Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

CryoAPEX-metoden for elektronmikroskopianalyse av membranproteinlokalisering innenfor ultrastrukturelt bevarte celler

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

Denne protokollen beskriver cryoAPEX-metoden, der et APEX2-merket membranprotein kan lokaliseres ved overføring elektronmikroskopi innenfor optimalt bevart celleultrastruktur.

Abstract

Viktige cellulære hendelser som signaltransduksjon og membranhandel er avhengig av riktig proteinplassering i cellulære rom. Å forstå presis subcellulær lokalisering av proteiner er derfor viktig for å svare på mange biologiske spørsmål. Jakten på en robust etikett for å identifisere proteinlokalisering kombinert med tilstrekkelig cellulær bevaring og farging har vært historisk utfordrende. Nylige fremskritt innen elektronmikroskopi (EM) bildebehandling har ført til utvikling av mange metoder og strategier for å øke cellulær bevaring og merke målproteiner. En relativt ny peroxidase-basert genetisk tag, APEX2, er en lovende leder i kloneable EM-aktive koder. Prøveforberedelse for transmisjonselektronmikroskopi (TEM) har også avansert de siste årene med bruk av gråtofixasjon ved høytrykksfrysing (HPF) og lavtemperaturdehydrering og farging via frysesubstitusjon (FS). HPF og FS gir utmerket bevaring av cellulær ultrastruktur for TEM-avbildning, andre bare for å direkte kryo-avbildning av glassholdige prøver. Her presenterer vi en protokoll for cryoAPEX-metoden, som kombinerer bruken av APEX2-koden med HPF og FS. I denne protokollen er et protein av interesse merket med APEX2, etterfulgt av kjemisk fiksering og peroksidasereaksjon. I stedet for tradisjonell farging og alkoholdehydrering ved romtemperatur, er prøven kryofikset og gjennomgår dehydrering og flekker ved lav temperatur via FS. Ved hjelp av cryoAPEX kan ikke bare et protein av interesse identifiseres i subcellulære rom, men også ytterligere informasjon kan løses med hensyn til topologien i en strukturelt bevart membran. Vi viser at denne metoden kan gi høy nok oppløsning til å tyde proteinfordelingsmønstre i en organellelumen, og for å skille sammenkupéiseringen av et protein i en organelle i nærheten av andre umerkede organeller. Videre er cryoAPEX prosedyremessig grei og mottagelig for celler dyrket i vevskultur. Det er ikke mer teknisk utfordrende enn typisk kryofixation og fryse substitusjonsmetoder. CryoAPEX er allment anvendelig for TEM-analyse av membranprotein som kan være genetisk merket.

Introduction

Biologiske studier inkluderer ofte spørsmål om å løse subcellulær protein lokalisering i celler og organeller. Immunofluorescence mikroskopi gir en nyttig lav oppløsning visning av protein lokalisering, og nylige fremskritt i super-oppløsning imaging presser grensene for oppløsning for fluorescerende merkede proteiner1,2,3. Elektronmikroskopi (EM) er imidlertid fortsatt gullstandarden for bildebehandling av høyoppløsnings cellulær ultrastruktur, selv om merking av proteiner er en utfordring.

Historisk har flere EM-metoder blitt brukt til å nærme seg spørsmål om ultrastrukturell proteinlokalisering. En av de mest brukte metodene er immunoelektronmikroskopi (IEM), hvor antigenspesifikke primære antistoffer brukes til å oppdage proteinet av interesse. EM-signal genereres ved påføring av sekundære antistoffer konjugert med elektrontette partikler, oftest kolloidalt gull4,5. Alternativt kan antistoffer konjugert med enzymer som hestereddik peroksidase (HRP) brukes til å produsere en elektrontett bunnfall6,7,8. To hovedtilnærminger finnes for IEM, kalt pre-embedding og post-embedding merking. I pre-embedding IEM, antistoffer innføres direkte i celler, noe som nødvendiggjør lys fiksering og permeabilisering av cellene9,10,11. Begge trinnene kan skade ultrastruktur12,13. Utvikling av betydelig mindre antistoffer bestående av et antistoff Fab fragment konjugert med 1,4 nm nanogold tillater svært milde permeabilization forhold som skal brukes; Nanogold er imidlertid for liten for direkte visualisering under TEM og krever ytterligere forbedringstrinn for å bli synlige14,15,16. I post-em- og etterem-innbygging brukes antistoffer på tynne deler av celler som er fullstendig behandlet ved fiksering, dehydrering og innebygging iharpiks 17. Selv om denne tilnærmingen unngår permeabiliseringstrinnet, er det utfordrende18,19,20. Tokuyasu-metoden for lysfiksering etterfulgt av frysing, kryosnitting og antistoffdeteksjon gir forbedret epitop bevaring21,22. Imidlertid er de tekniske kravene til kryo-ultramikrotomi, samt sub-optimal kontrast oppnådd i cellen, ulemper23.

Bruken av genetisk kodede koder eliminerer mange av vanskelighetene med IEM knyttet til påvisning av proteinet av interesse. En rekke koder er tilgjengelige, inkludert HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG og metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Hver av disse har fordeler fremfor tidligere metoder, men hver har også ulemper som hindrer utbredt bruk. Disse ulempene spenner fra inaktivitet av HRP i cytosol til den store størrelsen på ferritintagen, lysfølsomhet for ReAsH, og liten størrelse og mangel på kompatibilitet med cellulær farging av metallothionein. Nylig har et protein avledet fra ascorbate peroxidase blitt konstruert som en EM-tag, kalt APEX233,34. Som peroksidase kan APEX2 katalysere oksidasjonen av 3,3' diaminobenzidin (DAB), noe som produserer et stup som reagerer med osmiumtetroksid for å gi lokal EM-kontrast med minimal diffusjon fra proteinet av interesse (mindre enn 25 nm)33,35. I motsetning til tradisjonelle HRP-baserte metoder er APEX2 ekstremt stabil og forblir aktiv i alle cellulære rom33. Prøver kan behandles for TEM ved hjelp av tradisjonell EM-prøvefarging og metoder som tillater god visualisering av de omkringliggende strukturene33,34,36. På grunn av sin lille størrelse, stabilitet og allsidighet har APEX2 dukket opp som en EM-tag med stort potensial.

Mange av tilnærmingene som diskuteres ovenfor, kan heller ikke være eller ennå ikke har blitt kombinert med den nåværende toppmoderne i ultrastrukturell bevaring, kryofixation og lavtemperatur frysesubstitusjon. Dermed lider de av mangel på membranbevaring og / eller cellefarging for å bestemme nøyaktig proteinlokalisering. Dette begrenser nødvendigvis oppløsningen og tolkningen av dataene som kan oppnås. Cryofixation ved høytrykksfrysing (HPF) innebærer rask frysing av prøver i flytende nitrogen ved høyt trykk (~ 2100 bar), noe som forårsaker vitrifisering i stedet for krystallisering av vandige prøver, og dermed bevare celler i en nesten innfødt tilstand37,38,39. HPF etterfølges av frysesubstitusjon (FS), en lav temperatur (-90 °C) dehydrering i aceton kombinert med inkubasjon med typiske EM-flekker som osmiumtroksid og uranylacetat. HPF og FS sammen gir en klar fordel over tradisjonell kjemisk fiksering (en lengre prosess som kan føre til gjenstander) og alkoholdehydrering ved romtemperatur eller på is (noe som kan føre til ekstraksjon av lipider og sukker), og dermed er ønskelig å kombinere med de beste EM-kodene for proteindeteksjon.

En grunn til at HPF/FS ikke er kombinert med APEX2-merking, er at lett kjemisk fiksering er en forutsetning for peroksidasereaksjonen, noe som begrenser spredningen av DAB-reaksjonsproduktet. I APEX2-studier så langt etterfølges fiksering og peroksidasereaksjon av tradisjonelle EM-metoder for farging og alkoholdehydrering33,36. Det har imidlertid vist seg at etter kjemisk fiksering med HPF/FS gir en klar fordel i bevaring over tradisjonell kjemisk fiksering og alkoholdehydrering alene40. Tapet av ultrastrukturell integritet sett i tradisjonelle TEM-prøver ser mindre forbundet med fiksering enn til dehydrering, som vanligvis gjøres ved hjelp av alkohol ved romtemperatur eller på is, og kan føre til ekstraksjon av lipider og sukker40,41. For å utvikle cryoAPEX-metoden hypotetiserte vi at kjemisk fiksering og peroksidasereaksjon, etterfulgt av HPF og FS, ville gi et optimalt resultat når det gjelder ultrastrukturell bevaring.

Her presenterer vi cryoAPEX-protokollen, som kombinerer APEX2-merking med kryofixation og frysesubstitusjonsmetoder (Figur 1). Denne enkle protokollen består av transfection av et APEX2-merket protein av interesse, kjemisk fiksering av celler og peroksidasereaksjonen. HPF og FS utføres deretter etterfulgt av typisk resin innebygging og tynn snitting. TEM imaging avslører utmerket bevaring av ultrastruktur ved hjelp av denne metoden. I tillegg ble høyoppløsnings subcellulær lokalisering og romlig fordeling av et endoplasmatisk reticulum (ER) lumenalprotein observert. Denne metoden er allment nyttig for påvisning av membranproteinlokalisering i celler for elektronmikroskopianalyse. I våre hender har metoden fungert vellykket for en rekke cellelinjer dyrket i vevskultur, inkludert HEK-293T (human embryonal nyre), HeLa (menneskelig livmorhalskreft), Cos7 (afrikansk grønn ape nyre fibroblast), og BHK (baby hamster nyre). Detaljerte instruksjoner er beskrevet nedenfor ved hjelp av HEK-293T celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur og transfeksjon

  1. Seed HEK-293T celler på en 60 mm diameter eller større vev kultur parabolen og vokse til 60% -90% samløpet i en cellekultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Transfect celler med APEX2-merket pattedyr uttrykk plasmids ved hjelp av transfection reagens (se Tabell av materialer) i henhold til produsentens retninger.
  3. Ved 12–15 timer etter transfeksjon vasker du celler én gang med fosfatbufret saltvann (PBS). Fjern celler fra parabolen ved å forsiktig vask med PBS. En dissosiasjonsreagens som trypsin kan brukes hvis det er nødvendig for en gitt celletype. Sentrifuge på 500 x g i 5 min for å danne en pellet.

2. Kjemisk fiksering og peroksidasereaksjon

  1. Fjern forsiktig supernatanten og resuspender pelleten i 2 ml 2% glutaraldehyd (v/ v) i 0,1 M natriumcacodylate buffer, pH 7,4, ved romtemperatur. Plasser prøven på is og inkubator i 30 min. Pellet prøven ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Fra dette punktet til trinn 2.3.3, hold prøven og løsningene på is, og utfør sentrifugering ved 4 °C.
    FORSIKTIG: Både glutaraldehyd og natriumkacodylatebuffer (som inneholder arsen) er giftige. Egne sikkerhetsprosedyrer og personlig verneutstyr bør brukes under håndtering. Løsninger som inneholder glutaraldehyd og/eller natriumkacodylatebuffer, skal avhendes som farlig kjemisk avfall.
  2. Vask pellet 3x i 5 min med 2 ml 0,1 M natriumcacodylate buffer. For disse så vel som påfølgende vasker, forsiktig resuspendere cellepellet i den nødvendige løsningen, deretter sentrifuge i 5 min ved 500 x g og forsiktig fjerne og kaste supernatant. Forsiktighet bør tas med gjentatte pelleting og resuspension trinn, for å minimere prøvetap.
  3. Utfør peroksidasereaksjonen
    1. Forbered en ny løsning som inneholder 1 mg/ml 3,3-diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB) i 0,1 M natriumkacodylate buffer. Løs opp DAB ved kraftig virvlende i 5-10 min.
      FORSIKTIG: DAB er giftig og et potensielt kreftfremkallende og bør håndteres med riktige sikkerhetsprosedyrer og personlig verneutstyr. Løsninger som inneholder DAB bør behandles som farlig kjemisk avfall.
    2. Vask pellet ved å resuspendere i 3 ml DAB-oppløsning etterfulgt av pelleting på 500 x g i 5 min.
    3. Resuspender pelleten i 3 ml DAB-løsning som hydrogenperoksid er lagt til for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5,88 mM. Inkuber i 30 min på romtemp. Pelleten blir synlig brunfarget som indikerer tilstedeværelsen av det uoppløselige DAB-reaksjonsproduktet.
      MERK: DAB-inkubasjonstiden må kanskje optimaliseres for hver prøve. Fargeendringen kan overvåkes på lysmikroskopet. Etter vår erfaring er en 15-45 min inkubasjon tilstrekkelig for de fleste proteiner. Hydrogenperoksid bør fås fra en nyåpnet flaske eller en som har blitt holdt godt forseglet etter åpning.
    4. Pellet cellene, deretter vaske 2x for 5 min med 0,1 M natrium cacodylate buffer, etterfulgt av en vask i Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) eller celle medier av valget.
  4. Resuspender cellepelleten i 500 μL av en kryobeskyttende løsning av DMEM (eller andre cellemedier) som inneholder 10 % fosterstorfeserum og 15 % storfeserumalbumin. Pellet igjen, noe som øker sentrifugehastigheten fra 500 x g om nødvendig for å oppnå en pellet i den tykke kryobeskyttende løsningen. Kast flertallet av supernatanten, slik at nok væske er igjen slik at pelletikke vil tørke ut. Transporter cellepelleten til høytrykksfryseinstrumentet.

3. Frysing av høyt trykk

  1. Fyll høytrykksfrysebeholderen med flytende nitrogen (LN2)og start pumpen for å fylle prøvekammeret med LN2.
    FORSIKTIG: Bruk riktige sikkerhetsprosedyrer og personlig verneutstyr ved arbeid med flytende nitrogen.
    MERK: Disse trinnene er spesifikke for Leica EMPACT2 høytrykksfryseren.
  2. Fukt bort eventuell gjenværende væske fra cellepelleten ved hjelp av hjørnet av en laboratorieserviett eller papirhåndkle. Nok væske bør forbli at pellet danner en pasta som ligner i konsistens til tannkrem. Den skal være tynn nok til å bli aspirert i en 20 μL rørspiss.
  3. Aspir2-3 μL av cellepelleten og deponer den på en membranbærer. Fyll brønnen til membranbæreren helt, slik at overflatespenningen skaper en liten kuppel på toppen, men væsken søler ikke ut av brønnen. Ingen luftbobler skal være til stede.
  4. Skyv membranbæreren inn i sylinderampullen og fest. Plasser kassetten i HPF-maskinen som er klargjort og primet, og trykk Start for å fryse.
  5. Inspiser temperaturen vs. tid og trykk vs. tidsgrafer for å kontrollere at trykket nådde 2100 bar og temperaturen nådde -196 °C innen 200 ms, og begge parametrene holdt seg stabile for 600 ms måling.
  6. Gjenta trinn 3.3 til 3.5 til cellepelleten er brukt eller ønsket antall prøver er frosset.
  7. Hold patronene nedsenket i LN2, fjern hver membranbærer fra sylinderampullen, legg i en plastkapsel og plasser plastkapselen i et kryohetteglass fullt av LN2.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her. Kryo-hetteglassene med prøver kan lagres i en LN 2-dewar i kryorør eller kryobokser.

4. Fryse substitusjon

FORSIKTIG: Bruk riktige sikkerhetsprosedyrer og personlig verneutstyr ved arbeid med flytende nitrogen. I tillegg er mange av kjemikaliene som benyttes i trinn 4 giftige, inkludert tannsyre, osmiumtetroksid og uranylacetat. Disse kjemikaliene må håndteres i henhold til riktige sikkerhetsprosedyrer og kastes som farlig kjemisk avfall.

  1. Fyll den automatiske frysesubstitusjonsenheten med LN2. Ta temperaturen til -90 °C.
  2. Forbered FS Mix 1 og start FS.
    1. I en kjemisk hette, lag en løsning på 0,2% tannsyre (m / v) og 5% DI vann i aceton og aliquot 1 ml per prøve i kryo-hetteglass. Plasser i LN2 for å fryse.
    2. Plasser FS Mix 1 hetteglass og kryo-ampuller som inneholder de frosne cellepellets i FS-enhetens prøvekammer. Overfør den indre kapselen som inneholder membranbæreren fra LN2 hetteglasset til det tilsvarende hetteglasset som inneholder FS Mix 1.
    3. Start en FS-protokoll med sitt første trinn er 24 timer ved -90 °C. Etter 24 timer, pause FS, og vask prøvene 3x i 5 min med aceton som er avkjølt til -90 ° C.
  3. Klargjør FS Mix 2 og komplett FS
    FORSIKTIG: Osmiumteroksid er et svært giftig og oksiderende kjemikalie som bare skal håndteres av opplærte personer i henhold til etablerte sikkerhetsprotokoller. Protokoller for lagring og avhending av osmiumholdige løsninger må følges, samt merking av laboratorieområder der osmiumtetroksid er i bruk. Osmium tetroxide bør håndteres i en kjemisk hette med personlig verneutstyr, inkludert øyebeskyttelse, en lab frakk som gir full arm beskyttelse, doble Nitril hansker, og en valgfri åndedrettsvern.
    1. I en kjemisk hette, utarbeide en løsning av 1% osmium tetroxide, 0,2% uranylacetat, og 5% DI vann i aceton. Aliquot 1 ml per prøve i kryo-hetteglass og plasser i LN2 for å fryse.
      MERK: Lagerløsninger av tannsyre (10 % m/v i aceton), osmiumtetroksid (10 % m/v i aceton) og uranylacetat (8 % m/v i metanol) kan tilberedes og lagres i kryo-hetteglass i en LN2-dewar for enkel tilberedning av FS-blandinger.
    2. Plasser kryohetteglassene med FS Mix 2 inn i FS-enheten og overfør kapslene fra den tredje acetonvasken til FS Mix 2 hetteglass. Inkuber i FS Mix 2 for 72 h ved -90 °C, etterfulgt av gradvis oppvarming til 0 °C over 12-18 timer.
  4. Hold temperaturen ved 0 °C og vask 3x i 30 min med forkjølt aceton fra en nyåpnet flaske.

5. Harpiks infiltrasjon og innebygging

FORSIKTIG: Harpiksen som brukes her (se Materialtabell)er giftig før polymerisering, og bør håndteres med riktige sikkerhetsprosedyrer og personlig verneutstyr. Enhver upolymerisert harpiks skal avhendes som farlig kjemisk avfall.

  1. Infiltrere prøvene med økende konsentrasjoner av harpiks oppløst i aceton fra en nyåpnet flaske. Forbered en blanding av harpikskomponenter A, B og D i et plastbeger i henhold til produsentens anvisninger, og inkubatorprøver i følgende harpikskonsentrasjoner: 2%, 4%, og 8% for 2 timer hver ved 0 °C. Inkuber i 15%, 30%, 60%, 90%, og 100% harpiks i 4 timer hver ved romtemperatur. Inkuber i 4 timer i en blanding av komponenter A, B, C og D.
  2. Plasser membranbærerne med cellepellet side opp i flate innebygging smiformer og fyll med harpiks (A, B, C og D). Papiretiketter for prøvene kan legges til brønnene på dette tidspunktet.
  3. Polymeriser i ovnen ved 60 °C i 24-36 timer.
    MERK: Protokollen kan settes på pause etter polymeriseringen.
  4. Fjern blokkene fra formen og la avkjøles. For å fjerne membranbæreren, plasser først prøven i den vertikale chucken av ultramikrotomen hvor den kan visualiseres med forstørrelse. Skill membranbæreren fra blokken ved en kombinasjon av dabbing flytende nitrogen på membranbæreren for å skille metallet fra plasten, og bruk et barberblad for å chippe bort harpiksen rundt membranbæreren. Når den er separert, løft forsiktig membranbæreren og la cellepelletkuppelen stå på forsiden av blokken.
  5. Plasser blokken med den eksponerte cellepelleten vendt oppover i en flat innebyggingsform som er litt dypere enn den første formen, og fyll med harpiks. Polymeriser ved 60 °C i 24–36 timer.
    MERK: Protokollen kan settes på pause etter polymeriseringen.

6. Snitting

  1. Trim blokken rundt cellepelleten ved hjelp av et barberblad. Plasser deretter blokken i prøvechucken på snittarmen til et ultramikrotome. Bruk et glass eller en diamantkniv til å trimme blokken i en trapesformet form tett rundt cellepelleten.
  2. Få 90 nm ultratynne deler av cellepelleten ved hjelp av et glass eller en diamantkniv.
  3. Plukk opp et bånd med inndelinger i et TEM-rutenett. Formvar-belagt kobber spor rutenett (1 x 2 mm2 spor) er nyttig for bildeserieseksjoner. Tørk rutenettet ved å tørke kanten på et stykke filterpapir, og oppbevar esken i en TEM-rutenettoppbevaringsboks.
    MERK: Protokollen kan settes på pause etter inndeling.

7. TEM-avbildning

  1. Monter rutenettet på TEM-holderen og plasser inn i mikroskopet. Vi bruker rutinemessig en Tecnai T12 på 80 kV for screening cryoAPEX prøver. Erverve bilder av celler og subcellulære strukturer av interesse med APEX2 merking.
  2. Hvis ønskelig, få ekstra membran kontrast ved bruk av bly etter farging. Se figur 2 for sammenligning av ikke-postfargede prøver ( figur2I–K) og bly postfargede prøver ( figur2A-H).
    1. Flyte tørre gitter snitt-side ned på en dråpe fortynnet natriumklorid oppløsning (~ 1,5 mM), 2x for 1 min hver, deretter 1x i 10 min.
    2. Flytegitter på en dråpe av Satos blyløsning i 1 min. Vask ved å flyte på natriumkloridoppløsning 3x i 1 min, deretter på DI vann 3x i 1 min. Blot overflødig væske fra rutenettene og lagre i en rutenettboks.
      FORSIKTIG: Bly er et giftig kjemikalie og bør håndteres med riktige sikkerhetsprosedyrer og personlig verneutstyr. Løsninger som inneholder bly skal avhendes som farlig kjemisk avfall.
  3. Bilde postfargede prøver på TEM.
    MERK: I tradisjonell prøveforberedelse av TEM utføres det ledende kontrasttrinnet før TEM-avbildning. Det anbefales imidlertid at for kryoAPEX-prøver utføres avbildning først på ikke-kontrasterte prøver. Dette sikrer at signalet fra taggen lett kan plasseres ved sin sterke kontrast med de mer lett fargede cellulære strukturene. For mange prøver vil det ikke være nødvendig med ytterligere farging; Hvis det imidlertid er ønsket ekstra membrankontrast, kan blyetterfarging utføres (trinn 7.2) og prøven avbildes på nytt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å sammenligne den ultrastrukturelle bevaringen ved hjelp av kryoAPEX-metoden med tradisjonell fiksering og dehydrering, forberedte vi prøver der en endoplasmatisk reticulummembran (ERM; ER membran) peptid ble merket med APEX2 og transfected til HEK-293T celler. ERM-APEX2 lokaliserer til det cytoplasmatiske ansiktet til ER og ommodellerer ER-strukturen til morfologisk distinkte strukturer kjent som organisert glatt ER (OSER)34,42,43. OSER morfologi inkluderer regioner med glatte, parallelle, tett stablede membraner som tjener som en optimal region for å sammenligne ultrastrukturell bevaring. Utarbeidelse av prøven ved tradisjonelle APEX-metoder resulterte i klar merking av OSER-strukturer (figur 2A–D). Ved inspeksjon ved høy forstørrelse, de stablede membranene dukket ruffled og ikke-ensartede hull var til stede mellom konsentriske membran tettheter, indikerer dårlig membran bevaring og lipid utvinning (Figur 2D). Prøven utarbeidet av cryoAPEX hadde også klart definert merking av OSER strukturer; Men membranene var glatte og parallelle, og lite eller ingen lipidekstraksjon ble sett (Figur 2E-H). Resultatene fra cryoAPEX var av lignende bevaring av høy kvalitet som de som ble hentet fra en prøve som gjennomgikk HPF/FS uten ytterligere kjemisk fiksering og APEX2/DAB-reaksjonstrinn (figur 2I–K).

I tillegg til visuelt merkbar membranbevaring bevarer kryoAPEX-metoden proteinet av interesse slik at aspekter ved proteindistribusjonsmønstre kan observeres i noen tilfeller. For å illustrere dette punktet brukte vi et annet ER-lokalisert protein, huntingtin gjær interagerende protein E (HYPE). HYPE er et membranprotein som ligger på luminalansiktet til ER-membranen 44,45,46,47. HYPE-APEX2 konstruksjoner ble overuttrykt i HEK-293T celler. TEM analyse av 90 nm tynne seksjoner viste at HYPE var til stede i hele perifere ER samt atomkonvolutten (Figur 3A,B). I tillegg var HYPE tetthet en stand til å løses inn i regelmessig fordelt foci langs lumenal ER membran (Figur 3C, piler). HYPE distribusjon og foci var også synlig i en prøve utarbeidet med tradisjonell fiksering og dehydrering; Omfattende membranavbrudd og ekstraksjon var imidlertid til stede, noe som gjorde prøven suboptimal (Figur 3D,E).

For å demonstrere den robuste organellars spesifisitet og anvendelighet av cryoAPEX-metoden for en rekke merkede proteiner, utførte vi APEX2-merking ved hjelp av tre cellulære markører. Mitokondrier ble merket med mito-V5-APEX234. Denne markøren av mitokondriematrisen ga spesifikk farging av mitokondrier bare (figur 4A). På samme måte vurderte vi plasmamembranmerking ved hjelp av CAAX-APEX234, som kun produserte distinkt farging av plasmamembranen (figur 4C). Ingen merking ble observert hos intracellulære organeller (figur 4C). I tillegg opprettet vi en ny konstruksjon som en markør for Golgi-lumen ved å fusjonere de første 118 aminosyrene i musen isoform av α-mannosidase med APEX2 genet48. Den resulterende MannII-APEX2 ble forbigående overført til celler som senere ble utarbeidet av kryoAPEX-metoden. Farget Golgi stabler var tydelig skilles fra de omkringliggende organeller (Figur 4B). Individuelle stabler, sisterner og noen vesikler ble merket, typisk for Golgi farging (Figur 4B). Til sammen viser disse markørene at kryoAPEX-metoden gir spesifikk merking av membranproteiner innenfor ulike organeller med høy nok oppløsning for å skille dem fra omkringliggende subcellulære strukturer.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk av de viktigste trinnene i CryoAPEX-protokollen. (A) Celler dyrkes og overføres med en APEX2 plasmid. (B) Celler er pelleted og festet med glutaraldehyd, etterfulgt av (C) inkubasjon med DAB og hydrogenperoksid for å produsere peroksidase reaksjonsproduktet. (D) Pelleten er kryofikset av HPF, (E) fryse erstattet med tungmetaller og aceton, og (F) innebygd i harpiks. Tynne seksjoner samles på mikrotomen. (G) TEM-avbildning utføres, og ytterligere kontrast kan legges til ved etterfarging. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning av OSER membranbevaring ved hjelp av tradisjonell kjemisk fiksering, kryoAPEX og HPF/FS. Dab reagerte på ERM–APEX2-uttrykkende celler som ble behandlet via tradisjonell kjemisk fiksering og alkoholdehydrering (A–D) eller av cryoAPEX (E-H)sammenlignet med ERM–APEX2 som uttrykte celler som ble kryofikset live og utenDAB-reaksjonen ( I–K). De levende kryofiksede cellene representerer den beste oppnåelige ultrastrukturelle bevaringen og tjener her som beregning for evaluering av membranbevaring oppnådd via de to APEX-baserte deteksjonsprotokollene (A-H). Den jevnt fordelte parallelle lamellarstablingen av ER-avledede membraner oppnådd av cryoAPEX (eksemplifisert i paneler G og H),i motsetning til ruffled membraner oppnådd av tradisjonelle metoder (panel C og D), fremhever overlegen membran bevaring oppnådd av cryoAPEX. Dette tallet er endret fra Sengupta et al. 201948. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Proteinlokalisering av et APEX2-merket ER-membranprotein kan løses til periodisk ei. (A) Et bilde av en tynn del av en HEK-293T celle som uttrykker HYPE-APEX2 og behandlet av cryoAPEX avslører farging av ER i en godt bevart (tett) cytoplasmatisk bakgrunn (B,C). Høyere forstørrelsesbilder av en liten del av den perifere ER (avgrenset av gul boks i A og vist i B, med ytterligere forstørrelse av rød boks i B vist i C)viser periodiske foci av APEX2-generert tetthet (B, rød boks og C, hvite pilspisser som viser periodicitet mellom HYPE foci). (D) Bilde av en tynn del av en celle som uttrykker HYPE-APEX2 og utarbeidet av tradisjonell kjemisk fiksering og dehydrering viser spesifikk farging av kortikal ER og atomkonvolutten (røde piler). (E) Ved en høyere forstørrelse var periodisk hype-spesifikke foci tydelig innenfor strekninger av ER (gul boks og hvite pilhoder i innfelt), til tross for omfattende membranforstyrrelser, indikert av røde piler. NE = kjernefysisk konvolutt. Dette tallet er endret fra Sengupta et al. 201948. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Organellemarkører viser spesifisitet av signalet hentet fra APEX2-merkede proteiner. APEX2-merket proteinkonstruksjoner designet for å lokalisere mitokondriematrisen (mito-V5-APEX2; vist i A),eller Golgi-lumen (α-mannII-APEX2; vist i B),eller plasmamembranen (CAAX-APEX2; vist i C) ble transiently uttrykt i HEK293-celler og prøvene behandlet av cryoAPEX. Hver konstruksjon ga organelle spesifikke tettheter. Forstørrede visninger av to seksjoner (gule eller røde bokser) fra cellene som uttrykker α-mannIIAPEX2 (panel B) eller CAAX-APEX2 (panel C)vises. Dette tallet er endret fra Sengupta et al. 201948. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CryoAPEX-protokollen som presenteres her gir en robust metode for å karakterisere lokaliseringen av membranproteiner i cellulært miljø. Ikke bare gir bruk av en genetisk kodet APEX2-tag presis lokalisering av et protein av interesse, men bruk av kryofiksering og lavtemperatur dehydrering gir utmerket bevaring og farging av den omkringliggende cellulære ultrastrukturen. Kombinert er disse tilnærmingene et kraftig verktøy for å lokalisere et protein med høy presisjon i sin subcellulære kontekst.

Kjernen i utviklingen av denne metoden er det faktum at tapet av ultrastruktur opplevd etter forberedelse av tradisjonelle TEM-metoder kommer hovedsakelig fra dehydreringstrinnet i stedet for fikseringstrinnet 40. Det ble tidligere antatt at peroksidasebaserte metoder var uforenlige med HPF/FS fordi de krever kjemisk fiksering før peroksidasereaksjonen. For å omgå dette ble en protokoll kalt CryoCHEM nylig utviklet der prøver i utgangspunktet kryofikset, etterfulgt av rehydrering og peroksidasereaksjonen49. Denne tilnærmingen gir utmerket mållokalisering med betydelige forbedringer i prøvefarging og bevaring. Det har vist seg å være nyttig for vevsprøver og i tilfeller der korrelativ fluorescens og elektronmikroskopi er ønsket. Parallelt med cryoCHEM kombinerer vår metode glutaraldehydfiksering med HPF og FS. CryoAPEX tilbyr en strømlinjeformet protokoll som fungerer effektivt selv for små cellulære prøver.

Tilgang til trykkfrysing og frysing av substitusjonsinstrumenter er avgjørende for kryoAPEX-metoden. Disse instrumentene og ferdighetene blir stadig vanligere i EM-anlegg. Selv om HPF- og FS-utstyr ikke er lett tilgjengelig, er den kjemisk faste prøven stabil nok til at en kort tid transporteres beskjedne avstander40. Vi har funnet ut at prøver kan lagres etter DAB-reaksjonen ved 4 °C i minst 48 timer før HPF uten betydelig tap av kvalitet. Et annet kritisk aspekt ved cryoAPEX-protokollen er inkluderingen av kontroller, som er avgjørende for et robust eksperiment og overbevisende resultater. Prøver utarbeidet av forbigående transfection med effektivitet mindre enn 100% vil inneholde negative kontrollceller samt merkede celler i samme prøve. Hvis du bruker cellelinjer med stabilt uttrykk for APEX2, bør en egen negativ kontroll utarbeides av transfection av celler med det ikke-APEX2-merkede proteinet av interesse. Flere konstruksjoner som kan tjene som organellar kontroller er tilgjengelig gjennom Addgene, og publiserte bilder er tilgjengelig i denne og andre publikasjoner som kan brukes til verifisering33,34,36,48. Grundig diskusjon om eksperimentell design og verifisering av nye APEX2 fusjonskonstruksjoner er levert av Martell et al.36

Mens kryoAPEX er bredt nyttig for påvisning av membranproteiner, finnes det noen begrensninger. Selv om APEX2 er et lite 28 kDa-protein, kan det hende at noen proteiner ikke kan innlemme taggen33,34. APEX2 anses ikke som nyttig for merking av løselige proteiner i cytosol, på grunn av det diffuse reaksjonsproduktet33,36. I tillegg utgjør påvisning av små mengder protein en utfordring på grunn av tilstedeværelsen av flekker i den omkringliggende cellen. Forberedelse av HPF og FS bevarer cellulære komponenter som ekstraheres av tradisjonell fiksering og dehydrering. Dette fører til generell mørkere flekker i cellen, potensielt konkurrerer med lave nivåer av APEX2 merking.

CryoAPEX-teknikken gjelder mye for mange proteiner, med et begrenset antall trinn som kan kreve optimalisering. For det første, på grunn av individuell variasjon blant proteiner, kan det hende at proteinuttrykksnivået og/eller DAB-reaksjonstiden må justeres for at signalet skal visualiseres over cellefarging. Nyttig informasjon og protokoller for validering av nye APEX2 fusjonskonstruksjoner og optimalisering av uttrykket og DAB-farging er gitt av Martell et al.36 Fra et mobilt fargeperspektiv må FS-protokollen og/eller kjemikaliene justeres for optimal visualisering av forskjellige organelle membraner, innenfor ulike celletyper, vev eller organismer50,51,52,53,54. Etter vår erfaring har FS-forholdene som presenteres her fungert bra for en rekke pattedyrcellelinjer.

Den hybride tilnærmingen til cryoAPEX har potensial til å bli brukt på mange andre genetiske merkingteknikker. Erstatte tradisjonell alkohol dehydrering med HPF / FS forventes å forbedre ultrastrukturell bevaring og protein lokalisering informasjon. Ved hjelp av safirplater som et cellesubstrat for å fikse celler som monolayer forbedrer bevaringen av celleperiferien, inkludert cytoskjelettet og cellecellerkontakter. Mindre endringer i protokollen vil være nødvendig for å bruke safirplater. APEX-teknologi kan brukes til å oppdage grønne fluorescerende proteiner (GFP) merkede proteiner via et GFP-bindende peptid35. Denne indirekte deteksjonsmetoden åpner opp for potensialet til å bruke APEX-teknologi for de utallige proteinene som allerede er merket med GFP. Den nylig introduserte splitten APEX2 vil være en fordel for nærhets- og interaksjonsstudier55. I tillegg kan eksisterende HRP-baserte metoder kombineres med HPF/FS for å forbedre mobilbevaring. Et eksempel er fluorescent indicator og peroxidase for precipitation med EM roppløsning (FLIPPER), der individuelle cellemarkører har blitt smeltet sammen med både en fluorescerende tag og HRP, som gir lumenal markører for Golgi eller ER56. Bruk av forbedrede peroksidater i stedet for DAB er også mulig med denne metoden, inkludert substrater som er optimalisert for RNA-merking 57. CryoAPEX gir også in-cell merking og ultrastrukturell bevaring nødvendig for tredimensjonal analyse av proteindistribusjon gjennom elektrontomografi, og potensielt ved høye volumer gjennom SBF-SEM eller FIB-SEM48,58.

Samlet sett er CryoAPEX en robust metode med bred anvendelighet. I prinsippet kan det påføres ethvert membranprotein, enten innenfor et organels lumenalrom, på cytoplasmatisk ansikt, i vesikler, på cellens plasmamembran eller til og med i det ekstracellulære rommet. For dette store spekteret av membranproteiner gir kryoAPEX-metoden potensial til å se lokalisering og distribusjon av et protein med nøyaktighet i sin subcellulære kontekst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Protokollen beskrevet her stammer fra en publikasjon av Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Dette arbeidet støttes av tilskudd R01GM10092 (til S.M.) og AI081077 (R.V.S.) fra National Institutes of Health, CTSI-106564 (til S.M.) fra Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, og PI4D-209263 (til S.M.) fra Purdue University Institute for Inflammation, Immunology, and Infectious Disease.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. Oliver, C., Jamur, M. C. 588, Humana Press. 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. Mueller-Reichert, T., Verkade, P. 111, Elsevier. 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. Hajibagheri, N. 117, Humana Press. 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , International ed. in English (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Tags

Biologi Utgave 156 CryoAPEX membranprotein APEX2 transmisjonelektronmikroskopi cryofixation trykkfrysing med høyt trykk frysesubstitusjon
CryoAPEX-metoden for elektronmikroskopianalyse av membranproteinlokalisering innenfor ultrastrukturelt bevarte celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin,… More

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter