Summary
Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.
Abstract
Belangrijke cellulaire gebeurtenissen zoals signaaltransductie en membraanhandel vertrouwen op de juiste eiwitlocatie in cellulaire compartimenten. Inzicht in nauwkeurige subcellulaire lokalisatie van eiwitten is dus belangrijk voor het beantwoorden van veel biologische vragen. De zoektocht naar een robuust label om eiwitlokalisatie te identificeren in combinatie met voldoende cellulaire conservering en kleuring is historisch uitdagend. Recente vooruitgang in elektronenmicroscopie (EM) beeldvorming heeft geleid tot de ontwikkeling van vele methoden en strategieën om cellulaire conservering te verhogen en het label doel eiwitten. Een relatief nieuwe peroxidase-gebaseerde genetische tag, APEX2, is een veelbelovende leider in kloonbare EM-actieve tags. Monstervoorbereiding voor transmissieelektronenmicroscopie (TEM) is de laatste jaren ook gevorderd met de komst van cryofixatie door hoge drukbevriezing (HPF) en uitdroging en vlekken bij lage temperaturen via vriessubstitutie (FS). HPF en FS bieden een uitstekende bewaring van cellulaire ultrastructuur voor TEM-beeldvorming, op de tweede plaats om cryo-beeldvorming van glasachtige monsters te direct. Hier presenteren we een protocol voor de cryoAPEX methode, die het gebruik van de APEX2 tag combineert met HPF en FS. In dit protocol wordt een eiwit van belang getagd met APEX2, gevolgd door chemische fixatie en de peroxidase reactie. In plaats van traditionele vlekken en alcohol uitdroging bij kamertemperatuur, het monster is cryofixed en ondergaat uitdroging en vlekken bij lage temperatuur via FS. Met behulp van cryoAPEX kan niet alleen een eiwit van belang worden geïdentificeerd in subcellulaire compartimenten, maar ook aanvullende informatie kan worden opgelost met betrekking tot de topologie binnen een structureel bewaard membraan. We tonen aan dat deze methode een hoge resolutie kan bieden om eiwitverdelingspatronen binnen een organellelumen te ontcijferen en om de compartimentering van een eiwit binnen één organelle te onderscheiden in de nabijheid van andere niet-gelabelde organellen. Verder is cryoAPEX procedureel eenvoudig en vatbaar voor cellen die in de weefselkweek worden gekweekt. Het is technisch niet uitdagender dan typische cryofixatie- en vriessubstitutiemethoden. CryoAPEX is op grote schaal toepasbaar voor TEM-analyse van membraaneiwit dat genetisch kan worden getagd.
Introduction
Biologische studies omvatten vaak vragen over het oplossen van subcellulaire eiwitlokalisatie in cellen en organellen. Immunofluorescentie microscopie biedt een nuttige lage resolutie weergave van eiwitlokalisatie, en de recente vooruitgang in super-resolutie beeldvorming duwen de grenzen van de resolutie voor fluorescerende gelabelde eiwitten1,2,3. Echter, elektronenmicroscopie (EM) blijft de gouden standaard voor beeldvorming hoge resolutie cellulaire ultrastructuur, hoewel de etikettering van eiwitten is een uitdaging.
Historisch gezien zijn verschillende EM-methoden gebruikt om vragen van ultrastructurele eiwitlokalisatie te benaderen. Een van de meest gebruikte methoden is immuno-elektronenmicroscopie (IEM), waarbij antigeenspecifieke primaire antilichamen worden gebruikt om het eiwit van belang te detecteren. EM-signaal wordt gegenereerd door de toepassing van secundaire antilichamen die zijn vervoegd met elektronendichte deeltjes, meestal colloïdaal goud4,5. Afwisselend kunnen antilichamen die zijn vervoegd met enzymen zoals mierikswortel peroxidase (HRP) worden gebruikt om een elektronendicht neerslag te produceren6,7,8. Er bestaan twee belangrijke benaderingen voor IEM, de zogenaamde pre-embedding en post-embeding labeling. Bij pre-inbedding van IEM worden antilichamen rechtstreeks in cellen geïntroduceerd, wat lichte fixatie en permeabilisatie van de cellen9,10,11noodzakelijk maakt. Beide stappen kunnen ultrastructuur12,13beschadigen. De ontwikkeling van aanzienlijk kleinere antilichamen bestaande uit een antilichaam Fab fragment vervoegd met 1,4 nm nanogoud maakt het mogelijk zeer zachte permeabilisatie voorwaarden te gebruiken; nanogold is echter te klein voor directe visualisatie onder TEM en vereist extra verbeteringsstappen om zichtbaar te worden14,15,16. Bij post-inbedding IEM worden antilichamen aangebracht op dunne delen van cellen die volledig zijn verwerkt door fixatie, uitdroging en inbedding in hars17. Hoewel deze aanpak de permeabilisatiestap vermijdt, is het behoud van de epitoop van belang tijdens de steekproefvoorbereiding een uitdaging18,19,20. De Tokuyasu-methode van lichtfixatie gevolgd door bevriezing, cryo-sectioning en antilichaamdetectie zorgt voor een verbeterde epitoopconservering21,22. De technische vereisten van cryo-ultramicrotomie en het suboptimale contrast in de cel zijn echter nadelen23.
Het gebruik van genetisch gecodeerde tags elimineert veel van de moeilijkheden van IEM in verband met de detectie van het eiwit van belang. Er zijn verschillende tags beschikbaar, waaronder HRP, ferritine, ReAsH, miniSOG en metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Elk van deze heeft voordelen ten opzichte van eerdere methoden, maar elk heeft ook nadelen voorkomen wijdverbreid gebruik. Deze nadelen variëren van inactiviteit van HRP in de cytosol tot de grote omvang van de ferritinetag, lichtgevoeligheid van ReAsH en kleine omvang en gebrek aan compatibiliteit met cellulaire vlekken van metallothionein. Onlangs is een eiwit afkomstig van ascorbaat peroxidase ontworpen als een EM-tag, genaamd APEX233,34. Als peroxidase kan APEX2 de oxidatie van 3,3' diaminobenzidine (DAB) katalyseren, waardoor een neerslag ontstaat dat reageert met osmium tetroxide om lokaal EM-contrast te bieden met minimale diffusie van het eiwit van belang (minder dan 25 nm)33,35. In tegenstelling tot traditionele HRP-gebaseerde methoden is APEX2 uiterst stabiel en blijft het actief in alle cellulaire compartimenten33. Monsters kunnen voor TEM worden verwerkt met behulp van traditionele EM-monsterkleuring en methoden die een goede visualisatie van de omringende structuren mogelijk maken33,34,36. Door zijn kleine omvang, stabiliteit en veelzijdigheid is APEX2 uitgegroeid tot een EM-tag met een groot potentieel.
Veel van de hierboven besproken benaderingen kunnen of zijn nog niet gecombineerd met de huidige stand van de techniek in ultrastructurele conservering, cryofixatie en lage temperatuur vriessubstitutie. Zo hebben ze last van een gebrek aan membraanbehoud en/of celkleuring om nauwkeurige eiwitlokalisatie te bepalen. Dit beperkt noodzakelijkerwijs de resolutie en interpretatie van de gegevens die kunnen worden verkregen. Cryofixatie door hoge druk bevriezing (HPF) omvat een snelle bevriezing van monsters in vloeibare stikstof bij een hoge druk (~ 2.100 bar), die vitrificatie veroorzaakt in plaats van kristallisatie van waterige monsters, waardoor cellen in een bijna-inheemse toestand37,38,39. HPF wordt gevolgd door vriessubstitutie (FS), een lage temperatuur (-90 °C) uitdroging in aceton in combinatie met incubatie met typische EM-vlekken zoals osmium tetroxide en uranylacetaat. HPF en FS samen bieden een duidelijk voordeel ten opzichte van de traditionele chemische fixatie (een langer proces dat kan leiden tot artefacten) en alcohol uitdroging bij kamertemperatuur of op ijs (wat kan leiden tot extractie van lipiden en suikers), en dus wenselijk zijn om te combineren met de beste EM-tags voor eiwitdetectie.
Een van de redenen dat HPF/FS niet is gecombineerd met APEX2-etikettering is dat lichte chemische fixatie een voorwaarde is voor de peroxidasereactie, waardoor de verspreiding van het DAB-reactieproduct wordt beperkt. In APEX2-studies tot nu toe worden fixatie en peroxidasereactie gevolgd door traditionele EM-methoden voor kleuring en alcoholuitdroging33,36. Er is echter aangetoond dat het volgen van chemische fixatie met HPF/FS een duidelijk voordeel biedt bij het behoud ten opzichte van traditionele chemische fixatie en alcoholuitdroging alleenal 40. Het verlies van ultrastructurele integriteit gezien in de traditionele TEM monsters lijkt minder verbonden met fixatie dan met uitdroging, die meestal wordt gedaan met behulp van alcohol bij kamertemperatuur of op ijs, en kan leiden tot extractie van lipiden en suikers40,41. Om de cryoAPEX-methode te ontwikkelen, veronderstelden we dat chemische fixatie en peroxidasereactie, gevolgd door HPF en FS, een optimaal resultaat zou opleveren in termen van ultrastructurele conservering.
Hier presenteren we het cryoAPEX-protocol, dat APEX2-tagging combineert met cryofixatie- en vriessubstitutiemethoden(figuur 1). Dit eenvoudige protocol bestaat uit transfection van een APEX2-gelabeld eiwit van belang, chemische fixatie van cellen, en de peroxidase reactie. HPF en FS worden vervolgens uitgevoerd, gevolgd door typische hars inbedding en dunne delen. TEM imaging onthult een uitstekende bewaring van ultrastructuur met behulp van deze methode. Daarnaast werden subcellulaire lokalisatie met hoge resolutie en ruimtelijke verdeling van een endoplasmische reticulum (ER) luminaaleiwit waargenomen. Deze methode is op grote schaal nuttig voor de detectie van membraan eiwitlokalisatie binnen cellen voor elektronenmicroscopie analyse. In onze handen, heeft de methode met succes gewerkt voor een verscheidenheid van cellijnen geteeld in weefselcultuur, met inbegrip van HEK-293T (menselijke embryonale nier), HeLa (menselijke baarmoederhalskanker), Cos7 (Afrikaanse groene aap nier fibroblast), en BHK (baby hamster nier). Gedetailleerde instructies worden hieronder beschreven met behulp van HEK-293T cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celcultuur en transfection
- Zaad HEK-293T cellen met een diameter van 60 mm of grotere weefselkweekschotel en groeien tot 60%-90% samenvloeiing in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Transfect-cellen met APEX2-gelabelde zoogdierexpressieplasmiden met transfection reagens (zie Tabel met materialen)volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
- Bij 12-15 uur na het transfectie, wascellen eenmaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder cellen uit de schotel door zacht wassen met PBS. Een dissociatiereagens zoals trypsine kan worden gebruikt indien nodig voor een bepaald celtype. Centrifugeer bij 500 x g voor 5 min om een pellet tevormen.
2. Chemische fixatie en peroxidasereactie
- Verwijder voorzichtig de supernatant en brep de pellet opnieuw in 2 mL van 2% glutaraldehyde (v/v) in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer, pH 7.4, bij kamertemperatuur. Plaats monster op ijs en uitbroed gedurende 30 min. Pellet het monster op 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Houd vanaf dit punt tot stap 2.3.3 het monster en de oplossingen op ijs en voer centrifugeren bij 4 °C.
LET OP: Zowel glutaraldehyde als natriumcacodylaatbuffer (met arseen) zijn giftig. Tijdens het hanteren moeten goede veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen worden gebruikt. Oplossingen die glutaraldehyde en/of natriumcacodylaatbuffer bevatten, moeten als gevaarlijk chemisch afval worden verwijderd. - Was de pellet 3x gedurende 5 min met 2 mL natriumcacodylaatbuffer. Voor deze en latere wasbeurten, voorzichtig opnieuw opschorten van de cel pellet in de vereiste oplossing, dan centrifugeeren voor 5 min op 500 x g en zorgvuldig verwijderen en gooi de supernatant. Zorg moet worden genomen met de herhaalde pelleting en resuspension stappen, om monsterverlies te minimaliseren.
- Voer de peroxidasereactie uit
- Bereid een verse oplossing voor die 1 mg/mL van 3,3%-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) bevat in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer. Los de DAB op door 5-10 min krachtig vortexen.
LET OP: DAB is giftig en een potentieel kankerverwekkend en moet worden behandeld met de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen. Oplossingen die DAB bevatten, moeten worden behandeld als gevaarlijk chemisch afval. - Was pellet door resuspending in 3 mL DAB-oplossing gevolgd door pelleting op 500 x g voor 5 min.
- Resuspend de pellet in 3 mL DAB oplossing waaraan waterstofperoxide is toegevoegd om een definitieve concentratie van 5,88 mM te bereiken. Incubeer voor 30 min op kamer temp. De pellet wordt zichtbaar bruingekleurd, wat de aanwezigheid van het onoplosbare DAB-reactieproduct aangeeft.
OPMERKING: De DAB-incubatietijd moet mogelijk voor elk monster worden geoptimaliseerd. De kleurverandering kan worden gecontroleerd op de lichtmicroscoop. In onze ervaring is een incubatie van 15-45 min voldoende voor de meeste eiwitten. Waterstofperoxide moet worden verkregen uit een vers geopende fles of een die goed is bewaard na het openen. - Pellet de cellen, dan wassen 2x voor 5 min met 0,1 M natrium cacodylaat buffer, gevolgd door een wassen in dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) of cel media naar keuze.
- Bereid een verse oplossing voor die 1 mg/mL van 3,3%-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) bevat in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer. Los de DAB op door 5-10 min krachtig vortexen.
- Schorsde de celpellet in 500 μL van een cryoprotectivistische oplossing van DMEM (of andere celmedia naar keuze) met 10% foetaal runderserum en 15% runderserumalbumine. Pellet weer, licht verhogen van de centrifuge snelheid van 500 x g indien nodig om een pellet te bereiken in de dikke cryo-protectant oplossing. Gooi de meerderheid van de supernatant weg, zodat er voldoende vloeistof overblijft, zodat de pellet niet uitdroogt. Transport de celpellet naar het hogedrukvriesinstrument.
3. Hogedrukbevriezing
- Vul het hogedrukvriesreservoir met vloeibare stikstof (LN2)en start de pomp om de monsterkamer te vullen met LN2.
LET OP: Gebruik de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen bij het werken met vloeibare stikstof.
OPMERKING: Deze stappen zijn specifiek voor de Leica EMPACT2 hogedrukvriezer. - Wick weg alle resterende vloeistof uit de cel pellet met behulp van de hoek van een laboratorium doekje of papieren handdoek. Genoeg vloeistof moet blijven dat de pellet vormt een pasta vergelijkbaar in consistentie met tandpasta. Het moet dun genoeg zijn om te worden aangezogen in een 20 μL pipet tip.
- Aanzuigen 2-3 μL van de celpellet en deponeren op een membraan drager. Vul de put van de membraandrager volledig, zodat de oppervlaktespanning een lichte koepel bovenop creëert, maar de vloeistof lekt niet uit de put. Er mogen geen luchtbellen aanwezig zijn.
- Schuif de membraandrager in de cartridge en zet deze veilig. Plaats de cartridge in de HPF-machine die is voorbereid en geprimed, en druk op Start om te bevriezen.
- Inspecteer de temperatuur vs. tijd en druk grafieken om te controleren of de druk bereikt 2100 bar en de temperatuur bereikt -196 °C binnen 200 ms, en beide parameters stabiel gebleven voor de 600 ms van de meting.
- Herhaal stap 3.3 tot 3,5 totdat de celpellet is gebruikt of het gewenste aantal monsters is ingevroren.
- Houd de cartridges ondergedompeld in LN2,verwijder elke membraandrager van de cartridge, plaats in een plastic capsule en plaats de plastic capsule in een cryo-flacon vol LN2.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. De cryo-flesjes met monsters kunnen worden opgeslagen in een LN2 dewar in cryo-canes of cryo-boxen.
4. Substitutie bevriezen
LET OP: Gebruik de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen bij het werken met vloeibare stikstof. Bovendien, veel van de chemische stoffen gebruikt in stap 4 zijn giftig, met inbegrip van tanninezuur, osmium tetroxide, en uranyl acetaat. Deze chemische stoffen moeten volgens de juiste veiligheidsprocedures worden behandeld en als gevaarlijk chemisch afval worden verwijderd.
- Vul de geautomatiseerde freeze substitutie-eenheid met LN2. Breng de temperatuur op -90 °C.
- Bereid FS Mix 1 voor en begin FS.
- Bereid in een chemische kap een oplossing van 0,2% tanninezuur (w/v) en 5% DI-water in aceton en aliquot 1 mL per monster in cryo-flacons. Plaats in LN2 om te bevriezen.
- Plaats de FS Mix 1 flacons en de cryo-flacons met de bevroren celpellets in de monsterkamer van de FS-eenheid. Breng de binnenste capsule met de membraandrager van de LN2 flacon over in de bijbehorende flacon met FS Mix 1.
- Start een FS-protocol met de eerste stap is 24 uur bij -90°C. Na de 24 uur, pauzeer de FS, en was de monsters 3x gedurende 5 minuten met aceton die is afgekoeld tot -90 °C.
- Bereid FS Mix 2 en voltooi FS
LET OP: Osmium tetroxide is een zeer giftige en oxiderende chemische stof die alleen mag worden behandeld door getrainde individuen volgens vastgestelde veiligheidsprotocollen. Protocollen voor de opslag en verwijdering van osmiumhoudende oplossingen moeten worden gevolgd, evenals de etikettering van laboratoriumgebieden waar osmium tetroxide wordt gebruikt. Osmium tetroxide moet worden behandeld in een chemische kap met persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder oogbescherming, een labjas die volledige armbescherming biedt, dubbele Nitrilhandschoenen en een optionele ademhalingsmasker.- In een chemische kap, bereiden een oplossing van 1% osmium tetroxide, 0,2% uranyl acetaat, en 5% DI water in aceton. Aliquot 1 mL per monster in cryo-flesjes en plaats in LN2 om te bevriezen.
OPMERKING: Stockoplossingen van tanninezuur (10% w/v in aceton), osmium tetroxide (10% w/v in aceton) en uranylacetaat (8% w/v in methanol) kunnen worden bereid en opgeslagen in cryo-flesjes in een LN 2-dewar voor het gemak van bereiding van FS Mixen. - Plaats de cryo-flacons met FS Mix 2 in de FS-unit en breng de capsules van de derde acetonwasin de FS Mix 2 flacons. Incubeer in FS Mix 2 voor 72 uur bij -90 °C, gevolgd door geleidelijke opwarming tot 0 °C over 12-18 uur.
- In een chemische kap, bereiden een oplossing van 1% osmium tetroxide, 0,2% uranyl acetaat, en 5% DI water in aceton. Aliquot 1 mL per monster in cryo-flesjes en plaats in LN2 om te bevriezen.
- Houd de temperatuur op 0 °C en was 3x gedurende 30 min met voorgekoelde aceton uit een vers geopende fles.
5. Hars Infiltratie en inbedding
LET OP: De hars die hier wordt gebruikt (zie Tabel met materialen)is giftig voorafgaand aan polymerisatie en moet worden behandeld met de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen. Ongepolymeriseerde hars moet worden verwijderd als gevaarlijk chemisch afval.
- Infiltreren in de monsters met toenemende concentraties hars opgelost in aceton uit een nieuw geopende fles. Bereid een mengsel van harscomponenten A, B en D in een plastic beker glas volgens de aanwijzingen van de fabrikant en bebroed monsters in de volgende harsconcentraties: 2%, 4%, en 8% voor 2 uur elk bij 0 °C. Incubeer in 15%, 30%, 60%, 90%, en 100% hars voor 4 uur elk bij kamertemperatuur. Incubeer gedurende 4 uur in een mengsel van componenten A, B, C en D.
- Plaats de membraandragers met celpelletzijde omhoog in platte inbeddingsmallen en vul met hars (A, B, C en D). Papieren etiketten voor de monsters kunnen worden toegevoegd aan de putten op dit moment.
- Polymeriseren in een oven bij 60 °C gedurende 24-36 uur.
OPMERKING: Het protocol kan worden onderbroken na de polymerisatie. - Verwijder de blokken uit de mal en laat afkoelen. Om de membraandrager te verwijderen, plaats u eerst het monster in de verticale klem van de ultramicrotoom waar het met vergroting kan worden gevisualiseerd. Scheid de membraandrager van het blok door een combinatie van deppen de vloeibare stikstof op de membraandrager om het metaal van het plastic te scheiden, en gebruik een scheermesje om de hars rond de membraandrager weg te snijden. Wanneer gescheiden, voorzichtig weg te tillen het membraan drager het verlaten van de cel pellet koepel op het gezicht van het blok.
- Plaats het blok met de blootgestelde celpellet naar boven gericht in een platte inbedding mal die iets dieper is dan de eerste mal, en vul met hars. Polymeriseren bij 60 °C voor 24-36 uur.
OPMERKING: Het protocol kan worden onderbroken na de polymerisatie.
6.
- Trim het blok rond de celpellet met behulp van een scheermesje. Plaats vervolgens het blok in de monsterklem op de sectioning arm van een ultramicrotome. Met behulp van een glas of diamant mes, trim het blok in een trapeziumvormige vorm dicht rond de cel pellet.
- Verkrijg 90 nm ultradunne delen van de celpellet met een glas of diamantmes.
- Een lint met secties op een TEM-raster ophalen. Met formvar-gecoate koperen sleufroosters (1 x 2 mm2-sleuf) zijn handig voor beeldvormingsdeelingen. Droog het raster door de rand op een stuk filterpapier te smeten en op te slaan in een TEM-rasteropslagbox.
OPMERKING: Het protocol kan worden onderbroken na sectie.
7. TEM-beeldvorming
- Monteer het raster op de TEM-houder en plaats in de microscoop. We gebruiken routinematig een Tecnai T12 bij 80 kV voor het screenen van cryoAPEX monsters. Verwerf afbeeldingen van cellen en subcellulaire structuren van belang met APEX2 labeling.
- Verkrijg indien gewenst extra membraancontrast door het gebruik van lood na het vlekken. Zie figuur 2 voor vergelijking van niet-post-gekleurde monsters(figuur 2I-K) en lood post-gekleurde monsters(figuur 2A–H).
- Drijf droge roosters sectie-kant naar beneden op een druppel verdunde natriumchloride oplossing (~ 1,5 mM), 2x voor 1 min per stuk, dan 1x voor 10 min.
- Float roosters op een druppel van sato's lood oplossing voor 1 min. Wassen door te zweven op natriumchloride oplossing 3x voor 1 min, dan op DI water 3x voor 1 min. Blot overtollige vloeistof uit de roosters en op te slaan in een netdoos.
LET OP: Lood is een giftige chemische stof en moet worden behandeld met de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen. Oplossingen die lood bevatten, moeten worden verwijderd als gevaarlijk chemisch afval.
- Afbeelding post-gekleurdmonsters op de TEM.
OPMERKING: In de traditionele monstervoorbereiding voor TEM wordt de loodcontrasterende stap uitgevoerd voordat TEM-beeldvorming wordt uitgevoerd. Het wordt echter aanbevolen dat voor cryoAPEX-monsters eerst beeldvorming wordt uitgevoerd op niet-contrasterende monsters. Dit zorgt ervoor dat het signaal van de tag gemakkelijk kan worden geplaatst door het sterke contrast met de meer licht gekleurde cellulaire structuren. Voor veel monsters is geen verdere kleuring nodig; als echter extra membraancontrast gewenst is, kan lood na kleuring worden uitgevoerd (stap 7.2) en wordt het monster opnieuw weergegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de ultrastructurele conservering met behulp van de cryoAPEX-methode te vergelijken met traditionele fixatie en uitdroging, hebben we monsters gemaakt waarin een endoplasmatisch reticulum membraan (ERM; ER membraan) peptide werd gelabeld met APEX2 en omgezet in HEK-293T cellen. ERM-APEX2 lokaliseert het cytoplasmatische gezicht van de ER en hermodelleert de ER-structuur tot morfologische verschillende structuren die bekend staan als georganiseerde gladde ER (OSER)34,42,43. OSER morfologie omvat gebieden van gladde, parallelle, dicht gestapelde membranen die dienen als een optimale regio om ultrastructurele conservering te vergelijken. De bereiding van het monster volgens traditionele APEX-methoden resulteerde in een duidelijke etikettering van OSER-structuren(figuur 2A–D). Bij inspectie bij hoge vergroting verschenen de gestapelde membranen gegolfd en waren er niet-uniforme openingen aanwezig tussen concentrische membraandichtheden, wat wijst op een slechte membraanbehoud en lipideextractie(figuur 2D). Het door cryoAPEX bereide monster had ook duidelijk omschreven etikettering van OSER-structuren; echter, de membranen waren glad en parallel, en weinig tot geen lipide extractie werd gezien (Figuur 2E-H). De resultaten van cryoAPEX waren van vergelijkbare kwaliteit smetselen als die verkregen uit een monster dat HPF/FS onderging zonder de extra chemische fixatie en APEX2/DAB-reactiestappen (figuur 2I–K).
Naast visueel merkbare membraanbehoud behoudt de cryoAPEX-methode het eiwit van belang zodanig dat aspecten van eiwitdistributiepatronen in sommige gevallen kunnen worden waargenomen. Om dit punt te illustreren, gebruikten we een ander ER-gelokaliseerd eiwit, huntingtine gist interactie eiwit E (HYPE). HYPE is een membraaneiwit op de armatuurvan het ER membraan 44,45,46,47. HYPE-APEX2 constructies werden overuitgedrukt in HEK-293T cellen. Tem-analyse van 90 nm dunne secties bleek dat HYPE aanwezig was in de perifere ER, evenals de nucleaire envelop (Figuur 3A,B). Bovendien kon de HYPE-dichtheid worden opgelost in regelmatig gespreide foci langs het lumenalermembraan(figuur 3C, pijlen). HYPE distributie en foci waren ook zichtbaar in een monster bereid met traditionele fixatie en uitdroging; er waren echter uitgebreide membraanverstoring en -extractie aanwezig, waardoor het monster suboptimaal werd (figuur 3D,E).
Om de robuuste organelellar specificiteit en toepasbaarheid van de cryoAPEX-methode voor een reeks gelabelde eiwitten aan te tonen, hebben we APEX2-etikettering uitgevoerd met behulp van drie cellulaire markers. Mitochondriën werden gelabeld met behulp van mito-V5-APEX234. Deze marker van de mitochondriale matrix voorzag alleen specifieke vlekken van mitochondriën(figuur 4A). Ook beoordeelden we plasmamembraanetikettering met CAAX-APEX234, die alleen duidelijke vlekken van het plasmamembraan produceerde(figuur 4C). Er werd geen etikettering waargenomen in intracellulaire organellen (figuur 4C). Daarnaast hebben we een nieuwe constructie gemaakt als marker voor het Golgi-lumen door de eerste 118 aminozuren van de muis isoform van α-mannosidase te smelten met het APEX2-gen48. De resulterende MannII-APEX2 werd van voorbijgaande aard omgezet in cellen die vervolgens werden voorbereid door de cryoAPEX-methode. Bevlekte Golgi-stapels waren duidelijk te onderscheiden van de omringende organellen (figuur 4B). Individuele stapels, cisternae, en sommige blaasjes werden gelabeld, typisch voor Golgi vlekken (Figuur 4B). Al met al tonen deze markers aan dat de cryoAPEX-methode specifieke etikettering van membraaneiwitten in verschillende organellen met een hoge resolutie biedt om ze te onderscheiden van omringende subcellulaire structuren.
Figuur 1: Schematisch van de essentiële stappen in het CryoAPEX-protocol. (A) Cellen worden gekweekt en getransfecteerd met een APEX2 plasmid. (B) Cellen worden gepelleteerd en gefixeerd met glutaraldehyde, gevolgd door (C) incubatie met DAB en waterstofperoxide om het peroxidasereactieproduct te produceren. (D) De pellet wordt cryofixed door HPF, (E) bevriezen vervangen door zware metalen en aceton, en (F) ingebed in hars. Dunne secties worden verzameld op de microtoom. (G)TEM-beeldvorming wordt uitgevoerd en extra contrast kan worden toegevoegd door na kleuring. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van OSER membraanbehoud met behulp van traditionele chemische fixatie, cryoAPEX en HPF/FS. De gereorganiseerde ER morfologie in chemisch vaste, DAB reageerde ERM-APEX2-uitdrukkende cellen die verwerkt werden via traditionele chemische fixatie en alcoholdehydratie(A–D) of door cryoAPEX(E-H) werd vergeleken met ERM-APEX2 uitdrukkende cellen die live en zonder dab-reactie(I–K) cryofixeerden. De levende cryovaste cellen vertegenwoordigen de best haalbare ultrastructurele conservering en dienen hier als de statistiek voor de evaluatie van membraanbehoud verkregen via de twee APEX-gebaseerde detectieprotocollen(A–H). De gelijkmatig gespreide parallelle lamellenstapeling van de ER-afgeleide membranen verkregen door cryoAPEX (geïllustreerd in panelen G en H), in tegenstelling tot de gegolfde membranen verkregen door traditionele methoden (panelen C en D),benadrukt de superieure membraanbehoud verkregen door cryoAPEX. Dit cijfer is gewijzigd van Sengupta et al. 201948. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Eiwitlokalisatie van een APEX2-gelabeld ER membraaneiwit kan worden opgelost in periodieke foci. (A) Een afbeelding van een dun deel van een HEK-293T cel uitdrukken HYPE-APEX2 en verwerkt door cryoAPEX onthult vlekken van de ER in een goed bewaard gebleven (dichte) cytoplasmale achtergrond (B,C). Hogere vergroting beelden van een klein deel van de perifere ER (afgebakend door gele doos in A en weergegeven in B, met verdere vergroting van rode doos in B weergegeven in C) vertoont periodieke foci van APEX2-gegenereerde dichtheid(B, rode doos en C, witte pijlpunten met periodiciteit tussen de HYPE foci). (D) Afbeelding van een dun deel van een cel uitdrukken HYPE-APEX2 en bereid door traditionele chemische fixatie en uitdroging toont specifieke kleuring van de corticale ER en de nucleaire envelop (rode pijlen). (E) Bij een hogere vergroting, periodieke HYPE-specifieke foci werden duidelijk binnen stukken van de ER (gele doos en witte pijlpunten in het begin), ondanks uitgebreide membraan verstoring, aangegeven door rode pijlen. NE = nucleaire envelop. Dit cijfer is gewijzigd van Sengupta et al. 201948. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Organelle markers tonen de specificiteit van het signaal verkregen uit APEX2-gelabelde eiwitten. Apex2-gelabelde eiwitconstructies die zijn ontworpen om te lokaliseren naar de mitochondriale matrix (mito-V5-APEX2; weergegeven in A), of het Golgi-lumen (α-mannII-APEX2; weergegeven in B), of het plasmamembraan (CAAX-APEX2; weergegeven in C)werden van voorbijgaande aard uitgedrukt in HEK293-cellen en de monsters verwerkt door cryoAPEX. Elke constructie leverde organelle specifieke dichtheden op. Vergrootweergaven van twee secties (gele of rode vakken) uit de cellen die α-mannIIAPEX2 (paneel B)of CAAX-APEX2 (paneel C)uitdrukken, worden weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd van Sengupta et al. 201948. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde cryoAPEX-protocol biedt een robuuste methode om de lokalisatie van membraaneiwitten in de cellulaire omgeving te karakteriseren. Niet alleen zorgt het gebruik van een genetisch gecodeerde APEX2-tag voor nauwkeurige lokalisatie van een eiwit van belang, maar het gebruik van cryofixatie en uitdroging bij lage temperaturen zorgt voor een uitstekende bewaring en kleuring van de omringende cellulaire ultrastructuur. Gecombineerd zijn deze benaderingen een krachtig hulpmiddel voor het lokaliseren van een eiwit met hoge precisie binnen zijn subcellulaire context.
De kern van de vooruitgang van deze methode is het feit dat het verlies van ultrastructuur ervaren na de voorbereiding door de traditionele TEM-methoden komt voornamelijk uit de uitdroging stap in plaats van de fixatie stap40. Eerder werd aangenomen dat peroxidase-gebaseerde methoden onverenigbaar waren met HPF/ FS omdat ze chemische fixatie vereisen voorafgaand aan de peroxidasereactie. Om dit te omzeilen, werd onlangs een protocol ontwikkeld genaamd CryoCHEM waarin monsters in eerste instantie cryofixeren, gevolgd door rehydratie en de peroxidase reactie49. Deze aanpak biedt uitstekende doellokalisatie met aanzienlijke verbeteringen in monsterkleuring en conservering. Het is aangetoond dat het nuttig is voor weefselmonsters en in gevallen waar correlative fluorescentie en elektronenmicroscopie gewenst is. Parallel aan cryoCHEM combineert onze methode glutaraldehyde fixatie met HPF en FS. CryoAPEX biedt een gestroomlijnd protocol dat effectief werkt, zelfs voor kleine cellulaire monsters.
Toegang tot hogedrukvries- en vriessubstitutie-instrumenten is cruciaal voor de cryoAPEX-methode. Deze instrumenten en vaardigheden komen steeds vaker voor in EM-faciliteiten. Zelfs als HPF- en FS-apparatuur niet direct beschikbaar zijn, is het chemisch vaste monster stabiel genoeg om korte tijd te vervoeren met bescheiden afstanden40. We hebben vastgesteld dat monsters na de DAB-reactie op 4 °C kunnen worden opgeslagen gedurende ten minste 48 uur voorafgaand aan HPF zonder significant kwaliteitsverlies. Een ander cruciaal aspect van het cryoAPEX-protocol is het opnemen van controles, die essentieel zijn voor een robuust experiment en overtuigende resultaten. Monsters die worden bereid door voorbijgaande transfection met een efficiëntie van minder dan 100% bevatten zowel negatieve controlecellen als gelabelde cellen in hetzelfde monster. Als het gebruik van cellijnen met stabiele expressie van APEX2, moet een aparte negatieve controle worden voorbereid door transfection van cellen met de niet-APEX2 gelabeldeiwit van belang. Verschillende constructies die kunnen dienen als organellar controles zijn beschikbaar via Addgene, en gepubliceerde beelden zijn beschikbaar in deze en andere publicaties die kunnen worden gebruikt voor verificatie33,34,36,48. Diepgaande bespreking van experimenteel ontwerp en verificatie van nieuwe APEX2 fusieconstructies is verzorgd door Martell et al.36
Hoewel cryoAPEX in grote lijnen nuttig is voor de detectie van membraaneiwitten, bestaan er enkele beperkingen. Hoewel APEX2 een klein 28 kDa-eiwit is, kunnen sommige eiwitten de tag33,34niet opnemen. APEX2 wordt niet als nuttig beschouwd voor het etiketteren van oplosbare eiwitten in de cytosol, als gevolg van het diffuse reactieproduct33,36. Bovendien vormt de detectie van kleine hoeveelheden eiwit een uitdaging vanwege de aanwezigheid van vlekken in de omringende cel. Voorbereiding door HPF en FS behoudt cellulaire componenten die worden geëxtraheerd door traditionele fixatie en uitdroging. Dit leidt tot algehele donkere vlekken in de cel, mogelijk concurreren met lage niveaus van APEX2 etikettering.
De cryoAPEX techniek is op grote schaal toepasbaar op veel eiwitten, met een beperkt aantal stappen die optimalisatie vereisen. Ten eerste moet het eiwitexpressieniveau en/of DAB-reactietijd, als gevolg van de individuele variabiliteit tussen eiwitten, worden aangepast om het signaal boven de achtergrondkleuring van de cel te visualiseren. Nuttige informatie en protocollen voor de validatie van nieuwe APEX2 fusieconstructies en optimalisatie van de expressie en DAB-kleuring worden verstrekt door Martell et al.36 Vanuit een cellulair kleuringsperspectief moet het FS-protocol en/of chemicaliën mogelijk worden aangepast voor een optimale visualisatie van verschillende organellemembranen, binnen verschillende celtypen, weefsels of organismen50,51,52,53,54. In onze ervaring, de FS voorwaarden hier gepresenteerd hebben goed gewerkt voor een verscheidenheid van zoogdier cellijnen.
De hybride benadering van cryoAPEX heeft het potentieel om te worden toegepast op vele andere genetische etiketteringstechnieken. Het vervangen van traditionele alcoholuitdroging met HPF/ FS zal naar verwachting de ultrastructurele conservering en de eiwitlokalisatie-informatie sterk verbeteren. Het gebruik van saffierschijven als celsubstraat om cellen als monolayer te fixeren verbetert het behoud van de celperiferie, inclusief de cytoskelet- en celcelcontacten. Kleine wijzigingen in het protocol zou nodig zijn om saffierschijven te gebruiken. APEX-technologie kan worden gebruikt om groene fluorescerende eiwitten (GFP) gelabelde eiwitten te detecteren via een GFP-bindend peptide35. Deze indirecte detectiemethode opent het potentieel om APEX-technologie te gebruiken voor de talloze eiwitten die al met GFP zijn getagd. De onlangs geïntroduceerde split APEX2 zal voordelig zijn voor nabijheids- en interactiestudies55. Daarnaast kunnen bestaande HRP-gebaseerde methoden worden gecombineerd met HPF/FS om het behoud van cellen te verbeteren. Een voorbeeld is fluorescent indicator en peroxidase voor precipitatie met EM resolution (FLIPPER), waarin individuele celmarkers zijn gesmolten met zowel een fluorescerende tag als HRP, die lumenmarkeringen voor Golgi of ER56bieden. Het gebruik van verbeterde peroxidase substraten in plaats van DAB is ook mogelijk met deze methode, inclusief substraten die zijn geoptimaliseerd voor RNA-etikettering 57. CryoAPEX biedt ook in-cell labeling en ultrastructurele conservering die nodig zijn voor driedimensionale analyse van eiwitdistributie door middel van elektronentomografie, en mogelijk bij hoge volumes via SBF-SEM of FIB-SEM48,58.
Over het algemeen is CryoAPEX een robuuste methode met brede toepasbaarheid. In principe kan het worden toegepast op elk membraaneiwit, of het nu binnen de lumenale ruimte van een organelle is, op het cytoplasmagezicht, in blaasjes, op het plasmamembraan van de cel of zelfs in de extracellulaire ruimte. Voor dit uitgebreide scala aan membraaneiwitten biedt de cryoAPEX-methode het potentieel om de lokalisatie en distributie van een eiwit met nauwkeurigheid binnen zijn subcellulaire context te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Het hier beschreven protocol komt voort uit een publicatie van Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Dit werk wordt ondersteund door subsidies R01GM10092 (aan S.M.) en AI081077 (R.V.S.) van de National Institutes of Health, CTSI-106564 (aan S.M.) van Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, en PI4D-209263 (naar S.M.) van het Purdue University Institute for Inflammation, Immunology, and Infectious Disease.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637-1G | |
| Acetone (Glass Distilled) | Electron Microscopy Sciences | 10016 | |
| Beakers; Plastic, Disposable 120 cc | Electron Microscopy Sciences | 60952 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| Cryogenic Storage Vials, 2 mL | VWR | 82050-168 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin | Sigma-Aldrich | 44611-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 | Sigma-Aldrich | 44612-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) | Sigma-Aldrich | 44613-100ML | |
| Durcupan ACM Fluka,single component D | Sigma-Aldrich | 44614-100ML | |
| Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
| Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement | Corning | 355104 | |
| Glass Knife Boats, 6.4 mm | Electron Microscopy Sciences | 71008 | |
| Glass Knifemaker | Leica Microsystems | EM KMR3 | |
| Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| HEK 293 Cells | ATCC | CRL-1573 | |
| High Pressure Freezer with Rapid Transfer System | Leica Microsystems | EM PACT2 | Archived Product Replaced by Leica EM ICE |
| Hydrogen Peroxide 30% Solution | Fisher Scientific | 50-266-27 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000015 | |
| Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm | Mager Scientific | 16707898 | |
| Osmium Tetroxide, crystalline | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade | VWR | 97062-950 | |
| Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm | Mager Scientific | 16702738 | |
| Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film | Electron Microscopy Sciences | FF2010-Cu | |
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 102090-962 | |
| Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) | Avantor Macron Fine Chemicals | 7708-10 | |
| Tannic Acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 | |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm | VWR | 25382-166 | |
| Ultra Glass Knife Strips | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | EM UC7 | |
| Uranyl Acetate Dihydrate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X.
- Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
- De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
- Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
- Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
- Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
- Oliver, C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. Oliver, C., Jamur, M. C. 588, Humana Press. 381-386 (2010).
- Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
- Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. Mueller-Reichert, T., Verkade, P. 111, Elsevier. 21-35 (2012).
- Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D.
- Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
- Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
- Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
- Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
- Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
- Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
- Tokuyasu, K. T.
- Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
- Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
- Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
- Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. 327, 35-45 (2000).
- Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
- Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. L. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. Hajibagheri, N. 117, Humana Press. 77-97 (1999).
- Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
- Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
- Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
- Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
- Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
- Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
- Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
- Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
- Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
- McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
- Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
- Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
- Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
- Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
- Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , International ed. in English (2019).
- Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).
