Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60687
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Summary

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Abstract

Metastase is de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen en er zijn beperkte therapeutische opties voor patiënten met gemetastaseerde ziekte. De identificatie en het testen van nieuwe therapeutische doelstellingen die de ontwikkeling van betere behandelingen voor gemetastaseerde ziekten zullen vergemakkelijken, vereisen preklinische in vivo-modellen. Gedemonstreerd hier is een syngene muismodel voor borstkanker gemetastaseerde kolonisatie en daaropvolgende groei. Gemetastaseerde kankercellen worden stabiel met virale vectoren gecodeerd Firefly plaats en zsgreen eiwitten. Kandidaatgenen worden vervolgens stabiel gemanipuleerd in Luciferase/ZsGreen-uitdrukken van kankercellen en vervolgens worden de cellen via de laterale staart ader geïnjecteerd in muizen om gemetastaseerde kolonisatie en groei te assay. Een in vivo imaging-apparaat wordt vervolgens gebruikt om de Bioluminescentie of fluorescentie van de tumorcellen in de levende dieren te meten om veranderingen in de gemetastaseerde last na verloop van tijd te kwantificeren. De uitdrukking van het fluorescerende eiwit maakt het mogelijk het aantal en de grootte van metastasen in de longen aan het einde van het experiment te kwantificeren zonder dat er een snij-of histologische kleuring nodig is. Deze aanpak biedt een relatief snelle en eenvoudige manier om de rol van kandidaatgenen in gemetastaseerde kolonisatie en groei te testen, en biedt veel meer informatie dan de traditionele metastase-assays van de staart ader. Met deze aanpak tonen we aan dat gelijktijdige knock-down van Ja geassocieerde eiwitten (YAP) en transcriptionele co-Activator met een PDZ-bindend motief (TAZ) in borstkankercellen leidt tot een verminderde metastatische last in de longen en dat deze lagere last het resultaat is van een significant verminderde gemetastaseerde kolonisatie en verminderde groei van metastasen.

Introduction

Kanker blijft de tweede leidende doodsoorzaak wereldwijd1 en metastase is verantwoordelijk voor de meerderheid van deze sterfgevallen2,3. Een beperkt begrip van de moleculaire mechanismen die de gemetastaseerde kolonisatie en de daaropvolgende groei beheersen, heeft echter de ontwikkeling van effectieve behandelingen voor gemetastaseerde ziekte belemmerd. De identificatie van nieuwe therapeutische doelstellingen vereist een assay om te testen hoe verontrust expressie of functie van een kandidaatgen invloed heeft op metastase vorming en groei. Hoewel autochtone Mouse-modellen hun voordelen hebben, zijn ze tijdrovend en duur om te genereren, waardoor ze geschikter zijn voor doel validatie in plaats van doel detectie. Transplantatie modelsystemen waarbij het aspirant-gen in kankercellen in vitro wordt verstoord en vervolgens effecten op gemetastaseerd potentieel worden beoordeeld in vivo, zijn minder duur en hoger doorvoer dan autochtone modellen. Bovendien zijn virale vectoren voor stabiele levering van RNAi, CRISPR/CAS9 en transgenen op grote schaal beschikbaar, waardoor het relatief gemakkelijk is om vrijwel elk gen of genen van belang in een kankercellijnen te perturb. Deze aanpak kan ook worden gebruikt om de rol van kandidaatgenen bij gemetastaseerde kolonisatie en groei in menselijke kankercellijnen te testen door de cellen in immuungecompromitteerde of gehumaniseerde muizen te verplanten.

De twee soorten assays die worden gebruikt om metastase vorming te testen door getransplanteerde kankercellen in vivo zijn spontane metastase-assays en experimentele metastase-assays. In spontane metastase testen4,5, kankercellen worden geïnjecteerd in muizen, toegestaan om een primaire tumor te vormen, en vervolgens spontane metastasen vorming en daaropvolgende groei worden getest. De sterkte van dit model is dat de cellen alle stappen van het metastatische proces moeten voltooien om gemetastaseerde tumoren te vormen. Echter, veel kanker cellijnen niet metastaseren efficiënt in spontane metastase modellen, en elke manipulatie van de cellen die invloed hebben op primaire tumorgroei kan de resultaten van de metastase assay Verwar. Experimentele metastase-assays, waarin kankercellen direct in omloop worden geïnjecteerd, worden gebruikt om deze valkuilen te voorkomen. Gemeenschappelijke experimentele metastase-assays omvatten de staart ader injectie6,7,8 (en gedemonstreerd hier), intracardiale injectie9, en portaal ader injectie10.

Het doel van het hier gepresenteerde protocol is om een in vivo experimentele metastase test te bieden die een onderzoeker in staat stelt om metastase vorming en groei in real time te monitoren, alsook om het aantal en de grootte van het eindpunt in de longen van dezelfde muis te kwantificeren. Om dit te bereiken, wordt de traditionele experimentele staart ader metastase assays6,7,8 gecombineerd met levende dieren beeldvorming, met behulp van een in vivo beeldapparaat9,11,12,13,14. Tumor cellen met een stabiel uitdrukken van beide plaats en een fluorescerend eiwit worden geïnjecteerd in muizen via de laterale staart ader en vervolgens wordt het in vivo beeldapparaat gebruikt om veranderingen in de gemetastaseerde belasting in de longen na verloop van tijd te meten (Figuur 1). De in vivo levende dier beeldvormings inrichting kan echter de grootte van individuele metastasen niet onderscheiden of meten. Zo wordt aan het einde van het experiment een fluorescerende stereomicroscoop gebruikt om het aantal te tellen en de grootte van de fluorescerende metastasen in de longen te meten zonder de noodzaak voor snijden en histologie of immunohistochemie (Figuur 1). Dit protocol kan worden gebruikt om te testen hoe het veranderen van de uitdrukking of functie van een kandidaatgen invloed heeft op metastase vorming en groei. Potentiële therapeutische verbindingen zoals kleine moleculen of functie blokkerende antilichamen kunnen ook worden getest.

Om deze aanpak te demonstreren, hebben we eerst een proof of concept experiment uitgevoerd waarin de essentiële replicatiefactor, replicatie eiwit a3 (RPA3) is neergeslagen in gemetastaseerde muizen borstkankercellen. We laten zien dat muizen die geïnjecteerd zijn met RPA3 knockdown cellen significant minder gemetastaseerde last hebben op elk tijdstip in vergelijking met muizen die met controle cellen worden geïnjecteerd. Analyse van de metastasen-bevattende longen toont aan dat deze verlaagde gemetastaseerde belasting het resultaat is van significant gereduceerde gemetastaseerde kolonisatie en verminderde groei van de uitzaaiingen die vormen. Om deze techniek verder aan te tonen, hebben we getest of gelijktijdige knock-down van Ja-geassocieerde eiwitten (YAP) en transcriptionele co-Activator met een PDZ-bindend motief (TAZ) de metastatische kolonisatie of daaropvolgende groei belemmert. YAP en TAZ zijn twee gerelateerde transcriptionele co-Activators die de kritische stroomafwaartse Effectors van de Hippo pathway zijn. We15,16 en anderen hebben betrokken Yap en taz in metastasen (beoordeeld in17,18,19), wat suggereert dat deze eiwitten goede therapeutische doelen zijn. Consequent, ontdekten we dat muizen geïnjecteerd met YAP/TAZ knockdown cellen aanzienlijk verminderde gemetastaseerd Last. Analyse van de longen toonde aan dat de YAP/TAZ knockdown cellen veel minder metastasen vormden en dat de metastasen die vorm kregen kleiner waren. Deze experimenten laten zien hoe experimentele metastase testen een onderzoeker in staat stellen om snel en goedkoop de rol van een kandidaat-gen in metastase vorming en groei te onderzoeken. Ze laten verder zien hoe het gecombineerde gebruik van levende dierlijke beeldvorming en fluorescerende kwantificering van metastasen in hele longen de onderzoeker in staat stelt om de stappen tijdens gemetastaseerde kolonisatie beter te begrijpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol omvat het gebruik van muizen en biogevaarlijke materialen en vereist goedkeuring van de bevoegde institutionele veiligheids comités. Alle beschreven in vivo werk hier is goedgekeurd door het Albany Medical College institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC).

Opmerking: voor een protocol overzicht, zie schematisch in Figuur 1.

1. verpakking van alle vereiste retrovirussen en linvirussen

Opmerking: het beschreven protocol maakt gebruik van linvirale of retrovirale vectoren om een plaats-enzym en TL-eiwit stabiel te uiten en om de uitdrukking van een kandidaatgen te manipuleren. Deze virussen zijn verpakt in HEK-293FT cellen zoals hieronder beschreven.

  1. Dag 1: plaat HEK-293FT cellen op 6-well platen in 2 mL van volledige groeimedia (10% FBS in DMEM met 1% penicillaire/streptomycine en 2 mM L-glutamine) zodat ze 40-60% Confluent Health op dag 2. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2 's nachts.
  2. Dag 2: voor elke virale vector die moet worden verpakt, transfect een 40-60% confluente goed van HEK-293FT cellen met de retrovirale of lentivirale vector en de juiste vectoren coderen van de virale vacht en de verpakking eiwitten.
    Opmerking: dit protocol maakt gebruik van VSVG als de vacht eiwitten, psPAX2 voor linvirale verpakkingen, en gag-Pol voor retrovirale verpakking (Zie aanvullende tabel 1 voor vector lijst).
  3. Maak een co-transfection mengsel voor elk goed als volgt:
    1. Combineer 4 μL lipide oplossing voor trans fecties (Zie tabel met materialen) en 96 μL transfectie buffer en inincuberen gedurende 5 minuten.
    2. Voeg toe 1 μg virale vector, 0,5 μg vacht eiwit vector (VSVG), en 0,5 μg verpakking eiwit vector (psPAX2 of gag-Pol) en inbroed gedurende 20 minuten.
    3. Voeg zachtjes het co-transfection mengsel toe van stap 1.3.2 tot de HEK-293FT cellen in stap 1,1 en inincuberen bij 37 °C, 5% CO2 's nachts.
  4. Dag 3: Verwijder de transfectie-bevattende media van elk goed en voeg zachtjes 2 mL volledige groeimedia toe aan elk goed. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende ongeveer 24 uur.
  5. Dag 4: Verzamel de virale supernatant van elke put met behulp van een 3 mL spuit en filtreer door een 0,45 μm filter in een 2 mL micro centrifugebuis.
  6. Optioneel: als de verzameling van een tweede batch virus gewenst is, voeg dan voorzichtig 2 mL volledige groeimedia toe aan elk goed en inbroed bij 37 °C, 5% CO2 gedurende ongeveer 24 uur.
  7. Dag 5 (optioneel): Verzamel een tweede ronde van virale supernatant zoals in stap 1,5.
    Opmerking: het protocol kan worden onderbroken door de virale supernatant te bevriezen.

2. generatie van kankercellen met een stabiel uitdrukken van plaats en een fluorescerende proteïne

Opmerking: in het volgende protocol wordt beschreven hoe u eerst een stabiel label van 4t1-cellen labelen met Firefly plaats en een fluorescerende proteïne (zsgreen) met behulp van twee vectoren met unieke selectie genen. Vervolgens wordt een 3RD virale vector gebruikt om de uitdrukking van een kandidaatgen te manipuleren. Virale vectoren die tegelijkertijd een fluorescerende proteïne en een genetische manipulatie leveren, kunnen echter ook als alternatief worden gebruikt (zoals in de representatieve experimenten hieronder). Andere kankercellen kunnen worden gebruikt, maar de celaantallen moeten worden geoptimaliseerd voor de stappen 2,1 en 2.7.1.

  1. Plaat 4T1 cellen bij 1,5 x 105 cellen/goed in een 12-put plaat in volledige groeimedia (10% FBS in DMEM met 1% penicileen/streptomycine en 2 mm L-glutamine) en inincuberen bij 37 ° c, 5% Co2 's nachts.
  2. Infecteren de 4T1 cellen met de virale supernatant gegenereerd in stap 1 als volgt.
    1. Aspireren de groeimedia uit de cellen en voeg 500 μl plaats virale supernatant en 500 μl van fluorescerende eiwit virale supernatant om de cellen gelijktijdig te infecteren met zowel de plaats als de fluorescerende proteïne virale supernatants.
    2. Voeg 1 μL van 8 mg/mL hexadimethrine bromide toe (Zie tabel met materialen).
    3. Inincuberen de cellen bij 37 °C, 5% tot 75-90% Confluent Health (meestal 24-48 uur).
  3. Trypsinoseer de 4T1-cellen met 500 μL trypsine gedurende 2-5 minuten (cellen moeten vrij uit de bodem van de put spoelen). Breng alle cellen over in een schaal van 6 cm in 4 mL selectie media (volledige groeimedia met de juiste antibiotica), waardoor de trypsine wordt afgemaakt. Plaat een 6 cm schaal van niet-geïnfecteerde controle cellen in dezelfde selectie media.
    Opmerking: een geschikte antibioticum concentratie moet vooraf worden bepaald door verschillende doses te testen. Bovendien kan fluorescentie-geactiveerde celsortering ook worden gebruikt om de fluorescently gelabelde cellen in plaats van de drug selectie te selecteren.
  4. Inincuberen de cellen bij 37 °C, 5% CO2 in de selectie media en splitsen de cellen indien nodig totdat alle niet-geïnfecteerde controle cellen dood zijn (afhankelijk van het selectie-gen en de cellijn).
  5. Bevestig dat de geïnfecteerde 4T1 cellen het ZsGreen fluorescerende eiwit uitdrukken met behulp van een groene excitatie (450-490 nm)/emission (500-550 nm) filter ingesteld op een omgekeerde fluorescerende Microscoop met een vergroting van 50-100x.
  6. Bevestig dat de geïnfecteerde 4t1 cellen plaats uitdrukken met behulp van een commercieel beschikbare plaats activity Kit als volgt.
    1. Gebruik een minimaal volume van 1x passieve lysisbuffer aan lyse Luciferase-uitdrukken van 4T1 cellen en controle 4T1 cellen die Luciferase niet uitdrukken, zachtjes schudden gedurende 30 minuten.
    2. Voeg 20 μL cellysaat toe aan een witte bodem 96-goed plaat en vervolgens 50 μL van het plaats-test reagens uit de plaats-activiteitskit.
    3. Gebruik een plaat lezer om de luminescentie van de cellen op alle golflengten in het spectrum te meten met behulp van de luminescentie instelling.
      Opmerking: het protocol kan worden onderbroken door de stabiel-transduced cellen te bevriezen.
  7. Manipuleer de uitdrukking van het kandidaatgen als volgt:
    1. Plaat 6 x 105 gelabelde 4T1 cellen uit stap 2,6 op een 60 mm schaal in 4 ml volledige groeimedia en inbroed bij 37 °c, 5% Co2 's nachts.
    2. Aspireren de groeimedia van elk goed en voeg 2 mL volledige groeimedia toe met 4 μL 8 mg/mL hexadimethrine bromide.
    3. Voeg 2 mL virale supernatant uit stap 1 toe aan de cellen verguld uit stap 2.7.2 en inincuberen bij 37 °C, 5% CO2 's nachts.
    4. Trypsinoseer de 4T1-cellen met 500 μL trypsine gedurende 2-5 minuten (cellen moeten vrij uit de bodem van de put spoelen). Breng alle cellen over naar een schaal van 10 cm in 10 mL selectie media (volledige groeimedia met de juiste antibiotica), waardoor de trypsine wordt afgemaakt. Sommige niet-geïnfecteerde besturingselement gelabeld 4T1 cellen in dezelfde selectie media.
    5. Inincuberen de cellen bij 37 °C, 5% CO2 in de selectie media en splitsen de cellen indien nodig totdat alle niet-geïnfecteerde cellen dood zijn.
    6. Bevestig dat de uitdrukking van het kandidaatgen wordt gewijzigd met behulp van een standaard aanpak zoals Western Blot20 of qPCR21.
    7. Test luminescentie en fluorescentie zoals in stappen 2.5-2.6 om te bepalen hoe vergelijkbaar ze zijn in de controle en knockdown cellen, als dit kan veranderen (zie discussie).
      Opmerking: het protocol kan worden onderbroken door de stabiel-transduced cellen te bevriezen.

3. optimalisatie van het in vivo experimentele ontwerp

  1. Optimaliseer het juiste celnummer en de duur van het experiment voor de gewenste gemetastaseerde last als volgt.
    1. Breid de fluorescerende en bioluminescente 4T1-cellen uit vanaf stap 2,6 in volledige groeimedia, zodat overtollige cellen beschikbaar zijn op de gewenste dag van de injectie.
    2. Bereid de cellen voor op de staart ader injecties zoals beschreven in stap 4,2. Om het optimale celnummer voor injecties te bepalen, moet u de cellen in verschillende concentraties in 100 μL van 1x PBS rehervatten.
      Opmerking: we raden u aan een reeks celnummers/muizen te testen van 25.000 tot 500.000.
    3. Houd de cel suspensies op ijs tot de injectie.
    4. Injecteer elke verdunning van 4T1 cellen van stap 3.1.2 in 3-4 muizen via de laterale staart ader zoals beschreven in stap 4,3 (zie hieronder).
    5. Keer de muis terug naar de kooi en monitor gedurende 15 minuten om een volledig herstel te garanderen. Muizen moeten worden gecontroleerd op tekenen van pijn of nood 3x per week.
    6. Monitor muizen voor metastase vorming en groei voor 3-6 weken (afhankelijk van de cellijn en de muis) met behulp van een in vivo Live dieren beeldapparaat (zie stap 5 en 6).
      1. Euthaniseer muizen 3-6 weken na de staart ader injectie volgens de standaard institutionele richtlijnen.
      2. Bereid de longen voor en evalueer de metastasen en de grootte en het aantal zoals beschreven in stap 7.
      3. Kies de juiste tijdsduur om de metastasen te laten groeien voor de gewenste gemetastaseerde last (zie discussie).

4. staart ader injectie van gelabelde kankercellen

NB: stap 4.2.4 is geoptimaliseerd voor 4T1 cellen die groeien in syngene BALB/c muizen. Als andere cellijnen en muis stammen van kanker worden gebruikt, moet het aantal geïnjecteerde cellen en de lengte van de test eerst worden geoptimaliseerd.

  1. Breid de 4T1-cellijnen uit stap 2 uit op 2 15 cm-schotels in volledige groeimedia, zodat overtollige cellen beschikbaar zijn op de dag van de injectie.
  2. Bereid de cellen voor de injectie van de staart ader als volgt voor:
    1. Aspireren van de media en spoel de celplaten met 1x PBS.
    2. Trypsinize de cellen met 5 mL trypsine per 15 cm plaat gedurende 2-5 minuten (cellen moeten vrij afspoelen van de bodem van de put). Breng alle cellen over naar een conische buis. Was de overgebleven cellen uit de weefselkweek schaal met voldoende volledige groeimedia om de trypsine te doven en de wassing aan dezelfde conische buis toe te voegen.
    3. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller om het totale celnummer te bepalen.
    4. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 122 x g , zuig het supernatant op en hervat de cellen in 1x PBS op de gewenste concentratie. Hier worden 2,5 x 104 cellen geïnjecteerd in elke muis in 100 μL PBS, dus de respendeer cellen bij 2,5 x 105 cellen/ml. Houd de cel suspensies op ijs tot de injectie.
      Opmerking: het is belangrijk om de hoeveelheid tijd tussen trypsinoisatie van de cellen en de staart ader injectie te beperken tot ongeveer 1 uur.
  3. Injecteer 4T1 cellen van stap 4.2.5 in muizen via de laterale staart ader als volgt:
    1. Werken in een afzuigkap bij de dieren faciliteit, zachtjes maar grondig mengen van de cellen door het omkeren van de buis of met behulp van een 1 mL spuit om ervoor te zorgen dat ze uniform worden geresuspendeerd. Zorg er altijd voor dat de cellen worden geresuspendeerd voordat de spuit wordt geladen.
    2. Laad een 1 mL Luer-Lock spuit met celsuspensie en verwijder overtollige luchtbellen. Plaats een 1/2 inch, 30-gauge naald op de spuit met de schuine kant omhoog en verdrijven luchtbellen.
    3. Plaats de muis voorzichtig in een knaagdieren-fixator.
    4. De laterale staart aders moeten zichtbaar en verwijd zijn. Als dat niet zo is, knijp dan zachtjes de onderkant van de staart en dompel de staart in warm kraanwater om de aderen te verwijden.
      Opmerking: verwijding van de aderen kan ook worden bereikt door het plaatsen van de muis kooi onder een verwarmings lamp en/of bovenop een verwarmingskussen.
    5. Gebruik een alcoholdoekje om de staart te reinigen. Steek de naald in de staart ader, de schuine kant naar boven en Injecteer 100 μL celsuspensie.
      Opmerking: als de naald goed in de ader is gestoken, moet deze gemakkelijk iets naar voren en achteren schuiven en moet er geen weerstand zijn wanneer de zuiger wordt geduwd. Succesvolle injecties moeten ook resulteren in een "flush" waarin de blauwe kleur van de ader wordt wit gedurende een paar seconden na de injectie.
  4. Verwijder langzaam de naald en gebruik een steriel gaas, druk op de injectieplaats om eventuele bloedingen te stoppen.
  5. Keer de muis terug naar de kooi en monitor gedurende 15 minuten om volledig herstel te garanderen. Muizen moeten worden gecontroleerd op tekenen van pijn of nood 3x per week.
  6. Monitor muizen voor metastase vorming en groei voor 3-6 weken (afhankelijk van de cellijn en de muis) met behulp van een in vivo Live dieren beeldapparaat (zie stap 5 en 6).

5. monitoring van de gemetastaseerde last door fluorescentie met een in vivo levend dier beeldvormings apparaat

Let op: geen afbeelding van het dier voor fluorescentie met actief lichtgevend signaal.

  1. Als alleen Imaging bioluminescentie, gaat u verder met stap 6.
  2. Schakel het in vivo levende dier beeldvormings apparaat in.
  3. Opzetten van de in vivo levende dierlijke Imaging anesthesie systeem volgens de richtlijnen van de fabrikant te leveren tussen 1,5% en 2% Isofluraan aan de anesthesie kamer en de Imaging kamer.
  4. Anesthetiseer muizen met fluorescently gelabelde metastasen uit stap 4 door ze in een anesthesie kamer te plaatsen en 1,5-2,5% Isofluraan te leveren.
  5. Open de beeld software (Zie tabel met materialen) en login.
  6. Klik op de knop initialiseren en wacht tot de computer is geïnitialiseerd.
  7. Verander het gezichtsveld in D.
    Opmerking: het gezichtsveld C kan ook worden gebruikt als een nauwkeuriger beeld van een muis is vereist, maar dit beperkt het aantal muizen dat tegelijkertijd kan worden afgebeeld.
  8. Zodra de software heeft aangegeven dat de camera de juiste temperatuur heeft bereikt, klikt u op de knop Imaging wizard , kiest u fluorescentie en kiest u vervolgens het gewenste filter paar in het vervolgkeuzemenu.
    Opmerking: als de de die wordt gebruikt geen optie is, kiest u input ex/EM en typt u de gewenste excitatie en emissie.
  9. Plaats de muis in de kamer zoals beschreven in stap 3.2.4.
  10. Klik op reeks ophalen.
  11. Na beeldvorming, de muis terug naar de kooi en monitor gedurende 15 minuten om volledig herstel te garanderen.
  12. Herhaal stap 5,2 en de stappen 5.7-5.9 met ten minste één muis die geen metastasen bevat. Opmerking: deze muis wordt gebruikt om het achtergrond signaal te kwantificeren en af te trekken tijdens de analyse (stap 8).
  13. Afbeelding 2-3 keer per week gedurende de duur van het experiment.

6. monitoring van de gemetastaseerde last door bioluminescentie met een in vivo levend dier beeldvormings apparaat

  1. Schakel het in vivo Live dieren beeldvormings apparaat in en stel het programma als volgt in.
    1. Open de beeld software (Zie tabel met materialen) en login. Klik op de knop initialiseren en wacht tot de computer is geïnitialiseerd. Verander het gezichtsveld in D.
      Opmerking: het gezichts veld C kan worden gebruikt voor een betere weergave om de volledige muis te beeld; Dit beperkt echter het aantal muizen dat in één keer kan worden gefotografeerd.
    2. Voor de eerste keer gebruiken, bewerk belichtingsinstellingen als volgt: Klik op bewerken | Voorkeuren | Acquisitie | Automatische belichting en verander de maximale belichtingstijd van de standaard 60 seconden tot 300 seconden en klik op OK.
      Opmerking: Verander geen andere parameters in het tabblad Automatische belichting.
  2. Opzetten van de anesthesie systeem volgens de richtlijnen van de fabrikant te leveren tussen 1,5% en 2% Isofluraan aan de anesthesie kamer en de Imaging kamer.
  3. Zorg ervoor dat de camera de juiste temperatuur heeft bereikt voordat u doorgaat naar stap 6,4.
  4. Anesthetiseren metastase-bevattende muizen uit stap 4 door ze te plaatsen in een anesthesie kamer en leveren 1.5-2.5% isoflurane.
  5. Bereid de muizen voor op Bioluminescentie beeldvorming als volgt.
    1. Laad een 1 mL spuit met D-Luciferin (30 mg/mL in D-PBS) en voeg vervolgens een 1/2 inch 30-gauge naald toe aan de spuit en verwijder luchtbellen.
    2. Meet en noteer de massa van de verdoofd Mouse.
    3. Trek de muis aan door de Scruff van de nek met de duim en aanwijzer vingers te knijpen en de staart tussen de Pinkie Finger en de basis van de hand te grijpen. Keer de muis om in een hoek van 45 graden, met het hoofd naar beneden gericht.
    4. Steek de naald, schuine kant naar boven, in de linker kant intraperitoneale (IP) ruimte van de muis. Bevestig de invoer in de IP-ruimte door een klein volume terug te trekken. Er mag geen kleur aan de basis van de naald zijn bij het terugtekenen in de IP-ruimte.
    5. Injecteer het juiste volume van D-Luciferin voor een dosis van 150 mg/kg.
    6. Onmiddellijk na D-Luciferin administratie, start een timer en plaats de muis plat op zijn rug in het beeldapparaat met zijn neus in de neuskegel en ervoor te zorgen dat 1.5-2.5% Isofluraan wordt toegediend. Plaats de scheidingslijnen tussen elke muis als u meerdere muizen Imaging. Zorg ervoor dat muizen zo plat mogelijk worden gepositioneerd (d.w.z. niet aan één kant leunen).
    7. Klik op de vakken luminescente en foto en klik vervolgens op verwerven in het configuratie scherm voor aanschaf.
  6. Verkrijg continu bioluminescente beelden totdat het piek signaal is bereikt en gebruik het beeld met het piek-bioluminescente signaal voor analyse.
  7. Na beeldvorming, de muis terug naar de kooi en monitor gedurende 15 minuten om volledig herstel te garanderen.
  8. Afbeelding 2-3 keer per week gedurende de duur van het experiment.

7. kwantificering van het aantal en de omvang van metastasen

Opmerking: de lengte van de tijd die de metastasen mogen groeien, moet worden bepaald voor elke cellijn en muis stam, en zal worden beïnvloed door het aantal geïnjecteerde cellen.

  1. Euthaniseer de muizen volgens de standaard institutionele richtlijnen.
  2. Isoleer en verwijder de longen van elke muis en spoel in 1x PBS om overtollig bloed te verwijderen.
  3. Scheid de longen voorzichtig in lobben.
  4. Verkrijg beelden van zsgreen metastasen in de lobben bij 10x in helderveld en fluorescentie met behulp van een fluorescerende stereoscoop met een GFP breedband-filter (excitatie 470/40x).
    Opmerking: behoud dezelfde vergroting en helderheid voor alle samples. De gebruikte vergroting kan variëren afhankelijk van de grootte, het aantal en de helderheid van metastasen, evenals het gezichtsveld voor de gebruikte Microscoop.
  5. Gebruik beeldanalyse software om de grootte en het aantal metastasen van de beelden te kwantificeren.
    Opmerking: het protocol voorbeeld analyse is afhankelijk van de software en kan worden geoptimaliseerd met tumoren van de. U ook het aantal metastasen in elke longen handmatig tellen met behulp van de fluorescerende stereoscoop. Protocol kan hier worden onderbroken en stap 8 kan op elk moment worden uitgevoerd nadat alle in vivo beelden zijn verzameld.

8. verwerking en analyse van de gegevens van de beelden die zijn verkregen met het in vivo Live Animal imaging-apparaat

  1. Open alle afbeeldingsbestanden voor elke muis in de afbeeldings software.
    Opmerking: gebruik de afbeelding met het Peak bioluminescente signaal voor analyse
  2. Zorg ervoor dat de units in glans zijn voor bioluminescente gegevens en efficiëntie voor fluorescerende gegevens door op de pijl linksboven in het afbeeldingsvenster te klikken en deze te wijzigen in de juiste eenheid.
  3. Gebruik de afbeelding van het laatste tijdpunt om een regio van belang (ROI) als volgt te maken.
    1. Klik op ROI tools in het gereedschapspalet venster. Voeg één ROI in door op de pijl te klikken en 1te selecteren.
    2. Klik op de rand van de ROI en beweeg deze over de borst van de muis. Pas de grootte van de ROI aan zodat deze de borst van de muis bedekt en het signaal niet uitsluit.
  4. Klik op meet ROIs en kopieer of typ het onbewerkte getal in een Excel-werkblad.
    Opmerking: voor bioluminescente gegevens selecteert u de totale flux (fotonen/seconde), de som van alle glans in de ROI. Aangezien metastasen niet noodzakelijkerwijs gelijkmatig groeien, heeft de totale flux de voorkeur boven gemiddelde glans omdat het de som van de gemetastaseerde belasting meet. Evenzo moet voor fluorescerende gegevens het totale efficiëntiepercentage (emissie licht (fotonen/seconde)/excitatie licht (fotonen/seconde)) worden gebruikt in plaats van de gemiddelde efficiëntie.
  5. Klik met de rechtermuisknop in het afbeeldingsbestand om de ROI te kopiëren die in stap 8,3 wordt gebruikt en plak deze in elk afbeeldingsbestand.
    Opmerking: bij het kwantificeren van fluorescerende afbeeldingen, kwantificeer je dezelfde regio op een muis die zonder metastase is afgebeeld. Gebruik dit signaal als achtergrond signaal en trek het af van elke verkregen fluorescerende metastase-bevattende muis afbeelding.
  6. Verplaats geplakte ROIs over dezelfde regio die is geselecteerd in stap 8.3.4 voor elke afbeelding en herhaal stap 8,4.
  7. Plot en analyseer de onbewerkte gegevens als volgt (Zie aanvullende tabel 2).
    1. Doe een log10 transformatie van de onbewerkte gegevens voor elke muis met behulp van de aangegeven formule (aanvullende tabel 2) en plot zoals in Figuur 2D en Figuur 4F. De log10 -transformatie lineariseert de groeicurve die de neiging heeft om geometrisch te zijn en heteroscedasticiteit minimaliseert.
    2. Met behulp van lineaire regressie, bereken de helling van de fitted-lijn naar de log10 getransformeerde gegevens voor elke muis uitgezet in stap 8.7.1 (aanvullende tabel 2). Raadpleeg de formule in aanvullende tabel 2 om de lijn aan te passen en de helling in één stap te berekenen.
    3. Plot de numerieke waarden van de hellingen zoals in Figuur 2E en Figuur 4G. Gebruik de t-toets van een student of een one-way ANOVA (voor meer dan 2 groepen) op de hellingen om de statistische significantie te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de bovenstaande aanpak te demonstreren, hebben we een proof of concept experiment uitgevoerd waarin een kritische replicatiefactor, RPA3 werd neergeslagen in een metastatische muis borstkanker cellijn (4T122). Terwijl het protocol beschrijft het labelen van de cellen met zowel plaats en fluorescentie eiwitten voorafgaand aan genetische manipulatie, we gebruikten een gemodificeerde aanpak omdat de RNAi vectoren ook zsgreen leveren (Figuur 2a). Ten eerste werden 4t1-cellen stabiel met een lentivirale constructie gecodeerd met Firefly plaats en hygromycine resistentie (Phage-plaats-IRES-Hygro). Na hygromycine selectie werd een plaats test uitgevoerd om een stabiele uitdrukking van de Firefly plaats te bevestigen (Figuur 2a). Vervolgens werden de 4t1-Luciferase cellen stabiel weergegeven met retrovirale vectoren die zsgreen uitdrukken en ofwel een op controle miR30 gebaseerde shRNA, of een miR30-gebaseerde shRNA die eerder werd getoond om doeltreffend de muis RPA316,23,24te targeten. De cellen werden vervolgens via de laterale staart ader in de muizen geïnjecteerd en in vivo werd tweemaal per week een bioluminescente signaal gemeten om de gemetastaseerde last te bewaken (Figuur 2B, C). Het in Log10 getransformeerde signaal voor elke muis werd uitgezet als gemetastaseerde last in de loop van de tijd (Figuur 2D) en de hellingen van elk perceel werden bepaald (Figuur 2E). Deze gegevens tonen aan dat de mate van verandering in de gemetastaseerde last significant wordt verlaagd met RPA3 knockdown in vergelijking met controle cellen. Hoewel de verschillen opvallend zijn, kunnen deze gegevens alleen niet bepalen of de verlaagde gemetastaseerde belasting het gevolg is van minder metastasen of door een tragere groei van metastasen. Daarom werden de ZsGreen-gelabelde metastasen in de longen ook geanalyseerd aan het einde van het experiment. Muizen die met RPA3 knockdown cellen werden geïnjecteerd, hadden bijna geen metastasen in de longen, terwijl de controle muizen talrijke grote metastasen hadden (Figuur 3). Bovendien waren de metastasen die uit RPA3 knockdown-cellen kwamen duidelijk kleiner dan controle 4T1-metastasen (Figuur 3A). In overeenstemming met onze handmatige tellingen (Figuur 3B), telde beeldanalyse software significant minder METASTASEN in de RPA3 knockdown muizen (Figuur 3C). Bovendien werd de totale gemetastaseerde last in de longen (som van de gebieden van elke metastasen in millimeters) ook drastisch verlaagd door RPA3 knockdown (Figuur 3D). Ten slotte was de grootte van de individuele metastasen die in de RPA3-knockdown-muizen ontstonden, over het algemeen veel kleiner dan die in de controle muizen (Figuur 3E). Naast de grote metastasen in de controle muizen, hebben we ook tal van kleine metastasen observeren, maar kunnen niet bepalen of dit tumorcellen zijn die de longen hebben geseerd en niet groeien of als ze tumorcellen zijn die worden vergoten uit een van de grotere metastasen die de Long opnieuw hebben gesest in een nieuwe locatie (Figuur 3E). Collectief deze gegevens tonen aan dat RPA3 nodig is voor metastase vorming door 4T1 cellen. Deze bevindingen werden verwacht omdat ons vorige werk toonde dat RPA3 knock-down cellen aanzienlijk minder vermogen hadden om metastasen in de longen te vormen na een staart ader injectie16. Dit experiment laat echter zien hoe het gebruik van levende dierlijke beeldvorming en fluorescerende kwantificering van metastasen aantal en grootte kan worden gebruikt om te bepalen of veranderingen in de gemetastaseerde belasting te wijten zijn aan verschillen in gemetastaseerde kolonisatie of groei.

Om te laten zien hoe deze aanpak kan worden gebruikt om een meer biologisch relevante vraag te beantwoorden, vroegen we of YAP en TAZ nodig zijn voor gemetastaseerde kolonisatie en daaropvolgende groei in dit syngene model van borstkanker. De expressie en activiteit van Yap of taz worden in veel kankers verhoogd in vergelijking met normaal weefsel en dit is voorspellend voor een slechte patiënt uitkomst25,26,27,28,29. Daarnaast hebben verschillende studies betrokken bij Yap, taz of teads, de kritische Yap/taz-bindende partners, in metastasen15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Gezien deze gegevens gebruikten we onze aanpak om te testen of YAP en TAZ nodig zijn voor metastase vorming en groei. Hiervoor gebruiken we een retrovirale vector die tandem miR30 gebaseerde shRNAs uitdrukt, gericht op zowel YAP als TAZ. Zoals getoond, vermindert deze tandem shRNA effectief YAP en TAZ eiwit expressie en transcriptionele activiteit in 4T1 cellen (Figuur 4A, B). 4t1-Luciferase cellen werden stabiel met een zsgreen-uitdrukken versie van deze tandem Yap/taz shRNA vector of een Control miR30 gebaseerde shRNA (Figuur 4C) en vervolgens getest door staart ader injecties in syngene Balb/C muizen. Zoals weergegeven in Figuur 4, was de snelheid waarmee de gemetastaseerde last toenam significant sneller in de muizen die met controle cellen werden geïnjecteerd in vergelijking met de muizen die met de Yap/taz-knockdown-cellen werden geïnjecteerd (Figuur 4D-F). Significant minder metastasen gevormd in de muizen geïnjecteerd met YAP/TAZ knockdown cellen in vergelijking met muizen met controle cellen of handmatig geteld (Figuur 5A, B) of met behulp van de beeldanalyse software (Figuur 5C). Niet alleen hebben veel meer metastasen vorm in de controle muizen, maar ze waren over het algemeen groter (Figuur 5E). Consequent werd de gemetastaseerde last in de longen (totale metastasen gebied in mm) ook drastisch verlaagd door YAP/TAZ knockdown (Figuur 5D). Het is belangrijk op te merken dat wanneer de metastasen zijn groot en dicht bij elkaar, de software kan niet in staat zijn om onderscheid te maken verschillende metastasen. Dit was het geval voor enkele metastasen in controle muizen (muis 3 en muis 7). Het is dus belangrijk om de uitvoer van de beeldanalyse software te controleren om ervoor te zorgen dat het nauwkeurig het gebied van enkele tumoren meet. Dit is ook de reden waarom het belangrijk is om het aantal cellen dat wordt geïnjecteerd en de lengte van het experiment te optimaliseren. Gezamenlijk tonen deze gegevens aan dat YAP en TAZ moeten voldoen aan de snelheid waarmee de gemetastaseerde last toeneemt in een syngene-muriene model van gemetastaseerde borstkanker en dat dit het gevolg is van het onvermogen om metastasen te vormen en de groei van de weinige metastasen die zich vormen te verminderen.

Figure 1
Figuur 1: schematische voorstelling van het protocol. Alle noodzakelijke virussen worden eerst verpakt in HEK-293FT cellen. De gewenste cellen voor de studie worden vervolgens gelijktijdig geïnfecteerd met plaats en fluorescerende virussen die elk een uniek zoogdier drug selectie gen uitdrukken. Geïnfecteerde cellen worden vervolgens uitgebreid in de juiste media met beide geneesmiddelen om te selecteren voor stabiel getransduceerde cellen die zowel plaats als het TL-eiwit uitdrukken. De expressie van beide labels wordt bevestigd zoals beschreven in het protocol. De gelabelde cellen worden vervolgens met een derde virus a met genetische manipulatie (miR30 shRNA) en een derde unieke drug Selection gen. Na selectie met het derde medicijn worden de cellen via de laterale staart ader in de muizen geïnjecteerd. De gemetastaseerde last wordt tijdens het experiment in de muizen gemonitord met een in vivo levend dieren beeldvormings systeem. Aan het einde van het experiment worden muizen geëeseerd en worden beelden van de hele longen genomen met behulp van een fluorescerende ontleed Microscoop en vervolgens gebruikt om het aantal en de grootte van metastasen te meten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Luciferase-gebaseerd in vivo levende dieren beeldvormende toont aan dat RPA3 knockdown vermindert borstkanker metastatische belasting. (A) Schematische weergave van de gegenereerde cellen voor deze in vivo studie. 4t1 cellen waren stabiel getransduceerde met een lentivirus codering plaats en hygromycine weerstand. Geïnfecteerde cellen werden geselecteerd met 600 μg/ml hygromycine B voor een week en vervolgens plaats activiteit werd gemeten in de ouderlijke of 4t1-plaats cellen met behulp van een plaats reporter Kit en Plate Reader (n = 1 experiment met replicaatputten gemiddeld). 4T1-Luciferase cellen werden vervolgens geïnfecteerd met retrovirus die ZsGreen en miR30 shRNAs leveren gericht op ofwel mCherry (Control) of mRPA3. Puromycine selectie (2,5 μg/mL) voor 3 dagen werd gebruikt om te selecteren voor stabiele integratie van het virus. (B-E) 4t1-Luciferase cellen met een stabiel uitdrukken van zsgreen en Control (sh-mcherry) of mRPA3 (sh-mRPA3-431) shrnas werden geïnjecteerd in muizen en afbeelding gemaakt voor bioluminescentie op de aangegeven dagen zoals beschreven in het protocol. (B &Amp; C) Bioluminescente beelden voor een representatieve muis van elke groep op de aangegeven dag na injectie (D) plot van het log10 getransformeerd plaats-signaal gemeten voor elke muis tijdens het experiment. (E) spreidings plot met gemiddelde (ononderbroken lijn) voor de hellingen van elke muis in D (n = 6 voor sh-Control en 8 voor sh-mRPA3-431). Statistische significantie werd getest met een student t -toets; * p ≤ 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: kwantificering van fluorescerende metastasen onthult dat RPA3 knockdown voorkomt metastatische kolonisatie en daaropvolgende groei van borstkankercellen. A) fluorescerende (linker) en brightfield (rechts) afbeeldingen van representatieve lobben van elke muis geïnjecteerd in figuur 2 21 dagen na de injectie. Sterretjes (*) gaven groene autofluorescentie Bronchi aan. (C-E) Image Analysis software (Zie tabel met materialen) werd gebruikt om objecten te identificeren en te meten met een intensiteits drempel van 25 tot 100 en een grootte drempel van 0,01 mm2 tot oneindig. (B &Amp; C) Spreidings plot met de gemiddelde (vaste staaf) van het totale aantal metastasen in de longen van elke muis wanneer geteld (B) door beeldanalyse software (C). D) de totale oppervlakte (mm) van de Long die werd gemeten met beeldanalyse software wordt uitgezet als gemetastaseerde last met het gemiddelde aangegeven door een vaste staaf. E) de grootte van elke metastase wordt voor elke muis getekend. Controle muizen worden aangeduid met de blauwe stippen en mRPA3 knockdown muizen door de rode stippen. Let op, de schaalbalk wordt gescheiden op 1 mm om het gemakkelijker te maken om de grootte en het aantal kleine metastasen te visualiseren (n = 6 sh-Control, 8 sh-mRPA3-431). Statistische significantie werd getest met een student t -toets; p = 0,06; * * p ≤ 0,01. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: YAP/taz knockdown vermindert de gemetastaseerde last van borstkanker. (A & B) 4t1 cellen die stabiel de miR30-gebaseerde controle (mcherry) of tandem Yap/taz shrnas (sh-mYAP1/mTAZ6) uitdrukken, werden geanalyseerd door Western Blot Analysis (A) of met een AP/taz-TEAD plaats reporter Construct en getest voor Yap/taz-TEAD transcriptionele activiteit zoals eerder beschreven15,16 (B) (n = 5 voor controle en 4 voor YAP1/TAZ6). (C) Schematische weergave van de gegenereerde cellen voor de in vivo studie. 4T1-Luciferase cellen werden geïnfecteerd met retrovirussen die ZsGreen leveren en ofwel een miR30 shRNA gericht op mCherry (Control) of tandem miR30 shRNAs gericht op zowel mYAP als mTAZ. Geïnfecteerde cellen werden geselecteerd in Puromycine (2,5 μg/mL) voor 3 dagen. 4t1-Luciferase cellen met een stabiel uitdrukken van zsgreen en Control (sh-mcherry) of Yap/Taz (sh-mYAP1/mTAZ1) shrnas werden vervolgens geïnjecteerd in muizen en afbeelding gemaakt voor bioluminescentie door op de geïnjecteerde dagen. (D &Amp; E) Bioluminescente beelden voor een representatieve muis van elke groep op de aangegeven dag na injectie. (F) plot van de log10 getransformeerd plaats signaal gemeten voor elke muis in de loop van het experiment. G) spreidings plot met gemiddelde (massieve staaf) voor de hellingen van elke muis in F (n = 7 voor sh-Control en 8 voor sh-mRPA3-431). Gemiddelde wordt aangegeven door een ononderbroken lijn. Statistische significantie werd getest met een student t -toets; p = 0,06; #, p ≤ 0,01; ***. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: YAP en taz zijn nodig voor gemetastaseerde borstkankercellen om de longen te koloniseren. A) fluorescerende (linker) en brightfield (rechts) afbeeldingen van representatieve lobben van elke muis geïnjecteerd in Figuur 4 21 dagen na injectie. (C-E) Afbeeldingen werden verwerkt met beeldanalyse software zoals beschreven in Figuur 3. (B &Amp; C) Spreidings plot met de gemiddelde (ononderbroken staaf) van het totale aantal metastasen in de longen van elke muis wanneer deze handmatig wordt geteld (B) of door beeldanalyse software (C). D) de totale oppervlakte van alle metastasen (mm) werd gemeten met beeldanalyse software en geplot als gemetastaseerde last met de gemiddelde (massieve staaf). E) de grootte van elke metastase wordt voor elke muis getekend. Controle muizen worden aangeduid met de blauwe stippen en de sh-mYAP1/mTAZ6 knockdown muizen door de rode stippen. Opmerking: de schaalbalk wordt op 1 mm van elkaar gescheiden om de grootte en het aantal kleine metastasen beter te visualiseren (n = 7 sh-Control, 8 sh-mYA1/mTAZ6). Gemiddelde wordt aangegeven door een ononderbroken lijn. Statistische significantie werd getest met een student t -toets; * p ≤ 0,05, * *, p ≤ 0,01; **. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende tabel 1: tabel van vectoren. Alle gebruikte vectoren worden vermeld en nieuwe vectoren worden beschreven. Standaard moleculaire biologie technieken werden gebruikt voor het klonen van nieuwe vectoren en sequenties voor nieuw beschreven 97-Mer shRNA zijn opgenomen. Citations verwijzen naar: [1]53, [2]16, [3]54Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 2: voorbeeld van in vivo gegevensverwerking en-analyse van levende dieren. Spreadsheet waarin wordt gedemonstreerd hoe de onbewerkte gegevens uit de in vivo levende dieren afbeeldingen worden geconverteerd voor analyse zoals beschreven in de stappen 6,7 en 6,8. Onbewerkte gegevens verkregen uit de in vivo levende dierlijke beeldvorming getransformeerd met behulp van een log10 -transformatie. De mate van verandering in de gemetastaseerde last wordt voor elke muis berekend door de helling te berekenen die wordt gegenereerd door de in logboek10 getransformeerde gegevens. Voorbeelden zijn plaats-analyse uit Figuur 2. De kolommen zijn kleurgecodeerd om aan te geven welke gegevens zijn gebruikt om elke richtings waarde te genereren en de formules worden in het werkblad vastgelegd. Dubbelklikken op de put zal de formule onthullen die wordt gebruikt om de gegevens te verwerken. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritieke stappen van de methode
Het is van cruciaal belang om het aantal geïnjecteerde cellen te optimaliseren (stap 3) voor een bepaalde cellijn en muis stam, omdat dit het aantal metastasen dat vorm en de lengte van het experiment sterk kan beïnvloeden. Als te veel cellen worden geïnjecteerd of de metastasen te lang groeien, kunnen de metastasen moeilijk te tellen zijn, waardoor de effecten van de genetische manipulatie moeilijk te beoordelen zijn. Echter, als er te weinig cellen worden geïnjecteerd, kunnen er weinig of geen metastasen vormen. Zo moet een voorlopig experiment worden uitgevoerd met behulp van verschillende aantallen cellen om het optimale aantal te bepalen en de lengte van de tijd dat de metastasen groeien. Om consistente aantallen metastasen binnen een groep te garanderen, is het belangrijk om gelijke aantallen levensvatbare cellen in elke muis te injecteren. Omdat cellen zich in zowel de buis als de spuit kunnen vestigen, moeten de cellen voorzichtig worden geresuspendeerd voordat de spuit wordt geladen, en moeten celsuspensies niet te lang in de spuit achterblijven (stap 4.3.2). De levensvatbaarheid van de cel neemt af naarmate de cellen langer in suspensie zijn, dus de hoeveelheid tijd tussen trypsinoisatie en injectie van de cellen mag niet meer dan één uur zijn (stap 4.2.5). Luchtbellen en grote klonters van cellen mogen niet worden geïnjecteerd omdat deze embolieën kunnen veroorzaken die de muis doden. Bovendien kan het tekenen van cellen omhoog door de naald ze afschuiven, zodat de spuit zonder de naald moet worden geladen. Om te bevestigen dat een relatief gelijk aantal cellen werd geïnjecteerd, kunnen in vivo kort na de injectie levende dier beelden worden ingenomen (Figuur 2B, Figuur 4D).

Nauwkeurige en consistente kwantificering van het bioluminescente signaal is belangrijk en afhankelijk van de cellen die de D-Luciferin innemen en metaboliseren. Dit kan worden beïnvloed door vele variabelen, met inbegrip van, de dosis van D-Luciferin, timing van de injectie, muis van lichaamstemperatuur, hoe verdoving de muis is wanneer geïnjecteerd, en hoe een muis is gepositioneerd in de anesthesie kamer voorafgaand aan beeldvorming. Daarom is het essentieel om deze stappen consistent te houden voor alle muizen-en beeldvormings sessies. We gebruikten een verwarmingskussen te handhaven consistente muis lichaamstemperatuur terwijl in de anesthesie kamer. Omdat het signaal het weefsel moet binnendringen voor zowel bioluminescente als fluorescerende detectie, is het ook essentieel om de muis positie consistent te houden voor elke afbeelding (plat op zijn rug werkt het beste voorbeeld vorming van de longen). Kwantificering van fluorescerende afbeeldingen uit de in vivo levende dierlijke beeldvorming moet altijd worden gedaan met behulp van de efficiency%-eenheden, omdat dit de juiste vergelijking tussen afbeeldingen mogelijk maakt. Evenzo moet de totale flux (fotonen/seconde) altijd worden gebruikt bij het kwantificeren van bioluminescente beelden. Voor de analyse van de gemetastaseerde belasting zet de log10 -transformatie de groeicurve (voordat het maximale signaal wordt bereikt) om in een lineair plot, dat noodzakelijk was voor de helling analyse.

Wijzigingen en het oplossen van problemen met de methode
In het gepresenteerde protocol wordt een populatie cellen eerst stabiel met een fluorescerend eiwit en Luciferase, waarna die populatie wordt weergegeven met een controle vector of een vector die gericht is op het gen van belang. Dit zorgt ervoor dat beide celpopulaties vergelijkbare fluorescerende eiwitten en plaats expressie hebben. Echter, als alternatief, virale vectoren die gelijktijdig leveren twee van deze componenten kunnen worden gebruikt. Sterker nog, in de representatieve experimenten gebruikten we ZsGreen om retrovirale vectoren uit te drukken om de shRNAs in 4T1-Luciferase-cellen uit te drukken. Het wordt aanbevolen dat de uitdrukking van de plaats en het fluorescerende eiwit worden getest in alle celgroepen nadat het gen van belang is veranderd. Verschillende niveaus van expressie tussen groepen kunnen compliceren de interpretatie van de gegevens, dus het is het beste als de verschillende groepen vergelijkbare uitdrukking van zowel de fluorescerende eiwitten en Luciferase hebben. Bovendien kunnen rode bloedcellen autofluorescentie zijn en kan het moeilijk zijn om de fluorescerende metastasen in de longen te visualiseren. Als dit het geval is, kunnen rode bloedcellen worden gewist uit de longen door PBS perfusie tijdens euthanasie om auto fluorescerende achtergrond te verminderen (geschikte euthanasie technieken en richtlijnen moeten worden gevolgd). Hoewel de verschillen tussen controle-en knockdown-groepen in onze representatieve experimenten dramatisch zijn, is de inherente muis-naar-muis variabiliteit die vaak voorkomt in in vivo metastase-assays zichtbaar in de controle muizen (Figuur 3b en Figuur 5b). Wanneer deze variabiliteit hoog is, kan het moeilijk zijn om de grootte van het afdekeffect te bepalen. Een alternatieve aanpak die kan worden gebruikt om deze variabiliteit te verminderen is het labelen van de controle cellen en de afdek cellen met verschillende fluorescerende eiwitten en verschillende plaats enzymen en meng vervolgens de twee populaties in gelijke aantallen en Injecteer het mengsel. Bijvoorbeeld, controle cellen die stabiel uitdrukken tomaat en renilla plaats kunnen worden gemengd met knockdown cellen zsgreen en Firefly plaats uitdrukken. In vivo kunnen levende dier beeldvormings apparaten renilla plaats onderscheiden van Firefly plaats, en tomaat van zsgreen, zodat ofwel fluorescentie of luminescentie kan worden gebruikt om elke celpopulatie onafhankelijk te kwantificeren. Inderdaad, Dual plaats beeldvorming van 4t1 cellen groeien als primaire tumoren in levende dieren is aangetoond met behulp van een in vivo levende dieren beeldapparaat4. Echter, het is belangrijk op te merken dat er mogelijk overlap in fluorescerende signaal, dus een spectrale unmixing stap (Zie richtlijnen van de fabrikanten) moet worden opgenomen in deze aanpak. Bovendien moeten de renilla plaats en Firefly plaats afzonderlijk worden afgebeeld met een voldoende tijdvertraging die het mogelijk maakt het eerste plaats-signaal niet langer detecteerbaar te maken vóór de tweede Imaging. Het gebruik van verschillende fluor Foren maakt het nog steeds mogelijk om het aantal en de grootte van metastase in de longen te kwantificeren16. Om gemetastaseerde kolonisatie en groei in andere organen naast de longen te testen, kan dit protocol worden gewijzigd en gebruikt voor intracardiale en portaal ader injecties9,10.

Beperkingen van de methode
Het gebruik van een in vivo levend dier beeldvormings apparaat om real-time gemetastaseerde belasting in combinatie met fluorescently gelabelde kankercellen te verwerven, biedt een krachtige methode om gemetastaseerde kolonisatie en daaropvolgende groei te testen; Er zijn echter beperkingen van deze aanpak. Sommige genen kunnen nodig zijn voor aangeboren celproliferatie in plaats van specifieke rollen in metastasen. In vitro celproliferatie kan worden uitgevoerd voorafgaand aan het in vivo experiment om te bepalen of het gen in vitro groei verstoort. Bij de beeldvorming van een levend dier moet het bioluminescente of fluorescerende signaal van metastasen sterk genoeg zijn om het weefsel te passeren. Bovendien beïnvloeden de optische eigenschappen (d.w.z. absorptie en verstrooiing) van het weefsel ook de detectie55. De excitatie lichtbron moet in staat zijn om door het weefsel te gaan om fluorescerelijk gelabelde kankercellen te prikkelen en bioluminescentie heeft een groter dynamisch bereik dan fluorescentie. Hoewel fluorescentie kan worden gebruikt voor levende dier beeldvorming, heeft bioluminescentie de voorkeur voor het detecteren van signaal in inwendige organen. Bovendien kunnen sommige immunocompetente muis stammen cellen afwijzen die fluorescerende eiwitten uitdrukken. Sterker nog, we ontdekten dat cellen die tomaat, GFP of mcherry uitdrukken, de de in de groei van Balb/c-muizen (gegevens niet weergegeven en15) hebben gereguleerd of verworpen. Echter, zoals hier gedemonstreerd (Figuur 3 en Figuur 5) en eerder15,16, zsgreen-gelabelde cellen zijn detecteerbaar in deze muizen. In gevallen waarin de fluorescerende eiwit expressie niet detecteerbaar wordt, is een andere manier om de relatieve gemetastaseerde kolonisatie te kwantificeren om qPCR te gebruiken om ofwel het fluorescerende gen of een ander gen in de geïntegreerde virale Vector15te kwantificeren. Hoewel een in vivo Live dieren beeldvormings apparaat u toelaat om veranderingen in de gemetastaseerde last te detecteren, staat het niet toe om te bepalen of deze veranderingen te wijten zijn aan veranderde grootte of aantal metastasen. Het biedt ook geen ruimtelijke informatie over de locatie van de metastasen. Bovendien kan de sterkte van het signaal worden beïnvloed door hoe diep in het weefsel het is.

De betekenis van de methode en mogelijke toekomstige toepassingen
Er zijn vele manieren waarop deze aanpak kan worden aangepast om meer of andere informatie te krijgen. In deze test kan een verscheidenheid aan cellijnen van kanker worden gebruikt, waaronder humane kankercellijnen of patiënten afgeleide xenotransplantaten. Andere Muismodellen kunnen ook worden gebruikt, met inbegrip van transgene of knock-out muizen die zijn ontworpen om te testen hoe targeting eiwitten gemaakt door stromale cellen de gemetastaseerde kolonisatie en groei van de geïnjecteerde kankercellen beïnvloedt. Als er meerdere kandidaatgenen moeten worden getest, kan deze aanpak Multiplexed zijn, omdat in vivo levende dierlijke beeldvormings apparaten een breed scala aan fluor Foren kunnen detecteren en onderscheiden. Dit zou het aantal vereiste muizen verminderen en het aantal te testen doelwitten verhogen. In vivo kunnen beelden van levende dieren ook worden gecombineerd met Röntgen-of CT9 -beeldvorming om veel meer ruimtelijke informatie te verschaffen over de locatie van de metastasen. Ten slotte kan deze aanpak worden aangepast om specifiekere stappen binnen de metastatische kolonisatie Cascade te testen. Bijvoorbeeld, de stappen die betrokken zijn bij tumor Cell zaaien (intravasculaire overleving, extravasatie, en post extravasatie overleving) kunnen worden onderscheiden door het aantal tumorcellen in de longen op verschillende tijdstippen binnen de eerste 3 dagen na de injectie te kwantificeren (zoals hier gedaan16). In dit geval kan de longen ook worden gekleurd met vasculaire markers en afbeelding gemaakt ex vivo om te bepalen van het percentage van kankercellen die op elk tijdstip punt56,57hebben extravasated.

Samengevat, het gebruik van real-time in vivo levende dierlijke beeldvorming van fluorescerende en luminescente kankercellen na de staart ader injectie maakt een meer gedetailleerde analyse mogelijk van hoe een kandidaatgen of genen de metastatische kolonisatie en daaropvolgende groei beïnvloedt. Deze aanpak is sneller en minder duur dan autochtone Muismodellen en vermijdt enkele van de kanttekeningen van spontane metastase modellen. Het gebruik van zowel fluorescentie als luminescentie als middel om metastasen op te sporen en te kwantificeren geeft onderzoekers onafhankelijke uitlezingen die het vertrouwen in de resultaten vergroten en flexibiliteit in het experimentele ontwerp mogelijk maken. Het gebruik van fluorescentie om metastase grootte en aantal te kwantificeren vermijdt de noodzaak van tijdrovende en potentieel dure histologische verwerking en analyse, en maakt het mogelijk om het hele weefsel extra te gebruiken. Het protocol kan worden gebruikt met een aantal verschillende technieken om de uitdrukking of functie van het kandidaatgen te manipuleren, zoals RNAi, transgenexpressie of CRISPR/CAS-gemedieerde bewerking, en kan ook worden gebruikt om kleine moleculen, functie blokkerende antilichamen of andere potentiële therapeutische verbindingen te testen. Zoals hierboven vermeld, kunnen verschillende eenvoudige wijzigingen worden aangebracht om de assay te verbeteren en aanvullende informatie te verstrekken. Deze aanpak is een ideale manier om te identificeren en testen van Pro-metastatische genen die therapeutisch potentieel voor de behandeling van kanker hebben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We danken Emily Norton voor het bijstaan van virale infecties en het kritisch lezen van het manuscript. We bedanken Ryan Kanai ook voor hulp bij het verwerven van beelden van de longen en Kate E. Tubbesing voor hulp bij beeldanalyse van de groene metastasen in de longen. We danken het personeel van de dierenonderzoekfaciliteit voor hun ondersteuning en voor hulp bij de voorbereiding van deze video. Dit werk werd gesteund door een Susan G. komen Career Catalyst subsidie die werd toegekend aan J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. , Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
  2. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  4. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  5. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  6. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  7. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  9. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  10. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  11. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  12. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  13. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  14. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  16. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
  17. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
  18. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  19. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
  20. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  21. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  22. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  23. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
  24. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
  25. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119 (2015).
  26. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  27. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529 (2011).
  28. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
  29. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  30. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
  31. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
  32. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
  33. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
  34. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647 (2016).
  35. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
  36. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
  37. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
  38. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
  39. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
  40. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
  41. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
  42. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
  43. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
  44. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
  45. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
  46. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
  47. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
  48. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
  49. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310 (2017).
  50. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
  51. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
  52. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
  53. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  54. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
  55. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  56. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
  57. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).

Tags

Kankeronderzoek uitgave 154 4T1 cellen syngene muismodel metastasering gemetastaseerde kolonisatie borstkanker muis beeldvorming van levende dieren staart ader metastasen YAP TAZ
Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, J. S. A., Feustel, P. J.,… More

Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter