Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

CryoAPEX-metoden til elektronmikroskopianalyse af membranproteinlokalisering i ultrastrukturelt bevarede celler

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

Denne protokol beskriver cryoAPEX-metoden, hvor et APEX2-mærket membranprotein kan lokaliseres ved transmissionselektronmikroskopi i optimalt bevaret celleultrastruktur.

Abstract

Vigtige cellulære begivenheder som signaltransduktion og membranhandel er afhængige af korrekt proteinplacering i cellulære rum. Forståelse af præcis subcellulær lokalisering af proteiner er derfor vigtigt for at besvare mange biologiske spørgsmål. Jagten på en robust etiket til at identificere protein lokalisering kombineret med tilstrækkelig cellulær bevarelse og farvning har været historisk udfordrende. Nylige fremskridt inden for elektronmikroskopi (EM) billeddannelse har ført til udvikling af mange metoder og strategier til at øge cellulære bevarelse og etiket mål proteiner. En forholdsvis ny peroxidase-baserede genetiske tag, APEX2, er en lovende leder i klonelige EM-aktive tags. Prøveforberedelse til mikromikroskopi af transmissionselektron (TEM) er også udviklet i de senere år med fremkomsten af kryofixation ved højtryksfrysning (HPF) og lavtemperaturdehydrering og farvning via frysesubstitution (FS). HPF og FS giver fremragende bevarelse af cellulære ultrastruktur til TEM-billeddannelse, kun overgået af direkte kryo-billeddannelse af glasagtige prøver. Her præsenterer vi en protokol for cryoAPEX-metoden, som kombinerer brugen af APEX2-mærket med HPF og FS. I denne protokol mærkes et protein af interesse med APEX2, efterfulgt af kemisk fiksering og peroxidasereaktionen. I stedet for traditionel farvning og alkoholdehydrering ved stuetemperatur kryofikser prøven og gennemgår dehydrering og farvning ved lav temperatur via FS. Ved hjælp af cryoAPEX kan et protein af interesse ikke identificeres i subcellulære rum, men også yderligere oplysninger kan løses med hensyn til dets topologi i en strukturelt bevaret membran. Vi viser, at denne metode kan give høj nok opløsning til at dechifrere proteinfordelingsmønstre i et organellelumen og til at skelne mellem opdelingen af et protein i en organelle i nærheden af andre umærkede organeller. Desuden er cryoAPEX proceduremæssigt ligetil og modtagelig for celler dyrket i vævskultur. Det er ikke mere teknisk udfordrende end typiskkrofixation og frysesubstitutionsmetoder. CryoAPEX er almindeligt anvendelig for TEM analyse af enhver membran protein, der kan genetisk mærkes.

Introduction

Biologiske undersøgelser omfatter ofte spørgsmål om løsning af subcellulær proteinlokalisering i celler og organeller. Immunfluorescensmikroskopi giver en nyttig lav opløsning opfattelse af protein lokalisering, og de seneste fremskridt i super-opløsning imaging skubber grænserne for opløsning for fluorescerende mærkede proteiner1,2,3. Men elektronmikroskopi (EM) forbliver guldstandarden for billeddannelse cellulære ultrastruktur med høj opløsning, selv om mærkning af proteiner er en udfordring.

Historisk set er flere EM-metoder blevet anvendt til at behandle spørgsmål om ultrastrukturel proteinlokalisering. En af de mest almindeligt anvendte metoder er immunelektronmikroskopi (IEM), hvor antigen-specifikke primære antistoffer bruges til at detektere protein af interesse. EM-signalet genereres ved anvendelse af sekundære antistoffer konjugeret med elektrontætte partikler, oftest kolloidguld4,5. Alternativt kan antistoffer konjugeret med enzymer som hesteradisk peroxidase (HRP) anvendes til at producere en elektrontæt bundfald6,7,8. Der findes to hovedtilgange til IEM, der kaldes forindlejring og postintegreringsmærkning. Ved præintegrering i IEM indføres antistoffer direkte i celler, hvilket kræver lysfiksering og permeabilisering af cellerne9,10,11. Begge trin kan beskadige ultrastruktur12,13. Udvikling af betydeligt mindre antistoffer bestående af et antistof Fab fragment konjugeret med 1,4 nm nanoguld tillader meget blid permeabilisering betingelser, der skal anvendes; Nanoguld er dog for lille til direkte visualisering under TEM og kræver yderligere forbedringstrin for at blive synlige14,15,16. Ved post-indlejring IEM anvendes antistoffer på tynde dele af celler, som er blevet fuldt behandlet ved fiksering, dehydrering og indlejring i harpiks17. Selv om denne fremgangsmåde undgår gennemtrængelighedstrinnet, er det en udfordring at bevare interesseepicentret under hele prøveforberedelsen18,19,20. Tokuyasu-metoden til lysfiksering efterfulgt af frysning, kryo-skæring og antistofdetektion giver forbedret epitopkonservering21,22. Men de tekniske krav til kryo-ultramikrotomi, samt den sub-optimale kontrast opnået i cellen, er ulemper23.

