün yanıt indüksiyon nedeniyle insanlarda kendi kendine iyileşme olduğunu. Ancak, hücresel immün yanıt başarısız olabilir, ve hastalık yaygın kutanöz leishmaniasis ilerleyebilir4,5. Leishmania türleri ve ev sahibi genetik arka planlar arasında çeşitlilik nedeniyle kullanılabilir bir aşı yoktur6,7. Tedavi seçenekleri de şu anda mevcut ilaçların çoğu ya pahalı, toksik, ve / veya uzun süreli tedavigerektirebilirolarak sınırlıdır 8,9. Ayrıca, mevcut tedavilere karşı ilaç direnci raporları olmuştur10,11.

Leishmaniases ve nedensel ajan protozoon parazit Leishmaniaolduğunu. Parazit yaşam döngüsünde iki farklı morfolojik form sunar: promastigotes, kum sinalarda bulunan kamçılı form; ve amastigotes, memeli konak makrofajlar parasitophorous vakuollerde bulunan hücre içi formu12,13. Amastigotes 'yeteneği işgal etmek, hayatta kalmak ve omurgalı konak makrofajlar savunma mekanizmaları rağmen çoğaltmak birçokçalışmalaratabidir 14,15,16,17. Sonuç olarak, çeşitli araştırma grupları belirli çevresel faktörlerin yanı sıra parazit ve konak genlerin parazit enfektiliği üzerindeki etkisini değerlendirmek için in vitro makrofaj enfeksiyonu tahlilleri tarif edilmiştir. Bu tahlil, yüksek iş verime biçimine çalışmaları uyarlama yeteneği, sonuç elde etmek için nispeten daha kısa bir süre ve18kurban edilen laboratuvar hayvanı sayısının azalması gibi çeşitli avantajlar sunar. Ancak, in vitro tahlil bulguları her zaman in vivo çalışmalarda çoğaltmak değil çünkü sınırlıdır14,19,20,21. In vivo tahliller tam in vitro tahliller tarafından taklit edilemez konak-parazit etkileşimi, sistemik fizyolojik bir bakış sağlar. Örneğin, immünolojik çalışmalar toplanan footpad doku bölümlerinden immünohistokimyasal tahliller yoluyla ve hatta kurtarılan bağışıklık hücrelerinin analizi için popliteal lenf düğümlerinden yapılabilir22.

Hayvanlar genellikle biyolojik ve biyomedikal araştırmalarda insan hastalıkları için bir model olarak daha iyi hastalıkların altında yatan fizyolojik mekanizmaları anlamak için kullanılır23. Leishmaniasis durumunda, rota, site, veya aşı lama dozu hastalık sonucu etkisi24,25,26,27. Ayrıca, duyarlılık ve insanlar ve farelerde enfeksiyona direnç son derece konak ve parazit genetik arka planlar tarafından düzenlenir4,5,22,28,29,30,31. BALB/ c fareler l. amazonensis kutanöz enfeksiyona son derece duyarlıdır, lenf düğümleri, dalak ve karaciğer 32 parazitlerin yayılması ile hızlı bir hastalık ilerlemesi gösteren32. Hastalık kutanöz metastazlara doğru ilerleyebileceğinden, enfeksiyon ölümcül olabilir. Buna karşılık, C57BL/6 fareler genellikle L. amazonensis enfeksiyonu tahlilleri kalıcı parazit yükleri ile kronik lezyonlar geliştirmek33. Böylece, Bu özel fare türleri ile L. amazonensis enfeksiyon insanlarda kutanöz leishmaniasis kronik formları çalışmak için mükemmel bir model olarak kabul edilmiştir, bu BALB / c fareler enfeksiyon modeli daha iyi hastalık ilerlemesini taklit çünkü5,34.

Bu nedenle, biz in vivo enfeksiyon murine insan hastalığı için geçerli Leishmania virülans fizyolojik çalışmalar için yararlı bir yöntem olduğunu önermek, konak-parazit etkileşimsistemik bir görünüm sağlayan. Iyi kurulmuş tahliller22revisiting , burada axenic amastigotes içine parazit farklılaşması nı oluşturan L. amazonensis ile C57BL/6 farelerin in vivo enfeksiyonu bir derlenmiş adım adım protokol mevcut, fareler ayak takımı kutanöz aşılama, lezyon gelişimi, ve parazit yük tayini. Bu protokol kutanöz leishmaniases neden diğer fare suşları ve Leishmania türlerine adapte edilebilir. Sonuç olarak, burada sunulan yöntem yenianti-Leishmania ilaç hedefleri ve aşıları belirlenmesinde çok önemlidir, yanı sıra leishmania enfeksiyonuna konak bağışıklık ve metabolik tepkiler fizyolojik çalışmalarda.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler São Paulo Üniversitesi Biyobilim Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (CEUA 342/2019) ve São Paulo Eyaleti Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili öneriler ve politikalara uygun olarak yürütülmüştür (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) ve Brezilya hükümeti (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Bölüm 1-5'te açıklanan tüm adımlar laminar akış dolaplarıiçinde aseptik olarak yapılmalıdır. Canlı Leishmania parazitleri kullanılırken kişisel koruyucu ekipmanlar kullanılmalıdır.

1. In Vitro Farklılaşma L. amazonensis Promastigotes içine Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

NOT: Bu istetkide L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) paraziti kullanılmıştır. Çalışma amacına bağlı olarak, enfektif parazit formu ya daha önce açıklandığı gibi, bir yoğunluk gradyanı kullanarak metasiklik formun saflaştırılması ile elde edilebilir14, veya axenic amastigotes içine promastigotes farklılaşması, aşağıdaki protokole göre.

  1. Promastigotes (pro-medium) (pH = 7.0) için orta 10 mL içeren 25 cm2 hücre kültürü şişesi nde La promastigotes büyümek.
  2. 25 °C'de 3 gün kuluçkaya yatırın.
    NOT: Parazitlerin39, 40 ,41,42,43,44virülans ve aneuploidi değişikliklerinin kaybını önlemek için 10x'ten daha az in vitro olarak geçen promastigote kültürleri kullanın.
  3. Yeni bir 25 cm2 şişe içine logaritmik büyüme fazı promastigot ekolünün pipet 5 mL.
  4. Axenic amastigotes (ama-medium) (pH = 5.2) için orta 5 mL ekleyin.
  5. 34 °C'de 3-4 gün kuluçkaya yatırın.
  6. 1:3 oranında ama-orta ile seyrelterek kültürü yeni bir 25 cm2 şişeye bölün.
  7. 34 °C'de 3-5 gün kuluçkaya yatırın.
    NOT:37.olgunlaşmanın sonunu temsil eden axenic amastigotes'i 5 güne kadar kuluçkaya yatırın.

2. L. amazonensis ile C57BL/6 Ayak Takımı Enfeksiyonu

NOT: Kadın C57BL/6 fareler (6-8 haftalık) São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Hayvan Merkezi'nde elde edildi ve bakımı yapıldı. Hayvanlara yiyecek ve su reklamı libitum aldı.

  1. PBS'de seyreltilmiş parazit süspansiyonunun bir aliquot'u Neubauer odasına (yani hemositometre) aktararak axenic amastigotes kültürünü sayın. Amastigotes formlarını temsil eden kamçısız parazitleri sayın.
    NOT: Alternatif olarak, Trypan mavisi (1:1) uygun amastigotes sayısını saymak için kullanılabilir (yani, Bu Trypan mavi ile boyanmış değil).
  2. PBS'deki axenik amastigotları istenilen inokül dozuna ve amaçlanan inokül sayısına göre seyreltin (50 μL PBS'de 1 x 106 axenic amastigotes önerilir).
  3. Hazırlanan parazit süspansiyonu ile 27 G iğne ile bir tüberkülin şırınga yükleyin.
  4. Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi45tarafından tavsiye edilen% 3-5 izoflurankullanarak bir C57BL/6 fare anestezik. Farenin bir parmak kıskacına yanıtını test ederek anestezi derinliğini değerlendirin.
  5. Homojenize parazit süspansiyonunun 50 μL'sini (1 x 106 axenic amastigotes veya istenilen inokül dozu) sol arka ayak alt dipdokusunda, önceden yüklenmiş tüberkülin şırıngını kullanarak (adım 2.3) inceleyin.

3. Fare Ayak Takımı Lezyon Gelişimi

  1. Bir kaliper kullanarak sol (enfekte) ve sağ (enfekte olmayan) ayak lıklarının kalınlığını ölçerek haftada bir lezyonun ilerlemesini ölçün.
  2. Lezyon progresyonunu değerlendirmek için haftalık olarak sol ve sağ arka ayak altlıkları arasındaki kalınlık farkını hesaplayın.
  3. Hesaplanan farkları Y ekseni ve bulaşmasının zamanı üzerinde X ekseninde çizin ve istatistiksel anlamlılığı hesaplayın.
    NOT: Hayvan Bakım ve Kullanım Komitelerinin tavsiyeleri doğrultusunda, deri ülserleri ikincil enfeksiyona yol açabileceğinden, enfekte lezyon ülsere hale gelmeden önce hayvanlar kurban edilmelidir. Ek Şekil 1'degösterildiği gibi, lezyonların bu protokolde kullanılan parazit dozu (106 axenic amastigotes) ve konak suşu (C57BL/6) ile ülserasyon belirtileri göstermesi yaklaşık 10 hafta sürmelidir. Ülserasyon belirtileri gözlemlenmeden önce fareler lezyon ekstraksiyonu için kurban edilmelidir.

4. Fareler Footpad Lezyon Ekstraksiyon ve Parazit Sınırlayıcı Seyreltme

  1. Tüm kuyulara 180 μL pro-medium ekleyerek limitli seyreltme teşbi46,47 için 96 kuyu plakası (düz alt) hazırlayın.
    NOT: Her hayvan için dört lüzumlu tahlilleri (yani, hayvan 1 = a-d şeritleri; hayvan 2 = e-h şeritleri) temsil eden dört plaka şeridi (plakanın yarısı) kullanın.
  2. Lezyon başına cam doku öğütücü tüp pro-orta 1 mL ekleyin ve tüp tartın.
    NOT: Tüp steril tutulmalıdır, bu nedenle steril bir kapak kullanın ve kapalı kapaklı tüpü tartın, laminar akış dolabının dışında tartılırsa.
  3. Hayvan Bakım ve Kullanım Komitelerinin tavsiyelerine uyarek hayvanı CO2 odasında kurban edin. % 70 etanol ile püskürtme hayvan dezenfekte.
  4. Enfekte footpad ayıklamak ve dezenfeksiyon için ayak takımı% 70 etanol sprey için topuklar hayvanın ayak çıkarmak. Makas ve forceps sterilizasyon% 70 etanol içinde ıslatılmış tutarak emin olun.
  5. Bir steril Petri çanak enfekte footpad yerleştirin ve tüm yumuşak dokuları toplamak için steril forceps ve bir neşter kullanarak incelemek. Kemikleri atın.
    NOT: Diseksiyon basamağı nda tekdüzelik önyargılı doku iyileşmesini önlemek için tavsiye edilir.
  6. Toplanan dokuları pro-medium ile cam doku değirmeni tüpüne aktarın, sonra lezyon ağırlığını belirlemek için tüpü tekrar tartın.
    NOT: Küçük hacimler çıkarılabildiğiniz için, çalgılar ve neşterleri doğrudan ortama yerleştirmekten kaçının, bu da doku ağırlığının hafife alınmasına neden olabilir. Lezyonun ağırlığı, pro-orta içeren tüpün ağırlığı ile toplanan dokunun sadece pro-orta içeren tüpün ağırlığından çıkarılarak hesaplanır.
  7. Tam doku bozulması için değirmeni kullanarak doku 10x homojenize.
  8. 10 dakika boyunca tortu karışımı izin verin, sonra supernatant 20 μL toplamak.
  9. Adım 4.1'de hazırlanan 96 kuyu plakasının 1inci şeridinin 1inci sütunundaki süpernatantın 20 μL'sini yükleyin. Sonraki üç şerit için her hayvan için dört katına çıkmak için bunu tekrarlayın (örneğin, hayvan 1 için her kuyuya 20°L ekleyin ve A1, B1, C1 ve D1 etiketini etiketleyin).
  10. Çok kanallı bir pipet kullanarak 1inci sütun 10x'teki her kuyuyu homojenize edin. Daha sonra seyreltilmiş numunelerin 20 μL'sini 1inci sütundan 2sütuna aktarın.
    NOT: Her kuyu10x'ü bir sütundan diğerine homojenize etmek önemlidir.
  11. Kalan tüm sütunlara kalan tüm sütunlara 4.10 adımını son sütuna (12th)kadar tekrarlayın ve seyreltilmiş numunenin son 20 μL'sini atın.
    NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için her seyreltmeden sonra uçları değiştirin.
  12. Plakaları bir filmle kapatın ve 25 °C'de nemli bir odada 7 gün kuluçkaya yatırın.

5. Lezyon Parazit Yükü Tayini

  1. Her şerit için son parazit içeren kuyuyu belirlemek için ters bir mikroskop kullanarak 7 günlük kuluçkadan sonra plakaları analiz edin.
    NOT: Ortamın renk değişimleri ve bulanıklığının görsel analizi ile parazitlerin veya hücre yoğunluğunun büyümebelirtisine de sahip olmak mümkündür.
  2. Lezyon ağırlığı başına seyreltme faktörü bölerek her şerit için parazit doku yükünü hesaplayın.
    NOT: Belirli bir şeritte, parazitler sadece 1-5 sütunlarında mevcutsa (yani, A1-A5 kuyuları parazit büyümesi için pozitiftir), bu sütun 5'te sadece 1 parazit, sütun 4'te 10 parazit ve benzeri on katlarda bulunduğu anlamına gelir. Sütun 1, supernatantın ilk 20 μL'indeki parazit sayısını temsil eden 104 parazit içerecektir (adım 4.7'deki seyreltilmemiş numune). Bu 20 μL pro-orta 180 μL ile seyreltilmiş olduğundan, ilk tüp 5 x 105 parazit içeriyordu: (1 x 104) / (0.02 mL) = 5 x 105 parazit/1 mL. Daha sonra, bu lezyondaki parazit yükü, parazitin başlangıç konsantrasyonunun lezyon ağırlığına bölünmesi ile hesaplanabilir: (5 x 105) / lezyon ağırlığı (bkz. adım 4.6).
  3. Bir günlük Y-ölçeği ile her hayvan için dörtlü sonucun ortalamasını çizin.

6. İstatistiksel Analiz

  1. Verileri, kopyaolarak deney grubu başına en az beş hayvan kullanarak ortalama ± standart sapma olarak temsil edin.
  2. P değeri < 0,05'in önemli olduğunu göz önünde bulundurarak, eşleşmemiş iki kuyruklu testi kullanarak istatistiksel analiz yapın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Leishmania protozoan parazitler omurgasız ve omurgalı konaklarında yaşam döngüsü boyunca iki gelişimsel formlarda bulunurlar: promastigotes, dişi kum sineğinin lümeninde bulunan proliferatif formlar; ve amastigotes, memeli konak hücrelerin parasitophorous vakuollerde bulunan proliferatif formları. Promastigotes yaklaşık 1.5 μm genişliğinde ve 20 μm uzunluğunda uzun bir gövdeye sahiptir ve genellikle ön ekstremiteden çıkan bir kamçı vardır. Amastigotes boyutu 2-6 μm uzunluğunda ve 1.5-3 μm genişliğinde arasında değişen yuvarlak veya oval bir gövdeye sahip ve belirgin olmayan bir kamer12,13 (Şekil 1A)sahip. Kan yemeği sırasında omurgasız konak, aile Psychodidae bir hematophagous böcek, Leishmania amastigotes ile enfekte makrofajlar elde. Bu hücreler kum sineği sindirim tüpüne ulaştıktan sonra, amastigotes serbest bırakılır ve prosiklik promastigotes ayırt (Şekil 1A). Bu formlar noninfective ve yoğun ikili bölünme ile çarpma kvese ve böcek vektör sindirim tüpü kolonize. Prosiklik formlar daha sonra metasiklik formlara, enfektif ve hızlı hareket eden bir forma, daha ince bir gövde ve uzatılmış kamçılı formlara ayırttir (Şekil 1A). Metasiklik formlar yemek borusunun ön kısımlarını istila eder ve kum sineğinin proventrisi, böylece bir sonraki kan öğünü sırasında, kusturma bu enfekte formların yeni bir omurgalı konak içine aşılanması sağlar. Omurgalı konak tegument olarak, parazitler makrofajlar tarafından fagositoz ve parasitophorous vakuoller içinde amastigotes içine ayırt, amastigotes ikili bölünme ile çoğalmak ve Leishmania12 yaşam döngüsünü tamamlamak nerede13.

Axenic koşullar parazit morfolojisi ve canlılık koruyarak, in vitro farklı konak ortamları simüle edebilirsiniz. Amastigotes için axenic koşullar daha önce bir makrofaj parasitophorous vacuole ortamı simüle ve amastigot formu37içine promastigote in vitro farklılaşma tetikleyen tarif edildi . Bu koşullar asidik ortamı (pH = 5.5) ve omurgalı konaklarının artan sıcaklığını (34 °C) taklit eder. Şekil 1B, kültürdeki bu koşulları değiştirerek amastigotlara farklılaşan promastigotları göstermektedir. Bu axenic amastigotes canlılığı Trypan mavi boyama, canlı hücrelerin bazı boyalar hariç bozulmamış membranlar sahip ilkesine dayalı bir yöntem ile analiz edilebilir, ölü hücrelerise 48. Alternatif olarak, nötr pH'a aktarıldığında ve 25 °C'de kuluçkaya yattığında promastigotlara dönüşme yeteneklerini doğrulayan axenik amastigotların canlılığını analiz ettik (Şekil 1B).

Burada farklı Leishmania suşlarının virülansını değerlendirmek için in vivo enfeksiyon yöntemi öneriyoruz. Şekil 2A, yabani tip(La-WT) ve Leishmania Demir Regülatörü 1 nakavt(La-LIR1-/-) L. amazonensis saflaştırılmış metasiklikler ile enfekte olmuş C57BL/6 fare ayak pedlerinin kutanöz lezyon gelişimini gösteren in vivo enfeksiyon masını temsil eder. LIR1, Leishmania'da demir ihracatına aracılık eden ve hücre içi birikimini toksik seviyelere kadar engelleyen hücre içi demir seviyelerini düzenler14. Enfekte vs enfekte olmayan ayak lıklarının kalınlık farklılıklarının ilerlemesini gözlemleyerek, La-LIR1-/- enfekte farelerin La-WT enfekte farelere göre daha küçük lezyonlar sunduğunu gösterdik(Şekil 2A). Bu bulgular LIR1'in L. amazonensis in vivo virrulence için gerekli olduğunu ortaya koymuştur. Bu, Leishmaniagüdümlü kutanöz hastalıkların farklılıklarının değerlendirilmesinde bu yöntemin önemini ve etkinliğini göstermektedir. Şekil 2B, enfekte olmayan (sağ) ve enfekte (sol) ayak altlıklarını ve lezyon gelişimini 73 gün postenfeksiyon dan göstererek La-WTve La-LIR1-/- enfekte olmuş farelerin şişme ve lezyon ilerlemesindeki farklılıkları göstermektedir.

Leishmania enfeksiyonunun ilerlemesi sadece inflamatuar yanıtı temsil eden lezyon gelişimi değil, aynı zamanda parazitin hücre içi replikasyonundan da oluşur. Parazit replikasyonunu değerlendirmek için, lezyonların parazit yükü enfekte lezyon çıkarılarak belirlendi ve ardından 96 kuyu plakasında sınırlı seyreltme tetkik(Şekil 3A). Şekil 3B, 73 günlük enfeksiyon dan sonra La-WTve La-LIR1-/- enfekte farelerdeki ayak takımı lezyonlarının parazit yük analizini göstermektedir. Sınırlayıcı seyreltme tetkiklerinden La -LIR1-/- enfekte farelerin lezyonunda La-WT'ye kıyasla 106kat daha az parazit tespit ettik ve LIR1'in yokluğunun14'ün hücre içi replikasyonunu engellediğini ortaya çıkardık.

Hem lezyon gelişimini hem de parazit yükünü değerlendirmenin avantajlarından biri parazit hücre içi replikasyon ve konak inflamatuar yanıtın olası farklılıklarını saptamaktır. Bu iki fenotip arasındaki farkları, lir1ORF'nin ribozomal lokus14'eentegre edilmiş La -LIR1-/- olan eklenti LIR1(La-LIR1AB)kullanarak gözlemledik. La-LIR1AB bir farenin ayak takımı içine enjekte edildiğinde, La-LIR1-/- ve La-WT enfeksiyonlarına göre orta büyüklükte lezyonlar gözlemledik, ancak La-WT fenotipinin dikkate değer bir tam parazit yükü kurtarması(Ek Şekil 2). Bu sonuçlar La-LIR1AB parazitlerinin uzun süreli in vivo enfeksiyonda La-WT parazitleri gibi çoğalabildiğini göstermektedir. Ancak, lezyonlar önemli ölçüde daha küçük olduğu için fare inflamatuar yanıtı La-WT enfeksiyonları kadar şiddetlenmedi.

Böylece, burada açıklanan yöntem, memeli konaklarında başarılı amastigote hücre içi replikasyon ve kutanöz lezyon gelişimi için gerekli olan L. amazonensis virülans faktörünün tanımlanması ve karakterizasyonu için gerekli olduğu gösterilmiştir.

Figure 1
Şekil 1: L. amazonensis promastigotes ve amastigotes morfolojisi. (A) Leishmania'nınfarklı morfolojik formlarının illüstrasyonları : prosiklik promastigote, metasiklik promastigote ve amastigote. Ölçek çubuğu = 2 μm. (B) In vitro L. amazonensis kültürlerin resimleri. Promastigotların axenik amastigotlara ve axenik amastigotlara in vitro farklılaşması, adım adım protokolde açıklandığı gibi pH ve sıcaklık koşullarını değiştirerek promastigotes'e geri döner. Fotoğraflar ters bir mikroskop kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: LIR1 nakavt belirgin in vivo lezyon gelişiminde L. amazonensis azaltır. C57BL/6 fareler l. amazonensis yabani tip(La-WT) ve L. amazonensis LIR1 nakavt (La-LIR1-/-) 106 saflaştırılmış metasiklik ile sol arka ayak takımı aşılanmış edildi. (A) La -WT ve La-LIR1 -/- enfekte farelerin ayak takımı kutanöz lezyon progresyonu haftalık olarak analiz edilir. Veriler, her gruptaki beş farklı fareden enfekte olmayan ayak takımı kalınlığı ile çıkarılan enfekte footpad'in ortalama ± SEM'ini temsil eder (Laranjeira-Silva ve ark.14'tenuyarlanmıştır). (B) La-WT ve La-LIR1-/- enfekte olmayan ve enfekte olmayan ayak lıklarının resimleri 73 gün postenfeksiyon da şişlik farklılıklarını gösteren enfekte olmuş fareler (Laranjeira-Silva ve ark.14'tenuyarlanmıştır). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: LIR1 nakavt belirgin l. amazonensis in vivo hücre içi replikasyon azaltır. (A) L. amazonensis yabani tip(La-WT) ve LIR1 nakavt(La-LIR1-/-) ile enfekte kurtarılan ayak takımı dokularının 10x seri seyreltme temsil eden bir 96 iyi plaka bir örnek . A-D satırları, La-WT-pad lezyon örneğinin seri seyreltmelerinin dört lördiyi temsil eder. E-H satırları La-LIR1-/--footpad lezyon örneğinin seri seyreltmelerinin dört lördratını temsil eder. Grinin farklı tonları, gözlenen hücre yoğunluğunu iyi temsil eder (yani, daha açık renk daha az parazit anlamına gelir). Kırmızı ile işaretlenmiş kuyular, çoğaltma başına parazit içeren son kuyuları temsil eder. (B) C57BL/6 farelerinin kurtarılan ayak altlığı dokularında parazit yükü, L. amazonensis yabani tipi(La-WT) ve L. amazonensis LIR1 nakavt(La-LIR1-/-) tespit edilen 73 gün postenfeksiyon ile enfekte olmuş 106 saflaştırılmış metasiklik ile enfekte. Veriler, her gruptaki beş farklı fareden alınan doku mg başına parazit yükünün ortalamasını temsil eder (Laranjeira-Silva ve ark.14'tenuyarlanmıştır). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Supplementary Figure 1
Ek Şekil 1: İkincil bir enfeksiyonun göstergesi olarak deri ülseri. C57BL/6 fare ayak pedleri Temsili resimleri L. amazonensis yabani tip(La-WT) ile enfekte 80 gün postenfeksiyon aldı. Kırmızı oklar ülserasyon belirtilerine işaret eder ve deney sonlandırılmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Supplementary Figure 2
Ek Şekil 2: LIR1'in in vivo lezyon gelişimi ve hücre içi parazit replikasyonundaki rolü. C57BL/6 fareler l. amazonensis yabani tip (La-WT), L. amazonensis LIR1 nakavt (La-LIR1-/-), ve L. amazonensis LIR1 eklentisi (La-LIR1AB)ile sol arka ayak takımı aşılandı. (A) La -WT, La-LIR1 -/-ve La-LIR1AB enfekte farelerin ayak takımı kutanöz lezyon progresyonu haftalık olarak analiz edilir. Veriler, her gruptaki beş farklı fareden enfekte olmayan ayak takımı kalınlığı ile çıkarılan enfekte footpad'in ortalama ± SEM'ini temsil eder (Laranjeira-Silva ve ark.14'tenuyarlanmıştır). (B) La-WT, La-LIR1-/-veya La-LIR1AB enfekte farelerden kurtarılan ayak altlığı dokularında parazit yükü 73 gün postenfeksiyon tespit edilmiştir. Veriler, her gruptaki beş farklı fareden alınan doku mg başına parazit yükünün ortalamasını temsil eder (Laranjeira-Silva ve ark.14'tenuyarlanmıştır). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolde açıklanan in vivo enfeksiyon test sistemik bir senaryoda konak-parazit etkileşimi dikkate alınarak herhangi bir araştırmacı in vivo kutanöz leishmaniasis değerlendirmek için izin verir. Bu tahliller birçok grup tarafından kullanılmıştır22,24,27,29,31,32,34,49 ve burada bazı grupların sahip olabileceği altyapı sınırlamaları göz önünde bulundurularak bu yöntemi standartlaştırmak için adım adım bir protokol derledik. Bu protokol aynı zamanda transgenik Leishmania parazitlerinin virülansını in vivo biyogörüntüleme50,51,52ile değerlendirmek için de kullanılabilir. Diğer deneysel prosedürler gibi, bu testin de farelerle rahat çalışan ve kazara enfeksiyonları önlemek için subplantar enjeksiyonları yapma deneyimine sahip eğitimli personel gerektiren gibi yürütmek için sınırlamalar ve kritik adımlar vardır. Protokollerin standartlaştırılması, önyargılı sonuçlardan kaçınmak ve farklı araştırma grupları arasında karşılaştırılabilir sonuçlar üretmek için son derece önemlidir.

Kutanöz leishmaniases için bir model olarak L. amazonensis kullanmanın en büyük avantajı bu türün neden olduğu ayak takımı lezyonu farelerde kolayca değerlendirilebilir olmasıdır. Burada açıklanan yöntemle belirlenen ayak takımı şişmesi iki enfeksiyon fenotiplerinin toplamını temsil eder: konak inflamatuar yanıt ve parazit replikasyonu. Her iki fenotip de lezyon kalınlığı nın ilerlemesi tayini ile parazit hücre içi replikasyonunu yansıtan parazit doku yükü yöntemini ilişkilendirerek ayrı ayrı değerlendirilebilir. Başka bir avantajı L. amazonensis' promastigotes kolayca in vitro yetiştirilir olmasıdır. Bunları göz önünde bulundurarak, herhangi bir araştırma grubu kendi ihtiyaçlarına göre bu Leishmania türlerini manipüle edebilirsiniz. L. amazonensis' çalışmalarından elde edilen bulgular daha sonra belirli bir yol evrimsel olarak korunmuş veya farklı21olup olmadığını belirlemek için diğer Leishmania türleri ile karşılaştırılabilir,53,54.

Doğal döngüsünde, omurgalı konak için Leishmania iletim kan yemek sırasında enfekte kum sinek ısırığı ile oluşur. Kum sinek genellikle böcek tükürük birkaç yüz Leishmania metasiklik promastigotformları aşılar. Deneysel in vivo enfeksiyonlarda, aşılamaen en sık yer hayvanınfootpad 22.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00 Her site farklı fagositik hücre tipleri24,56sunar, çünkü kulak veya intraperitoneal enjeksiyon intradermal enjeksiyon çalışma amacına bağlı olarak aşılama alternatif sitelerdir. Bu nedenle, bazı araştırma grupları doğal iletim taklit etmek için hayvanın kulak dermis enfekte laboratuvar enfekte kum sinekler kullanın56,57,58,59. Ancak, bu protokol, çoğu araştırma grubu için mevcut olmayan tesisleri gerektiren kum sinek kolonilerinin bakımı gibi bazı kısıtlamalar sunar.

La-LIR1-/- ile in vivo C57BL/6 enfeksiyonu açıklayan orijinal çalışma14formlar saflaştırılmış metasiklik promastigotes kullanmıştır. Ancak, Leishmania genetik manipülasyon ya axenic amastigotes içine promastigotes 'farklılaşma bozabilir14 veya metasiklik enfektif formlariçine 20. Bu nedenle, Leishmania zorlanma bağlı olarak, araştırmacı kendi çalışma için uygun enfektif parazit formları elde etmek için en uygun yöntemi belirlemek gerekir. Burada açıklanan promastigote kültürlerden farklılaşan axenic amastigotes protokolü daha kolay bir alternatif olabilir, birçok durumda karşılaştırılabilir sonuçlar üreten19,20,35,37,38,64. Bu yaklaşım, genellikle metasiklik promastigotes arıtma için belirli ama yaygın olarak mevcut olmayan antikorlar65 ile promastigotes kuluçka gibi enfektif parazitlerin daha düşük verimleri neden diğer yöntemlerin kullanımını önler, ya da metasiklik 'LPG ekspresyonuna bağlı yoğunluk gradyan18,66. Diferansiyel protokolünün etkinliği amastin-aile genlerinin ekspresyon düzeyleri belirlenerek değerlendirilebilir64,67. Amastins farklı leishmania yaşam döngüsü sırasında modüle edilmiş bir korunmuş gen ailesinin üyeleridir68 ve parazit virülans ve patogenezi ile ilişkili67,69,70. Diğer belirteçler de promastigote formları amastigote ayırt etmek için kullanılabilir. Örneğin, gp63 amastigotes indirgenir, çünkü rolü böceğin sindirim enzimleri promastigotes korumaktır71.

Fare suş seçimi bir standart in vivo enfeksiyon protokolü geliştirirken dikkate alınması gereken bir başka kritik adımdır. Farelerde Leishmania enfeksiyonuna yatkınlık ve direnç esas olarak genetik arka plan29,30,55tarafından düzenlenir. Bu protokolde, C57BL/6 suş L. amazonensis bağışıklık yanıtı yakından insanlarda karışık Th1-Th2 yanıtı ile ilgili olduğu için seçildi72,73. L. amazonensis ile deneysel murine enfeksiyonları diğer fare suşları28,34,74ile karşılaştırıldığında C57BL/6 farelerde Orta lezyonlara neden olduğu tarif edilmiştir. Ancak parazit türüne bağlı olarak, lezyon boyutundaki farklılıklar sadece BALB/c36gibi duyarlı fare suşlarında tespit edilebilir. Enfeksiyon zaman ders de dikkate alınması gereken ve seçilen fareler suşu ile ilişkilidir29,26,60,61,62,63,75. Ülserli ayak takımları her zaman ikincil enfeksiyonları temsil edebilir ve genellikle enfeksiyon uzun dönemlerde gözlenen kaçınılmalıdır, özellikle duyarlı fare suşları ile deneylerde. Enfeksiyonu başlatmak için günün saatini belirleme göz önünde bulundurulması gereken bir başka adımdır. L. amazonensisile önceki çalışmalarda gösterildiği gibi , parazit inokül günün saati lezyon gelişimini etkiler çünkü konak-parazit etkileşimi çam-çıkışlı melatonin tarafından sirkadiyen bir şekilde etkilenir75.

In vivo enfeksiyon yönteminin en büyük dezavantajı deney laboratuvar hayvanlarının önemli sayıda kullanımını gerektirir ve in vitro enfeksiyon yöntemi18ile karşılaştırıldığında nihai sonuçları elde etmek için daha uzun zaman alır. Ancak, in vivo sonuçlar in vitro enfeksiyon elde edilen sonuçlara göre daha doğru hastalık ilerlemesinin doğal zaman seyrini yansıttığı için bu ikinci yönü de bir avantaj olarak kabul edilebilir. Daha da önemlisi, L. amazonensis in vivo enfeksiyon bulguları sadece parazit virülansındaki geçici değişiklikleri yansıtamaz, aynı zamanda ev sahibinin ve tüm oyuncularının sistemik durumunu kabul eder. Bu nedenle, yukarıda bahsedilen çeşitli faktörler göz önünde bulundurularak, bu protokolde tanımlanan yöntem, kutanöz leishmaniasis kontrolü için yeni kavrayışlar sağlayan virülans ile ilgili diğer hedeflerin ve tedavilerin karakterizasyonu için belirli deneysel ihtiyaçları karşılamak üzere uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgments

São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Hayvan Merkezi'nden Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara'ya destek için ve Prof. Dr. Silvia Reni Uliana'ya cam doku öğütücüsünü temin ettiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Sao Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP - MFLS hibe 2017/23933-3) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671 (2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296 (2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13 (2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300 (2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594 (2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165 (2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140 (2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025 (2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22 (2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108 (2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486 (2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022 (2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research - experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238 (2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144 (2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant? Frontiers in Immunology. 3, 80 (2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266 (2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340 (2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279 (2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764 (2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Johns Hopkins Animal Care and Use Program. , The Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. http://web.jhu.edu/animalcare/index.html (2019).
  46. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  47. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  48. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  49. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  50. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  51. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842 (2015).
  52. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980 (2010).
  53. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  54. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554 (2017).
  55. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  56. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  57. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  58. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  59. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  60. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  61. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  62. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  63. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  64. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026 (2017).
  65. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  66. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  67. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  68. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  69. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  70. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  71. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  72. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  73. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  74. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  75. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 156 C57BL/6 fareler inflamasyon yanıtı parazit yükü lezyon gelişimi kutanöz enfeksiyon baltalı amastigotlar
Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için <em>Leishmania amazonensis</em> ile Vivo Enfeksiyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R.… More

Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter