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El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

Este protocolo describe el método crioAPEX, en el que una proteína de membrana etiquetada con APEX2 puede ser localizada por microscopía electrónica de transmisión dentro de la ultraestructura celular óptimamente conservada.

Abstract

Los eventos celulares clave como la transducción de señales y el tráfico de membranas dependen de la ubicación adecuada de las proteínas dentro de los compartimentos celulares. Entender la localización subcelular precisa de las proteínas es por lo tanto importante para responder a muchas preguntas biológicas. La búsqueda de una etiqueta robusta para identificar la localización de proteínas combinada con la preservación celular adecuada y la tinción ha sido históricamente difícil. Los avances recientes en la microscopía electrónica (EM) han llevado al desarrollo de muchos métodos y estrategias para aumentar la preservación celular y etiquetar las proteínas diana. Una etiqueta genética relativamente nueva basada en peroxidasa, APEX2, es un líder prometedor en etiquetas EM-activas clonables. La preparación de muestras para la microscopía electrónica de transmisión (TEM) también ha avanzado en los últimos años con la llegada de la crioexposición por congelación a alta presión (HPF) y deshidratación y tinción a baja temperatura mediante sustitución por congelación (FS). HPF y FS proporcionan una excelente preservación de la ultraestructura celular para imágenes TEM, solo por sitoma directa de muestras vítreas. Aquí presentamos un protocolo para el método crioAPEX, que combina el uso de la etiqueta APEX2 con HPF y FS. En este protocolo, una proteína de interés se etiqueta con APEX2, seguido de la fijación química y la reacción de peroxidasa. En lugar de la tradicional tinción y deshidratación del alcohol a temperatura ambiente, la muestra se criofija y se somete a deshidratación y tinción a baja temperatura a través de FS. Usando crioAPEX, no sólo se puede identificar una proteína de interés dentro de los compartimentos subcelulares, sino que también se puede resolver información adicional con respecto a su topología dentro de una membrana estructuralmente conservada. Mostramos que este método puede proporcionar una resolución lo suficientemente alta como para descifrar patrones de distribución de proteínas dentro de un lumen de organelo, y para distinguir la compartimentación de una proteína dentro de un orgelle cerca de otros orgánulos sin etiquetar. Además, el crioAPEX es procedimentalmente sencillo y susceptible de células cultivadas en el cultivo de tejidos. No es técnicamente más difícil que los métodos típicos de sustitución de criofixación y congelación. CryoAPEX es ampliamente aplicable para el análisis TEM de cualquier proteína de membrana que pueda ser etiquetada genéticamente.

Introduction

Los estudios biológicos a menudo incluyen preguntas sobre cómo resolver la localización de proteínas subcelulares dentro de las células y orgánulos. La microscopía de inmunofluorescencia proporciona una vista útil de baja resolución de la localización de proteínas, y los avances recientes en imágenes de superresolución están empujando los límites de la resolución de proteínas etiquetadas fluorescentes1,2,3. Sin embargo, la microscopía electrónica (EM) sigue siendo el estándar de oro para la imagen de la ultraestructura celular de alta resolución, aunque el etiquetado de proteínas es un desafío.

Históricamente, se han utilizado varios métodos EM para abordar cuestiones de localización de proteínas ultraestructurales. Uno de los métodos más utilizados es la microscopía inmunoelectrón (IEM), donde se utilizan anticuerpos primarios específicos de antígeno para detectar la proteína de interés. La señal EM se genera mediante la aplicación de anticuerpos secundarios conjugados con partículas de densidad de electrones, más comúnmente oro coloidal4,5. Alternativamente, los anticuerpos conjugados con enzimas como la peroxidasa de rábano de caballo (HRP) se pueden utilizar para producir un precipitado denso de electrones6,7,8. Existen dos enfoques principales para el IEM, denominados etiquetado de preincrustación y post-inserción. En iEM pre-incrustación, los anticuerpos se introducen directamente en las células, lo que requiere la fijación de la luz y la permeabilización de las células9,10,11. Ambos pasos pueden dañar la ultraestructura12,13. El desarrollo de anticuerpos significativamente más pequeños consistentes en un fragmento de Fab de anticuerpos conjugado con nanooro de 1,4 nm permite utilizar condiciones de permeabilización muy suaves; sin embargo, el nanooro es demasiado pequeño para la visualización directa bajo TEM y requiere pasos de mejora adicionales para ser visible14,15,16. En IEM posterior a la incrustación, los anticuerpos se aplican en secciones delgadas de células que han sido completamente procesadas por fijación, deshidratación e incrustación en resina17. Si bien este enfoque evita el paso de permeabilización, preservar el epítome de interés a lo largo de la preparación de la muestra es un reto18,19,20. El método Tokuyasu de fijación de la luz seguido de congelación, criosección y detección de anticuerpos proporciona una mejor conservación del epítopo21,22. Sin embargo, los requisitos técnicos de la crioultramicrotomía, así como el contraste subóptimo alcanzado en la célula, son desventajas23.

El uso de etiquetas codificadas genéticamente elimina muchas de las dificultades de IEM relacionadas con la detección de la proteína de interés. Una variedad de etiquetas están disponibles, incluyendo HRP, ferritina, ReAsH, miniSOG, y metallotionina24,25,26,27,28,29,30,31,32. Cada uno de ellos tiene ventajas sobre los métodos anteriores, pero cada uno también tiene inconvenientes que impiden el uso generalizado. Estos inconvenientes van desde la inactividad de HRP en el citosol hasta el gran tamaño de la etiqueta de ferritina, la sensibilidad a la luz de ReAsH, y el pequeño tamaño y la falta de compatibilidad con la tinción celular de metalotionina. Recientemente, una proteína derivada de ascorbato peroxidasa ha sido diseñada como una etiqueta EM, llamada APEX233,34. Como peroxidasa, APEX2 puede catalizar la oxidación de 3,3' diaminobenzidina (DAB), produciendo un precipitado que reacciona con tetróxido de osmio para proporcionar contraste LOCAL EM con una difusión mínima de la proteína de interés (menos de 25 nm)33,35. A diferencia de los métodos tradicionales basados en HRP, APEX2 es extremadamente estable y permanece activo en todos los compartimentos celulares33. Las muestras se pueden procesar para TEM utilizando la tinción de muestras EM tradicional y métodos que permiten una buena visualización de las estructuras circundantes33,34,36. Debido a su pequeño tamaño, estabilidad y versatilidad, APEX2 ha surgido como una etiqueta EM con gran potencial.

Muchos de los enfoques mencionados anteriormente no pueden ser o aún no se han combinado con el estado actual de la técnica en la preservación ultraestructural, la criofixación y la sustitución de congelación a baja temperatura. Por lo tanto, sufren de una falta de preservación de la membrana y / o tinción celular para determinar la localización precisa de proteínas. Esto limita necesariamente la resolución e interpretación de los datos que se pueden obtener. La criofixación por congelación a alta presión (HPF) implica la congelación rápida de muestras en nitrógeno líquido a alta presión (2.100 bar), lo que provoca vitrificación en lugar de cristalización de muestras acuosas, preservando así las células en un estado casi nativo37,38,39. HpF es seguido por la sustitución por congelación (FS), una deshidratación a baja temperatura (-90 oC) en acetona combinada con incubación con manchas EM típicas como tetróxido de osmio y acetato de ursionlo. HpF y FS juntos proporcionan una clara ventaja sobre la fijación química tradicional (un proceso más largo que puede conducir a artefactos) y la deshidratación del alcohol a temperatura ambiente o en hielo (que puede conducir a la extracción de lípidos y azúcares), y por lo tanto son deseables para combinar con las mejores etiquetas EM para la detección de proteínas.

Una razón por la que HPF/FS no se ha combinado con el etiquetado APEX2 es que la fijación química ligera es un requisito previo para la reacción de peroxidasa, limitando la difusión del producto de reacción DAB. En los estudios APEX2 realizados hasta ahora, la fijación y la reacción de peroxidasa son seguidas por los métodos tradicionales EM para la tinción y la deshidratación del alcohol33,36. Sin embargo, se ha demostrado que la siguiente fijación química con HPF/FS proporciona una clara ventaja en la preservación sobre la fijación química tradicional y la deshidratación de alcohol por sí sola40. La pérdida de integridad ultraestructural que se ve en las muestras tradicionales de TEM parece estar menos relacionada con la fijación que con la deshidratación, que normalmente se realiza con alcohol a temperatura ambiente o en hielo, y puede conducir a la extracción de lípidos y azúcares40,41. Para desarrollar el método crioAPEX, hipotetizaron que la fijación química y la reacción de peroxidasa, seguidas de HPF y FS, producirían un resultado óptimo en términos de preservación ultraestructural.

Aquí presentamos el protocolo cryoAPEX, que combina el etiquetado APEX2 con los métodos de sustitución criofixation y freeze(Figura 1). Este protocolo sencillo consiste en la transfección de una proteína de interés con la etiqueta APEX2, la fijación química de las células y la reacción de la peroxidasa. HpF y FS se realizan seguidos de la incrustación típica de resina y el corte fino. Las imágenes TEM revelan una excelente preservación de la ultraestructura utilizando este método. Además, se observó la localización subcelular de alta resolución y la distribución espacial de una proteína lumenal endoplasmática (ER). Este método es ampliamente útil para la detección de la localización de proteínas de membrana dentro de las células para el análisis de microscopía electrónica. En nuestras manos, el método ha trabajado con éxito para una variedad de líneas celulares cultivadas en el cultivo de tejidos, incluyendo HEK-293T (riñón embrionario humano), HeLa (cáncer cervical humano), Cos7 (fibroblasto renal de mono verde africano), y BHK (riñón de hámster bebé). Las instrucciones detalladas se describen a continuación utilizando células HEK-293T.

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Protocol

1. Cultivo celular y transfección

  1. Células HEK-293T de semilla en un plato de cultivo de tejido de 60 mm de diámetro o más grande y crecen a entre el 60% y el 90% de confluencia en una incubadora de cultivo celular a 37 oC y 5% de CO2.
  2. Células transfect con plásmidos de expresión de mamíferos etiquetados con APEX2 utilizando reactivo de transfección (ver Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  3. A 12–15 h después de la transfección, lave las células una vez con solución salina tamponada de fosfato (PBS). Retire las células del plato lavándolo suavemente con PBS. Se puede utilizar un reactivo de disociación, como la tripsina, si es necesario para un tipo de célula determinado. Centrífuga a 500 x g durante 5 min para formar unpellet.

2. Fijación química y reacción de peroxidasa

  1. Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 ml de 2% de glutaraldehído (v/v) en tampón de cadilato sódico de 0,1 M, pH 7,4, a temperatura ambiente. Colocar la muestra sobre hielo e incubar durante 30 min. Pellet la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 oC. Desde este punto hasta el paso 2.3.3, mantenga la muestra y las soluciones en hielo, y realice la centrifugación a 4oC.
    ADVERTENCIA: Tanto el glutaraldehído como el tampón de cacodilato sódico (que contiene arsénico) son tóxicos. Durante la manipulación se deben utilizar los procedimientos de seguridad adecuados y el equipo de protección personal. Las soluciones que contengan glutaraldehído y/o tampón de cacodilato sódico deben eliminarse como residuos químicos peligrosos.
  2. Lavar el pellet 3x durante 5 min con 2 ml de tampón de cacodilato sódico de 0,1 M. Para estos, así como los lavados posteriores, resuspenda suavemente el pellet celular en la solución requerida, luego centrífuga durante 5 min a 500 x g y retire cuidadosamente y deseche el sobrenadante. Se debe tener cuidado con los repetidos pasos de peletización y resuspensión, con el fin de minimizar la pérdida de muestra.
  3. Llevar a cabo la reacción de peroxidasa
    1. Preparar una solución fresca que contenga 1 mg/ml de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) en tampón de cacodilato sódico de 0,1 M. Disolver el DAB mediante un vórtice vigoroso durante 5-10 min.
      ADVERTENCIA: DAB es tóxico y un carcinógeno potencial y debe manejarse con procedimientos de seguridad adecuados y equipo de protección personal. Las soluciones que contengan DAB deben tratarse como residuos químicos peligrosos.
    2. Lavar el pellet resuponiendo en 3 ml de solución DAB seguido de peletización a 500 x g durante 5 min.
    3. Resuspenda el pellet en una solución DAB de 3 ml a la que se haya añadido peróxido de hidrógeno para lograr una concentración final de 5,88 mM. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. El pellet se vuelve visiblemente de color marrón indicando la presencia del producto de reacción DAB insoluble.
      NOTA: Es posible que sea necesario optimizar el tiempo de incubación de DAB para cada muestra. El cambio de color se puede monitorear en el microscopio de luz. En nuestra experiencia, una incubación de 15-45 minutos es adecuada para la mayoría de las proteínas. El peróxido de hidrógeno debe obtenerse de una botella recién abierta o de una que se haya mantenido bien sellada después de la apertura.
    4. Pelet las células, luego lavar 2 veces durante 5 min con tampón de cacodilato sódico de 0,1 M, seguido de un lavado en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco o medios celulares de elección.
  4. Resuspenda el gránulo celular en 500 ml de una solución crioprotectora de DMEM (u otros medios celulares de elección) que contenga un 10% de suero bovino fetal y un 15% de albúmina sérica bovina. Pellet de nuevo, aumentando ligeramente la velocidad de centrífuga de 500 x g si es necesario para lograr un pellet en la solución crio-protecnte gruesa. Deseche la mayoría del sobrenadante, asegurándose de que quede suficiente líquido para que el pellet no se seque. Transporte el pellet celular al instrumento de congelación de alta presión.

3. Congelación de alta presión

  1. Llene el depósito del congelador de alta presión con nitrógeno líquido (LN2)e inicie la bomba para llenar la cámara de muestra con LN2.
    ADVERTENCIA: Utilice los procedimientos de seguridad adecuados y el equipo de protección personal cuando trabaje con nitrógeno líquido.
    NOTA: Estos pasos son específicos del congelador de alta presión Leica EMPACT2.
  2. Elimina cualquier líquido restante del pellet celular usando la esquina de una toallita de laboratorio o una toalla de papel. Suficiente líquido debe permanecer que el pellet forma una pasta similar en consistencia a la pasta de dientes. Debe ser lo suficientemente delgado como para aspirarse en una punta de pipeteo de 20 l.
  3. Aspirar 2–3 l del pellet celular y depositarlo en un portador de membrana. Llene el pozo del portador de la membrana completamente, de modo que la tensión superficial cree una ligera cúpula en la parte superior, pero el líquido no se derrama fuera del pozo. No deben estar presentes burbujas de aire.
  4. Deslice el soporte de membrana en el cartucho y asegúrelo. Coloque el cartucho en la máquina HPF que ha sido preparada y preparada, y presione Iniciar para congelar.
  5. Inspeccione la temperatura frente a los gráficos de tiempo y presión frente a los gráficos de tiempo para verificar que la presión alcanzó 2100 bar y la temperatura alcanzó -196 oC dentro de 200 ms, y ambos parámetros se mantuvieron estables durante los 600 ms de medición.
  6. Repita los pasos 3.3 a 3.5 hasta que se haya utilizado el pellet celular o se haya congelado el número deseado de muestras.
  7. Manteniendo los cartuchos sumergidos en LN2,retire cada portador de membrana de su cartucho, colóquelos en una cápsula de plástico y coloque la cápsula de plástico en un criovial lleno de LN2.
    NOTA: El protocolo puede estar en pausa aquí. Los crioviales con muestras se pueden almacenar en un LN2 dewar en criocañas o crio-cajas.

4. Sustitución de congelación

ADVERTENCIA: Utilice los procedimientos de seguridad adecuados y el equipo de protección personal cuando trabaje con nitrógeno líquido. Además, muchos de los productos químicos utilizados en el paso 4 son tóxicos, incluyendo ácido tánico, tetróxido de osmio, y acetato de ursionl. Estos productos químicos deben manipularse de acuerdo con los procedimientos de seguridad adecuados y eliminarse como residuos químicos peligrosos.

  1. Llene la unidad de sustitución de congelación automatizada con LN2. Llevar la temperatura a -90 oC.
  2. Prepare FS Mix 1 y comience FS.
    1. En una campana química, prepare una solución de ácido tánico al 0,2% (p/v) y un 5% de agua DI en acetona y alícuota 1 ml por muestra en crioviales. Colóquelo en LN2 para congelarlo.
    2. Coloque los viales de FS Mix 1 y los crioviales que contienen los pellets de células congeladas en la cámara de muestra de la unidad FS. Transfiera la cápsula interna que contiene el portador de membrana del vial LN2 al vial correspondiente que contenga FS Mix 1.
    3. Inicie un protocolo FS con su primer paso siendo 24 h a -90 oC. Después de las 24 h, pausar el FS, y lavar las muestras 3x durante 5 min con acetona que se ha enfriado a -90 oC.
  3. Preparar FS Mix 2 y completar FS
    ADVERTENCIA: El tetróxido de osmio es un producto químico altamente tóxico y oxidante que sólo debe ser manejado por individuos entrenados de acuerdo con los protocolos de seguridad establecidos. Deben seguirse los protocolos para el almacenamiento y eliminación de soluciones que contengan osmio, así como el etiquetado de las áreas de laboratorio en las que se esté utilizando tetróxido de osmio. El tetróxido de osmio debe manipularse en una campana química con equipo de protección personal, incluida la protección de los ojos, una capa de laboratorio que proporciona protección completa del brazo, guantes de nitrilo dobles y un respirador opcional.
    1. En una campana química, preparar una solución de 1% tetróxido de osmio, 0,2% acetato de urani y 5% de agua DI en acetona. Aliquot 1 ml por muestra en crioviales y colóquelo en LN2 para congelarlo.
      NOTA: Las soluciones de stock de ácido tánico (10% p/v en acetona), tetróxido de osmio (10% p/v en acetona) y acetato de ursionl (8% p/v en metanol) se pueden preparar y almacenar en crioviales en una dewar LN2 para facilitar la preparación de las mezclas FS.
    2. Coloque los crioviales con FS Mix 2 en la unidad FS y transfiera las cápsulas del tercer lavado de acetona a los viales de FS Mix 2. Incubar en FS Mix 2 para 72 h a -90 oC, seguido de un calentamiento gradual a 0 oC sobre 12-18 h.
  4. Mantener la temperatura a 0 oC y lavar 3 x durante 30 minutos con acetona preenfriada de una botella recién abierta.

5. Infiltración e incrustación de resina

ADVERTENCIA: La resina utilizada aquí (ver Tabla de Materiales)es tóxica antes de la polimerización, y debe ser manejada con procedimientos de seguridad adecuados y equipo de protección personal. Cualquier resina no polimerizada debe eliminarse como residuo químico peligroso.

  1. Infiltrar las muestras con concentraciones crecientes de resina disuelta en acetona de una botella recién abierta. Preparar una mezcla de componentes de resina A, B y D en un vaso de precipitados de plástico de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e incubar muestras en las siguientes concentraciones de resina: 2%, 4% y 8% para 2 h cada una a 0 oC. Incubar en 15%, 30%, 60%, 90%, y 100% resina para 4 h cada una a temperatura ambiente. Incubar durante 4 h en una mezcla de componentes A, B, C y D.
  2. Coloque los soportes de membrana con el lado del pellet celular en moldes de incrustación planos y llene con resina (A, B, C y D). Las etiquetas de papel para las muestras se pueden añadir a los pozos en este momento.
  3. Polimerizar en un horno a 60oC durante 24-36 h.
    NOTA: El protocolo se puede pausar después de la polimerización.
  4. Retire los bloques del molde y deje enfriar. Para extraer el soporte de membrana, coloque primero la muestra en el portabrocas vertical del ultramicrotome donde se pueda visualizar con aumento. Separe el portador de membrana del bloque mediante una combinación de nitrógeno líquido de dabbing en el portador de membrana para separar el metal del plástico y utilizando una cuchilla de afeitar para astillar la resina alrededor del portador de membrana. Cuando esté separado, levante suavemente el portador de membrana dejando la cúpula de pellet salinada en la cara del bloque.
  5. Coloque el bloque con el pellet de celda expuesto mirando hacia arriba en un molde de incrustación plana que sea ligeramente más profundo que el primer molde, y llene con resina. Polimerizar a 60oC durante 24–36 h.
    NOTA: El protocolo se puede pausar después de la polimerización.

6. Seccionamiento

  1. Recorte el bloque alrededor del pellet celular usando una cuchilla de afeitar. A continuación, coloque el bloque en el mandril de muestra en el brazo de sección de un ultramicrotoma. Usando un cuchillo de vidrio o diamante, recorta el bloque en una forma trapezoidal que rodea el pellet celular.
  2. Obtener 90 nm secciones ultrafinas del pellet celular utilizando un cuchillo de vidrio o diamante.
  3. Recoja una cinta de secciones en una rejilla TEM. Las rejillas de ranura de cobre recubiertas de Formvar (1 ranura de 2 mm2) son útiles para las secciones seriales de imagen. Seque la rejilla hinchando el borde en un trozo de papel de filtro y guárdelo en una caja de almacenamiento de rejilla TEM.
    NOTA: El protocolo se puede pausar después de la sección.

7. IMÁGenes TEM

  1. Monte la rejilla en el soporte TEM y colóquela en el microscopio. Utilizamos habitualmente un Tecnai T12 a 80 kV para la detección de muestras crioAPEX. Adquirir imágenes de células y estructuras subcelulares de interés con etiquetado APEX2.
  2. Si lo desea, obtenga un contraste de membrana adicional mediante el uso de plomo después de la tinción. Consulte la Figura 2 para la comparación de muestras no manchadas(Figura 2I–K) y muestras posteriores a la teñida de plomo(Figura 2A–H).
    1. Flotar rejillas secas de lado de sección hacia abajo en una gota de solución diluida de cloruro de sodio (1,5 mM), 2 veces por 1 min cada una, luego 1x durante 10 min.
    2. Flotar rejillas en una gota de la solución de plomo de Sato durante 1 min. Lavar flotando en la solución de cloruro de sodio 3x durante 1 min, luego en agua DI 3x durante 1 min. Blot exceso de líquido de las rejillas y almacenar en una caja de rejilla.
      ADVERTENCIA: El plomo es un producto químico tóxico y debe manipularse con los procedimientos de seguridad adecuados y el equipo de protección personal. Las soluciones que contengan plomo deben eliminarse como residuos químicos peligrosos.
  3. Muestras de imagen postmanchadas en el TEM.
    NOTA: En la preparación de muestras tradicional para TEM, el paso de contraste de plomo se realiza antes de la toma de imágenes TEM. Sin embargo, se recomienda que para las muestras crioAPEX, las imágenes se lleven a cabo primero en muestras no contrastadas. Esto garantiza que la señal de la etiqueta se puede ubicar fácilmente por su fuerte contraste con las estructuras celulares más ligeramente manchadas. Para muchas muestras, no se requerirá ninguna otra tinción; sin embargo, si se desea un contraste de membrana adicional, se puede realizar la post-manchación de plomo (Paso 7.2) y la muestra re-imagen.

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Representative Results

Con el fin de comparar la preservación ultraestructural utilizando el método crioAPEX con la fijación y deshidratación tradicional, preparamos muestras en las que una membrana de retículo endoplasmático (ERM; ER membrane) fue etiquetado con APEX2 y transfectó en células HEK-293T. ERM-APEX2 localiza la cara citoplasmática del ER y remodela la estructura de ER en estructuras morfológicamente distintas conocidas como ER suave organizado (OSER)34,42,43. La morfología oSER incluye regiones de membranas lisas, paralelas y densamente apiladas que sirven como una región óptima para comparar la preservación ultraestructural. La preparación de la muestra por métodos APEX tradicionales dio lugar a un etiquetado claro de las estructuras OSER(Figura 2A–D). Tras la inspección con un aumento alto, las membranas apiladas aparecieron con volantes y se presentaron brechas no uniformes entre las densidades de membrana concéntricas, lo que indica una mala preservación de la membrana y la extracción de lípidos(Figura 2D). La muestra preparada por cryoAPEX también tenía un etiquetado claramente definido de las estructuras OSER; sin embargo, las membranas eran lisas y paralelas, y se vio poca o ninguna extracción de lípidos(Figura 2E–H). Los resultados de crioAPEX fueron de una preservación de alta calidad similar a los obtenidos de una muestra que se sometió a HPF/FS sin la fijación química adicional y los pasos de reacción APEX2/DAB(Figura 2I–K).

Además de la preservación de la membrana visualmente apreciable, el método crioAPEX preserva la proteína de interés de tal manera que en algunos casos se pueden observar aspectos de los patrones de distribución de proteínas. Para ilustrar este punto, utilizamos otra proteína localizada en Er, la proteína que interactúa con la levadura de huntingtina E (HYPE). HYPE es una proteína de membrana situada en la cara luminal de la membrana ER 44,45,46,47. Las construcciones HYPE-APEX2 se sobreexpresaron en células HEK-293T. El análisis TEM de secciones delgadas de 90 nm reveló que HYPE estaba presente en todo el ER periférico, así como en la envolvente nuclear(Figura 3A,B). Además, la densidad de HYPE pudo ser resuelta en focos espaciados regularmente a lo largo de la membrana lumenal ER(Figura 3C, flechas). La distribución de HYPE y los focos también eran visibles en una muestra preparada con fijación y deshidratación tradicionales; sin embargo, se dismateriale y la extracción extensa de la membrana, lo que hace que la muestra sea subóptima(Figura 3D,E).

Para demostrar la robusta especificidad y aplicabilidad de los órganos del método crioAPEX para una gama de proteínas etiquetadas, realizamos el etiquetado APEX2 utilizando tres marcadores celulares. Las mitocondrias fueron etiquetadas con mito-V5-APEX234. Este marcador de la matriz mitocondrial proporcionaba una tinción específica de las mitocondrias solamente(Figura 4A). Del mismo modo, evaluamos el etiquetado de membranas plasmáticas utilizando CAAX-APEX234, que produjo una tinción distinta de la membrana plasmática solamente(Figura 4C). No se observó etiquetado en orgánulos intracelulares(Figura 4C). Además, creamos una nueva construcción como marcador para el lumen Golgi fusionando los primeros 118 aminoácidos de la isoforma de ratón de la -mannosidasa con el gen APEX248. El MannII-APEX2 resultante fue transfectó transitoriamente en células que posteriormente fueron preparadas por el método crioAPEX. Las pilas de Golgi manchadas se distinguían claramente de los orgánulos circundantes(Figura 4B). Se etiquetaron pilas individuales, cisternae y algunas vesículas, típicas de la tinción Golgi(Figura 4B). En conjunto, estos marcadores demuestran que el método crioAPEX proporciona un etiquetado específico de proteínas de membrana dentro de varios orgánulos con una resolución lo suficientemente alta como para distinguirlas de las estructuras subcelulares circundantes.

Figure 1
Figura 1: Esquema de los pasos esenciales en el protocolo CryoAPEX. (A) Las células se cultivan y se transinfectan con un plásmido APEX2. (B) Las células se peletizarán y se fijan con glutaraldehído, seguido de (C) incubación con DAB y peróxido de hidrógeno para producir el producto de reacción de peroxidasa. (D) El pellet es criofijado por HPF, (E) congelado sustituido por metales pesados y acetona, y (F) incrustado en resina. Las secciones delgadas se recogen en el microtome. (G) se realizan imágenes TEM y se puede añadir un contraste adicional después de la tinción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Comparación de la preservación de la membrana OSER utilizando la fijación química tradicional, crioAPEX y HPF/FS. La morfología reorganizada de ER en células reactivas por parte de DAB-APEX2 que se procesaban a través de la fijación química tradicional y la deshidratación del alcohol (A–D) o por crioAPEX (E–H) se comparó con las células que expresaban ERM-APEX2 y que estaban criofijadas en vivo y sin la reacción DAB (I-K). Las células criofijas vivas representan la mejor preservación ultraestructural alcanzable y sirven aquí como la métrica para evaluar la preservación de la membrana obtenida a través de los dos protocolos de detección basados en APEX (A–H). El apilamiento lamelar paralelo uniformemente espaciado de las membranas derivadas de ER obtenidas por crioAPEX (ejemplificado en los paneles G y H),a diferencia de las membranas con volantes obtenidas por métodos tradicionales (paneles C y D),destaca la preservación superior de la membrana obtenida por crioAPEX. Esta cifra ha sido modificada de Sengupta et al. 201948. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La localización de proteínas de una proteína de membrana ER etiquetada por APEX2 se puede resolver en focos periódicos. (A) Una imagen de una sección delgada de una célula HEK-293T que expresa HYPE–APEX2 y procesada por crioAPEX revela la tinción del ER en un fondo citoplasma bien conservado (denso) (B,C). Las imágenes de mayor aumento de una pequeña sección del ER periférico (demarcada por caja amarilla en A y mostrada en B, con aumento adicional de la caja roja en B mostrada en C) muestran focos periódicos de densidad generada por APEX2 (B, caja roja y C, puntas de flecha blancas que muestran periodicidad entre los focos HYPE). (D) La imagen de una sección delgada de una célula que expresa HYPE-APEX2 y preparada por fijación química tradicional y deshidratación muestra una tinción específica del ER cortical y la envolvente nuclear (flechas rojas). (E) A un aumento más alto, los focos periódicos específicos de HYPE eran evidentes dentro de los tramos del ER (caja amarilla y cabezas de flecha blanca en el recuadro), a pesar de la extensa interrupción de la membrana, indicada por flechas rojas. NE - sobre nuclear. Esta cifra ha sido modificada de Sengupta et al. 201948. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Los marcadores de Organelle muestran la especificidad de la señal obtenida de proteínas etiquetadas con APEX2. Las construcciones proteicas etiquetadas por APEX2 diseñadas para localizar la matriz mitocondrial (mito-V5-APEX2; mostradas en A), o el lumen Golgi (-mannII-APEX2; mostrada en B),o la membrana plasmática (CAAX-APEX2; mostrada en C) se expresaron transitoriamente en células HEK293 y las muestras procesadas por crioAPEX. Cada construcción produjo densidades específicas de orgánulos. Se muestran las vistas ampliadas de dos secciones (cajas amarillas o rojas) de las celdas que expresan el panel B (panel B)o CAAX-APEX2 (panel C). Esta cifra ha sido modificada de Sengupta et al. 201948. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo crioAPEX presentado aquí proporciona un método robusto para caracterizar la localización de proteínas de membrana dentro del entorno celular. El uso de una etiqueta APEX2 codificada genéticamente no sólo proporciona una localización precisa de una proteína de interés, sino que el uso de criofixación y deshidratación a baja temperatura proporciona una excelente preservación y tinción de la ultraestructura celular circundante. Combinados, estos enfoques son una poderosa herramienta para localizar una proteína con alta precisión dentro de su contexto subcelular.

El quid del avance de este método es el hecho de que la pérdida de ultraestructura experimentada después de la preparación por los métodos TEM tradicionales proviene principalmente del paso de deshidratación en lugar del paso de fijación40. Anteriormente se creía que los métodos basados en peroxidasa eran incompatibles con HPF/FS porque requieren fijación química antes de la reacción de peroxidasa. Para evitar esto, recientemente se desarrolló un protocolo llamado CryoCHEM en el que las muestras se criofijan inicialmente, seguido de la rehidratación y la reacción de peroxidasa49. Este enfoque proporciona una excelente localización de objetivos con mejoras significativas en la tinción y conservación de muestras. Se ha demostrado que es útil para muestras de tejido y en casos en los que se desea fluorescencia correlativa y microscopía electrónica. Paralelamente a crioCHEM, nuestro método combina la fijación de glutaraldehído con HPF y FS. CryoAPEX ofrece un protocolo simplificado que funciona eficazmente incluso para muestras celulares pequeñas.

El acceso a instrumentos de inmovilización y supresión de alta presión es crucial para el método crioAPEX. Estos instrumentos y habilidades son cada vez más comunes en las instalaciones de EM. Incluso si los equipos HPF y FS no están fácilmente disponibles, la muestra químicamente fija es lo suficientemente estable como para un corto período de tiempo para ser transportada distancias modestas40. Hemos encontrado que las muestras se pueden almacenar después de la reacción DAB a 4 oC durante al menos 48 horas antes de HPF sin pérdida significativa de calidad. Otro aspecto crítico del protocolo crioAPEX es la inclusión de controles, que son esenciales para un experimento sólido y resultados convincentes. Las muestras preparadas por transfección transitoria con una eficiencia inferior al 100% contendrán células de control negativas, así como células etiquetadas dentro de la misma muestra. Si se utilizan líneas celulares con expresión estable de APEX2, se debe preparar un control negativo separado mediante la transfección de células con la proteína de interés no etiquetada con APEX2. Varias construcciones que pueden servir como controles organelares están disponibles a través de Addgene, y las imágenes publicadas están disponibles en esta y otras publicaciones que se pueden utilizar para la verificación33,34,36,48. Martell et al.36 ha proporcionado un debate en profundidad sobre el diseño experimental y la verificación de nuevas construcciones de fusión APEX2

Mientras que el crioAPEX es ampliamente útil para la detección de proteínas de membrana, existen algunas limitaciones. Aunque APEX2 es una pequeña proteína de 28 kDa, algunas proteínas pueden no ser capaces de incorporar la etiqueta33,34. APEX2 no se considera útil para etiquetar proteínas solubles en el citosol, debido al producto de reacción difusa33,36. Además, la detección de pequeñas cantidades de proteína plantea un desafío debido a la presencia de tinción en la célula circundante. La preparación por HPF y FS preserva los componentes celulares que se extraen por fijación y deshidratación tradicionales. Esto conduce a la tinción general más oscura en la célula, potencialmente compitiendo con bajos niveles de etiquetado APEX2.

La técnica crioAPEX es ampliamente aplicable a muchas proteínas, con un número limitado de pasos que pueden requerir optimización. En primer lugar, debido a la variabilidad individual entre las proteínas, el nivel de expresión de proteína y/o el tiempo de reacción DAB pueden necesitar ser ajustados para que la señal se visualice por encima de la tinción de fondo de la célula. La información y los protocolos útiles para la validación de las nuevas construcciones de fusión APEX2 y la optimización de la expresión y la tinción DAB son proporcionados por Martell et al.36 Desde una perspectiva de tinción celular, el protocolo FS y/o los productos químicos pueden necesitar ser ajustados para una visualización óptima de diferentes membranas orgánulos, dentro de diferentes tipos de células, tejidos u organismos50,51,52,53,54. En nuestra experiencia, las condiciones del FS presentadas aquí han funcionado bien para una variedad de líneas celulares de mamíferos.

El enfoque híbrido de crioAPEX tiene el potencial de aplicarse a muchas otras técnicas de etiquetado genético. Se espera que reemplazar la deshidratación tradicional de alcohol por HPF/FS mejore en gran medida la preservación ultraestructural y la información de localización de proteínas. El uso de discos de zafiro como sustrato celular para fijar las células como monocapa mejora la preservación de la periferia celular, incluyendo el citoesqueleto y los contactos de células celulares. Se requerirían modificaciones menores en el protocolo para utilizar discos de zafiro. La tecnología APEX se puede utilizar para detectar proteínas etiquetadas con proteínas fluorescentes verdes (GFP) a través de un péptido de unión a gFP35. Este método indirecto de detección abre el potencial de utilizar la tecnología APEX para las innumerables proteínas ya etiquetadas con GFP. La división recientemente introducida APEX2 será ventajosa para los estudios de proximidad e interacción55. Además, los métodos existentes basados en HRP se pueden combinar con HPF/FS para mejorar la preservación celular. Un ejemplo es fluorescent indicator y peroxidase para la recipitación pcon EM resolution (FLIPPER), en la que los marcadores de celda individuales se han fusionado con una etiqueta fluorescente y HRP, proporcionando marcadores lúmenes para Golgi o ER56. El uso de sustratos mejorados de peroxidasa en lugar de DAB también es posible con este método, incluidos los sustratos optimizados para el etiquetado de ARN 57. CryoAPEX también proporciona etiquetado en células y preservación ultraestructural necesaria para el análisis tridimensional de la distribución de proteínas a través de la tomografía de electrones, y potencialmente a grandes volúmenes a través de SBF-SEM o FIB-SEM48,58.

En general, CryoAPEX es un método robusto con amplia aplicabilidad. En principio, se puede aplicar a cualquier proteína de membrana, ya sea dentro del espacio lumenal de un orgánulo, en la cara citoplasmática, dentro de las vesículas, en la membrana plasmática de la célula o incluso en el espacio extracelular. Para esta amplia gama de proteínas de membrana, el método crioAPEX proporciona el potencial de ver la localización y distribución de una proteína con precisión dentro de su contexto subcelular.

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Disclosures

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Acknowledgments

El protocolo descrito aquí se deriva de una publicación de Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Este trabajo está respaldado por las subvenciones R01GM10092 (a S.M.) y AI081077 (R.V.S.) de los Institutos Nacionales de Salud, CTSI-106564 (a S.M.) del Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales de Indiana, y PI4D-209263 (a S.M.) del Instituto de La Universidad de Purdue para la Inmunoinflamación,

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

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El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas
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