Summary
여기서, 우리는 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 세포 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 형광 현미경으로 부착 된 세포에서 세포 ROS 국소화를 시각화하고 형광 판 판독기와 ROS 강도를 정량화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 효율적이며 비용 효율적입니다.
Abstract
산화 스트레스는 생리학적 및 병리학 적 조건 모두에서 중요한 사건이다. 본 연구에서는 대장암 세포주에서 염색하는 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 반응성 산소 종(ROS)을 측정하여 산화 스트레스를 정량화하는 방법을 보여 준다. 이 프로토콜은 DCFH-DA 솔루션 의 준비, DCFH-DA 용액을 가진 세포의 인큐베이션 및 정규화된 강도의 측정을 포함한 상세한 단계를 설명합니다. DCFH-DA 염색은 세포에서 ROS를 검출하는 간단하고 비용 효율적인 방법입니다. 그것은 화학 적 치료 또는 유전자 변형 후 ROS 생성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 그것은 환경 스트레스에 세포 산화 스트레스를 결정에 유용, 기계학 연구에 단서를 제공.
Introduction
생리학적 의미의 세포 대사에 의해 생성되는 3개의 주요 반응성 산소 종(ROS)은 초산화수소 음이온, 하이드록실 라디칼 및 과산화수소1이다. 낮은 농도에서, 그들은 생리 세포 과정에 참여, 하지만 높은 농도에서 그들은 세포 신호 경로에부작용1. 우리 몸은 과도한 ROS에 효과적인 항산화 시스템을 개발했습니다. 그러나, 산화 스트레스는 ROS가 염증, 암 및 신경 퇴행성 질환2,,3,,4를포함한 많은 병리학 적 조건에 기여하는 우리 몸의 해독 능력을 압도 할 때 발생할 수 있습니다. 이 방법의 목적은 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 염색을 사용하여 부착된 세포에서 총 세포 ROS를 결정하는 것이다. 그 근거는 DCFH-DA에서 2'-7'dichlorofluorescein (DCF)의 산화가 하이드록실 라디칼 (•OH) 및 이산화질소 (•NO2)를포함한 총 ROS 검출을 위해 광범위하게 사용되었다는 것입니다. 기계적으로, DCFH-DA는 세포 esterase가 아세틸 군에서 갈라지는 세포에 의해 채택되어 DCFH의 결과로. ROS에 의한 DCFH의 산화는 분자를 DCF로 변환하여 485 nm의 내분 파장과 530 nm의 방출 파장에서 녹색 형광을 방출합니다. 유동 세포측정및 기타대체방법으로형광의 검출에 비해5,형광 현미경 및 플레이트 판독기를 이용한 이 방법의 장점은 명확하게 보이는 형광 영상을 생성하고, 효율적이고 비용 효율적이다. 이 방법은 다양한 조건을 연구하기 위한 셀룰러 ROS를 검출하는 데 널리 사용되어 왔다6,,7,,8. 이 프로토콜은 부착 된 세포에서 총 ROS를 검출하는 데 사용됩니다. 서스펜션 셀에서 ROS를 감지하려면 이 방법을 사용하면 약간의 수정이 필요할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 셀 시드
- 종자 2 x 105 HCT116 대장암세포는 24웰 플레이트에서 잘 되어 있으며, 37°C에서 하룻밤 사이에 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)에서 세포를 유지한다.
- 배양 배지를 100μM 철황산염(FS) 또는 10μM 독소루비신(DOX)의 배지 및 인큐베이트 24시간 없이 교체한다.
2. DCFH-DA 솔루션 준비
- 디메틸 설산화물(DMSO)의 1mL에 DCFH-DA 4.85 mg을 용해하여 10mM 스톡 용액을 만듭니다.
- 미리 데워진 DMEM으로 스톡 솔루션을 10 μM 작업 솔루션으로 희석한 후 우물에 추가합니다.
- 10초용 작업 용 솔루션.
3. DCFH-DA 염색
- 매체를 함유한 약물을 제거하고 DMEM으로 한 번 세척하십시오.
- DCFH-DA 작업 용액의 500 μL을 각 우물에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- DCFH-DA 작업 솔루션을 제거합니다. DMEM으로 한 번 씻고 1배 인산완충식식염수(PBS)로 2배 세척합니다.
- 각 웰에 1x PBS의 500 μL을 추가합니다.
4. 이미징 수집 및 강도 측정
- 형광 현미경에 녹색 형광 단백질 (GFP) 채널을 사용하여 각 우물에 대한 대표적인 형광 이미지를 가져 가라.
- 이미지를 촬영한 후 PBS를 제거하고 각 우물에 방사성 면역 침전 분석(RIPA) 버퍼 200 μL을 추가합니다.
- 얼음에 5분 동안 배양한 다음 세포 용액을 1.5mL 튜브로 수집합니다.
- 4°C에서 10분 동안 21,130 x g의 원심분리기.
- 상피관의 100 μL을 검정 96웰 플레이트로 옮기고 485nm의 내분 파장및 530nm의 방출 파장에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 형광 강도를 측정한다.
- 초상체의 1 μL을 브래드포드 분석9를사용하여 단백질 농도를 측정하기 위해 1x 단백질 분석 용액의 100 μL을 포함하는 투명한 96 개의 웰 플레이트로 전송한다.
- 단백질 농도로 형광 강도를 정상화하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HCT116 대장암세포는 산화응응을 유도하기 위해 100μM FS 또는 10 μM DOX로치료되었다. 도 1에도시된 바와 같이, 녹색 형광은 예상대로 FS와 DOX 모두에 의해 극적으로 증가되었다. 상대강도 변화를 정량화하기 위해, 세포를 촬영한 후 리즈화하고 단백질 농도로 정상화하였다. 정량화형 형광 강도는 HCT116 세포에서 FS 또는 DOX에 의해 현저하게 증가하였다.
그림 1: 철제 치료는 대장암세포에서 ROS를 증가시킨다. 형광 현미경 및 강도 정량화에 의해 촬영 된 대표적인 형광 이미지 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 이아세테이트 (DCFH-DA) H에서 염색 CT116 세포는 처리되지 않은 대조군(Ctrl),(A)100 μM 철황산염(FS) 또는(B)10 μM 독소루비신(DOX) 처리를 위한 24시간 스케일 바 = 400 μm을 치료하였다. * = p & lt; 0.05; = p & 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명된 실험 프로토콜은 세포 총 ROS를 측정하기 쉽게 재현할 수 있습니다. 중요한 단계에는 DCFH-DA 솔루션을 신선하게 만들고 광 노출을 방지하고, 세포 상태 방해를 최소화하고 이미지를 촬영하기 직전에 광범위한 PBS 세척이 포함됩니다. DCFH-DA 작업 솔루션의 준비를 위해 재고 솔루션은 24 웰 플레이트에 추가하기 직전에 미리 따뜻해진 DMEM에 추가되어야 합니다. 그 이유는 높은 배경 형광 또는 광 노출을 생성하는 오래된 솔루션이 광표백으로 이어질 것이기 때문입니다. 대부분의 연구는 1x PBS 또는 1x 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 사용하여 DCFH-DA를 희석시키고 반응 버퍼10으로사용합니다. 그러나, HCT116 및 RKO를 사용하는 경우, PBS및 태아소 혈청무료 DMEM을 이용한 DCFH-DA 스톡 용액의 희석은 처리되지 않은 세포에서도 높은 배경 신호를 생성하였다. 이것은 셀 상태 장애 때문일 수 있습니다. 또한 DCFH-DA 작업 솔루션은 웰 월을 따라 천천히 추가되어야 합니다. 세포 상태의 교란은 방해받지 않는 인근 지역에 비해 높은 형광 신호를 생성합니다. DMEM을 함유한 페놀의 자동 형광을 줄이기 위해 이미지를 촬영하기 전에 PBS로 적어도 두 번 세척하는 것도 중요합니다. 페놀프리 DMEM은 더 나은 선택이 될 수 있지만, PBS 세척이 자동 형광을 최소화하기에 충분하다는 것을 여기에서 보여줍니다. 도 1에도시된 바와 같이, 처리되지 않은 대조군에서도 두 개의 서로 다른 실험 배치가 다른 대표적인 이미지를 초래할 수 있다. 실험적 변이를 제어하려면 셀에 직접 스톡 솔루션을 추가하는 대신 희석된 DCFH-DA 작업 용액(프로토콜과 같이)으로 세포를 치료하는 것이 좋습니다. 또한 유사한 세포 밀도와 동일한 노출 시간이 있는 필드에서 이미지를 촬영해야 합니다. 마지막으로 모든 비교 그룹에서 동시에 실험을 수행하는 것이 중요합니다.
ROS의 중요성으로 인해 총 ROS 검출 외에도 특정 ROS 검출도 개발되었습니다. 예를 들어, 초산화화물의 세포 생산은 산화시 2-하이드록세티듐을 형성하기 위해 2위치의 하이드록실화를 초래하는 디하이드로에티듐에 의해 검출될 수 있다. 2-하이드록세티듐이 세포 DNA로 교차함에 따라, 각각 535nm 및 635 nm의 발아 및 방출 파장을 가진 적색 형광을 관찰할 수 있다. 미토콘드리아 초산화물은 미토콘드리아를 시약, 살아있는 세포에 입력하고 특히 미토콘드리아를 대상으로 디하이드로에티듐의 양이온 유도체로 시각화될 수 있다. 적색 형광을 생성하는 미토삭스의 산화 제품은 미토콘드리아 DNA로 교차할 수 있습니다. 화학 선택적 형광 내질리하이드 과산화수소 프로브는 H2O2 검출11을위해 개발되었다. 또한, 형광 분광광을 이용한 하이드록실 라디칼의 검출도1212개보고되었다.
요약하자면, 비용 효율적인 DCFH-DA 염색을 사용하여 셀룰러 총 ROS를 검출하기 위한 간단하고 최적화된 프로토콜을 설명했습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 암 학회 (RSG-18-050-01-NEC)의 연구 학자 보조금인 국립 보건 원 (K01DK14390)에 의해 부분적으로 지원되었으며, 연구 파일럿 프로젝트 보조금은 뉴멕시코 대학교 환경 건강 서명 프로그램 및 슈퍼펀드(P42 ES025589), 공유 자원 시범 프로젝트 상 및 UNM 종합 암 센터의 연구 프로그램 지원 파일럿 프로젝트 상(P30CA118100) 뉴멕시코 의과 대학의 전담 건강 연구 기금에서 새로운 조사자 상을 수상했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