Brugen af genetisk kodede tags eliminerer mange af de vanskeligheder, iiem i forbindelse med påvisning af protein af interesse. En række tags er tilgængelige, herunder HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG, og metallothionin24,25,26,27,28,29,30,31,32. Hver af disse har fordele i forhold til tidligere metoder, men hver har også ulemper, der forhindrer udbredt brug. Disse ulemper spænder fra inaktivitet af HRP i cytosol til den store størrelse af ferritin tag, lys følsomhed ReAsH, og lille størrelse og manglende kompatibilitet med cellulære farvning af metallothionin. For nylig, et protein fremstillet af ascorbat peroxidase er blevet manipuleret som en EM-tag, opkaldt APEX233,34. Som peroxidase kan APEX2 katalysere oxidationen af 3,3' diaminobenzidin (DAB), der producerer en bundfald, der reagerer med osmiumtetroxid for at give lokal EM-kontrast med minimal diffusion fra proteinaf interesse (mindre end 25 nm)33,35. I modsætning til traditionelle HRP-baserede metoder er APEX2 ekstremt stabil og forbliver aktiv i alle cellerum33. Prøver kan forarbejdes for TEM ved hjælp af traditionel EM-prøvefarvning og metoder , der giver mulighed for god visualisering af de omkringliggende konstruktioner33,34,36. På grund af sin lille størrelse, stabilitet og alsidighed, apex2 har vist sig som en EM tag med stort potentiale.

Mange af de tilgange, der er beskrevet ovenfor, kan enten ikke kombineres med den aktuelle tekniske situation inden for ultrastrukturel konservering, kryoviation og frysesubstitution ved lav temperatur. Således lider de af mangel på membran konservering og / eller celle farvning at bestemme nøjagtig protein lokalisering. Dette begrænser nødvendigvis opløsningen og fortolkningen af de data, der kan indhentes. Kryofixation ved højtryksfrysning (HPF) indebærer hurtig frysning af prøver i flydende nitrogen ved et højt tryk (~ 2.100 bar), som forårsager vitrification snarere end krystallisering af vandige prøver, og dermed bevare celler i en næsten hjemmehørende tilstand37,38,39. HPF efterfølges af frysesubstitution (FS), en lav temperatur (-90 °C) dehydrering i acetone kombineret med inkubation med typiske EM-pletter såsom osmiumtetroxid og uranylacetat. HPF og FS giver tilsammen en klar fordel i forhold til traditionel kemisk fiksering (en længere proces, der kan føre til artefakter) og alkoholdehydrering ved stuetemperatur eller is (hvilket kan føre til udvinding af lipider og sukker), og derfor er ønskeligt at kombinere med de bedste EM-tags til påvisning af protein.

En af grundene til, at HPF/FS ikke er blevet kombineret med APEX2-mærkning, er, at lyskemisk fiksering er en forudsætning for peroxidasereaktionen, hvilket begrænser udbredelsen af DAB-reaktionsproduktet. I APEX2-undersøgelser indtil videre efterfølges fiksering og peroxidasereaktion af traditionelle EM-metoder til farvning og alkoholdehydrering33,36. Det er imidlertid blevet påvist, at efter kemisk fiksering med HPF/FS giver en klar fordel i konserveringen i forhold til traditionel kemisk fiksering og alkoholdehydrering alene40. Tabet af ultrastrukturel integritet, der ses i traditionelle TEM-prøver, synes mindre forbundet med fiksering end til dehydrering, hvilket typisk sker ved hjælp af alkohol ved stuetemperatur eller is, og kan føre til ekstraktion af lipider og sukker40,41. For at udvikle cryoAPEX-metoden antager vi, at kemisk fiksering og peroxidasereaktion efterfulgt af HPF og FS ville give et optimalt resultat med hensyn til ultrastrukturel konservering.

Her præsenterer vi cryoAPEX-protokollen, som kombinerer APEX2-mærkning med kryopræks- og frysesubstitutionsmetoder (figur 1). Denne enkle protokol består af omladning af et APEX2-mærket protein af interesse, kemisk fiksering af celler og peroxidasereaktionen. HPF og FS udføres derefter efterfulgt af typisk harpiksintegrering og tynd skæring. TEM imaging afslører fremragende bevarelse af ultrastruktur ved hjælp af denne metode. Derudover blev der observeret højopløsningssubcellulær lokalisering og rumlig fordeling af et endoplasmisk retikulum (ER) lumenalprotein. Denne metode er meget nyttig til påvisning af membranproteinlokalisering i celler til elektronmikroskopianalyse. I vores hænder har metoden fungeret med succes for en række cellelinjer dyrket i vævkultur, herunder HEK-293T (human embryonal nyre), HeLa (human livmoderhalskræft), Cos7 (afrikansk grøn abe nyre fibroblast), og BHK (baby hamster nyre). Detaljerede instruktioner er beskrevet nedenfor ved hjælp af HEK-293T celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur og omladning

  1. Frø HEK-293T celler på en 60 mm diameter eller større væv kultur parabol og vokse til 60% -90% sammenløb i en celle kultur inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
  2. Transfect celler med APEX2-mærkede pattedyr udtryk plasmider ved hjælp af transfektionsreagens (se Tabel over materialer)i henhold til producentens anvisninger.
  3. Ved 12-15 timer efter omladning en gang med fosfat buffered saltvand (PBS). Fjern celler fra skålen ved skånsom vask med PBS. Der kan anvendes et dissociationsreagenssomt, f.eks. Centrifuger ved 500 x g i 5 minutter for at danne en pellet.

2. Kemisk fiksering og peroxidase reaktion

  1. Fjern forsigtigt supernatanten, og ophæng pelletiet igen i 2 ml 2% glutaraldehyd (v/v) i 0,1 M natriumkacodylate buffer, pH 7,4, ved stuetemperatur. Prøven anbringes på is og inkubering i 30 min. Pelletprøven ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Fra dette punkt til trin 2.3.3 skal prøven og opløsningerne opbevares på is, og der udføres centrifugering ved 4 °C.
    FORSIGTIG: Både glutaraldehyd og natriumkacodylate buffer (indeholdende arsen) er giftige. Der bør anvendes passende sikkerhedsprocedurer og personlige værnemidler under håndteringen. Opløsninger, der indeholder glutaraldehyd og/eller natriumkacodyatbuffer, skal bortskaffes som farligt kemisk affald.
  2. Vask pellet 3x i 5 min med 2 ml 0,1 M natriumkacodylate buffer. For disse såvel som efterfølgende vasker, forsigtigt resuspendere cellepellet i den ønskede opløsning, derefter centrifuge i 5 min ved 500 x g og forsigtigt fjerne og kassere supernatant. Der skal udvises forsigtighed med de gentagne pelleterings- og resuspensionstrin for at minimere prøvetabet.
  3. Udfør peroxidase reaktion
    1. Der fremstilles en frisk opløsning, der indeholder 1 mg/ml 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrochlorid (DAB) i 0,1 M natriumkacodyatbuffer. Dab opløses ved kraftig vortexing i 5-10 min.
      FORSIGTIG: DAB er giftigt og et potentielt kræftfremkaldende stof og skal håndteres med passende sikkerhedsprocedurer og personlige værnemidler. Opløsninger, der indeholder DAB, skal behandles som farligt kemisk affald.
    2. Vask pellet ved genophængning i 3 ml DAB opløsning efterfulgt af pelletering ved 500 x g i 5 min.
    3. Ophæng pellet i 3 ml DAB opløsning, som hydrogenperoxid er blevet tilføjet for at opnå en endelig koncentration på 5,88 mM. Inkuberi i 30 minutter på værelse temp. Pellet bliver synligt brun-farvet angiver tilstedeværelsen af det uopløselige DAB reaktionsprodukt.
      BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at optimere DAB-inkubationstiden for hver prøve. Farveændringen kan overvåges på lysmikroskopet. Det er vores erfaring, en 15-45 min inkubation er tilstrækkelig til de fleste proteiner. Hydrogenperoxid skal fremstilles af en nyåbnet flaske eller en flaske, der er blevet holdt godt forseglet efter åbning.
    4. Pellet cellerne, derefter vaskes 2x i 5 min med 0,1 M natriumkacodylate buffer, efterfulgt af en vask i Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) eller cellemedier valg.
  4. Kasehæl cellepelletiet i 500 μL af en kryobeskyttende opløsning af DMEM (eller andre foretrukne cellemedier), der indeholder 10 % føtal kvægserum og 15% kvægserumalbumin. Pellet igen, lidt øge centrifuge hastighed fra 500 x g hvis det kræves for at opnå en pellet i den tykke kryo-beskyttende løsning. Kassér størstedelen af supernatantet, hvilket sikrer, at der er tilstrækkelig væske tilbage, så pelleten ikke tørrer ud. Transport cellepellet til højtryksfryseinstrumentet.

3. Højtryksfrysning

  1. Fyld højtryksfrysebeholderen med flydende nitrogen (LN2)og start pumpen for at fylde prøvekammeret med LN2.
    FORSIGTIG: Brug passende sikkerhedsprocedurer og personlige værnemidler, når du arbejder med flydende nitrogen.
    BEMÆRK: Disse trin er specifikke for Leica EMPACT2 højtryksfryseren.
  2. Væg den resterende væske væk fra cellepellet ved hjælp af hjørnet af et laboratorium tørre eller køkkenrulle. Der bør være tilstrækkelig væske tilbage, at pellet danner en pasta svarende i konsistens til tandpasta. Den skal være tynd nok til at blive indsugning i en 20 μL pipetspids.
  3. Aspirate 2-3 μL af cellepellet og deponere det på en membran luftfartsselskab. Fyld brønden af membranholderen helt, så overfladespændingen skaber en let kuppel på toppen, men væsken ikke løber ud af brønden. Der må ikke være luftbobler til stede.
  4. Skub membranholderen ind i patronen og fastgør. Placer patronen i den HPF-maskine, der er klargjort og klargjort, og tryk på Start for at fryse.
  5. Undersøg temperaturen vs. tid og tryk vs. tidsgrafer for at kontrollere, at trykket nåede 2100 bar og temperaturen nåede -196 °C inden for 200 ms, og begge parametre forblev stabile for 600 ms måling.
  6. Gentag trin 3.3 til 3.5, indtil cellepellethar været brugt, eller det ønskede antal prøver er blevet frosset.
  7. Hold patronerne nedsænket i LN2,skal du fjerne hver membranholder fra patronen, placere sat i en plastikkapsel og placere plastkapslen i et kryohætteglas fyldt med LN2.
    BEMÆRK: Protokollen kan være sat på pause her. Kryohætteglas med prøver kan opbevares i en LN2 dewar i kryo-stokke eller kryo-kasser.

4. Frys substitution

FORSIGTIG: Brug passende sikkerhedsprocedurer og personlige værnemidler, når du arbejder med flydende nitrogen. Derudover er mange af de kemikalier, der anvendes i trin 4, giftige, herunder garvesyre, osmiumtroxid og uranylacetat. Disse kemikalier skal håndteres efter korrekte sikkerhedsprocedurer og bortskaffes som farligt kemisk affald.

  1. Fyld den automatiske fryseerstatningsenhed med LN2. Medbring temperaturen til -90 °C.
  2. Forbered FS Mix 1 og begynde FS.
    1. I en kemisk hætte fremstilles en opløsning på 0,2% garvesyre (w/v) og 5% DI-vand i acetone og aliquot 1 ml pr. prøve i kryohætteglas. Placer i LN2 for at fryse.
    2. FS Mix 1 hætteglas og kryo-hætteglas, der indeholder de frosne cellepiller, anbringes i FS-enhedens prøvekammer. Den indvendige kapsel, der indeholder membranholderen, overføres fra LN 2-hætteglasset til det tilsvarende hætteglas, der indeholder FS Mix 1.
    3. Start en FS-protokol med sit første trin er 24 timer ved -90°C. Efter 24 timer skal FS sættes på pause, og prøverne vaskes 3x i 5 minutter med acetone, der er afkølet til -90 °C.
  3. Forbered FS Mix 2 og komplet FS
    FORSIGTIG: Osmiumtroxid er et meget giftigt og oxiderende kemikalie, der kun bør håndteres af uddannede personer i henhold til etablerede sikkerhedsprotokoller. Protokoller ne for opbevaring og bortskaffelse af osmiumholdige opløsninger skal følges samt mærkning af laboratorieområder, hvor osmiumtetroxid er i brug. Osmiumtroxid skal håndteres i en kemisk hætte med personlige værnemidler, herunder øjenbeskyttelse, en laboratoriekittel, der giver fuld armbeskyttelse, dobbelte Nitrilhandsker og en valgfri åndedrætsværn.
    1. I en kemisk hætte, forberede en opløsning på 1% osmium tetroxid, 0,2% uransyl acetat, og 5% DI vand i acetone. Aliquot 1 ml pr. prøve i kryohætteglas og sted i LN2 for at fryse.
      BEMÆRK: Stock opløsninger af garvesyre (10% w / v i acetone), osmium tetroxid (10% w / v i acetone) og uranyl acetat (8% w / v i methanol) kan fremstilles og opbevares i kryo-hætteglas i en LN2 dewar for nem forberedelse af FS Blander.
    2. Spræmningshætteglas med FS Mix 2 anbringes i FS-enheden, og kapslerne overføres fra den tredje acetone, der vaskes i FS Mix 2-hætteglassene. Inkuber i FS Mix 2 for 72 timer ved -90 °C, efterfulgt af gradvis opvarmning til 0 °C over 12-18 h.
  4. Temperaturen opbevares ved 0 °C, og den vaskes 3x i 30 minutter med forkølet acetone fra en friskåbnet flaske.

5. Harpiks Infiltration og indlejring

FORSIGTIG: Den harpiks, der anvendes her (se Materialetabel),er giftig før polymerisering og skal håndteres med passende sikkerhedsprocedurer og personlige værnemidler. Enhver upolymeriseret harpiks skal bortskaffes som farligt kemisk affald.

  1. Infiltrere prøverne med stigende koncentrationer af harpiks opløst i acetone fra en nyåbnet flaske. Der fremstilles en blanding af harpikskomponenter A, B og D i et plastbæger i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger, og inkubere prøver i følgende harpikskoncentrationer: 2%, 4% og 8% for 2 h hver ved 0 °C. Inkuberi 15%, 30%, 60%, 90% og 100% harpiks for 4 h hver ved stuetemperatur. Inkuber i 4 timer i en blanding af komponenter A, B, C og D.
  2. Placer membranbærere med cellepellet side op i flade indlejring skimmelme og fyld med harpiks (A, B, C og D). Papiretiketter til prøverne kan tilsættes til brøndene på nuværende tidspunkt.
  3. Polymeriseres i en ovn ved 60 °C i 24-36 timer.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause efter polymeriseringen.
  4. Fjern blokke fra formen og lad afkøle. For at fjerne membranholderen skal prøven først placeres i ultramikrotomens lodrette klukl, hvor den kan visualiseres med forstørrelse. Adskil membranbæreren fra blokken ved en kombination af hulning af flydende nitrogen på membranbæreren for at adskille metallet fra plasten og bruge et barberblad til at chipre harpiksen væk omkring membranbæreren. Når den er adskilt, skal membranbæreren forsigtigt løfte membranholderen væk, hvilket efterlader cellepillekuplen på forsiden af blokken.
  5. Placer blokken med den udsatte celle pellet vender opad i en flad indlejring skimmel, der er lidt dybere end den første form, og fylde med harpiks. Polymeriseres ved 60 °C for 24-36 h.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause efter polymeriseringen.

6.

  1. Trim blokken omkring cellepellet ved hjælp af et barberblad. Placer derefter blokken i prøvepatronen på sektionsarmen i et ultramikrotomi. Brug en glas- eller diamantkniv, trim blokken i en trapezformet form tæt omkring cellepellet.
  2. Få 90 nm ultratynde dele af cellepellet ved hjælp af et glas eller diamant kniv.
  3. Hent et bånd af sektioner på et TEM-gitter. Formvar-belagtkobber slotgitre (1 x 2 mm2 slot) er nyttige til billeddannelse serielle sektioner. Tør gitteret ved at blotting kanten på et stykke filterpapir, og opbevares i en TEM gitter opbevaringsboks.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause efter skæring.

7. TEM-billeddannelse

  1. Monter gitteret på TEM-holderen, og anbring i mikroskopet. Vi bruger rutinemæssigt en Tecnai T12 på 80 kV til screening cryoAPEX prøver. Anskaf billeder af celler og subcellulære strukturer af interesse med APEX2 mærkning.
  2. Hvis det ønskes, opnå yderligere membran kontrast ved brug af bly post-farvning. Se figur 2 til sammenligning af ikke-postfarvede prøver(figur 2I-K) og blyefter farvede prøver ( figur2A-H).
    1. Flyde tørre gitre sektion-side ned på en dråbe fortyndet natriumchlorid opløsning (~ 1,5 mM), 2x for 1 min hver, derefter 1x i 10 min.
    2. Flydegitre på en dråbe Af Satos blyopløsning i 1 min. Vask ved at flyde på natriumchloridopløsning 3x i 1 min, derefter på DI-vand 3x i 1 min. Blot overskydende væske fra gitrene og opbevares i en gitterkasse.
      FORSIGTIG: Bly er et giftigt kemikalie og skal håndteres med passende sikkerhedsprocedurer og personlige værnemidler. Opløsninger, der indeholder bly, skal bortskaffes som farligt kemisk affald.
  3. Billede post-farvede prøver på TEM.
    BEMÆRK: Ved traditionel tem-klargøring udføres det ledende kontrasterende trin før TEM-billeddannelse. Det anbefales dog, at der for cryoAPEX-prøver først foretages billeddannelse på ikke-kontrasterede prøver. Dette sikrer, at signalet fra mærket nemt kan placeres ved sin stærke kontrast til de mere let plettede cellulære strukturer. For mange prøver vil der ikke være behov for yderligere farvning. Hvis der ønskes yderligere membrankontrast, kan blyefterfarvning dog udføres (trin 7.2) og prøven re-imaged.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at sammenligne den ultrastrukturelle konservering ved hjælp af cryoAPEX-metoden med traditionel fiksering og dehydrering udarbejdede vi prøver, hvor en endoplasmisk reticulummembran (ERM; ER membran) peptid blev mærket med APEX2 og transfected i HEK-293T celler. ERM-APEX2 lokaliserer til erens cytoplasmatiske ansigt og ommodellerer ER-strukturen til morfologisk adskilte strukturer kendt som organiseret smooth ER (OSER)34,42,43. OSER morfologi omfatter regioner med glatte, parallelle, tæt stablet membraner, der tjener som en optimal region til at sammenligne ultrastrukturelle bevarelse. Præparatet af prøven ved traditionelle APEX-metoder resulterede i klar mærkning af OSER-strukturer(figur 2A-D). Ved inspektion ved høj forstørrelse syntes de stablede membraner pjusket og ikke-ensartede huller var til stede mellem koncentriske membrantætheder, hvilket indikerer dårlig membrankonservering og lipidekstraktion (figur 2D). Den prøve, der blev fremstillet af cryoAPEX, havde også en klart defineret mærkning af OSER-strukturer. membranerne var dog glatte og parallelle, og der blev kun lidt eller ingen lipidekstraktion set (figur 2E-H). Resultaterne fra cryoAPEX var af samme præservering af høj kvalitet som dem, der blev fremstillet af en prøve, der gennemgik HPF/FS uden yderligere kemisk fiksering og APEX2/DAB-reaktionstrin (figur 2I-K).

Ud over visuelt mærkbar membrankonservering bevarer cryoAPEX-metoden proteinet af interesse, således at aspekter af proteinfordelingsmønstre i nogle tilfælde kan observeres. For at illustrere dette punkt, brugte vi en anden ER-lokaliseret protein, huntingtin gær interagerende protein E (HYPE). HYPE er et membranprotein placeret på lænden af ER membranen 44,45,46,47. HYPE-APEX2 konstruktioner blev overudtrykt i HEK-293T celler. TEM-analyse af 90 nm tynde sektioner viste, at HYPE var til stede i hele den perifere ER samt den nukleare kuvert(figur 3A,B). Derudover hype tæthed var i stand til at blive løst i regelmæssigt afstand foci langs lumenal ER membran(Figur 3C,pile). HYPE distribution og foci var også synlige i en prøve tilberedt med traditionel fiksering og dehydrering; Der var dog omfattende membranforstyrrelser og ekstraktioner til stede, hvilket gjorde prøven suboptimal (figur 3D,E).

For at demonstrere den robuste organellar specificitet og anvendelighed af cryoAPEX metode til en række mærkede proteiner, vi udførtAPEX2 mærkning ved hjælp af tre cellulære markører. Mitokondrier blev mærket ved hjælp af mito-V5-APEX234. Denne markør for mitokondriel matrix gav kun specifik farvning af mitokondrier (figur 4A). Ligeledes vurderede vi plasmamembranmærkning ved hjælp af CAAX-APEX234, som kun producerede særskilt farvning af plasmamembranen (figur 4C). Der blev ikke observeret mærkning i intracellulære organeller (figur 4C). Derudover skabte vi en ny konstruktion som en markør for Golgi lumen ved at smelte de første 118 aminosyrer af musen isoform af α-mannosidase med APEX2genet 48. Den resulterende MannII-APEX2 blev transient transpæeret til celler, som efterfølgende blev fremstillet ved cryoAPEX-metoden. Farvede Golgi-stakke kunne tydeligt skelnes fra de omkringliggende organeller (figur 4B). Individuelle stakke, cisternae, og nogle vesikler var mærket, typisk for Golgi farvning(Figur 4B). Alt i alt viser disse markører, at cryoAPEX-metoden giver specifik mærkning af membranproteiner i forskellige organeller ved høj nok opløsning til at skelne dem fra omgivende subcellulære strukturer.

Figure 1
Figur 1: Skematisk af de væsentlige trin i CryoAPEX-protokollen. (A) Celler dyrkes og transfected med en APEX2 plasmid. (B) Celler pelleteres og fastgøres med glutaraldehyd efterfulgt af (C) inkubation med DAB og hydrogenperoxid til fremstilling af peroxidasereaktionsproduktet. (D) Pelleteret kryofastgjort af HPF,(E)fryseerstattes med tungmetaller og acetone, ogf) indlejret i harpiks. Tynde sektioner indsamles på mikrotom. G) TEM-billeddannelse udføres, og der kan tilsættes yderligere kontrast ved efterfarvning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning af OSER membrankonservering ved hjælp af traditionel kemisk fiksering, cryoAPEX og HPF/FS. Den reorganiserede ER morfologi i kemisk faste, DAB reagerede ERM-APEX2-udtrykkende celler, der blev behandlet via traditionel kemisk fiksering og alkohol dehydrering (A-D) eller ved cryoAPEX (E-H) blev sammenlignet med ERM-APEX2 udtrykke celler, der blev kryofikset levende og uden DAB reaktion (I-K). De levende kryofikerede celler repræsenterer den bedst opnåelige ultrastrukturelle konservering og fungerer her som metrisk for evaluering af membrankonservering opnået via de to APEX-baserede detektionsprotokoller (A-H). Den jævnt afstand parallelle lameller stabling af ER-afledte membraner opnået ved cryoAPEX (eksemplificeret i paneler G og H),i modsætning til de pjusket membraner opnået ved traditionelle metoder (paneler C og D),fremhæver den overlegne membran bevarelse opnået ved cryoAPEX. Dette tal er blevet ændret fra Sengupta et al. 201948. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Proteinlokalisering af et APEX2-mærket ER membranprotein kan løses i periodisk foci. (A) Et billede af en tynd del af en HEK-293T celle udtrykker HYPE-APEX2 og behandles af cryoAPEX afslører farvning af ER i en velbevaret (tæt) cytoplasmatisk baggrund (B,C). Højere forstørrelsesbilleder af en lille del af den perifere ER (afgrænset med gul boks i A og vist i B, med yderligere forstørrelse af rød boks i Bvist i C ) udviser periodisk foci af APEX2-genereret tæthed (B,rød boks og C, hvide pilespidser viser periodicitet mellem HYPE foci). (D) Billedet af en tynd del af en celle, der udtrykker HYPE-APEX2 og fremstillet af traditionel kemisk fiksering og dehydrering, viser specifik farvning af den kortikale er og den nukleare kuvert (røde pile). (E) Ved en højere forstørrelse var periodisk hype-specifik foci tydelig inden for strækninger af ER (gul boks og hvide pilehoveder i starten), på trods af omfattende membranforstyrrelser, angivet med røde pile. NE = nuklear kuvert. Dette tal er blevet ændret fra Sengupta et al. 201948. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Organelle markører viser specificiteten af det signal, der er opnået fra APEX2-mærkede proteiner. APEX2-mærkede proteinkonstruktioner, der er designet til at lokalisere den mitokondriel matrix (mito-V5-APEX2; vist i A) eller Golgi lumen (α-mannII-APEX2, vist i B) eller plasmamembranen (CAAX-APEX2; vist i C) blev forbigående udtrykt i HEK293-celler og prøver, der blev behandlet af cryoAPEX. Hver konstruktion gav organelle specifikke tætheder. Forstørrede visninger af to sektioner (gule eller røde bokse) fra de celler, der udtrykker α-mannIIAPEX2 (panel B) eller CAAX-APEX2 (panel C),vises. Dette tal er blevet ændret fra Sengupta et al. 201948. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den cryoAPEX protokol præsenteres her giver en robust metode til at karakterisere lokaliseringen af membran proteiner i cellulære miljø. Ikke alene giver brugen af et genetisk kodet APEX2-tag præcis lokalisering af et protein af interesse, men brugen af kryoixation og lavtemperaturdehydrering giver fremragende bevarelse og farvning af den omgivende cellulære ultrastruktur. Kombineret er disse tilgange et kraftfuldt værktøj til lokalisering af et protein med høj præcision i sin undercellulære kontekst.

Kernen i udviklingen af denne metode er, at tabet af ultrastruktur opleves efter tilberedning af traditionelle TEM-metoder kommer primært fra dehydreringstrinnet i stedet for fikseringstrin40. Man skulle tidligere tro, at peroxidasebaserede metoder var uforenelige med HPF/FS, fordi de kræver kemisk fiksering forud for peroxidasereaktionen. For at omgå dette, en protokol ved navn CryoCHEM blev for nylig udviklet, hvor prøverne er oprindeligt kryofiks, efterfulgt af rehydrering og peroxidase reaktion49. Denne tilgang giver fremragende mål lokalisering med betydelige forbedringer i prøve farvning og bevarelse. Det har vist sig at være nyttigt for vævsprøver og i tilfælde, hvor korrelative fluorescens og elektronmikroskopi ønskes. Parallelt med cryoCHEM kombinerer vores metode glutaraldehydfiksering med HPF og FS. CryoAPEX tilbyder en strømlinet protokol, der fungerer effektivt selv for små cellulære prøver.

Adgang til højtryksfrysnings- og frysesubstitutionsinstrumenter er afgørende for kryoAPEX-metoden. Disse instrumenter og færdigheder bliver mere og mere almindelige i EM-faciliteterne. Selv om HPF- og FS-udstyr ikke er let tilgængeligt, er den kemisk faste prøve stabil nok til, at der kan transporteres beskedne afstande40. Vi har konstateret, at prøver kan opbevares efter DAB-reaktionen ved 4 °C i mindst 48 timer før HPF uden et betydeligt kvalitetstab. Et andet kritisk aspekt af cryoAPEX-protokollen er medtagelsen af kontroller, som er afgørende for et robust eksperiment og overbevisende resultater. Prøver fremstillet af transient omladning med effektivitet mindre end 100% vil indeholde negative kontrolceller samt mærkede celler i samme prøve. Hvis du anvender cellelinjer med stabilekspression af APEX2, skal der fremstilles en separat negativ kontrol ved omladning af celler med det ikke-APEX2-mærkede protein af interesse. Flere konstruktioner , der kan fungere som organellar kontrol er tilgængelige via Addgene, og offentliggjorte billeder er tilgængelige i denne og andre publikationer, der kan bruges til verifikation33,34,36,48. Martell et al.36

Mens cryoAPEX er stort set nyttigt til påvisning af membranproteiner, findes der nogle begrænsninger. Selvom APEX2 er et lille 28 kDa protein, kan nogle proteiner ikke være i stand til at indarbejde tag33,34. APEX2 anses ikke for nyttig til mærkning af opløselige proteiner i cytosol på grund af det diffuse reaktionsprodukt33,36. Derudover udgør påvisning af små mængder protein en udfordring på grund af tilstedeværelsen af farvning i den omgivende celle. Forberedelse af HPF og FS bevarer cellulære komponenter, som er udvundet af traditionel fiksering og dehydrering. Dette fører til generelt mørkere farvning i cellen, potentielt konkurrerer med lave niveauer af APEX2 mærkning.

CryoAPEX-teknikken er almindeligt anvendelig for mange proteiner med et begrænset antal trin, der kan kræve optimering. For det første kan det på grund af individuel variation blandt proteiner være nødvendigt at justere proteinekspressionsniveauet og/eller DAB-reaktionstiden, for at signalet kan visualiseres over cellens baggrundsfarvning. Nyttige oplysninger og protokoller til validering af nye APEX2 fusionkonstruktioner og optimering af udtrykket og DAB farvning leveres af Martell et al.36 Fra et cellulært farvningsperspektiv kan det være nødvendigt at justere FS-protokollen og/eller kemikalierfor optimal visualisering af forskellige organellemembraner inden for forskellige celletyper, væv eller organismer50,51,52,53,54. Det er vores erfaring, fs betingelser præsenteres her har fungeret godt for en række pattedyr cellelinjer.

Den hybride tilgang af cryoAPEX har potentiale til at blive anvendt på mange andre genetiske mærkning teknikker. Udskiftning af traditionel alkoholdehydrering med HPF/FS forventes i høj grad at forbedre den ultrastrukturelle konservering og proteinlokaliseringsoplysningerne. Ved hjælp af safirdiske som cellesubstrat til at fastsætte celler som et monolag forbedrer bevarelsen af celleperiferien, herunder cytoskelet og cellecellekontakter. Mindre ændringer af protokollen vil være forpligtet til at bruge safirdiske. APEX-teknologi kan bruges til at detektere grønne fluorescerende proteiner (GFP) mærkede proteiner via et GFP-bindende peptid35. Denne indirekte metode til påvisning åbner mulighed for at udnytte APEX-teknologi til de utallige proteiner, der allerede er mærket med GFP. Den nyligt indførte split APEX2 vil være en fordel for nærhed og interaktion undersøgelser55. Derudover kan eksisterende HRP-baserede metoder kombineres med HPF/FS for at forbedre mobilkonserveringen. Et eksempel er fluorescent indicator og peroxidase til precipitation med EM resolution (FLIPPER), hvor enkelte cellemarkører er blevet smeltet sammen med både en fluorescerende tag og HRP, der giver lumenal markører for Golgi eller ER56. Brug af forbedrede peroxidasesubstrater i stedet for DAB er også muligt med denne metode, herunder substrater, som er optimeret til RNA-mærkning 57. CryoAPEX giver også in-cell mærkning og ultrastrukturelle bevarelse er nødvendige for tredimensionel analyse af proteindistribution gennem elektron tomografi, og potentielt ved høje mængder gennem SBF-SEM eller FIB-SEM48,58.

Samlet set er CryoAPEX en robust metode med bred anvendelighed. I princippet kan det anvendes på enhver membran protein, enten inden for lumenal rummet af en organelle, på den cytoplasmatiske ansigt, inden vesikler, på cellens plasmamembran eller endda i det ekstracellulære rum. For denne enorme vifte af membran proteiner, cryoAPEX metode giver potentiale til at se lokalisering og fordeling af et protein med nøjagtighed i sin subcellulære sammenhæng.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Den protokol, der er beskrevet her, stammer fra en publikation af Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Dette arbejde understøttes af tilskud R01GM10092 (til SM) og AI081077 (R.V.S.) fra National Institutes of Health, CTSI-106564 (til S.M.) fra Indiana Clinical and Translational Sciences Institute og PI4D-209263 (til SM) fra Purdue University Institute for Inflammation, Immunologi og infektiøs sygdom.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. Oliver, C., Jamur, M. C. 588, Humana Press. 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. Mueller-Reichert, T., Verkade, P. 111, Elsevier. 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. Hajibagheri, N. 117, Humana Press. 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , International ed. in English (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Tags

Biologi CryoAPEX membranprotein APEX2 transmissionelektronmikroskopi cryofixation højtryksfrysning frysesubstitution
CryoAPEX-metoden til elektronmikroskopianalyse af membranproteinlokalisering i ultrastrukturelt bevarede celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin,… More

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter