Summary
Presentiamo un metodo che combina la purificazione delle proteine della membrana e la ricostituzione in peptidi in un'unica fase cromatografica. Gli scaffold biotinylati vengono utilizzati per l'attaccamento diretto della superficie e la misurazione delle interazioni proteina-ligando tramite interferometria biostrato.
Abstract
Le proteine della membrana, inclusi trasportatori, canali e recettori, costituiscono quasi un quarto del proteoma cellulare e oltre la metà degli attuali bersagli farmacologici. Tuttavia, un ostacolo importante alla loro caratterizzazione e sfruttamento in ambienti accademici o industriali è che la maggior parte delle strategie di screening biochimico, biofisico e farmacologico richiedono che queste proteine siano in uno stato solubile in acqua. Il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato il peptidisc, un mimetico a membrana che offre un approccio "uniforme" al problema della solubilità delle proteine della membrana. Vi presentiamo qui un protocollo semplificato che combina la purificazione delle proteine e la ricostituzione del peptidisco in un'unica fase cromatografica. Questo flusso di lavoro, chiamato PeptiQuick, consente di bypassare la dialisi e l'incubazione con perline di polistirolo, riducendo notevolmente l'esposizione al detersivo, la denaturazione delle proteine e la perdita del campione. Quando PeptiQuick viene eseguito con scaffold biotinylati, la preparazione può essere collegata direttamente alle superfici rivestite di streptavidina. Non c'è bisogno di biotinyare o modificare il bersaglio della proteina della membrana. PeptiQuick è mostrato qui con il recettore della membrana FhuA e la colica liganda antimicrobica M, utilizzando l'interferometria biostrato per determinare la cinetica precisa della loro interazione. Si conclude che PeptiQuick è un modo conveniente per preparare e analizzare le interazioni proteina-ligando della membrana entro un giorno in un ambiente privo di detersivo.
Introduction
Le proteine della membrana sono spesso escluse dai programmi di ricerca sulla scoperta di farmaci o anticorpi a causa della propensione delle proteine della membrana ad aggregarsi al di fuori dell'ambiente bistrato lipidico, soprattutto in presenza di detergenti1. Pertanto, negli ultimi anni, sono stati sviluppati diversi mimetici a membrana (definite scaffold) per facilitare l'isolamento e l'interrogatorio delle proteine della membrana in un ambiente completamente privo di detergenti (ad esempio, nanodischi, SMALP, anfipoli, ecc.) 2,3,4,5,6. Tuttavia, la ricostituzione delle proteine della membrana in questi mimetici spesso richiede un'ampia ottimizzazione, che richiede tempo e generalmente accompagnata da perdita di recupero proteico7,8. Per superare queste limitazioni, il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato una formulazione "one-size-fits-all" nota come peptidisc9. Il peptidisco si forma quando più copie di un designer 4.5 kDa peptide bihelical anfipatico si legano alla superficie idrofobica di una proteina membrana bersaglio. La ricostituzione stabile nel peptidisco avviene dopo la rimozione del detergente, intrappolando sia i lipidi endogeni che le proteine della membrana soluttiva in particelle solubili in acqua. Queste particelle stabilizzate sono ora suscettibili di numerose applicazioni a valle.
Il metodo peptidisc offre diversi vantaggi; per esempio, la ricostituzione è semplice, poiché il legame dell'impalcatura del peptidisco sul bersaglio è guidato dal modello proteico stesso9,10. La stoichiometria del peptide è anche autodeterminata e l'aggiunta di lipidi esogeni non è necessaria. La formazione di peptidi di peptidi provochi per semplice diluizione detergente, un importante vantaggio rispetto alla dialisi o all'adsorptioni su perline di polistirolo, che spesso si traducono in una bassa resa proteica a causa dell'associazione di superficie non specifica e dell'aggregazione11,12 ,13. L'assemblaggio finale del peptidisco è altamente termostabile e invariabilmente solubile in diversi cuscinetti o in presenza di cation divalenti (ad es., Ni2 .). Anche la purezza e l'omogeneità strutturale dell'impalcatura sono elevate (ad esempio, endotossina-free), e il peptide può essere personalizzato con gruppi funzionali posizionati in posizioni diverse.
Vi presentiamo qui un flusso di lavoro di laboratorio chiamato PeptiQuick, noto anche come on-perline ricostituzione9. Questo protocollo combina la purificazione delle proteine della membrana e la ricostituzione del peptidisco in un unico passaggio e sullo stesso supporto cromatografico. Come indica il nome, PeptiQuick è rapido rispetto ad altri metodi di ricostituzione, e riduce anche seriamente il tempo di esposizione al detersivo. Gli effetti negativi del detersivo, come lo sviluppo e l'aggregazione delle proteine, si verificano spesso in modo dipendente dal tempo; pertanto, ridurre al minimo l'esposizione al detersivo è fondamentale per mantenere la conformazione proteica nativa14,15. Questo è fondamentale per l'accuratezza dei metodi che riportano sulle interazioni proteiche e sulle affinità leganti.
Durante lo sviluppo di questo protocollo, presentiamo la nuova versione biotinylata dello scaffold peptidisce, chiamato Bio-Peptidisc. I gruppi funzionali della biotina consentono l'attaccamento della proteina della membrana bersaglio su superfici rivestite di streptavidina. Poiché l'etichettatura della biotina è limitata allo scaffold, i siti di legame sulla proteina della membrana bersaglio rimangono inalterati. Utilizzando il biopeptidisc, la cinetica legante del recettore della membrana batterica FhuA e la colicina peptide antimicrobica M (ColM) sono determinati16. Questa affinità viene misurata tramite l'interferometria del biostrato (BLI), che analizza le interazioni in tempo reale in base ai modelli di interferenza della luce bianca riflessi da una punta del sensore.
Utilizzando questo protocollo, viene eliminata la necessità di detersivo durante l'analisi BLI, che è uno sviluppo importante, poiché i detergenti possono interrompere le interazioni. Le affinità di legame possono essere misurate rapidamente con questo metodo e i risultati sono paragonabili a quelli riportati in precedenza utilizzando nanodischi e calorimetria di titola isotermica (ITC)16. I passaggi critici del flusso di lavoro PeptiQuick sono mostrati e discussi, come la preparazione delle proteine, la diluizione del detersivo, l'aggiunta di peptidi e la ricostituzione, insieme a suggerimenti per risolvere i problemi di ligando e analita nel saggio BLI. Utilizzando il flusso di lavoro PeptiQuick, si scopre che le proteine della membrana possono essere catturate in peptidiscs e le loro interazioni misurate in un giorno.
Protocol
1. Preparazione e solubilità del recettore della membrana FhuA
- Esprimereil suo 6-tagged FhuA in Escherichia coli ceppo AW740. Coltivare le cellule per 18 h a 37 gradi centigradi nei supporti M9 (Tabella 1). Vedere Mills et al.16 per un protocollo di espressione dettagliato.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione (5.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi) e sospenderle in 50 mL di tampone Tris-salt-glicerol (TSG) (Tabella 1). Dounce le cellule risospese e aggiungere fenilmetanosulfonylfluoride (PMSF) ad una concentrazione finale di 1 mM appena prima della lisi.
AVVISO: il PMSF è tossico e corrosivo. - Lyse le cellule utilizzando un microfluidizzatore (tre passaggi) a 15.000 psi o una stampa francese (tre passaggi) a 8.000 psi. Pellet le cellule non adimensionali e altro materiale insolubile per centrifugazione a bassa velocità (5.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi).
- Ultracentrifuga il supernatante (200.000 x g, 40 min, 4 gradi centigradi) per isolare la frazione di membrana grezza. Scartare il supernatante, riutilizzare il pellet a membrana in una quantità minima di tampone TSG, e far rimbalzare utilizzando un apparato douncer di vetro o metallo per garantire l'omogeneità.
- Eseguire un saggio di Bradford per controllare la concentrazione proteica della membrana grezza risospesa. Diluire la membrana grezza ad una concentrazione finale di 3 mg/mL utilizzando buffer TSG prima della solubilità.
- Aggiungere il detergente Triton X-100 ad una concentrazione finale dell'1% (v/v) per solubilizzare selettivamente la membrana interna batterica per 1 h a 4 gradi centigradi con un leggero dondolo. Pellet il materiale insolubile (frazione di membrana esterna) per ultracentrifugazione (200.000 x g, 40 min, 4 gradi centigradi).
- Scartare il supervolontario contenente la membrana solubile e risospendere il pellet in TSG per una concentrazione finale di 3 mg/mL. Aggiungere l'ossido di laurildimethylamine (LDAO) a una concentrazione dell'1% (v/v) alla frazione di membrana esterna risospesa e solubilizzare per 1 h a 4 gradi centigradi con dondolo delicato.
- Eseguire un passo di centrifugazione finale per pellet tutto il materiale insolubile (200,000 x g, 40 min, 4 .
NOTA: Il supernatante risultante contiene le proteine della membrana esterna solubilificate, incluso il bersaglio con l'etichetta FhuA.
2. Purificazione e ricostituzione di FhuA utilizzando il flusso di lavoro PeptiQuick
- Pre-equilibrate una colonna Ni-NTA preconfezionata (volume di resina da 5 mL) con due volumi di colonna di cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC) buffer di lavaggio (Tabella 1).
- Diluire la membrana esterna solubile dall'1% di LDAO allo 0,04% di LDAO utilizzando TSG. Quindi, aggiungere imidazolo ad una concentrazione finale di 5 mM.
PROCEDIMENTO: L'Imidazolo è tossico e corrosivo. - Caricare le proteine della membrana esterna solubilificate sulla resina Ni-NTA e raccogliere il flusso attraverso. Ricaricare il flusso attraverso la resina per aumentare il legame di resina di FhuA e raccogliere il flusso secondario attraverso.
NOTA: Mantenere un 20 - l'lundi di materiale soluttizzato come riferimento per l'analisi successiva di elettroforesi da solfato di sodio dodecyl (SDS-PAGE). - Lavare la resina con 250 mL di tampone di lavaggio IMAC e raccogliere i primi 50 mL di eluato. Scolare il buffer di lavaggio all'altezza del volume del letto di resina e chiudere il tappo sulla colonna.
- Aggiungere 1 mL di soluzione concentrata di peptide Biopeptidisc 10 mg/mL (Tabella 1) alla colonna. Aggiungere 50 mL di diluire 1 mg/mL Nella soluzione di peptide Bio-Peptidisc in TSG e mescolare la resina con un'asta di vetro per risospendere le perline in TSG.
- Dopo l'intrappolamento del peptidisco, lasciare che la resina si stabilizzi e drenare la soluzione bio-peptidisca in eccesso di 1 mg/mL attraverso la resina.
- Lavare le particelle peptidisce attaccate Ni-NTA con 50 mL di TSG. Eluire le particelle di peptidisco con 15 mL di tampone di eluizione IMAC (Tabella 1) contenenti 600 mM di imidazolo in TSG. Raccogliere 1 mL di frazioni e aggiungere immediatamente 10 .L of 0.5 M EDTA per chelare gli ioni di nichel lisciviati.
AVVISO: L'EDTA è un irritante.
3. Valutazione della ricostituzione di PeptiQuick
- Analisi SDS-PAGE
- Caricare 10 aliquote del materiale di partenza, flusso, lavaggio(e) e frazioni eluite dalla ricostituzione PeptiQuick su un gel e un 12% di gel di denaturazione SDS per 30 min ad una corrente costante di 60 mA.
- Macchiare il gel con Coomassie tintura blu, demacchiare il gel, e visualizzare su uno scanner.
- Cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC)
- Sulla base dell'analisi 12% SDS-PAGE della ricostituzione PeptiQuick, isolare e mettere in comune le frazioni rilevanti, e concentrarle utilizzando un concentratore centrifugo cut-off da 30 kDa.
NOTA: Nel video di accompagnamento, le frazioni F3–F7 sono raggruppate e concentrate sotto 1 mL (il volume del loop di iniezione sullo strumento SEC). - Iniettare 1 mL delle frazioni di eluizione IMAC raggruppate su una colonna di filtrazione gel S200 (300/10) a una velocità di flusso di 0,25 mL/min nel buffer TSG. Raccogliere 1 mL frazioni ed eseguirle su un 12% gel SDS per determinare quali frazioni SEC da raggruppare e concentrarsi.
NOTA: Le frazioni PeptiQuick eluite possono essere raggruppate senza concentrazione, e un'aliquota può essere iniettata sulla SEC per verificare la qualità della ricostituzione. Si tratta di un controllo importante per le proteine della membrana potenzialmente sensibili all'aggregazione durante la concentrazione centrifuga.
- Sulla base dell'analisi 12% SDS-PAGE della ricostituzione PeptiQuick, isolare e mettere in comune le frazioni rilevanti, e concentrarle utilizzando un concentratore centrifugo cut-off da 30 kDa.
4. Interferometria Biolayer
- Configurazione sperimentale BLI
- Impostare la piastra 96 pozzo a mano.
NOTA: Tutti i pozzetti sono riempiti ad un volume finale di 200 L. - Nella colonna 1, file A-E, caricare 200 l di tampone cinets per consentire alle punte di eclitare e formare un segnale di base.
- Diluire il ligando (FhuA in biopeptidisc) a una concentrazione di 2,5 g/mL nel tampone cinetico (tabella 1). Caricare 200 l di questa diluizione nelle file A-D nella colonna 2.
- Aggiungere 200 l di tampone cinetiche solo a E2 (il sensore di riferimento).
- Aggiungete 200 l di tampone cinetici alla colonna 3, righe A-E per lavare l'eccesso di FhuA dalla punta.
- Nella colonna 4, condurre diluizioni seriali bidimensionali dell'analita (ColM) lungo la piastra da A4 a D4. Iniziare con 28 nM (8 Kd) in A4 a 3.5 nM (1Kd) in D4.
- Aggiungere 28 nM ColM a E4 per misurare per l'associazione non specifica (utilizzata la più alta concentrazione ColM).
- Aggiungete 200 l di buffer cinetici alla colonna 5, righe A.
NOTA: Qui, il ColM si dissocia dalla punta e la dissociazione viene misurata. - Posizionare la piastra di configurazione nello strumento BLI.
- Posizionare il vassoio delle punta del sensore nello strumento BLI.
- Aprire il software di acquisizione dati BLI e selezionare Nuovo esperimento Kinetics nella procedura guidata del software.
- Utilizzare la scheda di definizione della piastra per inserire il layout della piastra 96 bene nel software.
NOTA: I pozze contenenti il ligando, FhuA vengono inseriti come "Carica". I pozzi contenenti solo buffer vengono immessi come "Buffer". I pozzi contenenti l'analita, ColM, vengono immessi come "Sample". - Utilizzare la scheda Definizione assaggio per definire la durata e la velocità di rotazione della piastra per ogni fase dell'esperimento.
NOTA: I passaggi sperimentali sono impostati come: 1) linea di base: 60 s; 2) carico: 250 s; 3) linea di base2: 300 s; 4) associazione: 450 s; e 5) dissociazione: 900 s. Lasciare la velocità di agitazione come default (1.000 rpm). I passaggi precedenti vengono assegnati singolarmente a ogni colonna della piastra di 96 pozzo selezionando il passo desiderato e fare clic con il pulsante destro del mouse su Aggiungi passo di saggio in ogni colonna. - Assegnare il primo passaggio facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla prima colonna e selezionare Avvia nuovo modello. Assicurarsi che il passaggio di base sia assegnato correttamente utilizzando la finestra in basso a destra e modificare con il menu a discesa in base alle esigenze.
- Assegnare i passaggi successivi a ogni colonna facendo clic con il pulsante destro del mouse lungo la piastra e selezionando Aggiungi passo di esercizio. Assegnare questi alla colonna appropriata, come impostato nel passaggio 4.1.13.Assign these to the appropriate column, as set in step 4.1.13.
- Utilizzare la scheda di assegnazione del sensore per assicurarsi che lo strumento di ottetta prenda i pin BLI dalla posizione corretta nel vassoio del sensore.
NOTA: nella scheda di assegnazione del sensore, solo A1-E1 deve essere evidenziato in blu. Assicurarsi che la punta del sensore sia presente in queste posizioni nel vassoio del sensore e che l'F1-H1 sia vuoto. - Evidenziare F1-H1 sullo schermo, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Rimuovi per contrassegnarli come vuoti. Selezionare Sostituire i sensori nel vassoio dopo l'uso per mantenere i sensori utilizzati.
- Nella scheda Dell'esperimento di revisione, che fornisce una panoramica finale dell'esperimento prima dell'esecuzione, esaminare i passaggi sperimentali per verificare che l'intera configurazione sia corretta.
- Nella scheda Esegui esperimento, selezionare un percorso di file per salvare i file del metodo.
- Modificare la temperatura della piastra alla temperatura ambiente.
- Selezionare GO per eseguire l'esperimento.
- Impostare la piastra 96 pozzo a mano.
- Analisi dei dati BLI
- Aprire il software di analisi dei dati BLI di Ottetto.
- Utilizzare la scheda di selezione dei dati per individuare l'esperimento e controllare il riepilogo sperimentale. Importare il file di progetto dal percorso di salvataggio definito durante il passaggio 4.1.19.
- Immettere le concentrazioni dell'analita (qui, ColM) selezionando le informazioni del sensore per ogni esperimento.
- Assegnare la punta in E1 come suggerimento di riferimento.
- Utilizzare la scheda di elaborazione per sottrarre il segnale di riferimento (E1) dai dati sperimentali. Controllare i dati non elaborati dal suggerimento di riferimento per l'associazione di analita non specifica. Se non viene osservato, procedere.
NOTA: si tratta di un importante controllo negativo. Se si osserva un binding non specifico, questo verrà contabilizzato nel passaggio 4.2.7.If nonspecific binding is observed, this will be accounted for in step 4.2.7. - Allineare l'asse y al secondo passo della linea di base. Non spuntare la connessione a interpassaggio. Selezionare Filtro Savitzky-Golay. Selezionare Elabora dati!.
- Nella scheda Analisi, selezionare i dati sperimentali nella tabella sotto il grafico per vedere le curve di associazione e dissociazione con il segnale dal sensore di riferimento sottratto.
- Selezionare il modello di rilegatura 1:1 e selezionare un adattamento parziale della curva. Selezionare Adatta curve!.
- Analizzare il grafico della vista residua per controllare il raccordo della curva.
- Scorrere la tabella per visualizzare il Kdcalcolato.
- Selezionare Salva rapporto... per salvare un documento di foglio di calcolo che descrive in dettaglio l'impostazione, i grafici dei dati non elaborati e analizzati e le costanti di dissociazione calcolate.
Representative Results
Il recettore della membrana FhuA è espresso in un ceppo E. coli di laboratorio. La frazione di membrana esterna viene raccolta dalla centrifugazione e le proteine sono solubilificate utilizzando un'estrazione del detergente in due fasi. Le proteine della membrana soluluttate vengono caricate su perline di agarose Ni-NTA confezionate in una colonna di plastica, seguite dal flusso di lavoro PeptiQuick presentato nel protocollo. Dopo un controllo di qualità che utilizza la cromatografia a esclusione di dimensioni, le particelle di Biopeptidisc sono immobilizzate su perni rivestiti di streptavidina. L'analisi BLI è condotta per misurare la cinetica delle interazioni tra FhuA e ColM. La panoramica schematica di questo esperimento è presentata nella Figura 1.
Un gel SDS viene eseguito per determinare la qualità della ricostituzione dopo l'eluizione delle particelle FhuA Bio-Peptidisc dalla colonna IMAC (Figura 2). Le frazioni corrispondenti all'inizio, al flusso, agli washe e alle frazioni di eluizione vengono caricate sul gel SDS per valutare il successo del metodo PeptiQuick. L'esaurimento di FhuA nella frazione flowthrough è correlato con un arricchimento nelle frazioni di eluizione, il che indica che la purificazione della proteina è stata efficace. Piccole bande proteiche contaminanti sono osservate nelle frazioni eluite. L'analisi del gel SDS viene utilizzata per determinare quali frazioni devono essere raggruppate prima dell'analisi SEC. Un gel nativo delle particelle FhuA Bio-Peptidisc eluite viene anche eseguito per confermare la solubilità FhuA (Figura supplementare 1). La migrazione della proteina ricostituita nel gel nativo indica la solubilità delle proteine in un ambiente privo di detersivo.
L'analisi SEC viene eseguita per valutare la solubilità delle particelle peptidisco. Il cromatogramma presentato nella Figura 3A mostra un singolo picco simmetrico che si avvicina a circa 14 mL (6 mL oltre il volume vuoto di 8,0 mL sulla filtrazione gel S200 10/300 colonna). La posizione di questo picco, oltre il volume vuoto, conferma la solubilità delle particelle FhuA Bio-Peptidisc. Per riferimento, la figura 3B illustra una preparazione teorica di peptidisco non ottimale. In questo caso, il cromatogramma mostra un picco proteico maggiore eluire al volume vuoto, indicando la presenza di aggregati proteici. Il picco più piccolo elusionare appena oltre il picco peptidisc principale corrisponde a peptidi peptidi eccesso.
L'interazione di FhuA con l'analita ColM viene determinata dopo l'attaccamento dei peptidiscs ai sensori rivestiti streptavidin. Le punte del sensore vengono prima equilibrate nel buffer cinetico, quindi trasferite in tampone contenente i Bio-PeptidiscF FhuA. La concentrazione dei Bio-Peptidi FhuA e il periodo di tempo per il quale vengono incubati con la punta sono ottimizzati prima di questo esperimento (Figura supplementare 1). Seguendo le fasi di caricamento e lavaggio, la fase di associazione misura le interazioni tra le punte caricate e quattro diverse concentrazioni di colica M. Il successivo movimento delle punte nel buffer si traduce in dissociazione, che viene misurata dallo spostamento della lunghezza d'onda della luce bianca che si riflette sulla punta.
Nella figura 4A viene visualizzato l'output del sensorgramma dei dati non elaborati di questo esperimento. Tutte le tracce appaiono uniformi nei passaggi di carico e di base, ad eccezione della traccia di riferimento in giallo. Il suggerimento di riferimento non ha ligando caricato, ma è esposto all'analita per ansay per l'associazione non specifica, che è un importante controllo negativo. Per un'analisi più dettagliata dei risultati, il segnale dal suggerimento di riferimento viene sottratto dalle tracce per le punte sperimentali per tenere conto dell'associazione non specifica. I dati sono allineati all'inizio del passaggio di associazione per consentire un confronto visivo diretto, come illustrato nella Figura 4B. Questo confronto mostra un aumento dello spostamento della lunghezza d'onda per l'aumento delle concentrazioni di colica M. La curva è adatta ai dati e presenta un modello di rilegatura 1:1 classico.
Il grafico di visualizzazione residua (Figura 4B, in basso), che descrive le differenze tra i dati di raccordo e sperimentale, mostra che il raccordo per la più alta concentrazione di ColM (28 nM) è scarso rispetto alle tre concentrazioni inferiori. Il profilo della curva stessa manca dell'altopiano della curva di rilegatura, che è caratteristico della saturazione del sito di rilegatura in un tipico esperimento di rilegatura. La mancanza di altopiano suggerisce un legame eterogeneo, che è probabilmente un artefatto dell'alta concentrazione di ColM. Questa più alta concentrazione di ColM è quindi scontata dall'analisi, e le altre tre concentrazioni vengono utilizzate per determinare la costante di dissociazione (Figura 4C,D). Un test t-testdi uno studente a due code, a un livello di confidenza del 95%, ha rilevato che la costante di dissociazione osservata da questo esperimento non è significativamente diversa dai valori ottenuti utilizzando tecniche diverse (Figura 4E)16.
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro PeptiQuick mediante biopeptidiscs e analisi BLI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi del gel SDS (12%) di inizio, flusso, lavaggio e frazioni di eluizione raccolte attraverso il flusso di lavoro PeptiQuick. Circa 10 l di campione è stato caricato in ogni corsia e la corsa per 30 min ad una corrente costante di 60 mA. Il gel è stato macchiato di blu Coomassie, destained, e visualizzato su uno scanner di gel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Profili SEC sperimentali e teorici che rappresentano rispettivamente ricostituzioni ottimali e non ottimali. (A) Il profilo sperimentale SEC di PeptiQuick ha ricostituito FhuA (82 kDa) in Bio-Peptidiscs. Le frazioni di eluizione dell'IMAC F3-F7 sono state raggruppate e concentrate utilizzando un concentratore centrifuga di taglio da 30 kDa a 1 mL. Questo campione concentrato è stato iniettato a 0,25 mL/min su una colonna di filtrazione gel S200 (10/300) nel buffer TSG. (B) Profilo teorico SEC di una ricostituzione PeptiQuick non ottimale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Indagine sulle interazioni ColM con FhuA ricostituita in Bio-Peptidiscs. (A) Sensorgramma sensore di dati grezzi con traccia del sensore di riferimento in giallo. (B, C) In alto: passaggi di associazione e dissociazione con raccordo parziale della curva di rilegatura 1:1. In basso: viste residue che rappresentano la differenza tra dati sperimentali e raccordo computazionale. (C) Ristampa di (B) con l'esclusione della più alta concentrazione di ColM. (D) Tassi di associazione e dissociazione osservati (rispettivamente kon e koff, ) e le costanti di dissociazione (Kd). (E) Confronto delle costanti di dissociazione FhuA-ColM ottenute da peptidisc e BLI (in questo esperimento), termoforesi peptidisc e microscala (Saville, dati inediti) e calorimetria di titore nanodisco e isotermiche16. Le barre di errore rappresentano un SD di incertezza, mentre n.s. non indica alcuna differenza significativa al livello di confidenza del 95%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| M9 Supporti (per litro) |
| 200 mL di sale M9 |
| 800 mL dH2O |
| 10 mL 40% Glucosio |
| 80 L L 1 M CaCl2 |
| 2,5 mL 1 M MgSO4 |
| 300 l 15 mg/mL di tiamina |
| TSG Buffer |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% Glicerolo |
| Buffer di lavaggio IMAC |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% glicerolo |
| 0.04% LDAO |
| 5 mM Imidazolo |
| Soluzione Bio-Peptidisc |
| Sciogliere il Bio-Peptidisc pronto all'uso (>95% purezza) in sterile dH2O. La concentrazione e il volume della soluzione peptide dipende dal passo nel processo di ricostituzione. |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| 50 mM NaCl |
| NOTA: Questo stock di peptidi bio-Peptidisc è stabile a 4 gradi centigradi per oltre un mese. |
| Buffer di eluzione IMAC |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| 50 mM NaCl |
| 10% Glicerolo |
| 600 mM Imidazolo |
| Buffer Cinetica |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| 50 mM NaCl |
| 0,002% Tween-20 |
| 0,1% BSA |
Tabella 1: Ricette per la preparazione di media e soluzioni.
Supplementari Figura 1: 4%–16% analisi gel nativo chiaro delle frazioni di eluizione raccolte dal flusso di lavoro PeptiQuick. Circa 10 l di campione è stato caricato in ogni corsia e ha funzionato per 40 min ad una corrente costante di 30 mA. Il gel è stato macchiato di coomassie blu, destained, e visualizzato su uno scanner. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 2: Ottimizzazione della concentrazione di ligando utilizzando un singolo perno. (A) Le sei diverse concentrazioni di FhuA in biopeptidisctestato per il legame ad un singolo perno rivestito streptavidin. Questo è stato impostato in una piastra 96 pozzo con buffer nei pozzi tra le concentrazioni di ligando (vedi File supplementare 1 per il protocollo di installazione). (B) Sensorgramma dei dati grezzi per l'esperimento di ottimizzazione del ligando. Il perno dà la risposta più grande e raggiunge inoltre la saturazione al numero di concentrazione 4 (o 2,5 g/mL). Clicca qui per scaricare questa figura.
File supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Discussion
Mentre i detergenti rimangono il metodo più semplice per estrarre e purificare le proteine della membrana, questi surfactants possono avere molti effetti indesiderati sulla stabilità delle proteine, sulla funzione e sulle analisi a valle1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Queste difficoltà hanno motivato lo sviluppo di mimetiche a membrana, che si sforzano di ridurre al minimo la presenza di detergenti e replicare l'ambiente nativo della membrana il più possibile2,3,4 ,5,6. La maggior parte dei metodi di ricostituzione, tuttavia, richiede un'ottimizzazione significativa delle condizioni di ricostituzione e spesso richiedono ulteriori fasi di purificazione, che riducono il rendimento finale7,8. Il peptidisc si adatta spontaneamente alla proteina della membrana bersaglio e relativamente, richiede poca ottimizzazione e purificazione a valle9,10. In questo protocollo, PeptiQuick è presentato come un semplice mezzo per semplificare il protocollo di ricostituzione per l'analisi a valle dell'interazione proteina-proteina.
Anche se semplici, ci sono diversi avvertimenti sperimentali che possono portare a una ricostituzione senza successo. Tra questi, il più comune è dovuto all'aggregazione delle proteine. È quindi fondamentale eseguire la cromatografia di esclusione delle dimensioni per monitorare il processo di ricostituzione. Ad esempio, un picco di esclusione di dimensioni che si eluisce al volume vuoto è indicativo di aggregati proteici (Figura 3B)17,18. Gli aggregati proteici di membrana si formano in genere in base all'esposizione prolungata a condizioni detergenti non ottimali prima della ricostituzione. In particolare, è stato scoperto che le proteine della membrana nel detersivo tendono a formare aggregati quando concentrate dall'ultrafiltrazione su dispositivi centrifughi. In questo caso, le proteine sensibili della membrana possono essere concentrate utilizzando l'ultra-filtrazione del vuoto, un metodo di concentrazione più delicato e più omogeneo poiché l'assorbimento delle proteine al filtro è diminuito.
In generale, per evitare la concentrazione di proteine, le frazioni eluite di IMAC dovrebbero essere raggruppate e una colonna di esclusione di dimensioni iniettata in una colonna di esclusione delle dimensioni per verificarne la qualità di ricostituzione. Va notato che non incorporato eluito peptide libero subito dopo il picco principale peptidisc (Figura 3B). L'impalcatura libera non ostacola necessariamente gli esperimenti a valle. Tuttavia, se necessario, questo eccesso può essere rimosso dalla cromatografia di esclusione di dimensioni. In alternativa, aumentare il volume di lavaggio durante la ricostituzione e prima dell'eluizione dalla resina IMAC è sufficiente per rimuovere efficacemente la maggior parte del peptidio peptidisco libero. Pertanto, la cromatografia di esclusione delle dimensioni è raccomandata come mezzo rapido e semplice per controllare la qualità della ricostituzione.
L'esperimento BLI richiede un'attenta ottimizzazione delle concentrazioni di ligando e analita. L'associazione del ligando deve essere sufficiente per ottenere un segnale chiaro, ma il sovraccarico causerà la saturazione del segnale, che si traduce in artefatti di dati provenienti dal sovraffollamento e ostacoli sterici sulla superficie della punta. Pertanto, sia la concentrazione del ligando che la durata del tempo che la mancia trascorre nella soluzione di ligando devono essere ottimizzate per ogni campione di proteine (Figura supplementare 2). Anche la concentrazione di analita deve essere ottimizzata. Se la costante di dissociazione è nota, questo passaggio diventa più facile, poiché l'intervallo di concentrazione può essere approssimato. Un buon punto di partenza per questa analisi è l'utilizzo di concentrazioni proteiche comprese tra 0,1 e 20 volte il Kd19previsto.
Dopo l'acquisizione dei dati BLI, è necessario eseguire un'attenta analisi dei dati per evitare interpretazioni errate. Il calcolo della costante di dissociazione dipende dall'adattamento di una curva di rilegatura. A meno che la stoichiometria di legame non sia già nota, per il montaggio iniziale deve essere utilizzato un modello di interazione bimolecolare 1:1 classico. Va notato che una curva di rilegatura eterogenea è spesso il risultato di artefatti e comportamenti non ideali causati da un'elevata concentrazione di analiti, che può essere erroneamente interpretata come un modello di legame complesso. Pertanto, abbassare la concentrazione di analita fino a quando il profilo del sensorgramma non visualizza la stoichiometria di rilegatura 1:1 può aiutare a differenziare l'associazione eterogenea dalle interazioni più complesse. Tutti i dati di associazione eterogenei residui vengono quindi scontati come illustrato nella figura 420.
In questo rapporto, viene misurata una costante di dissociazione di 2,28 x 0,74 nM per l'interazione FhuA-ColM. Questo valore è coerente con la costante di dissociazione precedentemente determinata nel nostro gruppo con nanodisco o peptidisc utilizzando ITC o MST, rispettivamente (Figura 4E)16. Questa consistenza fornisce fiducia sulla ricostituzione del peptidisco e l'analisi BLI come mezzo per determinare la cinetica di interazione. È importante sottolineare che le proteine sono solitamente immobilizzate su biosensori di streptavidina sia attraverso il cross-linking chimico della biotina che l'aggiunta site-specific utilizzando l'E. coli biotinli BirA21. Evidentemente, biotinyalare lo scaffold peptidisce, invece della proteina della membrana bersaglio, ha molti vantaggi. La biotinylazione degli scaffold consente di risparmiare tempo e riduce al minimo la possibilità di interrompere importanti siti di legame proteico. Abbiamo anche scoperto che PeptiQuick è applicabile a un'ampia gamma di classi di target proteiche, tra cui i recettori accoppiati con proteina G (GRACR), i canali ionici e le proteine della membrana delle botti z. In generale, va notato che l'estratto iniziale di detergenti delle proteine della membrana in uno stato privo di aggregati è critico e che la ricostituzione immediata nel peptidisco diminuisce i problemi di aggregazione a valle. Data la semplicità, si prevede che PeptiQuick sarà esteso ad altri saggi di legame a base di streptavidin, come la risonanza del plasmone superficiale (SPR), i saggi ELISA e i pull-down di affinità utilizzando perline streptavidin.
Disclosures
FD è fondatore di Peptidisc Biotech per distribuire peptidi peptidi alla comunità accademica. Peptidisc Biotech collabora anche con aziende industriali di biotecnologie e farmacie per implementare il peptidisc nei loro flussi di lavoro di scoperta. La pubblicazione Open Access di questo articolo è stata sponsorizzata da FortéBio.
Acknowledgments
Ringraziamo il Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada. JS detiene una borsa di studio CGS-M CIHR. LT è stato sostenuto dalla Biotechnology and Biological Sciences Research Council, finanziata dalla South West Biosciences Doctoral Training Partnership ,20m, finanziata dalla Biotechnology and Biological Sciences Research Partnership [forma di riferimento per la formazione BB/M009122/1]. FD è una cattedra di ricerca di livello II Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | - |
| Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
| Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | - |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
| CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
| EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
| Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | - |
| Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
| Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
| Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
| MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
| Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
| Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | - |
| Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
| Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | - |
| Protein Assay Dye - Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration |
| Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
| Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
| Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | - |
| Thiamine | Merck | 69271 | - |
| Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
| Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
| Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
| Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | - |
References
- Rawlings, A. E. Membrane proteins: always an insoluble problem. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 790-795 (2016).
- Popot, J. L. Amphipols, Nanodiscs, and Fluorinated Surfactants: Three Non Conventional Approaches to Studying Membrane Proteins in Aqueous Solutions. Annual Review of Biochemistry. 79, 737-775 (2010).
- Lee, S. C., et al. A Method for Detergent-Free Isolation of Membrane Proteins in their Local Lipid Environment. Nature Protocols. 11, 1149-1162 (2016).
- Frauenfeld, J., et al. A Saposin-Lipoprotein Nanoparticle System for Membrane Proteins. Nature Methods. 13, 345-351 (2016).
- Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Assembly of Single Bacteriorhodopsin Trimers in Bilayer Nanodiscs. Archives of Biochemistry and Biophysics. 450, 215-222 (2006).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126, 3477-3487 (2004).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for Structural and Functional Studies of Membrane Proteins. Nature Structural, Molecular Biology. 23, 481-486 (2016).
- Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized Phospholipid Bilayer Nanodiscs Facilitate High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins. Journal of the American Chemical Society. 135, 1919-1925 (2013).
- Carlson, M. L., et al. The Peptidisc, A Simple Method for Stabilizing Membrane Proteins in Detergent-Free Solution. eLife. 7, 34085 (2018).
- Carlson, M. L., et al. Profiling the E. coli Membrane Interactome Captured in Peptidisc Libraries. eLife. 8, 46615 (2019).
- Serdakowski, A., et al. A novel method to determine residual detergent in biological samples post endotoxin reduction treatment and evaluation of strategies for subsequent detergent removal. International Immunopharmacology. 37, 16-22 (2016).
- Smith, S. M. Strategies for the Purification of Membrane Proteins. Protein Chromatography. 681, 485-496 (2011).
- Lin, S. H., Guidotti, G.
- Wolfe, A. J., Gugel, J. F., Chen, M., Movileanu, L. Kinetics of Membrane Protein-Detergent Interactions Depend on Protein Electrostatics. Journal of Physical Chemistry B. 122 (41), 9471-9481 (2018).
- Montigny, C., et al. Slow Phospholipid Exchange between a Detergent-Solubilized Membrane Protein and Lipid-Detergent Mixed Micelles: Brominated Phospholipids as Tools to Follow Its Kinetics. PLoS ONE. 12 (1), 0170481 (2017).
- Mills, A. T., Le H, T., Coulton, J. W., Duong, F. FhuA Interactions in a Detergent-Free Nanodisc Environment. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (1), 364-371 (2014).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Mahler, H. C., Friess, W., Grauschopf, U., Kiese, S. Protein aggregation: Pathways, induction factors and analysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (9), 2909-2934 (2009).
- FortéBio. Octet System Data Acquisition User Guide, Release 7.1. . , Available from: http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2014/01/Data-Acquisition-Octet.pdf (2014).
- FortéBio. Octet System Data Analysis User Guide, Release 7.1. . , Available from: http://www.biophysics.bioc.cam.ac.uk/wp-content/uploads/2011/02/Data-Analysis-Octet.pdf (2011).
- Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Research. 8, 135 (2019).
