Summary
Dit protocol beschrijft de chirurgische generatie van orthotopic alvleesklier tumoren en de snelle vertering van vers geïsoleerde lymfatische alvleesklier tumoren. Na de spijsvertering kunnen levensvatbare immuuncelpopulaties worden gebruikt voor verdere downstream-analyse, inclusief ex-vivo stimulatie van T-cellen voor intracellulaire cytokine detectie door Flowcytometrie.
Abstract
In vivo modellen van pancreaskanker bieden onschatbare hulpmiddelen voor het bestuderen van de dynamiek van de ziekte, immuun infiltratie en nieuwe therapeutische strategieën. Het orthotopic Murine model kan worden uitgevoerd op grote cohorten van immunocompetente muizen tegelijk, is relatief goedkoop en behoudt de verwant weefsel micro omgeving. De kwantificering van T-celinfiltratie en cytotoxische activiteit binnen orthotopic tumoren biedt een nuttige indicator van een antitumorele respons.
Dit protocol beschrijft de methodologie voor chirurgische generatie van orthotopic alvleesklier tumoren door injectie van een laag aantal syngene tumorcellen geresuspendeerd in 5 μL kelder membraan direct in de alvleesklier. Muizen met orthotopic tumoren nemen ongeveer 30 dagen om het eindpunt te bereiken, op welk punt tumoren kunnen worden geoogst en verwerkt voor de karakterisering van tumor-infiltrerende T Cell activiteit. Snelle enzymatische spijsvertering met collagenase en DNase maakt het mogelijk om een eencellige suspensie uit tumoren te halen. De levensvatbaarheid en celoppervlak markers van immuuncellen geëxtraheerd uit de tumor worden bewaard; Daarom is het geschikt voor meerdere downstream toepassingen, met inbegrip van flowassisted celsortering van immune cellen voor cultuur of RNA-extractie, Flowcytometrie analyse van immuuncelpopulaties. Hier beschrijven we de ex vivo stimulatie van T celpopulaties voor intracellulaire cytokine kwantificering (IFNγ en TNFα) en degranulatie activiteit (CD107a) als maatstaf voor de totale cytotoxiciteit. Hele-tumor verteert werden gestimuleerd met forbol myristaat acetaat en ionomycine voor 5 h, in aanwezigheid van anti-CD107a-antilichaam om upregulate cytokine productie en degranulatie. De toevoeging van brefeldin A en monensin voor de laatste 4 h werd uitgevoerd om extracellulair transport te blokkeren en cytokine detectie te maximaliseren. Extra-en intra-cellulaire kleuring van cellen werd vervolgens uitgevoerd voor Flowcytometrie analyse, waarbij het aandeel IFNγ+, tnfα+ en CD107a+ CD4+ en CD8+ T cellen werd gekwantificeerd.
Deze methode biedt een start basis voor het uitvoeren van uitgebreide analyse van de tumor micro omgeving.
Introduction
Deze methode Details, van start-tot-finish, de chirurgische procedure voor het genereren van orthotopic alvleesklier tumoren met behulp van een minimale hoeveelheid cellulair materiaal en de daaropvolgende snelle dissociatie van gevestigde tumoren voor uitgebreide flow cytometrie analyse van immuuncelpopulaties, met inbegrip van ex vivo analyse van T cel functie.
Adenocarcinoom van de alvleesklier ductale (PDAC) is een agressief carcinoom met slechts 8% van de patiënten die 5 jaar1overleven. Aangezien minder dan 20% van de patiënten in aanmerking komt voor chirurgische resectie2, zijn verse patiënt monsters niet gemakkelijk toegankelijk voor onderzoek en dus in vivo -modellen bieden essentiële hulpmiddelen om deze ziekte te onderzoeken. Er zijn meerdere Murine modellen van PDAC: orthotopic, subcutaan, transgene, intraveneuze en patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX), uitvoerig beschreven hier3. Het orthotopic model dat hier wordt beschreven, maakt de injectie van syngene PDAC-cellen in de alvleesklier van immunocompetente muizen mogelijk. Dit kan worden uitgevoerd in grote cohorten van wild-type of Mutant muizen, en biedt dus een kostenbesparend en consistent model voor vergelijking van therapeutische middelen. Belangrijk is dat het orthotopic model de verwant micro omgeving biedt voor tumor celgroei en metastaseren in onze handen en anderen4 tot klinisch relevante sites (bijv. lever), waardoor het klinisch relevanter is dan de subcutane of chemisch geïnduceerde modellen. Orthotopic tumoren vertonen de belangrijkste kenmerken van PDAC, zoals een sterke desmoplastische reactie met een overvloed aan fibroblasten en extracellulaire matrix depositie5. Transgene modellen van PDAC zijn de gouden standaard van het muriene model en de meest gebruikte is het KPC-model, dat Mutant krasG12D/+ en Trp53R172H/+ onder de pancreas-specifieke pdx-1-CRE Promoter6uitdrukt. Extra KPC en andere in vivo PDAC modellen worden hier beoordeeld7. KPC-muizen ontwikkelen spontaan alvleesklier tumoren met een ziekteprogressie die getrouw de kenmerken van humane PDAC6repliceert. Echter, zoals voor alle transgene modellen, het fokprogramma is kostbaar, tumorprogressie is variabel en daarom vaak vereist grote cohorten van muizen. PDX-modellen maken gebruik van door patiënten afgeleide tumorcellen of stukken die vervolgens ofwel orthotopisch of vaker subcutaan worden gekweekt bij immuungecompromitteerde muizen. Xenograft modellen bieden nuttige hulpmiddelen voor het screenen van therapeutische verbindingen en rekening voor patiënt heterogeniteit. Echter, ze bieden geen volledige immuun micro-omgeving, waardoor hun toepassingen te beperken8,9.
Eenmaal vastgesteld, orthotopic tumoren meestal duren ongeveer 1 maand of meer om te groeien (afhankelijk van de gebruikte cellijn) en vormen grote tumoren die gemakkelijk kunnen worden afgebeeld door echografie of MRI om progressie te volgen en de effectiviteit van de behandeling te bepalen4,5,10. Echter, eenmaal in exponentiële groei, de laatste fase van de tumorgroei kan snel zijn, dus de meeste behandelingsregimes zijn relatief vroeg begonnen (bijv., 14 dagen)11,12. Het immuunsysteem speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van de tumor, waaronder in PDAC, die wordt gekenmerkt door een immunosuppressieve tumor infiltreren met relatieve paustad van T-cellen en frequente aanwezigheid van myeloïde cellen13. Een hoge aanwezigheid van T-cellen in PDAC verleent een betere prognose14,15. Echter, als enkelvoudige agenten, immuuncontroleeremmers die T-celimmuunsuppressie verlichten, zoals anti-CTLA-416 en anti-PD-L117, hebben geen klinisch voordeel aangetoond bij PDAC-patiënten, hoogstwaarschijnlijk omdat de totale reactiviteit van de t-cel zeer laag is. Echter, agenten die Prime T cel reacties, zoals anti-CD40, kunnen overwinnen anti-PD-L1/ctla-4 weerstand18,19 en vaccinatie met GM-CSF-afscheidende allogene PDAC vaccin (gvax) kan de immunogeniciteit van PDAC tumoren20verhogen, wat aangeeft dat het verbeteren van T cel reacties vormt belangrijke therapeutische Avenue.
Cruciaal voor een antitumorale T cel respons is de herkenning van tumor afgeleide antigenen via de T-cel receptor (TCR) en de daaropvolgende productie van cytotoxische cytokinen en korrels. Hoewel de T-cel-antigeen-herkenning kan worden bepaald door TCR-sequencing, is deze aanpak kostbaar en tijdrovend. Kwantificering van tumor-infiltrerende T-celsubgroepen biedt echter een goede indicatie van een anti-tumorele respons. Verder onderzoek van T-celactiviteit ex vivo in termen van degranulatie, cytokine productie en andere cytotoxische factoren zorgt voor een diepere functionele analyse. Deze testen kunnen worden uitgevoerd op verse tumormonsters en vele parameters van T cel functie kan snel worden gemeten doorstroming cytometrie.
CD8+ en CD4+ T-cellen produceren cytokines zoals Ifnγ en tnfα om een immuunrespons te versterken21. IFNɣ induceert mhci opregulatie op doelcellen, induceert differentiatie en werving van immuuncellen en aids celdood. Ifnγ productie door CD8+ T cellen is goed gekarakteriseerd om deel uit te maken van een antitumorale respons en correleert met tumor regressie22,23. TNFα is een andere proinflammatoire cytokine geproduceerd door zowel CD8+ en CD4+ T-cellen. Het verbetert de TCR-afhankelijke activering en de proliferatie van T-cellen, die de anti-tumorele respons helpen. Bij TCR-engagement kunnen cytotoxische CD8+ T-cellen degranulatie ondergaan, waarbij voorgevormde secretoire lysosomen die cytotoxische moleculen bevatten, in de immunologische SYNAPS vrijkomen om de afbraak van de doelcellen te veroorzaken21. Deze moleculen omvatten Perforine, een eiwit dat zich bindt aan het doelcelmembraan, waardoor poriën worden gevormd die vervolgens de integriteit van het membraan verstoren en diffusie21 of endocytose24 van andere cytotoxische moleculen, zoals Granzyme B, rechtstreeks in het cytoplasma van de doelcel. Granzyme B is een protease dat de afbraak van meerdere eiwitten binnen de doelcel tot gevolg heeft, wat leidt tot celdood21. De afgifte van dergelijke moleculen vereist exocytose van endosomes aan het celoppervlak, waarbij de endosomale marker CD107a (ook bekend als LAMP-1) transitief is opgenomen in het celmembraan25.
De meting van cytokine secretie door T-cellen vereist hun isolatie door middel van doorstroming geassisteerde celsortering of op kraal gebaseerde scheidings testen, die niet gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd op een groot aantal monsters tegelijk. Het meten van intracellulaire cytokines vereist echter geen pre-isolatie stappen en kan eenvoudig op meerdere monsters tegelijk worden uitgevoerd, waardoor een benadering met een hogere doorvoer mogelijk is. Aangezien cytokinen snel worden uitgescheiden door T-cellen, kunnen de intracellulaire niveaus niet detecteerbaar zijn en dus is de T-cel vereist stimulatie om de basale cytokine productie te verhogen. Om de antigeen-gestuurde cytokine productie te beoordelen, moet het door de TCR erkende antigeen in vitro aan de T-cel worden gepresenteerd door een klaar APC. In gevallen waarin de antigeen specificiteit niet bekend is, is een brede stimulatie methode vereist. TCR-stimulatie kan worden geïmtikt met behulp van anti-CD3/28-parels die zowel TCR-activering als costimulatie bieden, wat cytokine-productie en-proliferatie induceert. Echter, een meer kosteneffectieve alternatief is het gebruik van PMA en ionomycine, die samen breed activeren signalering trajecten die leiden tot de synthese en vrijlating van intracellulaire cytokines. Specifiek, PMA activeert proteïne kinase C (PKC) en ionomycine verhoogt intracellulaire CA2 + ionen, leidt tot verhoogde cel signalering. Om de intracellulaire inhoud van cytokines te behouden, kan deze stimulatie effectief worden gecombineerd met eiwit transport remmers brefeldin A en monensin, die eiwitten in de Golgi blokkeren en zo extracellulaire afgifte voorkomen. Het gebruik van PMA/ionomycine is een gevestigde methode voor het stimuleren van T-cellen en er is een sterke correlatie tussen extracellulaire-vrijgegeven en intracellulaire cytokines26. Stimulatie van T-cellen met PMA en ionomycine verhoogt ook lysosoom handel naar celmembraan en dus CD107a wordt transitief geïntegreerd op het celoppervlak voordat het in de cel wordt gerecycled. Door het opnemen van een anti-CD107a antilichaam tijdens de stimulatie, is het mogelijk om het te gebruiken als een marker van de degranulatie activiteit25.
Deze methode verteerd snel de tumoren om een eencellige suspensie te bieden. Op dit moment kunnen individuele populaties direct worden gekleurd voor Flowcytometrie of gezuiverd door downstreammethoden: doorstroming geassisteerde celsortering of scheiding van magnetische kraal. Voorbereiding van een eencellige suspensie voor Flowcytometrie analyse maakt analyse van meerdere immuuncelpopulaties en hun fenotypische markers mogelijk, met een nauwkeurige kwantificering van het immuuncelnummer en fenotype.
Tot slot voorkomt het verterings protocol dat hier wordt beschreven, verlies van celoppervlakte markeringen en handhaaft het de levensvatbaarheid van de immuuncel, waardoor immuuncellen verdere celzuivering stappen en cultuur kunnen ondergaan zoals vereist. Echter, deze methode is niet getest voor het afleiden van epitheliale cellen van deze spijsvertering.
Protocol
Orthotopic alvleesklier tumoren werden gegenereerd zoals eerder beschreven10 in overeenstemming met de Britse Home Office dierlijke en wetenschappelijke Procedures Act 1986 en de Europese richtlijn 2010/63/EU. Alle muizen werden perioperatief gecontroleerd op tekenen van pijn of leed, met inbegrip van maar niet beperkt tot gewichtsverlies (> 15% in 72 h of 20% in een bepaalde periode), piloerectie, vernauwing van de ogen, verhoogde gang, opgejakt uiterlijk, evenals tekenen van wondinfectie, waaronder bloeden, roodheid en ulceratie. Tumor groei werd gecontroleerd door palpatie, en aanvullende klinische verschijnselen zoals moeizame ademhaling, geelzucht en koude ledematen werden ook gemonitord om te beoordelen of er tekenen van eindpunt waren bereikt. Alle procedures moeten in steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Alle reagentia die vóór de Flowcytometrie kleuring worden gebruikt, dienen in steriele omstandigheden te worden bereid.
1. bereiding van tumorcellen voor injectie
- Neem een hoeveelheid kelder membraan van-20 °C en plaats op ijs bij 4 °C 's nachts.
Opmerking: kelder membraan concentratie kan variëren van batch tot batch; Daarom moeten partijen specifieke kelder membraan batches in vivo worden getest om de reproduceerbaarheid te garanderen. Een nieuwe partij van het kelder membraan wordt ontdooid op ijs bij 4 °C 's nachts dan alicgeciteerd in door de gebruiker gedefinieerde aliquots, op ijs, en vervolgens verder opgeslagen in-20 ° c totdat nodig. Dit minimaliseert de Pipetteer-en Vries ontdooiing bij gebruik van het kelder membraan.- Plaats steriel PBS bij 4 °C 's nachts om te relaxen.
- Plaats de steriele 200 μL en de 1000 μL pipetpunten bij-20 °C 's nachts om te relaxen.
- Gebruik tumorcellen die Mycoplasma vrij zijn, geteeld voor ten minste 2-10 passages post-ontdooien en in log-fase van de groei voorafgaand aan de oogst. Dit protocol maakt gebruik van de vrouwelijke Murine C57BL/6 KPC-afgeleide cellijn: TB32048 verstrekt als een royale gift door het lab van David Tuveson.
- Wanneer tumorcellen nodig zijn voor de oogst, verwijder medium uit de kolf en was de cellen tweemaal in PBS (voorverwarmd tot 37 °C).
- Voeg gedurende 10 minuten bij 37 °C 2x trypsine (voorverwarmd tot 37 °C) toe aan de kolf (in een T175 kolf, voeg 5 mL toe).
- Voeg na 10 min een gelijk volume volledig medium (10% FBS, 1x peniciline, 1x streptomycine in DMEM) toe aan de kolf en dissocieer de cellen door zachtjes op de kolf te tikken en goed te suspenderen in medium.
- Breng de cellen over in een buis en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g en kamertemperatuur (RT).
- Verwijder de supernatant en respendeer cellen in het volledige medium voor celtelling.
- Centrifugeer cellen opnieuw gedurende 5 minuten bij 300 x g en RT, en verwijder het supernatant.
- Respendeer cellen in voorgekoelde PBS om een concentratie van 1x106 cellen/ml te bereiken.
Opmerking: deze voorraad concentratie is bereid om een uiteindelijke injectie concentratie van 1000 cellen in 5 μl te bereiken. We vonden injectie van een lager aantal cellen in een laag injectievolume geminimaliseerde cellekkage en daarom verhoogde reproduceerbaarheid echter, tumorgroei kan afhankelijk van de cel zijn, dus gebruikers moeten elke cellijn optimaliseren.
- Naast dit, plaats een pre-aligeciteerde kelder membraan aliquot, op ijs, in de motorkap.
- De verhouding van de uiteindelijke oplossing van de kelder membraan, PBS en tumorcellen in PBS bereid voor injectie is 5:3:2. Voeg daarom met een voorgekoelde pipetpunt van 1000 μl 300 μL voorgekoelde PBS toe aan een aliquot-membraan van 500 μL.
- Voeg de PBS rechtstreeks toe aan het kelder membraan aliquot om pipetteren te minimaliseren.
- Houd de P1000 ingesteld op 300 μL en hervat het PBS-en het kelder membraan, zorg ervoor dat de buis op ijs blijft om het kelder membraan in vloeibare toestand te behouden.
- Wanneer u klaar bent met het uitwerpen van alle kelder membraan van de P1000 tip, laat u de punt in de buis zodat elke kelder membraan/PBS naar beneden te komen de pipetpunt.
- Na 5-10 min, uitwerpen meer kelder membraan van de P1000 Tip terug in de buis en laat de buis te zitten op ijs.
- Neem 200 μL geresuspendeerde tumorcellen in PBS en voeg rechtstreeks aan het kelder membraan toe met een voorgekoelde pipetpunt van 200 μL.
- Neem een verse voorgekoelde P1000 pipetpunt, stel de pipet in op 300 μL en hervat 30-40 keer. Een grotere pipetpunt, ingesteld op een laag volume, heeft de voorkeur omdat het kelder membraan de punt omhoog kan komen en het pipetpunt-filter aanraken tijdens het resuspensie.
- De tumorcellen zijn klaar voor injectie. Houd tumor cel/kelder membraan op ijs tijdens chirurgie.
2. orthotopic injectie van tumorcellen
- De muizen in de dieren faciliteit 7 dagen acclimeren.
- Rond 2 uur voorafgaand aan de operatie, Scheer de linker kant van de buik en rug, en dien vervolgens pre-operatieve analgeticum subcutaan toe onder de Scruff van de nek (buprenorfine bij 50-100 μg/kg).
- Bereid chirurgische veld, met een Heat mat om de muis op te leggen en gordijnen voor de omringende apparatuur en over de muis. Steriliseren alle chirurgische instrumenten; bereid genoeg sets met tools voor elke muis.
- Plaats de muis in een 5% Isofluraan met O2 kamer tot bewusteloos.
- Breng de muis, liggend op zijn rug, op een warmtemat en onderhoud anesthesie met behulp van een masker, meestal op een lagere 2-3% isoflurane.
- Bevestig diepe anesthesie; zoals geïdentificeerd door verlies van de pedaal-opname reflex wanneer de achterpoot wordt geknepen en monitor ademhaling blijft constant.
- Bedek het lichaam in draperen, met alleen het geschoren gedeelte dat wordt blootgelegd. Zorg ervoor dat de muis veilig in het verdoving masker.
- Met behulp van een steriele wattenstaafje, voeg jodiumoplossing in een cirkelvormige beweging over het geschoren gebied: beginnend vanuit het midden en cirkelen uit naar de rand. Herhaal het proces opnieuw met verse wattenstaafje en jodium.
- Gebruik scalpel om een 1 cm incisie direct boven de alvleesklier/milt locatie (linksboven Kwadrant) te maken. Een steriele schaar kan ook worden gebruikt om de incisie te maken, indien gewenst.
- Trek de huid uit elkaar met behulp van een tang. Met nieuwe Tang, lokaliseer de peritoneale muur en gebruik een schaar om nog eens 1 cm incisie door de peritoneale wand te maken.
- Extract de alvleesklier, die kan komen met de milt, uit het lichaam met behulp van het tweede paar van de Tang.
- Zachtjes omkeren van de flacon van tumorcellen/kelder membraan meerdere malen te mengen.
- Bereid de glazen spuit met 5 μL met 1.000 tumorcellen in het kelder membraan en plaats op de warmtemat voor een paar seconden om het warm te maken.
Opmerking: de korte opwarming van de spuit zal het mogelijk maken de kelder membraan stollen, zodat het gemakkelijker te injecteren zonder lekken. Echter, dit moet kort worden gehouden, indien te lang gelaten het kelder membraan zal volledig stollen en zal niet worden geïnjecteerd. Door het gebruik van een glazen spuit kan een laag volume nauwkeurig worden geïnjecteerd. - Houd de alvleesklier aan de staart om deze uit te breiden en steek de naald direct in het midden van de alvleesklier, parallel aan de alvleesklier zelf met een inspanning om zichtbare bloedvaten te vermijden.
Opmerking: het midden van de alvleesklier heeft een groot gebied en het is het gemakkelijkst te injecteren. Echter, de kop of staart van de alvleesklier kan ook specifiek worden geïnjecteerd als de voorkeur. - Injecteer langzaam 5 μL kelder membraan in de alvleesklier en houd de naald stabiel in de alvleesklier gedurende ten minste 30 s na de injectie, zodat het kelder membraan kan stollen en lekken voorkomen. Het kelder membraan moet zichtbaar zijn als een kleine heldere bubbel zal zijn gevormd; het is echter mogelijk niet zichtbaar.
Opmerking: grotere volumes van tumorcellen/kelder membraan kunnen worden geïnjecteerd; het precieze volume moet echter worden getest om er zeker van te zijn dat er geen lekkage optreedt. - Verwijder de naald uit de alvleesklier en wacht om te bevestigen dat er geen bloeding is opgetreden. Voorzichtig plaats de alvleesklier terug in de buikholte, het verzorgen van de kelder membraan bubbel niet aanraken.
- Trek de peritoneale wand samen en voer een enkele hecht, of twee onderbroken hechtingen indien nodig.
- Trek de twee kanten van de huid incisie samen en voer meerdere onderbroken hechtingen uit indien nodig of plaats twee chirurgische clips.
- Een andere subcutane injectie van buprenorfine toedienen in de Scruff.
- Breng de muis gedurende ten minste 30 minuten na de operatie over in een verwarmde kooi van 37 °C om de lichaamstemperatuur te behouden voordat u weer in een nieuwe kooi stapt.
- Bereid een puree dieet beschikbaar in de kooi, om te zorgen voor rehydratatie en lichaamsgewicht.
- Herbeheer postoperatieve analgesie zoals aanbevolen en kijk goed naar tekenen van wond opening, pijn of infectie en gewichtsverlies. Bij gebruik van chirurgische clips kunnen deze 7-10 dagen later worden verwijderd met behulp van een clip Remover.
- Na ongeveer 14 dagen zal het littekenweefsel voldoende genezen om te beginnen met het palperen van de buik. Monitor tumorgrootte nauw via palpatie tot muizen bereiken eindpunt.
- Bij eindpunt de muis wordt geculled via cervicale dislocatie gevolgd door onthoofding. De huid en peritoneale holte worden geopend met behulp van een schaar en de alvleesklier tumor uitblinkte met behulp van een tang om de tumor vast te houden, en een schaar om het omringende weefsel te verwijderen.
3. vertering van alvleesklier tumoren
- Plaats de ontleed alvleesklier tumor, gemetastaseerde site tumoren, of gezonde alvleesklier weefsel in ijskoude PBS, en op te slaan op ijs.
- Gebruik de tang om de tumor over te brengen op een Petri schaaltje.
- Voeg 5,0 mL verterings medium (2 mg/mL Collagenase, 0,025 mg/mL DNase RPMI) toe aan een buis van 50 mL; Bewaar op ijs om te voorkomen dat enzymactiviteit begint.
Opmerking: dit protocol gebruikt Collagenase type V, dat een activiteit heeft van ≥ 1 eenheden/mg FALGPA en > 125 collageen vergistings eenheden (CDU)/mg Solid. Collagenase en DNase aliquots kunnen worden bewaard bij-20 °C en ontdooid op ijs voor gebruik. Wanneer beide volledig oplosbaar zijn in steriele RPMI, kunnen ze worden doorgegeven via een filter van 0,2 μm om verontreinigingen te verwijderen. Collagenase moet volledig worden gesolubiliseerd vóór het filteren om verlies van materiaal te voorkomen. - Neem een klein aliquot van deze oplossing om de tumor op de Petri schaal te bedekken.
- Gebruik steriele scalpel en Tang om de tumor in kleine stukjes te snijden, ruwweg minder dan 3 mm lang.
- Schraape de tumor stukken in de buis en keer de buis zachtjes om tot alle stukken ondergedompeld zijn in de vergistings media. Opslaan op ijs als andere tumormonsters moeten worden voorbereid in een batch.
- Breng 20 minuten over op een schudapparaat bij 37 °C. Zorg ervoor dat alle stukjes tumor worden ondergedompeld en niet vastzitten aan de rand van de buis. Als schudden niet mogelijk is, Vortex het monster om de 5 minuten om de spijsvertering te helpen.
4. bereiding van eencellige suspensie van verteerde tumor
- Onmiddellijk na de digestie stap, plaats de buis op ijs tot langzame enzymactiviteit.
- Voeg EDTA toe om een eindconcentratie van 20 mM te bereiken en kort Vortex monster om te mengen. Dit zal verder vertragen enzymactiviteit.
- Open de buis en spoel elke tumor verteren van de deksel van de buis met verse RPMI medium.
- Bereid een zeef van 70 μm (de μm-grootte van de zeef kan naar wens worden gewijzigd) op een 50 mL open buis, op ijs.
- Bevochtig het filter met medium.
- Rebreng de verteerde cellen uit en was de zijkanten van de buis met een 25 mL stripette of groter. De bredere opening van de stripette is belangrijk om de dikke Digest gemakkelijk te laten passeren.
- Breng alle samenvatting over, met behulp van de 25 mL stripette, op de zeef.
- Pureer de tumor bovenop het filter met behulp van een 1 mL zuiger van de spuit. Mash alleen direct omhoog en omlaag om afschuif stress naar cellen te minimaliseren.
- Spoel cellen continu door de zeef met RPMI. Zorg ervoor dat je met genoeg kracht wast om cellen door te duwen.
- Als er nog materiaal is om te puree, maar de RPMI stopt met spoelen, dan zal de zeef verzadigd zijn. Breng het monster daarom over naar een nieuw filter en ga door.
Opmerking: uiteindelijk zullen alleen extracellulaire matrix componenten in het filter blijven, alle afzonderlijke cellen moeten zijn gepasseerd.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 300 x g en 4 °c.
- De celpellet zorgvuldig resuspenderen in volledige RPMI en direct door een ander filter passeren om eventuele extracellulaire matrix of grote celklonters te verwijderen die niet adequaat kunnen worden geresuspendeerd.
- Op dit punt, als er geen stimulatie nodig is, vlekken onmiddellijk de geïsoleerde cellen voor flowcytometry analyse door het overslaan naar stap 6,1. Alternatief, respenderen ze in Vries medium (10% DMSO in FBS) en opslaan bij-80 °C gevolgd door langdurige opslag in vloeibare stikstof.
Opmerking: de Vries stap kan het zuiveren van immuuncellen op een latere datum toestaan; de kwantificering van de immuuncelsubgroepen kan echter optimalisatie vereisen om te bevestigen dat de celaantallen en het fenotype niet worden beïnvloed door het Vries/ontdooien proces. De ex vivo T-celstimulatie wordt het best uitgevoerd op verse tumormonsters. Op dit punt kan het monster verder worden gezuiverd door kraal-gebaseerde verwijdering van dode cellen of immuuncelverrijking assays indien nodig.
5. cellen voorbereiden op de ex vivo stimulatie
- Tel de cellen om een concentratie van 2 x 106/100 μL in volledig medium te bereiken (rpmi 10% FBS, 1x peniciline en 1x streptomycine).
Opmerking: het hoge aantal totale cellen zorgt ervoor dat er voldoende T-cellen in dit voorbeeld zullen worden geanalyseerd. Het aantal kan echter omhoog of omlaag worden geschaald, afhankelijk van de beschikbaarheid van het monster en de zeldzame aard van T-cel deelverzamelingen van belang.- Plaat 100 μL cellen in een U-Bottomed 96-well plate.
- Voeg 100 μL volledig medium toe met een 2x preparaat van PMA/ionomycine (om respectievelijk een eindconcentratie 0,081 μM en 1,34 μM te bereiken, zoals aanbevolen door de fabrikant).
Opmerking: als het meten van degranulatie/exocytose, ook hier een fluorescently geconjugeerde anti-muis CD107a in de media. Er moet ook een controlemonster worden uitgevoerd dat geen CD107a bevat. - Plaats in een incubator van 37 °C met 5% CO2 voor 1 uur.
- Voeg in volledige media 20 μL van een 10x preparaat van brefeldin A en monensin (om een eindconcentratie 1,06 μM en 2,0 μM te bereiken (zoals aanbevolen door de fabrikant).
Opmerking: Brefeldin A en monensin zijn eiwit transport remmers en blokkeren extracellulaire afgifte van cytokines, etc. waardoor hun detectie doorstroming cytometrie. Als het meten van cytokine in de supernatant door ELISA of soortgelijke methoden – dan kan deze stap worden overgeslagen. - Plaats de plaat in een incubator van 37 °C met 5% CO2 voor verdere 4 uur.
6. extracellulaire en intracellulaire kleuring voor Flowcytometrie
- Verwijder de plaat en respendeer elk goed om al het materiaal over te brengen naar een V-Bottomed plaat, geplaatst op ijs.
Opmerking: epitheliale cellen, macrofagen en andere aanhandige cellen kunnen niet volledig worden opgehaald door opnieuw op te schorten. Maar aangezien de downstream-analyse alleen op T-cellen is, is dit geen probleem.- 6.1.1 Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 300 x g en 4 °c (gebruik deze voorwaarden voor volgende stappen tenzij anders aangegeven).
- Verwijder de supernatant door de plaat ondersteboven te flikken in één scherpe beweging.
- Respenderen in 50 μL van een corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof, bereid in ijskoude PBS. Zet de pipet bij het resuspendigen op een lager volume om te voorkomen dat u bubbels maakt.
- Inincuberen gedurende 20 minuten bij 4 °C, in het donker.
- Wash stap: Voeg 100 μL FACS buffer toe, centrifugeer en verwijder het supernatant.
- Respendeer elk goed met 50 μL anti-CD16/CD32 (2,5 μg/mL) in FACS buffer (0,5% BSA, 2,0 mM EDTA in PBS) om niet-specifieke binding van antilichamen tegen FC-receptoren te blokkeren.
- Inincuberen gedurende 15 minuten bij 4 °C, in het donker.
- Voeg direct toe aan elke put een 2x Mastermix van fluorochrome-geconjugeerde anti-muis CD45, CD3, CD4 en CD8 (verdere extracellulaire markers kunnen desgewenst worden toegevoegd) in FACS buffer.
- Inincuberen gedurende 30 minuten bij 4 °C, in het donker.
- Wash stap: Voeg 100 μL FACS buffer toe, centrifugeer en verwijder het supernatant.
- Voeg 100 μL 1x intracellulaire (IC) fixatie buffer toe en incuberen gedurende 30 minuten bij RT, in het donker.
- Bereid de centrifuge voor op RT.
- Voeg 100 μL FACS buffer toe, Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g en RT en verwijder het supernatant. Herhaal met 1x permeabilization buffer en Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g; Verwijder vervolgens het supernatant.
- Voeg 50 μL 1x Mastermix van fluorchrome-geconjugeerde anti-muis IFNγ, TNFα en andere intracellulaire markers toe, bereid in 1x permeabilization buffer.
- Incuberen voor 1 uur bij RT, in het donker.
- Voeg 100 μL permeabilization buffer toe om te wassen. Centrifugeer vervolgens 5 min bij 300 x g en RT en verwijder het supernatant.
- Voeg 100 μL FACS buffer toe om te wassen, Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g en RT en verwijder het supernatant.
- Na deze laatste centrifugeren, respendeert de cellen in een volume dat compatibel is met de flow cytometer. Het kan variëren afhankelijk van de grootte van de FACS buizen.
- Breng dit volume over naar geschikte FACS tubes voor acquisitie.
- Dek af van licht en bewaar in de koelkast en verkrijg de monsters binnen 24 uur.
Representative Results
Na het injecteren van 1000 TB32048 cellen in de alvleesklier nemen orthotopic tumoren ongeveer 30 dagen om te ontwikkelen (Figuur 1A, B). Kelder membraan lekkage tijdens chirurgie kan leiden tot grote tumoren te vormen direct op de peritoneale muur, die prominent zichtbaar door de huid (Figuur 1C). We zouden deze muizen uit de studie verwijderen. Echter, met goede chirurgische vaardigheden de incidentie van lekkage wordt geminimaliseerd. Orthotopic tumoren geoogst op eindpunt kan uitgroeien tot een aanzienlijke omvang in C57BL/6 wild-type muizen (Figuur 1D). Geoogste orthotopic tumoren vereisen de spijsvertering in Collagenase/DNase gedurende 20 minuten om een eencellige suspensie te bereiken (Figuur 2). Op dit punt, tumor-afgeleide cellen kunnen worden verguld in een U-Bottomed plaat op 2 x 106 cellen/goed. Het aantal geplateerde cellen kan worden gewijzigd, afhankelijk van de prevalentie van T-cellen in het monster; het celnummer kan worden verlaagd als T-cellen een hoge dichtheid hebben. Controle van de milt of lymfeklier monsters kunnen ook worden verguld op dit punt voor stimulatie. Elke put wordt gestimuleerd met PMA en ionomycine gedurende 5 uur en na 1 uur incubatie worden brefeldin A en monensin toegevoegd om de extracellulaire afgifte van cytokines te blokkeren (Figuur 2). Na de incubatie worden monsters gekleurd voor extracellulaire epitopen en intracellulaire cytokines voor analyse door Flowcytometrie (Figuur 2).
Monsters van milt en tumoren van muizen met orthotopic tumoren werden geanalyseerd door Flowcytometrie. De gating strategie gebruikt in flow cytometrie analyse voor de milt en orthotopic tumoren sluit vuil met behulp van FSC-a, SSC-a, wambuizen door FSC-a/FSC-H en SSC-a/SSC-W, dan Dead of apoptotic cellen als positief voor corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof (Figuur 3A). Immuuncellen worden vervolgens afgesloten als CD45+en T-cellen worden verder afgesloten als CD3+ waarvan de CD4+ -en CD8+ -subsets zijn gedefinieerd (Figuur 3A). Een fluorescentie minus één (FMO) wordt uitgevoerd om de achtergrond fluorescentie voor gating te bepalen en een brefeldin A/monensin alleen controle wordt uitgevoerd om de basale productie van cytokines te bepalen (Figuur 3B-D).
Voor IFNγ resulteerde incubatie met brefeldin A/monensin niet in een toename van IFNγ over FMO-controle in zowel milt-als tumormonsters. Echter, de toevoeging van PMA en ionomycine verhoogde de% van de intracellulaire IFNɣ detecteerbaar in zowel de milt en tumor afgeleide CD4+ en CD8+ T cellen.
De milt CD4+ -en CD8+ T-cellen, gebruikt als een positieve controle, hebben een relatief hogere ifnγ-productie dan tumor infiltrerende T-celsubgroepen, met een gemiddelde van 6,60 ± 1,5% en 12,97 ± 3,4% in vergelijking met 4,81 ± 1,0% en 4,13 ± 1,3%, wat aangeeft dat immunosuppressie optreedt binnen de tumor (Figuur 3B en 4a). Met dezelfde strategie voor TNFα hebben we gevisualiseerd dat een hoog percentage milt CD4+ t-cellen positief is voor intracellulaire tnfα (65,93 ± 2,3%), vergeleken met tumor-INFILTRERENDE CD4+ t-cellen (22,45 ± 5,4%). Milt-en tumor infiltrerende CD8+ T-cellen produceren vergelijkbare niveaus van tnfα (respectievelijk 25,15 ± 3,7% en 19,91 ± 5,1%) (Figuur 3C, Figuur 4B).
Ten slotte is CD107a een endosomale marker die transitief wordt uitgedrukt op het celoppervlak tijdens de exocytose van cytotoxische korrels en cytokinen, als zodanig, wordt het gebruikt als een surrogaat marker voor cytotoxiciteit. Het voordeel van kleuring voor CD107a tijdens de stimulatie is dat alle tijdelijk cellen, uitgedrukt CD107a, door het fluorescerende antilichaam zullen worden opgevangen. De basale niveaus van CD107a worden weergegeven in brefeldin A/monensin alleen behandelde cellen. Voor milt CD8+ T-cellen verhoogt stimulatie met PMA/ionomycine het niveau van CD107a gedetecteerd, met de sterkste opregulatie in CD8+ cellen die 23,95 ± 3,5% CD107a+waren, vergeleken met 5,8 ± 1,9% in tumor-infiltrerende CD8+ cellen, wat aangeeft dat de milt CD8+ een hoger percentage degranulatie had. Aan de andere kant, milt-en tumor infiltrerende CD4+ uitgedrukt vergelijkbare niveaus van CD107a 9,37 ± 1,5% en 11,50 ± 1,8% (Figuur 3D en 4c).
Over het algemeen deze resultaten benadrukken dat orthotopic tumoren kunnen worden gegenereerd uit de injectie van een zeer laag aantal (1.000) van tumorcellen in de alvleesklier. Deze tumoren kunnen snel worden verteerd voor de isolatie van T-cellen voor ex vivo stimulatie. Detectie van intracellulaire cytokines is mogelijk en markeert het basale niveau van immunosuppressie van infiltrerende T-cellen, in vergelijking met T-cellen in secundaire lymfoïde organen.
Figuur 1: generatie van orthotopic alvleesklier tumoren. A) schemavan in-vivo -experimenten. B) de macroscopische verschijning van orthotopic tumoren binnen de buikholte (links) en na excisie (rechts) waar de tumor getoond is gehalveerd. (C) bewijs van lekkage in de kelder membraan tijdens chirurgie kan leiden tot tumoren te ontwikkelen die zichtbaar zijn door de huid (bovenste foto) en vorm op de peritoneale muur (lagere foto). D) orthothematisch pancreas tumor gewichten geoogst van muizen die het eindpunt hadden bereikt (n = 22). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een afzonderlijke muis, staafdiagram toont gemiddelde ± SEM. De gegevens in deze afbeelding zijn gewijzigd van eerder gepubliceerde werk10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: schematische behandeling van orthotopic tumoren voor ex vivo T-celstimulatie. Na de oogst worden pancreas tumoren snel verteerd in Collagenase (2 mg/mL) en DNase (0,025 mg/mL) gedurende 20 min bij 37 °C. Daarna worden de cellen geresuspendeerd op 2 x 106/ml in complete rpmi-media en geplateerd in een U-bodemplaat. Een stimulatie cocktail van PMA en ionomycine wordt toegevoegd voor 5 uur, op welk punt het anti-muis CD107a antilichaam ook kan worden toegevoegd aan de cultuur. Na 1 uur incubatie worden de intracellulaire transport blokkers, brefeldin A en monensin, toegevoegd. Na de ex vivo -stimulatie worden de cellen overgebracht naar een v-Bottomed plaat voor kleuring met de corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof (in PBS) gedurende 20 min 4 °c. Cellen worden gewassen in FACS buffer en geïnineerd in anti-CD16/32 (FcR blok) gedurende 15 min (in FACS buffer) en vervolgens geïnfundeerd met extracellulaire fluorescerende-geconjugeerde antilichamen voor nog eens 30 min (in FACS buffer). Cellen worden opnieuw gewassen in de FACS buffer en respenderen in intracellulaire fixatie buffer gedurende 20 min. Hierna worden cellen eenmaal gewassen in FACS buffer en eenmaal in 1x permeabilization buffer. Cellen worden geresuspendeerd voor 1 uur op RT in intracellulaire fluorescerende-geconjugeerde antilichamen voor 1 h (in 1x permeabilization buffer). Cellen worden eenmaal gewassen in 1x permeabilization buffer en eenmaal in FACS buffer voor het resuspenseren in FACS buffer voor overname op de flow cytometer binnen 24 h. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Flowcytometrie analyse van ex vivo gestimuleerde milt-en tumor-afgeleide T-cellen. (A) Flowcytometrie gating strategie gebruikt voor milt (positieve controle) en orthotopic tumoren monsters. Cellen worden gediscrimineerd met behulp van FSC-A/SSC-A en enkele cellen worden verder geïsoleerd met FSC-A/FSC-H en SSC-A/SSC-W. Dode of apoptotische cellen worden uitgesloten met behulp van de corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof-FVD506 en immune cellen worden afgesloten door CD45+. Hierna worden CD3+ T-cellen en CD4+ -en CD8+ -subsets gedefinieerd. Gegevens werden overgenomen op een BD Fortessa. B) de gating-strategie die wordt gebruikt om IFNγ+ CD4+ en CD8+ T-cellen te kwantificeren. Een fluorescerende minus één (FMO) controle wordt gebruikt op volledig gestimuleerde monsters (PMA/ionomycine/brefeldin A/monensin) om de achtergrond fluorescentie te bepalen. Alleen een brefeldin A/monensin controle (alleen B + M) wordt gebruikt om de basale cytokine productie te bepalen. Het volledig gestimuleerde monster wordt vervolgens gebruikt om de% IFNγ+ T-cellen te berekenen. C) de gating-strategie die wordt gebruikt om TNFα+ CD4+ -en CD8+ T-cellen te kwantificeren. Een FMO-controle wordt gebruikt op volledig gestimuleerde monsters (PMA/ionomycine/brefeldin A/monensin) om de achtergrond fluorescentie te bepalen. Alleen een brefeldin A/monensin controle (alleen B + M) wordt gebruikt om de basale cytokine productie te bepalen. Het volledig gestimuleerde monster wordt vervolgens gebruikt om de% TNFα+ T-cellen te berekenen. D) de gating-strategie die wordt gebruikt om CD107a+ CD4+ -en CD8+ T-cellen te definiëren. Een FMO-controle wordt gebruikt op volledig gestimuleerde monsters (PMA/ionomycine/brefeldin A/monensin) om de achtergrond fluorescentie te bepalen. Alleen een brefeldin A/monensin controle (alleen B + M) wordt gebruikt om de basale degranulatie te bepalen. Het volledig gestimuleerde monster wordt vervolgens gebruikt om de% CD107a+ T-cellen te berekenen. Alle flow cytometrie gegevens werden geanalyseerd op FlowJo versie 10.6.1. De gegevens in deze afbeelding zijn gewijzigd van eerder gepubliceerde werk10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: kwantificering van ex vivo milt-en tumor-afgeleide T Cell activiteit. Het aandeel CD4+ en CD8+ T cellen positief voor (A) ifnγ+ (B) tnfα+ en (C) CD107a+ werd gekwantificeerd in de milt (n = 4) en tumor (n = 7) van orthotopic-tumor lager muizen. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een afzonderlijke muis en foutbalken weergeven gemiddelde ± SEM. statistische significantie is getest met een ongepaarde t-toets waarbij * = p < 0,05 en * * * = p < 0,001. Alle gegevens werden geanalyseerd met behulp van Prism 8. De gegevens in deze afbeelding zijn gewijzigd van eerder gepubliceerde werk10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
In vivo modellen van alvleesklierkanker bieden onschatbare hulpmiddelen om te begrijpen ziekteprogressie en beoordelen van nieuwe therapeutische doelwitten3. Met name het orthotopic model is een kostenbesparend en reproduceerbaar model dat kan worden toegepast in grote cohorten van muizen, gelijktijdig met4,27. Het orthotopic model biedt ook de verwant micro Environment en intact immuunsysteem voor tumorgroei, waardoor het geschikter is dan de subcutane en PDX-modellen. Echter, we hebben geconstateerd dat sommige elementen van immuun infiltratie kunnen verschillen tussen de orthotopic model en KPC muizen, de Gold-Standard Murine model10. Een van de redenen hiervoor zou kunnen zijn de versnelde tumorgroei gezien in het orthotopic model. Verdere verschillen in de dichtheid van immuuncelsubgroepen zijn beschreven tussen de orthotopic en subcutane modellen3,28. Daarom, hoewel het transgene KPC-model duurder en variabel6is, moeten de belangrijkste bevindingen worden geverifieerd in een klein cohort van KPC-muizen waar mogelijk.
De voorbereiding van tumorcellen voor de orthotopic chirurgie is een kritieke stap in het protocol. Cellen moeten altijd in de log fase van de groei en Mycoplasma-en infectie-vrij. Orthotopic chirurgie moet worden uitgesteld als er bezorgdheid over tumor celgroei. Het gebruik van het kelder membraan verbetert de incidentie van tumor bij het injecteren van cellen zonder29 en vermindert cellekkage en dus peritoneale verspreiding27. Echter, eenmaal geschorst in de kelder membraan, tumorcellen moeten snel worden geïnjecteerd (binnen 2 uur) om te voorkomen dat celverlies. Het aantal tumorcellen die nodig zijn voor het genereren van tumoren is waarschijnlijk cel-lijn afhankelijk, en een bereik van de celaantallen moeten worden getest (bijv., van 100 – 100.000) die kan ook bepalen de tijd om te bereiken eindpunt. Het is waarschijnlijk dat er een foutmarge zal zijn bij de voorbereiding van 1.000 cellen per muis voor injectie; Daarom, als meerdere dagen van de operatie nodig zijn, moet de behandeling van groepen gelijkelijk gespreid over dagen om te controleren voor batch-effecten. De meeste chirurgische stappen kunnen worden aangepast, afhankelijk van de voorkeuren; echter, zorg moet worden genomen niet te verstoren het kelder membraan bij het vervangen van de alvleesklier in de buikholte of het sluiten van de peritoneale muur. Membraan lekkage in de kelder kan leiden tot tumor celgroei op de peritoneale muur, die snel vorm en kan resulteren in het moeten opofferen van het dier eerder.
Idealiter moeten pancreas tumoren snel worden verteerd na de oogst en voorbereid voor ex vivo stimulatie onmiddellijk. Echter, dit is misschien niet mogelijk als er een grote partij van tumoren te oogsten, in dit geval tumoren moeten worden gehouden op ijs en verteerd in batches. Het type, de concentratie en de lengte van de blootstelling aan spijsverteringsenzymen hebben allemaal aangetoond dat ze invloed hebben op een groot aantal oppervlakte moleculen op immuuncellen30,31,32. De digestie tijd is ook opzettelijk kort om celdood te beperken33. Verteerde cellen kunnen worden bevroren in Vries medium voor lange termijn opslag; echter, sommige celverlies zal optreden bij het ontdooien. Het verteringsproces kan minder dan optimaal zijn als de tumor stukken niet voldoende worden uitgedikt voordat Collagenase incubatie en dit zal duidelijk zijn als harde tumor stukjes in het filter zullen blijven na de spijsvertering. De Collagenase concentratie kan worden verlaagd als het werken met gezonde alvleesklier of vroege fase tumoren; rapporten over het uitpakken van gezonde alvleesklier ductale cellen gebruiken significant lagere concentraties34. Een hoge graad van epitheliale celdood is te verwachten tijdens de spijsvertering; echter, immune cellen moeten het proces goed tolereren. Alternatieve methoden bestaan voor het isoleren van levensvatbare epitheelcellen voor organoïde groei35 of om weefsel architectuur te behouden36.
Wijzigingen in het stimulatie protocol kunnen gemakkelijk worden gemaakt, afhankelijk van de gewenste uitlees-en immuuncel geanalyseerd (bijv. macrofagen of B-cellen). Het gebruik van pan-stimulatie reagentia PMA/ionomycine discrimineert niet voor de specificiteit van TCR-antigeen, waardoor het nuttig is wanneer het antigeen bekend is. De productie van IFNɣ is echter nauw verbonden met TCR engagement37 en zowel IFNɣ als TNFα-productie zijn van cruciaal belang in PDAC antitumorele responsen38. PMA/ionomycine stimulatie weerspiegelt de maximale capaciteit van T-cellen om cytokines te produceren, die al dan niet door de T-cellen binnen de tumor micro omgeving kunnen worden geproduceerd. Endogene productie kan worden gemeten zonder de noodzaak van stimulatie; echter, niveaus kunnen veel lager of niet detecteerbaar. Er zijn alternatieve methoden om T-cellen te stimuleren: anti-CD3/28-gecoate kralen, die ook geen antigeen of zelfs andere immuuncelpopulaties vereisen. Het voordeel van deze methode is het toestaan van kwantificering van de productie van cytokine door specifieke T-celsubgroepen zonder dat er scheidingsmethoden nodig zijn. Andere markers van cytotoxiciteit (Granzyme B en Perforin A), activiteit (IL-2) of immunosuppressie (IL-10) kunnen ook worden toegevoegd21. Echter, hoge kwaliteit flow cytometrie antilichamen zijn niet beschikbaar voor het opsporen van alle cytokines en factoren van belang. Daarom, als er andere toepassingen zoals ELISA vereist de stimulatie kan worden uitgevoerd zonder de opneming van brefeldin A/monensin, waardoor cytokine vrijkomen in de supernatant. Echter, van nota, dit zal toestaan totale cel cytokine vrijlating en het zal niet mogelijk zijn om te bepalen welke celpopulaties bijgedragen.
De productie van ifnγ is een dominant kenmerk van een antitumorele T celrespons, vaak gebruikt als vervanging voor TCR-antigeen herkenning37,38. Andere in vivo methoden die de antigeen-specifieke reacties nauwkeuriger definiëren, maken gebruik van tumorcellen die een bekend antigeen uitdrukken, zoals ovalbumin of SV40. Het universele antigeen kan vervolgens worden gebruikt ex vivo voor het testen van T-celherkenning of in combinatie met een TCR-restricted host Mouse. Indien het antigeen niet bekend is, kan de kwantificering van de groei van de T-cel worden uitgevoerd door bulk-TCR-sequencing, of meer recentelijk eencellige TCR-sequencing39,40. Om de toestand van de intra-morele T celrespons volledig te begrijpen, moeten markers die duiden op uitputting of remmende receptoren ook worden gemeten, waaronder: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Evenals markers van Effector T cellen (CD44Hi, CD62lo) en proliferatieve activiteit, Ki67+ of csfe verdunning41,42,43,44. Over het algemeen biedt het orthotopic model een nuttig platform om snel therapeutische strategieën te testen, in het bijzonder die de antitumorele T-celrespons kunnen moduleren, die vervolgens kan worden gevalideerd op een kleinere cohort transgene, KPC, muizen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag de Animal Technician service en Dr. Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk) bedanken voor hun hulp tijdens de orthotopic chirurgie. We willen ook Dr. Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Verenigd Koninkrijk) voor haar begeleiding in chirurgische techniek, Dr. Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk) voor haar advies over tumor spijsvertering en Dr. Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk) voor haar advies over ex vivo T Cell stimulatie We willen ook de Medical Research Council (MRC), pancreaskanker onderzoek Fonds (PCFR) en ovariële kanker actie bedanken die dit onderzoek hebben gefinancierd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
| 70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
| 9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
| anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
| anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
| anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
| anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
| anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
| anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
| anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
| anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
| Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
| Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
| Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
| DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
| Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
| Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
| Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
| Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
| Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
| Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
| RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
| Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
| U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
| Universal Cotton Tipped Applicators - 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
| V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Conroy, T., et al. Current standards and new innovative approaches for treatment of pancreatic cancer. European Journal of Cancer. 57, 10-22 (2016).
- Lee, J. W., Komar, C. A., Bengsch, F., Graham, K., Beatty, G. L. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer: The KPC model (LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre), its variants, and their application in immuno-oncology drug discovery. Current Protocols in Pharmacology. 2016, (2016).
- Tseng, W. W., et al. Development of an Orthotopic Model of Invasive Pancreatic Cancer in an Immunocompetent Murine Host. Clinical Cancer Research. 16 (14), 3684-3695 (2010).
- Majumder, K., et al. A Novel Immunocompetent Mouse Model of Pancreatic Cancer with Robust Stroma: a Valuable Tool for Preclinical Evaluation of New Therapies. Journal of Gastrointestinal Surgery. 20 (1), 53-65 (2016).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Witkiewicz, A. K., et al. Integrated Patient-Derived Models Delineate Individualized Therapeutic Vulnerabilities of Pancreatic Cancer. Cell Reports. , (2016).
- Nicolle, R., et al. Pancreatic Adenocarcinoma Therapeutic Targets Revealed by Tumor-Stroma Cross-Talk Analyses in Patient-Derived Xenografts. Cell Reports. , (2017).
- Spear, S., et al. Discrepancies in the Tumor Microenvironment of Spontaneous and Orthotopic Murine Models of Pancreatic Cancer Uncover a New Immunostimulatory Phenotype for B Cells. Frontiers in Immunology. 10, 542 (2019).
- Zhu, Y., et al. CSF1/CSF1R blockade reprograms tumor-infiltrating macrophages and improves response to T-cell checkpoint immunotherapy in pancreatic cancer models. Cancer Research. , (2014).
- Lee, J. J., Huang, J., England, C. G., McNally, L. R., Frieboes, H. B. Predictive Modeling of In vivo Response to Gemcitabine in Pancreatic Cancer. PLoS Computational Biology. , (2013).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the Immune Reaction to Pancreatic Cancer from Inception to Invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Fukunaga, A., et al. CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes together with CD4+ tumor-infiltrating lymphocytes and dendritic cells improve the prognosis of patients with pancreatic adenocarcinoma. Pancreas. 28 (1), 26-31 (2004).
- Tewari, N., et al. The presence of tumor-associated lymphocytes confers a good prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma: an immunohistochemical study of tissue microarrays. BMC Cancer. 13 (1), 436 (2013).
- Royal, R. E., et al. Phase 2 Trial of Single Agent Ipilimumab (Anti-CTLA-4) for Locally Advanced or Metastatic Pancreatic Adenocarcinoma. Journal of Immunotherapy. 33 (8), 828-833 (2010).
- Brahmer, J. R., et al. Safety and Activity of Anti–PD-L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer. New England Journal of Medicine. 366 (26), 2455-2465 (2012).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Beatty, G. L., et al. CD40 Agonists Alter Tumor Stroma and Show Efficacy Against Pancreatic Carcinoma in Mice and Humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lutz, E. R., et al. Immunotherapy converts nonimmunogenic pancreatic tumors into immunogenic foci of immune regulation. Cancer Immunology Research. 2 (7), 616-631 (2014).
- Barry, M., Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nature Reviews. Immunology. 2 (6), 401-409 (2002).
- Mojic, M., Takeda, K., Hayakawa, Y. The dark side of IFN-γ: Its role in promoting cancer immunoevasion. International Journal of Molecular Sciences. , (2018).
- Castro, F., Cardoso, A. P., Gonçalves, R. M., Serre, K., Oliveira, M. J. Interferon-gamma at the crossroads of tumor immune surveillance or evasion. Frontiers in Immunology. , (2018).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nature Immunology. , (2011).
- Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
- Schuerwegh, A. J., De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Stevens, W. J. Comparison of intracellular cytokine production with extracellular cytokine levels using two flow cytometric techniques. Cytometry. 55 (1), 52-58 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the panc02 and 6606PDA cell lines. European Surgical Research. , (2011).
- An, X., et al. Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Jiang, Y. J., et al. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: Cells suspended and injected in Matrigel. World Journal of Gastroenterology. , (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2017).
- Liu, Q., et al. Effects of enzymatic digestion, cell culture and preservation conditions on surface CD62L expression of primary murine CD3+CD4+T cells. Biomedical Research (India). 29 (10), 2153-2159 (2018).
- Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO Journal. , (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. , (2015).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. , (2019).
- Moran, A. E., Polesso, F., Weinberg, A. D. Immunotherapy Expands and Maintains the Function of High-Affinity Tumor-Infiltrating CD8 T Cells In Situ. The Journal of Immunology. , (2016).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. , (2015).
- Singh, M., et al. High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes. Nature Communications. 10 (1), 3120 (2019).
- Jiang, N., Schonnesen, A. A., Ma, K. Y. Opinion Ushering in Integrated T Cell Repertoire Profiling in Cancer. Trends in Cancer. 5, 85-94 (2019).
- Schietinger, A., et al. Tumor-Specific T Cell Dysfunction Is a Dynamic Antigen-Driven Differentiation Program Initiated Early during Tumorigenesis. Immunity. 45 (2), 389-401 (2016).
- Raghav, S. K., et al. Exhaustion of tumor-specific CD8+ T cells in metastases from melanoma patients. Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific in filtrating human tumors. The Journal of Clinical Investigation. , (2014).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8 + T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. , (2019).
