Summary
تتطلب أعاده برمجه الخلايا إدخال الجينات الرئيسية ، التي تنظم وتحافظ علي حاله الخلايا المستحثة. البروتوكول الموصوف يمكن تشكيل الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) مستعمرات من الليفية الجلدية البشرية دون أساليب الفيروسية/دمج ولكن باستخدام RNAs غير المعدلة (نانومتر-RNAs) جنبا إلى جنب مع عوامل التهرب المناعي الحد من أليات الدفاع الخلوي.
Abstract
ويمكن اعتبار الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) ، حتى الآن ، مصدرا واعدا للخلايا المستحثة لأداره الامراض غير القابلة للعلاج حاليا ، ولأعاده تشكيل الانسجه المصابة وتجديدها ، ولتطوير ادويه جديده. علي الرغم من جميع المزايا المتعلقة باستخدام iPSCs ، مثل انخفاض خطر الرفض ، والقضايا الاخلاقيه التي قللت ، وامكانيه الحصول عليها من كل من المرضي الصغار والكبار دون اي فرق في امكانيه أعاده برمجتها ، ومشاكل للتغلب علي لا تزال عديده. في الواقع ، يمكن أعاده برمجه الخلايا التي أجريت مع فيروسات الفيروسية ودمج تسبب العدوى وإدخال الجينات المطلوبة يمكن ان تحفز عدم الاستقرار الجينوم من الخلية المتلقية ، مما يعوق استخدامها في العيادة. علي وجه الخصوص ، هناك العديد من المخاوف بشان استخدام الجينات c-Myc ، والمعروفة من عده دراسات لنشاطها حفز الطفرة. وقد برزت الخلايا الليفية كالسكان الخلية مناسبه لأعاده برمجه الخلوية لأنها سهله لعزل والثقافة ويتم حصادها بواسطة خزعة الجلد الطفيفة الغازية لكمه. البروتوكول الموصوف هنا يوفر وصف مفصل خطوه بخطوه للاجراء بأكمله ، من معالجه العينة للحصول علي ثقافات الخلايا ، واختيار الكواشف واللوازم ، والتنظيف والاعداد ، إلى أعاده برمجه الخلية بواسطة وسائل تجاريه مجموعه أعاده البرمجة المستندة إلى RNAs (NM-RNAs) غير المعدلة. مجموعه أعاده برمجه المختار يسمح لأعاده برمجه فعاله من الخلايا الليفية الجلدية البشرية إلى iPSCs والمستعمرات الصغيرة يمكن ان ينظر اليها في وقت مبكر 24 ح بعد الانتقال الأول ، حتى مع التعديلات مع الاحترام لورقه البيانات القياسية. الاجراء أعاده برمجه المستخدمة في هذا البروتوكول يوفر ميزه أعاده برمجه أمنه, دون مخاطر العدوى الناجمة عن الأساليب الفيروسية القائمة علي ناقلات, يقلل من أليات الدفاع الخلوية, ويسمح للجيل من iPSCs خاليه من xeno, جميع الميزات الهامه التي إلزاميه لمزيد من التطبيقات السريرية.
Introduction
وتمثل أعاده برمجه الخلايا تكنولوجيا جديده لتحويل كل خليه جسديه من الجسم إلى خليه جذعيه مستحثه ، تعرف باسم iPSC1. وقد تغلبت امكانيه أعاده برمجه خليه جسديه بالغه إلى دوله مستحثه وغير متمايزة علي الحدود التي يفرضها الفقراء علي التوافر والمسائل الاخلاقيه المتصلة باستخدام الخلايا المستحثة ، والتي كانت في السابقحيد عنه فقطمن الاجنه البشرية (الخلايا الجذعية الجنينية أوESC). في 2006 ، اجري كازوتوشي تاكاهاشي وشينيا ياماناكا دراسة رائده لتحقيق أول تحويل للخلايا الجسدية البالغة من الجلد إلى خلايا مستحثه باضافه أربعه جينات محدده بشكل مصطنع (Oct4 ، Sox2 ، Klf4 ، c-Myc)5. وبعد عام ، ادي العمل الذي اجري في مختبر طومسون إلى أعاده برمجه ناجحه للخلايا الجسدية في iPSCs عن طريق توصيل مزيج مختلف من أربعه جينات (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
تقدم iPSCs عددا من الفرص للعلماء والباحثين من مختلف المجالات ، مثل الطب التجديدي وعلم الصيدلة ، كونها منصة ممتازة لدراسة وعلاج الامراض المختلفة جنبا إلى جانب انعكاس التنميط الجيني لخصائص المريض التي تستمد منها. استخدام iPSCs يوفر العديد من المزايا بما في ذلك: انخفاض خطر الاستجابة المناعية بسبب أصل ذاتي تماما من الخلايا. امكانيه إنشاء مكتبه خليه ، أداه هامه للتنبؤ بالاستجابة للعقاقير الجديدة وأثارها الجانبية ، لأنها قادره علي التجديد الذاتي باستمرار وتوليد أنواع مختلفه من الخلايا ؛ والفرصة لوضع نهج مخصص لأداره المخدرات7،8،9.
تقنيات متنوعة معروفه في الوقت الحاضر ، للحث علي التعبير عن عوامل أعاده برمجه وانها مدرجه في فئتين رئيسيتين: الطرق غير الفيروسية والفيروسية القائمة علي ناقلات الامراض10،11،12،13. وتشمل الطرق غير الفيروسية نقل mrna ، ميرنا العدوى/ترانسكشن ، الحاملة ، النواقل الصغيرة والبلازميدات الفرجين و exosomes10،11،12،13. وتشمل الأساليب القائمة علي الفيروسية الفيروسات غير المدمجة ، مثل فيروس الغدة الدرقية ، وحمي سينداي والبروتينات ، ودمج الفيروسات مثل الفيروسات الرجعية و لينتيفيروس10،11،12،13.
وفقا لعده دراسات ، لم يلاحظ اي اختلافات كبيره بين هذه الطرق من حيث فعاليه أعاده برمجه الخلية ، التالي ، فان اختيار الطريقة المناسبة يعتمد بدقه علي نوع الخلية المستخدمة وعلي التطبيقات اللاحقة من ipscs التي تم الحصول عليها14،15. جميع الطرق المذكورة تظهر مساوئ, علي سبيل المثال, فيروس سينداي فعاله علي جميع أنواع الخلايا, ولكن يتطلب الكثير من الممرات للحصول علي iPSCs; أعاده برمجه من قبل الابيسمات ممتازة لخلايا الدم ولكن يحتاج إلى تعديل ظروف الثقافة القياسية للخلايا الليفية. يمكن ان تمثل طريقه الدخول بديلا جذابا ولكن الدراسات في الخلايا البشرية لا تزال محدوده وضعيفه10،11،12،13. التماثيل هي الحويصلات النانويه يفرز فسيولوجيا في جميع سوائل الجسم عن طريق الخلايا. ووفقا للدراسات الاخيره ، فهي مسؤوله عن الاتصالات بين الخلايا ويمكن ان يكون لها دور في العمليات البيولوجية الهامه ، مثل تكاثر الخلايا والهجرة والتمايز. Exosomes يمكن نقل ونقل mRNA وميرنا إلى الخلايا المتلقية مع اليه طبيعيه تماما ، كما انها تشترك في تكوين نفس الغشاء الخلوي16. ولذلك ، exosomes هي تقنيه جيل جديد واعده لأعاده برمجه ، ولكن قدرتها علي أعاده برمجه الخلايا الجسدية من محتواها لا يزال قيد التحقيق. تستخدم الأساليب القائمة علي النواقل الفيروسية الفيروسات المعدلة من أجل نقل الجينات أعاده برمجه إلى الخلايا المتلقية. هذا الأسلوب, علي الرغم من كفاءه عاليه من أعاده برمجه, لا تعتبر أمنه, كما ان دمج الفيروس داخل الخلية يمكن ان تكون مسؤوله عن العدوى, التراتومه وعدم الاستقرار الجينوم17.
البروتوكول التالي لتوليد مستعمرات iPSCs يجمع بين الكوكتيل في ياماناكا وأعاده برمجه طومسون ويستند علي استخدام طريقه تتطلب نانومتر-RNAs وعوامل التهرب المناعي مع امكانيه تنفيذ ذلك في ظروف خاليه من xeno. الأساس المنطقي وراء استخدام هذه الطريقة هو لنشر ، داخل المجتمع العلمي ، بروتوكول السماح لأعاده برمجه سريعة وبسيطه وفعاله للغاية من الخلايا الليفية البشرية الكبار من جلد البطن إلى iPSCs18.
نقاط القوه في الطريقة المقترحة هي ، في الواقع ، سهوله الأداء والوقت القصير اللازم للحصول علي iPSCs. وعلاوة علي ذلك ، فان الطريقة تتجنب أليات الدفاع الخلوي واستخدام النواقل الفيروسية ، المسؤولة عن القضايا ذات الصلة.
وفيما يتعلق بالبروتوكول الموحد ، أجريت التعديلات التالية: (1) تمت مزامنة متموج الخلايا الليفية في مرور 4 من خلال وضع في المصل 0.1 ٪ ل 48 h قبل التريسينزيشن ؛ (2) تم تعديل الكثافة الخلوية للثقافة وحجم الكواشف للاستخدام علي لوحه متعددة الآبار 24 جيدا بدلا من لوحه 6-حسنا ؛ (3) تم تنفيذ تجربه أعاده برمجه باستخدام حاضنه 5 ٪ CO2 بدلا من حاضنه مع الغلاف الجوي (21 ٪ o2) أو نقص الأكسجين (5 ٪ س2) الشروط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع العينات من الانسجه البشرية وفقا لإعلان هلسنكي في حين مراقبه مستشفي جامعه فيديريكو الثاني المبادئ التوجيهية. وقدم جميع المرضي المشاركين في هذه الدراسة موافقه خطيه.
1. اعداد اللوازم والاعلام الثقافي
- تنظيف والاوتوكلاف واحد زوج كبير من مقص الجراحية ، ومجموعتين من الملقط غرامه ، واثنين من أزواج من مقص ميكروتشريح ، 1 لتر زجاجه معقمه ، 500 mL زجاجه معقمه ، وزجاجه معقمه 250 mL.
- اعداد 100 مم لوحات ، 60 مم لوحات ، 35 ملم لوحات ، القابل للتصرف المستغل ، 50 mL أنابيب معقمه ، 15 مل أنابيب معقمه ، ولوحه زجاجيه 100 مم. خزن الاداات في ظروف معقمه حتى تصبح جاهزه للاستعمال.
- تنظيف وتعقيم 22 مم × 22 مم غطاء النظارات قبل الاستخدام. لهذا ، وضع نظارات الغطاء في لوحه زجاجيه ، وتغطيتها مع 70 ٪ الايثانول والانتظار لبضع ثوان قبل الشفط الايثانول. دعوانا نغطي النظارات الجافة في الفرن عند 37 درجه مئوية ثم الاوتوكلافها.
- أعد 1 لتر من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) عند 7.4 درجه الحموضة عن طريق أذابه الأملاح المسحوقة المتوفرة تجاريا في الماء المعقم المقطر المزدوج وأضافه 0.35 غرام من بيكربونات الصوديوم. تعقيم عن طريق الترشيح تحت غطاء محرك العقيمة وتخزين في + 4 ° c حتى استخدام.
- اعداد 500 مل من الفوسفات 1x معقمه-مخزنه-المالحة (تلفزيوني) عن طريق تذويب 0.1 غرام من فوسفات البوتاسيوم أحادي ، 0.1 غرام من كلوريد البوتاسيوم ، 4.0 غرام من كلوريد الصوديوم و 0.575 غرام من فوسفات الصوديوم ثنائي فوسفات في المياه المقطرة المزدوجة المعقمة. تحقق من قيمه الأس الهيدروجيني (7.4) وتعقيم تحت غطاء محرك العقيمة عن طريق الترشيح. يخزن عند + 4 درجه مئوية حتى يتم استخدامه.
- اعداد 50 مل من الحل التوقف التريبسين (خدمات المرفق التقني) عن طريق أضافه 5 مل من 10 ٪ الجنين البقري المصل (الدم) إلى 45 مل من HBSS تحت غطاء محرك العقيمة. يخزن عند + 4 درجه مئوية حتى يتم استخدامه.
- اعداد المتوسطة النسر دولبيكو المعدلة للعزل الليفي (I-DMEM) باستخدام 250 مل من المتوسط النسر دولبيكو المعدلة (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ والبنسلين 0.5 ٪ و ستربتومايسين (القلم/بكتيريا) تحت غطاء محرك معقم. يخزن عند + 4 درجه مئوية حتى يتم استخدامه.
- اعداد DMEM للمزامنة الخلايا الليفية (S-DMEM) باستخدام 250 mL من DMEM تستكمل مع 0.1 ٪ والقلم 0.5 ٪/بكتيريا تحت غطاء محرك العقيمة. يخزن عند + 4 درجه مئوية حتى يتم استخدامه.
2. عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية
ملاحظه: يجب اجراء الخطوات 2.1 إلى 2.3 المذكورة أدناه تحت غطاء محرك معقم. عينه اسطوانيه قياس حوالي 0.8 سم في قطر غله 2 × 106 الخلايا الليفية في الممر 1.
- اغسل العينة التي تم الحصول عليها حديثا من الجلد البشري من البطن في طبق 100 مم مع محلول HBSS. يهز بلطف لأزاله الدم والسوائل البيولوجية الأخرى. كرر الخطوة ثلاث مرات ، وتغيير الحل HBSS ولوحه في كل غسل.
- ضع العينة في لوحه 100 مم ، وأزاله الشعر والدهون باستخدام ملقط ومقص غرامه ، وتشريحها بمشرط للحصول علي 2 مم × 1 مم شظايا (لما مجموعه 16 شظايا) تجنب الندوب ، القذرة (علي سبيل المثال ، نتيجة للرسومات مع القلم dermographic) أو حرق المناطق من الانسجه.
- ضع 4 أجزاء صغيره في كل طبق 35 مم ، غطه بغطاء زجاجي معقم 22 مم × 22 مم. ضبط بواسطة وسائل الملقط الناعم. أضافه 1.5 mL من I-DMEM.
- احتضان لوحات في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO2 لمده 15 يوما أو حتى تصل الخلايا 85% التقاء. تغيير متوسط الثقافة كل 3 أيام والتحقق من نمو الخلايا باستخدام المجهر النقيض من المرحلة المقلوبة يوميا.
3. التوسع في الخلايا الليفية الجلد البشري
ملاحظه: يجب ان يتم تنفيذ الخطوات المذكورة أدناه تحت غطاء محرك معقم باستثناء الخطوات التي تم تنفيذها في الحاضنة.
- رفع نظارات الغطاء مع ملقط غرامه ، وضعها راسا علي عقب في صحن 1 100 مم ويغسل مع 1x العقيمة تلفزيوني.
- أزاله شظايا من العينات وتجاهلها ، وغسل لوحات مع 1x العقيمة تلفزيوني.
- أزاله 1x التلفزيونية وأضافه 3 مل و 1 مل من تريبسين-أدتا (حمض ايثيلنديدياتيتاياستيك) لتغطيه النظارات وضعت في صحن 100 mm و 35 mm الاطباق ، علي التوالي. احتضان لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
- منع التريسينزيشن عن طريق أضافه 5 مل من خدمات المرفق التقني إلى طبق 100 مم و 2 مل من خدمات المرفقات لكل طبق 35 ملم. جمع تعليق في أنابيب معقمه 15 مل ، الطرد المركزي في 400 x g في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
- يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 12 مل من I-dmem. تقسيم تعليق الخلية إلى 3 مل قسامات لكل لوحه 60 mm.
- احتضان في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2. تغيير المتوسطة يوميا. الحفاظ علي الخلايا في الثقافة حتى تصل إلى التقاء 75 ٪.
- يستنشق المتوسطة من لوحات ويغسل بسرعة في 1x تلفزيوني.
- تكرار التريسينزيشن (الخطوات 3.3 و 3.4) ثلاث مرات للحصول علي الخلايا في مرور 4. استخدام 1.5 مل من تريبسين-أدتا و 3 مل من خدمات المرفقات في كل طبق 60 مم. تقسيم الخلايا 1:3.
- مزامنة الخلايا عن طريق استبدال I-DMEM مع S-DMEM واحتضان ل 48 h في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
- اعداد ما يلي (اثناء مزامنة الخلية).
- اعداد الخلايا الليفية التوسع المتوسطة عن طريق أضافه 5.0 mL من 0.5 ml من L-الجلوتامين إلى 44.5 mL من DMEM المتقدمة (ا-DMEM) ، مخزن في + 4 ° c.
- اعداد مجموع NM-RNA-أعاده برمجه كوكتيل لأعاده برمجه الخلايا الليفية من خلال الجمع بين ما يلي في كل من 9 أنابيب معقمه RNase خاليه: 32 μL من OSKMNL NM-RNA ، 24 μL من EKB NM-RNA ، 5.6 μL من NM-ميكرورناس (61.6 μL الحجم النهائي ل 9 aliquots).
- تقسيم كل أنبوب من 61.6 μl من إجمالي NM-RNA-أعاده برمجه كوكتيل ل الخلايا الليفية أعاده برمجه إلى أربعه 15.4 μl واحد--استخدام قسامات في العقيمة ، أنابيب خاليه rnase وتخزين في-80 درجه مئوية (15.4 μl الحجم النهائي ل 36 قسامات).
4. أعاده برمجه الخلايا الليفية الجلدية إلى iPSCs
- اليوم العاشر: بذر الخلايا
ملاحظه: يجب تنفيذ الخطوات 4-1-1 إلى 4-1-3 و 4.1.8 ل4.1.9 تحت غطاء معقم. مصفوفة غشاء القبو (BMM) الهلام بسرعة في درجه حرارة الغرفة. ولذلك ، فانه ينصح بشده لذوبان BMM بين عشيه وضحيها علي الجليد في الثلاجة ، وتمييع مع الجليد الباردة خاليه من المصل واستخدام الpipetsات المبردة مسبقا ، ونصائح ، وأنابيب.- اعداد لوحه 24 بئر عن طريق طلاء كل بئر مع 100 μL من BMM واحتضان لمده 1 ساعة علي الأقل في 37 درجه مئوية قبل بذر الخلايا.
- يستنشق المتوسطة من لوحات مع الخلايا في الثقافة ويغسل بسرعة في 1x تلفزيوني.
- تكرار التريسينزيشن (الخطوات 3.3 و 3.4) للحصول علي الخلايا في مرور 5. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في حجم مناسب من الخلايا الليفية توسيع المتوسطة (انظر الخطوة 3.10).
- اعداد وتنظيف الكريات البيضاء مع 70 ٪ الكحول.
- اعداد حل عن طريق خلط بلطف 10 ميكرولتر من التريبين الأزرق و 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب 1.5 mL ، واحتضان لمده 1-2 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. يجب الحرص علي عدم احتضان أطول من 5 دقائق.
- ماصه 10 μL من المحلول في الكيس النصفي وضعه علي المرحلة من المجهر النقيض المرحلة المقلوبة للعد. الخلايا غير القابلة للحياة ستكون زرقاء ، في حين ان الخلايا القابلة للحياة ستكون غير ملطخه.
- عد الخلايا في 2 الساحات علي الأقل من غرفه الكريات الدموية. تطبيق الحساب التالي للحصول علي العدد الإجمالي للخلايا:
العدد الإجمالي للخلايا = (العدد الإجمالي للخلايا المحسوبة/العدد المربع) × 2 × 10 × الحجم الكلي لتعليق الخلية - اجراء تخفيف للحصول علي كثافة 2.5 x 104 خليه لكل 500 μl من الخلايا الليفية التوسع المتوسطة ، استنادا إلى العدد الإجمالي للخلايا عد. أعاده تعليق بيليه في حجم مناسب من الخلايا الليفية التوسع المتوسط.
- ماصه 500 μL من تعليق الخلية في كل بئر من لوحه 24 بئر. احتضان الخلايا بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
- اليوم الأول: العبور
ملاحظه: يجب تنظيف جميع أسطح العمل واللوازم (علي سبيل المثال ، القفازات ، الزجاجات ، أسطح الغطاء المعقم ، الماصات) باستخدام كاشف التنظيف لأزاله RNase قبل بدء الاجراء. تنفيذ الخطوات 4.2.2 ، 4.2.4-4.2.8 تحت غطاء محرك معقم.- الإحماء xeno خاليه ، مصل خاليه ، عامل النمو المنخفض الإنسان ESC/iPSC الثقافة المتوسطة (XF/FF الثقافة المتوسطة) في 37 درجه مئوية حمام المياه.
- أزاله المتوسطة القديمة من كل بئر واستبدالها مع 500 μL من المتوسطة مسبقا الحرارة XF/FF الثقافية.
- احتضان في 37 درجه مئوية تحت 5 ٪ CO2 لمده 6 ساعات علي الأقل.
- ذوبان خمسه 15.4 μl القسامات من إجمالي NM-RNA أعاده برمجه كوكتيل في درجه حرارة الغرفة ثم وضعه علي الجليد.
- أضف 234.6 μL من وسط المصل المخفض إلى كل من المحلول الهضمي ، ماصه برفق 3 – 5 مرات وتسميه كل واحده كانبوب A (الحمض الريبي النيبالي + المصل المنخفض المتوسط).
- التسمية 5 معقمه ، RNase-أنابيب 0.5 mL الحرة كما أنبوب B ومزيج 6 μl من الاصطناعية سيرنا كاشف النقل مع 244 μl من المتوسط المصل المنخفضة (الحمض الريبي النيبالي-ترانسفيكشن الكاشف + انخفاض المصل المتوسطة).
- أضافه محتويات كل أنبوب B إلى أنبوب A قطره (للحصول علي 500 μL الحجم النهائي للحل المعقدة التحويل الأحادي الحمض الريبي النيبالي). مزيج من خلال التنصت علي الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه.
- أضافه 125 μl من NM-الحمض الريبي النيبالي الحل المعقدة من كل من القسامات الخمسة من 500 μl إلى 4 ابار (للوصول إلى ما مجموعه 20 الآبار) ، أماله لوحه والأنابيب القطرات في الوسط. اخلطه برفق بالاهتزاز. استخدم الآبار الاربعه المتبقية كمرجع.
- احتضان ل 15 ح في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
- اليوم الثاني – الرابع: إكمال عمليه التحويل
- يستنشق الوسط. كرر اجراء التحويل كما في اليوم الأول تحت غطاء المحرك المعقم.
- اليوم 5 – 10: التغييرات الاعلاميه
- يستنشق المتوسطة والتبادل مع الطازجة, قبل الحرارة XF/FF الثقافة المتوسطة تحت غطاء محرك السيارة العقيمة.
- احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
- الحفاظ علي الثقافة حتى مراقبه تشكيل المستعمرات iPSC رصد يوميا من قبل المجهر علي النقيض من المرحلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان الهدف من هذا البروتوكول هو أعاده برمجه الخلايا الليفية الجلدية المعزولة عن جلد البطن باستخدام طريقه البرمجة غير المدمجة التي تعتمد علي NM-RNAs للحث علي التعبير عن عوامل محدده. لتحقيق هذا الهدف ، تم عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية من عينات الجلد من المرضي الذين يخضعون لجراحه شد البطن وتم إنشاء iPSCs إدخال Oct4 ، Sox2 ، Klf4 ، cMyc ، Nanog ، Lin28 أعاده برمجه العوامل و E3 ، K3 ، B18 عوامل التهرب المناعي من قبل التجارية جاهزه للاستخدام عده أعاده برمجه ويرد في الشكل 1موجز للجدول الزمني للبروتوكول.
ونميت الخلايا الليفية البشرية من عينات من جلد البطن في غضون أسبوع واحد من الثقافة (الشكل 2ا) ووصلتإلى 85 ٪ التقاء في غضون أسبوعين (الشكل 2ب). واتسمت الخلايا بنمو لاصق علي الاطباق الثقافية البلاستيكية وتنوعت المورفولوجية من ممدود وعلي شكل مغزل (الشكل 2ج) إلى بالأرض وعلي شكل نجمه (الشكل 2د). الليفية المورفولوجية والترتيب في الثقافة تغيرت بشكل كبير بعد البذر علي BMM ، عندماحصلتعلي المورفولوجية ممدود ورتبت لتشكيل هياكل متفرعه رقيقه (الشكل 3ا). وكانت المستعمرات الصغيرة مرئية بالفعل في الثقافة في اليوم 1 من الانتقال الأول (الشكل 3ب) ونما حجمها تدريجيا مع مرور الوقت ، في حين ارتفع عددها حتى اليوم 7 وبقي بعد ذلك مستقرا بين اليوم 7 واليوم 14 (الشكل 3ج ، د) ، ربما نتيجة لاندماج مستعمرات أصغر لتشكيل
وبما ان اجراء أعاده البرمجة يتم باستخدام وسائل الاعلام الخالية من المضادات الحيوية ، فان التلوث الجرثومي هو قضية رئيسيه وقد يحدث (الشكل 4) إذا لم يتم ضمان ظروف معقمه اعتماد إجراءات قياسيه لمنع التلوث (مثل ارتداء القفازات ، وأزاله الغبار من جميع الأسطح ، وتنظيف جميع الأسطح وال70 معدات
الشكل 1: الجدول الزمني للبروتوكول. الجدول الزمني للعزل وأعاده برمجه الخلايا الليفية البشرية من جلد البطن. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: العزلة وثقافة الخلايا الليفية الجلدية. الصور التمثيلية من الخلايا الليفية خارج النمو من شظايا الجلد (ا). وصلت الخلايا الليفية التقاء في حوالي 14 يوما (ب) وأظهرت علي شكل المغزل (ج) ونجم علي شكل (د) النمط الظاهري. ويشار إلى شظايا الجلد من قبل نجم ابيض. شريط مقياس = 200 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الخلايا الليفية الجلد التقدم أعاده برمجه. وأظهرت الخلايا المصنفة علي BMM تغيرا ملحوظا في الترتيبوالتشكل (ا). المستعمرات الصغيرة من iPSCs شكلت في وقت مبكر 24 ح بعد الانتقال الأول (ب) وحجمها زيادة تدريجيا في اليوم 7 (ج) ، و 14 (د) ، في حين ان عددهم زادت بين اليوم 1 واليوم 7 ولكن ظلت مستقره بين اليوم 7 و 14 من الانتقال الأول. شريط مقياس = 500 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التلوث الميكروبي اثناء عمليه أعاده البرمجة. صوره تمثيليه باستخدام المجهر علي النقيض من المرحلة التي تظهر التلوث الميكروبي للثقافة الليفية اثناء عمليه أعاده البرمجة. شريط مقياس = 500 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ipscs الناشئة بسرعة كمرشح الخلية الواعدة للتطبيقات الطب التجديدي وكاداه مفيده للغاية لنمذجة الامراض واختبار المخدرات3,8. يصف البروتوكول المعروض هنا توليد iPSCs البشرية من عينه لها حجم خزعة الجلد لكمه مع اجراء بسيط وفعال لا يتطلب اي معدات محدده أو خبره سابقه مع أعاده برمجه التكنولوجيا.
ومن الاهميه الاساسيه لتحسين العزلة الليفية والثقافة لزيادة فرص النجاح, كما كثافة الطلاء ومعدل الانتشار تاثير أعاده برمجه الكفاءة. وعلاوة علي ذلك ، فقد ذكر مؤخرا ان الخلايا الليفية الجلدية تستجيب بشكل مختلف لأعاده برمجه التكنولوجيا ، وعلي وجه التحديد ، الخلايا الليفية المعزولة عن جلد منطقه البطن هي أكثر سهوله وسهوله أعاده برمجتها من الخلايا الليفية الجلدية المعزولة عن مناطق الجسم الأخرى18. ولذلك ، فمن المهم لتحديد بدقه الخلايا الجسدية لأعاده برمجه وتحديد كثافة الطلاء علي أساس معدل انتشار الخلايا. ولهذا الغرض ، يرشد البروتوكول الحالي أيضا إلى كيفيه عزل الخلايا الليفية الجلدية من جلد البطن وكيفيه نشرها في المختبر لتسهيل وتسريع العملية.
قبل أعاده البرمجة ، تم نشر الخلايا الليفية للوصول إلى الممر 5 لمسح ذاكره الخلية18 والامتثال للادله المبلغ عنها ان المرور يمكن تسريع التحريض من مستحث الدولة19. وعلاوة علي ذلك ، وفقا لتجربتنا ، تظهر الخلايا الليفية في الثقافة خصائص التكاثر المتغيرة ، التالي قمنا بتعديل البروتوكول عن طريق إدخال خطوه اضافيه لمزامنة الخلايا الليفية وتقليل التغير في عدد الخلايا.
باستخدام مجموعه التجارية نانومتر-rnas المستندة إلى ان يقدم مجموعه من العوامل أعاده برمجه الناتجة عن ياماناكا ونهج طومسون5,6, جنبا إلى جنب مع ميرنا التي ثبت لتحسين المستندة إلى mrna أعاده برمجه20, يمكن أعاده برمجه الخلايا الليفية الجلدية البشرية بنجاح إلى ipsc والمستعمرات الصغيرة تصبح واضح المزايا الرئيسية لأعاده برمجه المستندة إلى mRNA هي ، في الواقع ، وظهور المستعمرات في وقت مبكر حتى عندما يتم أعاده برمجه عدد منخفض من الخلايا20 مع معدل منخفض جدا للغاية والغياب الكامل للتكامل التي تجعل ipscs المتولدة مع هذه الطريقة أمنه للاستخدام في الطب التجديدي. وعلاوة علي ذلك ، فان المجموعة التجارية المستخدمة لهذا البروتوكول تشترك في تسليم العوامل المناعية المعروفة لتحسين كفاءه أعاده البرمجة عن طريق منع وفاه الخلية الناجمة عن السامة للخلايا والمناعية نانومتر-rnas21،22.
علي الرغم من ان المجموعة المستخدمة لأعاده برمجه صممت ل 6 حسنا لوحه متعددة حسنا ، ونحن الأمثل الكثافة الخلوية وتعديل حجم الكواشف للاستخدام علي لوحه متعددة الآبار 24 جيدا لجعل بروتوكول فعال لتوليد iPSCs الإنسان من خزعة الجلد لكمه. وعلاوة علي ذلك ، علي الرغم من انه إذا تم الإبلاغ عن الحاجة إلى حاضنه ثقافة الانسجه مع O2 السيطرة من قبل العديد من المؤلفين20،23 والموصي بها من قبل الشركة المصنعة كيت ، وبعد البروتوكول الموصوف هنا ونحن أعاده برمجه الخلايا الليفية الجلدية البشرية من جلد البطن في لذلك ، يمكن اجراء العملية في اي مختبر ثقافة الخلية دون الحاجة إلى الغلاف الجوي (21 ٪ س2) أو نقص الأكسجين (5 ٪ س2) الظروف الثقافية ، علي الرغم من ان هذه قد تزيد من تحسين أعاده برمجهالكفاءة 24 ،25.
ومع ذلك ، استخدمنا الكواشف غير البشرية المشتقة من الحيوانية لاشتقاقها من عينات البشرة الصغيرة iPSCs التي يمكن استخدامها لأغراض البحث. علي الرغم من ان التطبيق الأكثر جاذبيه هو لتجديد الانسجه والأعضاء ، وقد استخدمت ipscs لنمذجة الامراض المختلفة ومن ثم التحقيق في أليات الجزيئية الكامنة وتطوير ادويه محدده والعلاجات3،26.
بشكل ملحوظ ، واستبدال الكواشف المستمدة من الحيوانية للكواشف المناسبة xeno خاليه ، والبروتوكول نفسه يسمح لأعاده برمجه الخلايا الليفية البشرية الكبار في iPSCs في بيئة ثقافة خاليه من xeno كامله التي تبرر استخدامها السريري.
بيد ان عبء العمل الثقيل يحتاج إلى ان يؤخذ في الاعتبار. في راينا ، من المهم للتخطيط للتجربة بعناية في وقت مبكر ، بما في ذلك الخطوات التي تحتاج إلى القيام به خلال عطله نهاية الأسبوع ، واعداد جميع الكواشف ترانسكشن خلال خطوه التزامن. وفي الواقع ، من المقرر القيام بها كل يوم لمده أربعه أيام ، وبعد ذلك ، تحتاج الخلايا إلى ان تراقب كل يوم والمتوسطة التي سيتم استبدالها علي أساس يومي.
وعلاوة علي ذلك ، فان التحديد الدقيق لمستعمرات iPSC لا يمكن ان يستند فقط إلى المعايير المورفولوجية. التالي ، يجب ان تتميز iPSCs المشتقة حديثا البحث عن التعبير عن علامات مستحث متعددة من خلال التحليلات الخلوية والجزيئية. وتشمل العلامات المقبولة علي نطاق واسع NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81 و SSEA4, والتي يمكن التعرف عليها بواسطة التحليل المناعي الكيميائي وتحليل التعبير الجيني باستخدام شبه الكمية أو الكمية RT-PCR. منذ النشاط الفوسفاتيز القلوية وقد ثبت ان اوبريجولاتيد في الخلايا الجذعية مستحث ، يمكن الكشف عن هذا النشاط الانزيمي بسهوله القيام بها لتحديد ipscs والتحقق من حدوث أعاده برمجه27،28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ولم اعلامات صاحبا البلاغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
| Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
| Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
| NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
| Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
References
- Lo, B., Parham, L. Ethical Issues in Stem Cell Research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine. Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).
- Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
- Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).
- Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications. Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Malik, N., Rao, M. R. A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).
- Poleganov, M. A., et al. Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion. Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).
- Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies. Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).
- Revilla, A., et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).
- Lee, Y. S., et al. Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells. ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Shan, Z. Y., et al. Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells. Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts. Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).
- Beissert, T., et al. Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins. Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).
- Mathieu, J., et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).
- Wang, Y., et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).
- Deng, Y., et al. Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).
- Karagiannis, P., et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development. Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).
- Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).
