Summary
Katı tümör hücre hatlarındaki yan popülasyon hücrelerinin oranını ölçmek için uygun, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunulmuştur.
Abstract
Kanser kök hücreleri (KSS) tümör büyümesi, metastaz ve nüksün önemli bir nedenidir. CSC'lerin izolasyonu ve tanımlanması tümör araştırmaları için büyük önem taşımaktadır. Günümüzde CSC'lerin tümör dokularından ve tümör hücre hatlarından tanımlanması ve saflaştırılması için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Yan popülasyon (SP) hücrelerinin ayrılması ve analizi yaygın olarak kullanılan yöntemlerden ikisidir. Yöntemler, CSC'lerin Hoechst 33342 gibi floresan boyaları hızla dışarı atma yeteneğine dayanır. Boyanın efflux'u ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları ile ilişkilidir ve ABC taşıyıcı inhibitörleri tarafından engellenebilir. Hoechst 33342 ile kültürlü tümör hücrelerini boyama ve SP hücrelerinin akış sitometrisi ile oranını analiz etme yöntemleri açıklanmıştır. Bu test kullanışlı, hızlı ve uygun maliyetlidir. Bu testte oluşturulan veriler, genlerin veya diğer hücre dışı ve hücre içi sinyallerin tümör hücrelerinin köklük özellikleri üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Introduction
Kanser kök hücreleri (CSC' ler), tümör büyümesi, metastaz ve nüks1,2'dehayati rol oynayan, kendini yenileme yeteneğine ve çoklu farklılaşma potansiyeline sahip hücrelerin alt kümeleridir. Şu anda, CSC'lerin akciğer, beyin, pankreas, prostat, meme ve karaciğer kanserleri 3, 4 , 5 ,6,7,8,9dahil olmak üzere çeşitli kötü huylu tümörlerde varolduğutanımlanmıştır. Bu tümörlerde CSC'lerin tanımlanması esas olarak CD44, CD24, CD133 ve Sca-19,10 'un yüksek ve/veya düşük ekspresyosu gibi yüzey belirteç proteinlerinin varlığına dayanmaktadır, ancak CSC'leri CSC olmayanlardan ayırt edebilecek benzersiz bir belirteç şimdiye kadar bildirilmemiştir. Şu anda tümör dokusunda veya tümör hücre hatlarında CSC'leri tanımlamak ve arındırmak için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Bu teknikler CSC'lerin belirli özelliklerine göre tasarlanmıştır. Bunlar arasında, yan popülasyon (SP) hücrelerinin tahlilleri ve sıraları yaygın olarak kullanılan yöntemlerden ikisidir.
SP hücreleri başlangıçta Goodell ve ark.11, fare kemik iliği hücrelerinde hematopoetik kök hücreleri karakterize ettiklerinde keşfedildi. Fare kemik iliği hücreleri floresan boya Hoechst 33342 ile etiketlendiğinde, bir akış sitometrisi testinin iki boyutlu nokta grafiğinde hoechst 33342 loş lekeli hücrelerin küçük bir grubu ortaya çıktı. Hoechst 33342 DNA bağlayıcı bir boyadır ve farklı spektral özelliklere yol açan en az iki bağlama moduna sahiptir. Floresan emisyonu aynı anda iki dalga boyunda görüntülerken, birden fazla popülasyon ortaya çıkabilir12. Tahlillerinde Hoechst 33342 350 nm'de heyecanlandı ve floresan 450/20 nm bant geçişi (BP) filtresi ve 675 nm kenar filtresi uzun geçiş (EFLP)11kullanılarak ölçüldü. Kemik iliği hücrelerinin tüm popülasyonu ile karşılaştırıldığında, bu hücre grubu SP hücreleri11adı verilen hematopoetik kök hücreler ile zenginleştirilmiştir. SP hücreleri Hoechst 33342'yi hızla dışarı atabilir. Bu boyanın efflux ile ilgilidir ATP bağlayıcı kaset (ABC) transporters13Fumitremorgin C14, Verapamil ve Reserpine 15,16gibi bazı ajanlar tarafından inhibe edilebilir. Bundan sonra, çeşitli dokularda, organlarda, tümör dokularında ve tümör hücre hatlarında farklı oranlarda SP hücreleri tespit edildi17,18,19. Bu SP hücreleri kök hücrelerin birçok özelliğine sahiptir17,19.
Bu makalede Hoechst 33342 kültürlü tümör hücrelerinin etiketlenerek boyanması ve SP hücrelerinin akış sitometrisi ile analizi açıklanmaktadır. Ayrıca Hoechst 33342 konsantrasyonunun optimizasyonu ve bu yaklaşım kullanılarak belirli bir tümör hücre hattı için uygun bloker seçimi gösterilmiştir. Son olarak, saplanma terfisi veya inhibisyon sinyallerinin tümör hücrelerindeki SP oranı üzerindeki etkileri gösterilmiştir. Deneysel örnekler, SP'nin analizinin gen ekspresyatörleri, küçük inhibitörler, aktivatörler, sitokinler ve kemokinler gibi çeşitli sinyallerin tümör saplığı üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanılabileceğini göstermektedir. CD44+/CD24– popülasyonun sıralenmesi, aldehit dehidrogenaz (ALDH) analizi ve tümör küre oluşumu tahlilleri gibi CSC'lerin izolasyonu ve saflaştırılması için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem manipülasyon için daha kolaydır ve uygun maliyetlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre hazırlığı
- Hücre sindirimi ve nötralizasyon
- Tohum tümör hücreleri (MDA-MB-231 hücreleri gibi) 6 kuyu plakasında ve % 5 CO2ile birlikte verilen 37 °C inkübatörde kültüre edilir.
- Yoğunlukları yaklaşık% 90'a ulaştığında hücreleri hasat edin. Kültür ortamını iyice emiş ve hücreleri 3 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2x yıkayın.
NOT: Sinyal yolu inhibitörlerinin (örneğin FRA1 inhibitörü) veya aktivatörlerin (örneğin STAT3 aktivatör) tümör hücrelerinin sap özellikleri üzerindeki etkilerini incelemek için tümör hücreleri 6 kuyu plakasında tohumlanır ve hasat öncesi belirli bir süre inhibitörler veya aktivatörlerle ön işlemden geçirilir. - 6 kuyu plakasının her kuyusuna 500 μL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin, plakayı 37 ° C'de bir inkübatöre 1-3 dakika (dk) yerleştirin ve hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe dokunun.
NOT: Hücre canlılığındaki değişiklikler nedeniyle uzun süreli sindirim SP profilini etkileyecektir. - Sindirimi sonlandırmak için 6 kuyu plakasının her kuyusuna% 2 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 3 mL PBS ekleyin ve hücre kümelerini dağıtmak için hücreleri 3-5x yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin.
- Yeni bir 6 kuyu plakasının bir kuyusuna 0,5 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve mikroskop altında inceleyin. Hücre kümeleri gözlenirse, hücre süspansiyonunu 70 μM hücre süzgecinden geçirin.
NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır. - Hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Pelet hücrelerine 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj hücreleri. Üstnatantı çıkarın ve % 2 FBS ile desteklenmiş 3 mL PBS'de yeniden dürt. Hücreleri iyice karıştırmak için 3-5x yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Hücre sayıları
- 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve 50 μL trippan mavi çözelti ile karıştırın. Pipet 10 μL karışımın hemositometre gibi standart bir yöntem kullanarak canlı hücre sayısını saymak için.
- PBS'deki hücreleri %2 FBS ile birlikte 1 x 106 hücre/mL'lik son konsantrasyona seyreltin. 5 mL polistiren yuvarlak alt test tüpüne 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve iki numune tüpü hazırlayın.
2. Hoechst 33342 ile hücre boyama
- Uygun bir son konsantrasyona ulaşmak için Hoechst 33342'yi bir tüpe ekleyin.
NOT: Örneğin, Hoechst 33342'nin uygun konsantrasyonu MDA-MB-231 hücreleri için 3 μg/mL'dir. - Uygun bir son konsantrasyona başka bir tüpe bir bloker (örneğin, Fumitremorgin C, Verapamil veya Reserpine) ekleyin ve 2.1 adımında açıklandığı gibi hoechst 33342 konsantrasyonunun aynısını eklemeden önce tüpü 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: MDA-MB-231 hücreleri için uygun engelleyici Reserpine'dir (40 μM). Reserpine, geçişli SP alanında hücre olmadığını doğrulamak için engelleme denetimi olarak kullanılır. - Hücre içeren birkaç tüp hazırlayın ve farklı konsantrasyon gradyanlarına Hoechst 33342 ekleyin. Akış sitometrisi test edildikten sonra SP profiline ve oranına göre uygun konsantrasyonu seçin.
NOT: Bu, Hoechst 33342'nin uygun konsantrasyonunun tanımlanmasında kullanılan isteğe bağlı bir adımdır. - Hücre içeren birkaç tüp hazırlayın, blokeri farklı konsantrasyon gradyanlarına ekleyin, tüpleri 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın, ardından uygun bir konsantrasyona Hoechst 33342 ekleyin. Akış sitometrisi test edildikten sonra, kapılı SP alanında hücrelerin yokluğuna göre uygun konsantrasyonu seçin.
NOT: Bu, uygun engelleyici konsantrasyonunun tanımlanması için kullanılan isteğe bağlı bir adımdır. - Tüpleri 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve tüpleri her 10 dakikada bir sallayarak 60 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Tüpleri iyice sallamak lekeleme için önemlidir, çünkü daha iyi boyama sonuçları için hücreler ve boya arasında tam temas sağlar. - Kuluçkadan sonra, hücreleri 200 x g, 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice emiş edin, çünkü hücreler çok gevşek ve dengesiz peletler oluşturur.
- Her tüpün hücrelerini% 2 FBS ile desteklenmiş 1 mL buz gibi PBS'de yeniden depolayın ve hücreleri iyice karıştırmak için 3-5x yukarı ve aşağı pipetleyin. Ölü hücreleri tanımlamak için her tüpün süspansiyonuna 1 μL 1 mg/mL propidium iyodür (PI) ekleyin.
NOT: Bu adımdaki tüm prosedürler, Hoechst 33342'nin tümör hücrelerinden efflux'ını inhibe etmek için 4 °C'de yapılmalıdır. Tüpler ışığa doğrudan maruz kalmaktan korunmalıdır.
3. Akış sitometrisine göre analiz
NOT: Akış sitometresi yazılımının kullanım talimatları (bkz. Malzeme Tablosu)bu bölümde açıklanmıştır ve Ek Şekiller 1–10.
- Akış sitometresi yazılımında KLASÖR düğmesini tıklatın. Deney düğmesini tıklatın, sonra Yeni Deneme 'yi tıklatın ( Tamamlayıcı Şekil1A,B).
- Tamam düğmesini tıklatın. "Experiment_001" KLASÖR altında görünecektir (Ek Şekil 2A,B).
- Klasör adını belirli bir adla (örneğin, "20191118-SP") değiştirmek için Experiment_001 düğmesini tıklatın. Enter 'ıtıklatın. Yeni ad ("20191118-SP") FOLDER (Ek Şekil 3A,B)altında görünecektir.
- Yeni deneme klasörüne örnek eklemek için Yeni Örnek düğmesini tıklatın ("20191118-SP"). Numuneye tüp eklemek için Yeni Tüp düğmesini tıklatın. Ok Ucu düğmesini tıklatın (Tamamlayıcı Şekil 4A-C).
- Parametreler düğmesini tıklatın ve akış sitometresinin parametrelerini ayarlayın (Tamamlayıcı Şekil 5).
- Emisyon dalga boylarını ayırmak için 610 nm dikroik ayna kısa geçişi (DMSP) kullanın. Mavi floresan toplamak için 450/20 nm BP filtre ve kırmızı floresan toplamak için 675 nm EFLP kullanın.
NOT: Hoechst 33342 355 nm'de UV lazer ile, PI ise 488 nm'de heyecanlanıyor.
- Emisyon dalga boylarını ayırmak için 610 nm dikroik ayna kısa geçişi (DMSP) kullanın. Mavi floresan toplamak için 450/20 nm BP filtre ve kırmızı floresan toplamak için 675 nm EFLP kullanın.
- Akış sitometreslerindeki hücre örneklerini çalıştırın.
NOT: SP hücreleri steril koşullar altında floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile sıralanabilir. Takip deneyleri için toplam 100.000-500.000 hücre toplanmalıdır.- Akış sitometresinde Hoechst 33342 ile boyanmış hücreleri çalıştırın.
- Hoechst 33342 ile boyanmış hücreleri içeren tüpleri sitometreye yerleştirin.
- Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Çizimi düğmesini tıklatın, sonra X eksenini tıklatın ve "FSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "PI-A" olarak ayarlayın. PI floresansına (logaritmik ölçeğe ayarlanmış Y ekseni) karşı ileri dağılım darbe alanının (FSC-A, doğrusal moda ayarlanmış X ekseni) nokta çizimini görüntüleyin. Sağ taraftaki canlı hücreleri ve pi ile parlak bir şekilde lekelenmiş canlı olmayan hücreleri sol üst köşede gösterecek şekilde voltajları ayarlayın. Ardından, FSC-A, PI-A alt kümesi ( TamamlayıcıŞekil 6A,B)olarak da bilinen P1 alt kümesini kapıya almak için Çokgen Kapı düğmesini tıklatarak ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını dışlamak için bir çokgen kapı kurun (Şekil 1A).
- Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Grafiği düğmesini tıklatın, X eksenini tıklatın ve "FSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "FSC-W" olarak ayarlayın. FSC-A'nın (X ekseni) nokta çizimini ileri dağılım darbe genişliğine (FSC-W, Y ekseni) karşı görüntüleyin. Nokta çizimini sağ tıklatın, Popülasyonları Göster düğmesinin altındaki P1 düğmesini tıklatın. P2 alt kümesini (FSC-A, FSC-W alt kümesi olarak da bilinir) geçirmek için dikdörtgen bir kapı oluşturmak için Dikdörtgen Kapı düğmesini tıklatın. Bu, büyük hacimli hücreleri hariç tutacaktır(Ek Şekil 7A-C ve Şekil 1A).
- Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Çizimi düğmesini tıklatın, X eksenini tıklatın ve "SSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "SSC-W" olarak ayarlayın. Yan dağılım darbe alanının (SSC-A, X ekseni) yan dağılım darbe genişliğine (SSC-W, Y ekseni) karşı nokta çizimini görüntüleyin. Nokta çizimini sağ tıklatın ve Popülasyonları Göster düğmesinin altındaki P2 düğmesini tıklatın. Ardından, P3 alt kümesini (SSC-A, SSC-W alt kümesi olarak da bilinir) geçirmek için dikdörtgen bir kapı oluşturmak için Dikdörtgen Kapı düğmesini tıklatın. Bu, tekdüze tanecikli bir hücre popülasyonu elde edecektir(Ek Şekil 8A-C ve Şekil 1A).
- Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Çizimi düğmesini tıklatın, X eksenini tıklatın ve "Hoechst Red-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "Hoechst Blue-A" olarak ayarlayın. Hoechst Red-A (X ekseni) ile Hoechst Blue-A (Y ekseni) arasındaki nokta çizimini görüntüleyin. Nokta çizimini sağ tıklatın, Popülasyonları Göster düğmesinin altındaki P3 düğmesini tıklatın. P4 alt kümesini (Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A alt kümesi olarak da bilinir) kapıya bir çokgen kapı oluşturmak için Çokgen Kapı düğmesini tıklatın. Nokta çizimini sağ tıklatın, nüfus hiyerarşisini göstermek için Nüfus Hiyerarşisini Göster düğmesini tıklatın.
NOT: Nokta çizimi üç farklı popülasyon gösterecektir: 1) grafiğin merkezine yakın bir G0-G1 faz popülasyonu; 2) sağ üst köşeye yakın bir S-G2/M faz popülasyonu; 3) SP. SP daha sonra daha fazla analiz için kapılıdır(Ek Şekil 9A-D ve Şekil 1A). Hoechst Red-A vs Hoechst Blue-A'nın nokta çizimi Şekil 1A'dagösterilene benzer bir SP profili göstermiyorsa, benzer bir profil görülene kadar voltajlar ayarlanmalıdır. Bu arada, yukarıdaki kapıların tümlerini buna göre ayarlayın. - SP hücrelerinin kapı bölgesini belirledikten sonra, SP hücrelerinin yüzdesini analiz etmek için her örnekten 20.000-100.000 olay toplamak için Veri Al'ı tıklatın (Tamamlayıcı Şekil 10).
- Akış sitometresinde bloker ile işlenmiş Hoechst 33342 lekeli hücreleri çalıştırın.
- Bloker içeren tüpleri sitometreye yerleştirin ve voltajların ve kapıların uygun şekilde seçilip seçilmediğini daha fazla kontrol etmek için aynı voltajları ve kapıları kullanarak hücreleri çalıştırın.
NOT: Sadece Hoechst 33342 boyama ile karşılaştırıldığında, varsa hücrelerin sadece çok küçük bir kısmı SP'nin kapılı bölgesinde görünmelidir (Şekil 1B). - SP hücrelerinin yüzdesini analiz etmek için her örnekten 20.000-100.000 olay toplayın.
- Bloker içeren tüpleri sitometreye yerleştirin ve voltajların ve kapıların uygun şekilde seçilip seçilmediğini daha fazla kontrol etmek için aynı voltajları ve kapıları kullanarak hücreleri çalıştırın.
- Akış sitometresinde Hoechst 33342 ile boyanmış hücreleri çalıştırın.
4. Veri analizi
NOT: Akış sitometri analiz yazılımının kullanımına ilişkin talimatlar (bkz. Malzeme Tablosu)bu bölümde açıklanmıştır ve Ek Şekiller 11–16.
- Dosyaları fcs biçiminde bir bilgisayara kopyalayın, akış sitometri analiz yazılımını açın ve bir örnek dosyayı yazılıma sürükleyin (Tamamlayıcı Şekil 11A,B).
- Ağ hücreleri ve SP hücrelerinin yüzdesini elde edin.
- Bu örnek dosyayıçift tıklatın, X eksenini tıklatın ve "FSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "PI-A" olarak ayarlayın. Ardından, bir çokgen kapı oluşturun ve FSC-A, PI-A alt kümesini(Tamamlayıcı Şekil 12A-E)elde etmek için Tamam düğmesini tıklatın.
- FSC-A, PI-A alt küme dosyasınıçift tıklatın, X eksenini tıklatın ve "FSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "FSC-W" olarak ayarlayın. Ardından, dikdörtgen bir kapı oluşturun ve FSC-A, FSC-W alt kümesini(Tamamlayıcı Şekil 13A-E)elde etmek için Tamam düğmesini tıklatın.
- FSC-A, FSC-W alt küme dosyasınıçift tıklatın, X eksenini tıklatın ve "SSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "SSC-W" olarak ayarlayın. Ardından, dikdörtgen bir kapı oluşturun ve SSC-A, SSC-W alt kümesini(Tamamlayıcı Şekil 14A-E)elde etmek için Tamam düğmesini tıklatın.
- SSC-A, SSC-W alt küme dosyasınıçift tıklatın, X eksenini tıklatın ve "Hoechst Red-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "Hoechst Blue-A" olarak ayarlayın. Ardından, bir çokgen kapı oluşturun ve Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A alt kümesini(Tamamlayıcı Şekil 15A-E)elde etmek için Tamam düğmesini tıklatın.
- Düzen Düzenleyicisi'ni Aç düğmesini tıklatarak Düzen Düzenleyicisi'ni açın. SSC-A, SSC-W alt küme dosyasını Düzen Düzenleyicisi'ne sürükleyin, sonra görüntü sonuçlarını kaydetmek için düzen penceresini dosyaya kaydetmek için tıklatın düğmesini tıklatın ( Tamamlayıcı Şekil16A-C).
- Yazılımı kapatırken gating bilgilerini korumak için çalışma alanını kaydedin.
- İki grup arasındaki farkı karşılaştırmak için istatistiksel analiz yazılımı ile t-test analizleri gerçekleştirin. P değeri 0.05'< istatistiksel olarak anlamlı olarak tanımlandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yönteme göre dört deneysel SP analizi yapıldı. İlkinde üç negatif insan meme kanseri hücre hattı olan MDA-MB-231'deki SP hücrelerinin oranını normal şartlarda tespit ettik. Hücre sayımından sonra Hoechst 33342, 1 x 10 6 hücre içeren bir tüpe3 μg/mL'lik son konsantrasyona eklendi. Reserpine ve Hoechst 33342, sırasıyla 40 μM ve 3 μg/mL'lik son konsantrasyonlara başka bir tüpe eklendi. Pi her iki tüpe de eklendi. FSC-A'nın (X ekseni) PI-A'ya (Y ekseni) karşı noktasal grafiği üç popülasyon gösterdi: 1) ölü hücreleri temsil eden PI pozitif hücre popülasyonu; 2) hücre kalıntıları; ve 3) ana popülasyon, daha fazla analize tabi tutulan PI negatif hücrelerdi (Şekil 1A,B). SP hücrelerinin oranını analiz etmek için FSC-A (X ekseni) ile FSC-W (Y ekseni) ve SSC-A 'nın (X ekseni) SSC-W (Y ekseni) nokta çiziminden kapılı tek hücreli bir popülasyon kullanılmıştır (Şekil 1A,B). SP hücreleri Hoechst Red-A (X ekseni) ile Hoechst Blue-A (Y ekseni) arasındaki noktasal çizimden kapılıydı ve yüzdeleri MDA-MB-231 hücrelerinde yaklaşık% 0.9 idi (Şekil 1A). Bununla birlikte, Reserpine SP hücrelerinin oranını büyük ölçüde azalttı (Şekil 1B), SP için kapı boyamanın doğru olduğunu destekledi.
İkinci deney, MDA-MB-435 hücrelerinde Hoechst 33342'nin uygun boyama konsantrasyonunun belirlenmesiydi. Hücre sayımından sonra Hoechst 33342, %2 FBS ile desteklenmiş 1 mL PBS'de askıya alınan 1 x 106 hücreye, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 ve 4 μg/mL dahil olmak üzere farklı konsantrasyon gradyanlarına eklendi. Şekil 2A'dagösterildiği gibi, Hoechst 33342 konsantrasyonu çok düşük olduğunda (yani, 0.5, 1, 1.5 μg / mL), SP hücrelerini diğer hücre popülasyonlarından ayırt etmek zordu, çünkü birçok hücre loş lekeli bir durumdaydı. Hoechst 33342 konsantrasyonu çok yüksek olduğunda (yani, 2.5, 3, 3.5, 4 μg/ mL), SP hücrelerinin oranı kaybolana kadar azaldı. Böylece 2 μg/mL Hoechst 33342, MDA-MB-435 hücrelerinde SP analizi için en iyi konsantrasyondu. Buna ek olarak, bu hücre hattı için uygun blokeri belirlemek için, 1 x 106 hücreye Hoechst 33342 ve bir bloker (Verapamil veya Reserpine) eklendi ve bu hücreler sırasıyla 2 μg/mL ve 40 μM'lik son konsantrasyonlara% 2 FBS ile desteklenmiş 1 mL PBS'de askıya alındı. Şekil 2B'degösterildiği gibi, hücrelerin yaklaşık% 0.4'ü Verapamil tedavisinden sonra boyayı dışarı atmış. Bununla birlikte, Reserpine tedavisinden sonra, oran yaklaşık% 0.1'e düştü (Şekil 2C). Bu deneyden, Reserpine bu hücre hattı için daha uygun bir engelleyici olarak kabul edildi.
Üçüncü örnekte, A549 hücreleri (insan akciğer adenokarsinom hücreleri) STAT3 aktivatör-Colivelin20 (100 nM) ile 48 saat (h) boyunca ön işlemden geçirildi. STAT3 sinyal yolu tümör hücrelerinin sap özelliklerini teşvik etmek için önemlidir21. Şekil 3'tegösterildiği gibi, SP hücrelerinin oranı Colivelin stimülasyonunda artmıştır.
Son örnekte, T47D hücreleri (insan meme kanseri hücreleri) 48 h22için 0.1 μM FRA1 inhibitörü-SKLB816 (ayrıca 13an olarak da adlandırılır) ile ön işlemden geçirildi. FRA1 epitel-mezenkimal geçişin (EMT) rapor edilen bir kapı bekçisidir ve tümör saplığının düzenlenmesinde rol oynar23. Şekil 4'tegösterildiği gibi FRA1 inhibitörünün tedavisi nedeniyle SP hücrelerinin oranı azaldı.
Şekil 1: SP analizinde MDA-MB-231 hücrelerinin gating stratejisi. (A) Hoechst 33342 (3 μg/mL) ve propidium iyodür (PI, 1 μg/mL) ile boyanmış MDA-MB-231 hücrelerinin gating stratejisi. (B) Reserpine (40 μM) ile tedavi edilen ve Hoechst 33342 (3 μg/mL) ve PI (1 μg/mL) ile boyanan MDA-MB-231 hücrelerinin gating stratejisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hoechst 33342 konsantrasyonunun optimizasyonu ve MDA-MB-435 hücrelerinde bloker seçimi. (A) Pi (1 μg/mL) ile birlikte farklı konsantrasyon gradyanlarında (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 μg/mL) Hoechst 33342 (Hoechst) ile boyanan MDA-MB-435 hücrelerinin SP analiz sonuçları. (B) Verapamil (40 μM) ile tedavi edilen ve Hoechst 33342 (2 μg/mL) ve PI (1 μg/mL) ile boyanan MDA-MB-435 hücrelerinin SP analiz sonucu. (C) Reserpine (40 μM) ile tedavi edilen ve Hoechst 33342 (2 μg/mL) ve PI (1 μg/mL) ile boyanan MDA-MB-435 hücrelerinin SP analiz sonucu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SP hücrelerinin oranı A549 hücrelerinde STAT3 aktivatör ile geliştirilmiştir. (A) STAT3 aktivatör-Kolivelin (100 nM) veya araç kontrolü (Ctrl)-H2O ile 48 saat boyunca ön işlemden geçen A549 hücrelerinin SP analiz sonuçları. Engelleme kontrolü olarak Reserpine (45 μM) ile tedavi edilen A549 hücreleri kullanıldı. A549 hücreleri Hoechst 33342 (7 μg/mL) ve PI (1 μg/mL) ile boyandı. (B) Colivelin (100 nM) ile tedavi edilen A549 hücrelerindeki SP hücrelerinin oranının istatistiksel sonuçları ve araç kontrolü. Veriler ortalama + standart hata olarak sunulur ortalama (SEM), n = her grup için 3. "*" P < 0.05'i gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: SP hücrelerinin oranı T47D hücrelerinde FRA1 inhibitörü tarafından inhibe edildi. (A) SKLB816 (0,1 μM) veya araç kontrolü (Ctrl)-DMSO ile 48 saat boyunca önceden tedavi edilen T47D hücrelerinin SP analiz sonuçları. Engelleme kontrolü olarak Reserpine (40 μM) ile tedavi edilen T47D hücreler kullanıldı. T47D hücreleri Hoechst 33342 (8 μg/mL) ve PI (1 μg/mL) ile boyandı. (B) SKLB816 (0.1 μM) ile tedavi edilen T47D hücrelerindeki SP hücrelerinin oranının istatistiksel sonuçları ve araç kontrolü. Veriler her grup için ortalama + SEM, n = 3 olarak sunulur. "*" P < 0.05'i gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Akış sitometresi yazılım adım numarası 3.1 için talimatlar. (A) KLASÖR düğmesini tıklatın. (B) Deney düğmesine tıklayın ve ardından Yeni Deneme düğmesine tıklayın. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Akış sitometresi yazılım adım numarası 3.2 için talimatlar. (A) Tamam düğmesini tıklatın. (B) Experiment_001 KLASÖRaltında gösterilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Akış sitometresi yazılım adım numarası 3.3 için talimatlar. (A) Experiment_001 adını belirli bir adla (örneğin, "20191118-SP") değiştirmek için Experiment_001 düğmesini tıklatın. (B) Enter düğmesini tıklatın. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 4: Akış sitometresi yazılım adım numarası 3.4 için talimatlar. (A) Yeni Örnek düğmesini tıklatın. (B) Yeni Tüp düğmesine tıklayın. (C) Ok Ucu düğmesini tıklatın. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 5: Akış sitometresi yazılım adım numarası 3.5 için talimatlar. (A) Parametreleri ayarlamak için Parametreler düğmesini tıklatın. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 6: Akış sitometresi yazılım adım numarası 3.6.1.2 için talimatlar. (A) Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Çizimi düğmesini tıklatın, X eksenini tıklatın ve "FSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "PI-A" olarakayarlayın. (B) P1 alt kümesini (FSC-A, PI-A alt kümesi olarak da bilinir) kapıya bir çokgen kapı oluşturmak için Çokgen Kapı düğmesini tıklatın. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 7: Akış sitometresi yazılım adım numarası 3.6.1.3 için talimatlar. (A) Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Çizimi düğmesini tıklatın, X eksenini tıklatın ve "FSC-A"olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "FSC-W"olarak ayarlayın. (B) Nokta çizimine sağ tıklayın ve Popülasyonları Göster düğmesinin altındaki P1 düğmesine tıklayın. (C) P2 alt kümesini (FSC-A, FSC-W alt kümesi olarak da bilinir) geçirmek için dikdörtgen bir kapı oluşturmak için Dikdörtgen Kapı düğmesini tıklatın. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 8: Akış sitometresi yazılım adım numarası 3.6.1.4 için talimatlar. (A) Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Çizimi düğmesini tıklatın, X eksenini tıklatın ve "SSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "SSC-W" olarak ayarlayın. (B) Nokta çizimini sağ tıklatın ve Popülasyonları Göster düğmesinin altındaki P2 düğmesini tıklatın. (C) P3 alt kümesini (SSC-A, SSC-W alt kümesi olarak da bilinir) geçirmek için dikdörtgen bir kapı oluşturmak için Dikdörtgen Kapı düğmesini tıklatın. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 9: Akış sitometresi yazılım adım numarası 3.6.1.5 için talimatlar. (A) Nokta çizimini görüntülemek için Nokta Çizimi düğmesini tıklatın, X eksenini tıklatın ve "Hoechst Red-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "Hoechst Blue-A" olarak ayarlayın. (B) Nokta çizimine sağ tıklayın ve Popülasyonları Göster düğmesinin altındaki P3 düğmesine tıklayın. (C) P4 alt kümesini (Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A alt kümesi olarak da bilinir) kapıya bir çokgen kapı oluşturmak için Çokgen Kapı düğmesini tıklatın. (D) Nokta çizimini sağ tıklatın, sonra nüfus hiyerarşisini göstermek için Nüfus Hiyerarşisini Göster düğmesini tıklatın. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 10: Akış sitometresi yazılım adım numarası 3.6.1.6 için talimatlar. (A) Veri Al düğmesine tıklayın, ardından her örnekten 20.000-100.000 olay toplayın. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 11: Akış sitometri analizi yazılımı adım numarası 4.1 için talimatlar. (A) Akış sitometri analiz yazılımını açın ve bir örnek dosyayı yazılıma sürükleyin. (B) Örnek dosya alınır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 12: Akış sitometri analiz yazılımı adım numarası 4.2.1 için talimatlar. (A) Bu örnek dosyayı çift tıklatın. (B) X eksenini tıklatın ve "FSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "PI-A" olarak ayarlayın. (C) Çokgen kapısı oluşturmak için Çokgen kapı oluştur düğmesini tıklatın. (D) FSC-A, PI-A alt kümesini edinmek için Tamam düğmesini tıklatın. (E) FSC-A, PI-A alt kümesi elde edilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 13: Akış sitometri analizi yazılımı adım numarası 4.2.2 için talimatlar. (A) FSC-A, PI-A alt küme dosyasını çift tıklatın. (B) X eksenini tıklatın ve "FSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "FSC-W" olarak ayarlayın. (C) Dikdörtgen kapı oluştur düğmesini tıklatın. (D) FSC-A, FSC-W alt kümesini elde etmek için Tamam düğmesini tıklatın. (E) FSC-A, FSC-W alt kümesi elde edilir.
Ek Şekil 14: Akış sitometri analizi yazılımı adım numarası 4.2.3 için talimatlar. (A) FSC-A, FSC-W alt küme dosyasını çift tıklatın. (B) X eksenini tıklatın ve "SSC-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "SSC-W" olarak ayarlayın. (C) Dikdörtgen kapı oluşturmak için Dikdörtgen kapı oluştur düğmesini tıklatın. (D) SSC-A, SSC-W alt kümesini edinmek için Tamam düğmesini tıklatın. (E) SSC-A, SSC-W alt kümesi elde edilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 15: Akış sitometri analizi yazılım adım numarası 4.2.4 için talimatlar. (A) SSC-A, SSC-W alt küme dosyasını çift tıklatın. (B) X eksenini tıklatın ve "Hoechst Red-A" olarak ayarlayın; Y eksenini tıklatın ve "Hoechst Blue-A" olarak ayarlayın. (C) Çokgen kapısı oluşturmak için Çokgen kapı oluştur düğmesini tıklatın. (D) Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A alt kümesini edinmek için Tamam düğmesini tıklatın. (E) Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A alt kümesi elde edilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 16: Akış sitometri analizi yazılımı adım numarası 4.2.5 için talimatlar. (A) Düzen düzenleyicisini açmak için Düzen Düzenleyicisini Aç düğmesini tıklatın. (B) SSC-A, SSC-W alt kümesi örnek dosyasını Düzen Düzenleyicisi 'ne sürükleyin. (C) Görüntü sonuçlarını kaydetmek için düzen penceresini dosyaya kaydetmek için tıklatın düğmesini tıklatın. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SP tahlilleri için akılda tutulması gereken birkaç önemli nokta vardır. Birincisi, her hücre hattı için Verapamil veya Reserpine gibi uygun bir engelleyicinin seçilmesidir, çünkü SP hücrelerinin "kapı" konumu, engelleyicinin eklenmesinden sonra çok sayıda SP hücresinin kaybolduğu konuma göre belirlenir. MDA-MB-231 hücre hattı için Reserpine iyi çalışır. Ancak, diğer hücre hatları için farklı engelleyiciler daha iyi çalışabilir.
İkincisi Hoechst 33342 konsantrasyonudur. Temsili verilerin gösterdiği gibi Hoechst 33342'nin boyama konsantrasyonu azaldıkça SP hücrelerinin yüzdesi arttı. Bu fenomen boya alımı kinetiği ile açıklanabilir24. Boya konsantrasyonundaki değişiklikler hoechst 33342'nin hücrelerde zenginleştirilmesini etkiler. Bu nedenle Hoechst 33342 boyama konsantrasyonu SP test sonuçları ile yakından ilişkilidir. Ayrıca Hoechst 33342'nin alınması ve atılması hücre tipleri arasında değişiklik göstermektedir. Bu nedenle, SP analizinden önce farklı hücre hatları için hoechst 33342'nin uygun konsantrasyonlarının araştırılması gerekir.
Üçüncüsü, SP analizi için de kritik olan akış sitometresinin iyi bir değişim katsayısıdır(CV). UV lazer gücü daha iyi CV'ler için önemli bir kriterdir12. Bu protokol, SP testini gerçekleştirmek için ticari akış sitometresi (bkz. Malzeme Tablosu)kullanır. Bu cuvette-flow-cell cihazında, en iyi CV'leri elde etmek için 15 mW gücünde UV lazer kullandık. Genel olarak, nispeten yüksek bir UV lazer gücü en uygun CV'leri sağlar. Örneğin, 50–100 mW, jet-in-air cihazlarında en uygun Hoechst sinyalini sağlar12. Bazı lazerler daha düşük UV gücü sağlar ve bu da CV'leri azaltabilir. Bu durumlarda, iyi lazer hizalaması kritik öneme sahiptir.
Sonuncusu, deney sırasında diğer faktörlerin etkisidir. Hücre durumu, sıcaklık, lekeleme zamanı, akış sitometrisinin çalışması ve diğer faktörler de SP testinin oranını ve kalitesini etkileyebilir. Örneğin, hücre süspansiyonlarının hazırlanması sırasında hücre canlılığındaki değişiklikler SP hücrelerinin oranını etkileyecektir. Bu nedenle, SP analizi yapmadan önce en iyi deneysel koşulların araştırılması gerekir. Yukarıdaki faktörler göz önüne alındığında, farklı laboratuvarlar tarafından ölçülen aynı hücre hattının SP oranı farklı olabilir. Örneğin, MDA-MB-231 ve A549 hücrelerinin oranlarının sırasıyla ~%0,1–%4,826,27,28,29ve ~%0,8–%1830,31,32,33,34olduğu bildirilmiştir.
Araştırmacılar bu tahlilleri, diğer tümör hücre hatlarının veya birincil hasta kaynaklı tümör hücrelerinin incelenmesi gibi farklı uygulamalar için değiştirebilirler. Protokol test edilen hücreler için iyi çalışmazsa, araştırmacılar MDA-MB-231 hücrelerini pozitif kontrol olarak kullanabilir ve verilen spesifikasyonları izleyen hücreleri lekeleyebilirler. Bu protokol Hoechst 33342 konsantrasyonuna, boyama sıcaklığına ve zamanına vb. Birçok insan tümör hücre hattında SP yüzdesi nispeten düşüktür (~ %0–%37)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Aşırı yüksek veya düşük oranda SP görülürse, bunun nedeni hoechst 33342 veya kullanılan engelleyicinin uygunsuz konsantrasyonları olabilir. Sorun akış sitometresi ile ilgili gibi görünüyorsa, teknik destek alınmalıdır.
CSC'leri analiz etmek ve ayırmak için SP kullanımı son derece verimli olsa da, yine de belirli sınırlamaları vardır. Birincisi, boyama koşullarına karşı yüksek hassasiyeti12. Hoechst 33342 konsantrasyonu, hücre durumu, sıcaklık, lekelenme süresi, akış sitometrisinin çalışması ve engelleyici seçimi gibi birçok faktör SP analizinin kalitesini etkileyebilir. İkincisi Hoechst 33342'nin sitotoksik etkisidir. Hoechst 33342 DNA bağlayıcı bir boyadır, ancak yüksek konsantrasyonlara ulaştığında hücreler için toksiktir ve böylece hücre aktivitesini azaltır37.
Özetle, SP analizi tümör hücre hatlarındaki CSC'leri tanımlamak ve arındırmak için son yıllarda en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Yöntemin bazı sınırlamaları olmasına rağmen, belirli CSC yüzey işaretçilerinin yokluğunda, CSC'lerin kullanışlı, hızlı ve uygun maliyetli zenginleştirilmesi için hala bir yöntemdir. Bu yöntem, CSC'lerin biyolojik fonksiyonlarının incelenmesi ve belirli yüzey belirteçlerinin tanımlanması için faydalıdır. Ayrıca, çeşitli sinyallerin tümör hücrelerinin SP oranı üzerindeki etkilerini tespit ederek, bu sinyal yollarının CSC özellikleri üzerindeki düzenleyici etkisine dair ipuçları sağlayabilir ve sonuçta tümörlerin hedeflenen tedavisine rehberlik edebilecek yeni mekanizmaların keşfini kolaylaştırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin doğa bilimleri vakfı tarafından finanse edildi 81572599, 81773124 ve 81972787; Tianjin Şehri Doğa Bilimleri Vakfı (Çin) 19JCYBJC27300; Tianjin Halk Hastanesi & Nankai Üniversitesi İşbirlikçi Araştırma Hibesi 2016rmnk005; Nankai Üniversitesi Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları 63191153.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
