Summary
Wnt-1 Cre+/-の周産脂肪組織から誘導された脂肪由来幹細胞 (NCAC) の神経堤の分離、培養、脂肪誘導のプロトコルを提示します。ローザ26RFP/+マウス。NCAdscは、インビトロで脂肪形成または脂肪形成をモデル化するためのACの簡単にアクセス可能なソースであることができます。
Abstract
血管を取り巻く脂肪組織の過剰な量(PVATとも呼ばれる血管周囲脂肪組織)は、心血管疾患のリスクが高いと関連している。異なる脂肪組織に由来するAVCは明確な特徴を示し、PVATからのAPCは十分に特徴付けされていなかった。最近の研究では、周皮弓脂肪組織(PAAT)の一部のADCが、外虫に由来する一過性の移動細胞である神経堤細胞(NCCs)から下降することを報告した。
本稿では、Wnt-1 Cre+/-のPAATから赤蛍光タンパク質(RFP)標識NCCを分離するためのプロトコルについて説明する。Rosa26RFP/+マウスと体外でのそれらの二分化を誘導します。簡単に言うと、間質血管画分(SVF)はPAATから酵素的に解離され、RFP+神経堤由来AVC(NCADSC)は蛍光活性化細胞選別(FACS)によって単離される。NCADSCは、茶色と白の両方のアディポサイトに分化し、凍結保存することができ、〜3〜5節の間、その有数可能性を保持することができます。当社のプロトコルは、PVATの脂肪形成またはインビトロでの脂肪生成のモデル化のためにPVATから豊富なAdscを生成することができる。したがって、これらのNCADSCはPVAT分化に関与する分子スイッチを研究するための貴重なシステムを提供することができる。
Introduction
肥満の罹患率は世界的に増加しており、これは心血管疾患および糖尿病を含む関連慢性疾患のリスクを増大させる1.PVATは血管を取り囲み、血管系機能に関与する内分泌およびパラクリン因子の主要な供給源である。臨床研究は、高いPVAT含有量が心血管疾患2、3の独立した危険因子であり、その病理学的機能が構成脂肪由来幹細胞(AC)の表現型に依存することを示す4。
マウス3T3-L1、3T3-F442A、OP9などのADSC細胞株は、脂肪形成または脂肪形成5を研究するのに有用な細胞モデルであるが、脂肪形成のための調節機構は細胞株と一次細胞間で異なる。間質血管細胞画分(SVF)中のAVCは脂肪組織から直接分離し、生体内脂肪形成および脂肪形成6で再キャピテーションする可能性が最も高い脂肪細胞に分化するように誘導される。しかし、APCの脆弱性、浮力、およびサイズと免疫フェノタイプのバリエーションは、その直接的な分離を困難にします。さらに、異なる分離手順は、これらの細胞7の表現型および食前性電位能力にも大きな影響を及ぼし、したがってADSC完全性を維持するプロトコルの必要性を強調する。
脂肪組織は典型的には、形態学的および機能的に別個の白色脂肪組織(WAT)、または褐色脂肪組織(BAT)8のいずれかに分類され、これらは異なるACC9を収容する。皮下過性およびインギナル皮下WATから単離されたAVCは、以前の研究9、10、11、12で特徴付けられてきたが、BAT13を主成分とするPVATからのAVCに関してはあまり知られていない。
最近の研究では、周皮弓脂肪組織(PAAT)に存在するADCの一部が神経堤細胞(NCCs)に由来することを発見した。Wnt1-Creトランスジェニックマウスは、神経堤細胞発生16、17をトレースするために使用した。私たちは、Wnt-1 Cre+/-を生成する Rosa26RFP/+マウスと Wnt1-Cre+マウスを交配しました。Rosa26RFP/+マウスは、NCCとその子孫が赤色蛍光タンパク質(RFP)で標識され、生体内およびインビトロ15で容易に追跡される。ここでは、マウスPAATから神経堤由来AVC(NC由来AVC、またはNCAC)を分離し、白色のアディポサイトまたは褐色のアディポサイトに分化するようにNCAdsCを誘導する方法について説明する。
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Protocol
動物のプロトコルは、上海交通大学の動物ケア委員会によって審査され、承認されています.
1. Wnt-1 Cre+/-の生成;ローザ26RFP/+マウス
- クロスWnt-1 Cre+/-マウス16 Rosa26RFP/+マウス18を用いて Wnt-1 Cre+/-を生成する ;ローザ26RFP/+マウス。生後4~8週間まで、病原体のない施設で12時間の明暗サイクルでマウスを45°C、湿度45%で飼います。
2. PAATの解剖
メモ:図 1を参照してください。
- 121°Cで30分間オートクレーブすることにより、すべての外科用ツール(例えば、外科用ハサミ、標準鉗子、およびマイクロサージと鉗子)を殺菌します。
- 消化培地(高グルコースダルベッコの修飾イーグル培地[HDMEM]2 mg/mLコラゲネーゼI型を含む)を準備します。培養培地(10%ウシ胎児血清[FBS]および1%v/vペニシリン-ストレプトマイシン[PS]を含むHDMEM)を調製する。使用前に0.22μmのシリンジフィルターを使用して滅菌します。
- 適宜、UV、エタノール、ろ過、または蒸気を用いて細胞培養試薬を滅菌する。
- ハンクスのバランスのとれた生理食分溶液(HBSS)と15 mLの円錐形チューブと10 mLのHBSSをPS溶液の1%v/vで補ってペトリ皿を準備します。両方を氷の上に置いておきなさい。
- マウス15をイソファフルランで麻酔し、頸部脱臼による犠牲をする。体を75%アルコール(200mL)で満たされたビーカーに5分間浸し、皮膚表面を殺菌します。
- 腹部の皮膚を切り取り、分離し、腹部の正中線に沿って骨盤から首に切り取ります。腹部を開き、肝臓を動かして横隔膜19を露出させる。
- 正中線の両側の横の横隔膜と肋骨を切り、肋骨を剥がして心臓と肺を露出させる。
- 肺と胸腺を取り除き、大オルタと心臓と一緒にPAATを抽出します。
- 大動脈根の大動脈を切り落とし、心臓を取り除く。大動脈弓と下降大動脈の間にカットを行い、慎重に後胸壁から左右の一般的な頸動脈と両方の構造を囲む脂肪組織を分離します。ペトリ皿の氷冷HBSSバッファーに組織を移します。
- 滅菌鉗子を使用して、血管系(例えば、大動脈、一般的な頸動脈、および他の小さな血管系)および筋膜のできるだけ多くを除去し、脂肪組織を2 mLのエプペンドルフ管に移し、氷上に0.5 mLの氷冷HBSバッファーを含む。
3. SVF の分離
5-6マウスのPAATを1 mLの作り出したばかりの消化媒体を含む1つの2 mLマイクロ遠心チューブに集め、室温(RT)のエペンドルフ管の外科用はさみを使用して組織をミンチします。
- この混合物を、9 mLの消化媒体を含む50 mLチューブに移す。1 mLピペット10倍で上下にピペットをピペット化して組織を均質化します。
- 37 °Cでチューブをインキュベートし、100 rpmで30~45分ずつ常時揺れ、5~10分ごとにチェックして過剰消化を防ぎます。これは、細胞の生存率と収量を改善するために重要です。
注:良好な組織消化は、穏やかに渦巻くチューブに肉眼で見える均質な、淡黄色の脂肪組織になります。 - RTで10%FBSと1%v/v PSを含むHDMEMの5 mLを加えることによって消化を停止し、ピペッティングでよく混ぜます。
- RTで5分間500 x gで細胞懸濁液を遠心分離する。SVFは茶色がかったペレットとして見えます。浮遊性の深細胞を注意深く吸引し、SVFを妨げることなく残りの上清をデカントする。SVFペレットを10mLの培地に溶解し、70μmの細胞ストレーナーを通して濾過します。
- 500 x gで細胞懸濁液を5分間遠心分離し、上清を除去し、RTで10分間15mLの円錐形チューブ中の赤血球リシス緩衝液の5mL中にペレットを穏やかに再懸濁させる。
- 1%FBSを含む1x PBSの10 mLを加えて反応を停止する。4°Cで5分間500xgで細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、ペレットを1%FBSを含有する1x PBSの10mLに再懸濁した。
- 4°Cで5分間500xgで再び細胞を遠心分離する。上清を取り出し、4°Cで15mL円錐管内の5mLの培養培地中にペレットを再懸濁させる。
- 最後の遠心分離(4°Cで5分間500×g)を行った後、ペレット状の細胞を5mLのFACSバッファー(10%FBS、100単位/mL DNA I、1%v/v PSを含むPBS)で氷上に再懸濁し、細胞をヘモサイトメーターで数えます。
4. FACSによるNCAdsCの分離
- 取扱説明書に従ってセルソーターをセットアップし、最適化します。100 μm のノズルを選択し、収集管を滅菌し、必要な収集装置を取り付け、サイド・ストリーム20をセットアップします。
- 561 nm の黄色/緑色レーザーおよび光学フィルター 579/16 は RFP+細胞の選別に推奨されます。負のコントロールと単一染色された正のコントロールを使用して補正を実行します。Gating スキームについては、図 2Aを参照してください。
- 40 μm のストレーナーを通して細胞をフィルター処理し、5 分間 500 x gで遠心分離し、0.5–1 x 107/mL の密度で FACS バッファーの 2 mL でセルを再懸濁します。細胞を5 mL丸底ポリスチレンチューブに明確に標識し、ソーターに負荷します。
- 実験用サンプルチューブを4°Cで実行し、たわみプレートをオンにし、1%FBSと1%v/v PSを含むRPMIを事前にコーティングした15mL円錐形チューブに並べ替えます。
注:RFPの消光を最小限に抑えるために、強い光からサンプルを保護します。
5. NCADSCの文化
- 完全培養培地の12ウェル培養プレートに5,000セル/cm2の密度で選別した細胞をプレートし、湿度の高い雰囲気の中で37°Cで20〜24時間の5%のCO2をインキュベートします。
- 培地を取り出し、プレウォート(37°C)PBSで細胞を洗浄し、細胞の残骸を除去し、新鮮な培地を加える。
- 細胞が80〜90%コンフルエントになったら、3〜5分間インキュベーターで37°Cで0.25%トリプシンEDTA溶液を使用して単層を消化し、2 mLの培地で中和します。
- RTで250xgで収穫した細胞を15分間遠心分離し、上清を除去し、培養培地の1mLで細胞を再懸濁させる。細胞をヘモサイトメーターで数えます。
- 5,000個の細胞/cm2の密度で12ウェル培養プレートに細胞を播種する。
- 残りの細胞を10%DMSOを含有する培地に再懸濁し、凍結し、液体窒素に貯蔵した。
6. NCADSCの有価細胞誘導
- 80~90%の合流率および標準的な培養条件でNCACの分化を誘導する21.
- 褐色の生理活性誘導の場合、最初に褐色の生理導入誘導培地(HDMEM、10%FBS、1%v/v PS、0.5 mM/L IBMX、0.1μM/Lデキサメタゾン、1 μM/Lロシグリタゾン、10 nmol/Lトリヨードチロニン、および1 μg/mLインスリンインスリン)を用いて培養した細胞を治療する。細胞をPBS 2xで洗浄し、新鮮な培地(HDMEM、10%FBS、1%v/v PS、1 μM/Lロシグリタゾン、10 nmol/Lトリヨールチロニン、および1 μg/mLインスリン)で置き換えます。合計 3 ~ 5 倍の 2 日ごとにこのメディアを変更します。
- 白色のアディポゲン誘導の場合、まず、白色の二生物誘導培地(HDMEM、10%FBS、1%v/v PS、0.5 mM/L IBMX、0.1 μM/Lデキサメタゾン、および1 μg/mLインスリン)を2日間治療します。細胞をPBS 2xで洗浄し、新鮮な培地(HDMEM、10%FBS、1%v/v PS、および1 μg/mLインスリン)で交換します。このメディアは、合計 3 ~ 5 倍に対して 2 日ごとに変更します。
- 必要に応じて、アディポゲン細胞を分析します。
注:PBSで細胞を洗浄するときは、優しくしてください。分化したアディポサイトは簡単に洗い流すことができます。
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Representative Results
上記のプロトコルを使用して、5–6 Wnt-1 Cre+/-から~0.5~1.0 x 106 Adscを取得しました。Rosa26RFP/+マウス (48 週齢, 男性または女性).
マウスからのPAATの収集のフローチャートを図1に示します。NCAdsCsの形態は、他のマウス脂肪組織からのADSCに類似していた。培養されたNcAdscは、7-8日の培養後に80~90%の合流率に達し、NCAdsCは線維芽細胞様の形態を拡張しました(図2B,C)。
さらに、NCAdsCがアディポゲンポテンシャルを有することを確認するために、白色または褐色のアディポ細胞へのNCAdsCの分化が誘導された。油赤染色は、成熟したアディポサイトを検出するために使用した(図2)。NCADSCは、誘導後の白色および褐色の両方のアディポサイトに対して強い色素性を示した。成熟したジポサイトは、白または茶色のアディポジェニック誘導の8日後に観察され、NCAdsCの60%以上が占い分化を示した(図2D、F、H)。アディポゲン誘導時間の延長により、成熟したアディポサイトの収穫速度が改善された(データは示されていない)。NCAdsCは、合格後のアディポゲン性を大幅に低下させた(図2E、G、H)。
免疫ブロッティングおよび定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)(使用されるプライマーの補足ファイル1を参照)は、脂肪細胞特異的相対タンパク質および脂肪細胞特異的相対タンパク質(ペリリピン、PPARγ、Cebp/α)の発現レベルが、白色脂肪形成誘導の8日後に有意に増加したことを証明した(qRT-PCRの結果は、脂肪細胞特異的遺伝子(ペリリピン、PPARγ、セbp/α)および褐色脂肪細胞特異的遺伝子(Pgc1α、UCP-1、PPARα、PRDM16)の誘導が8日間で有意に増加したことを示した(図3B,C,D)。
図1:マウスからのPAATの収集のフローチャート。(A) Wnt-1 Creを麻酔して犠牲にする+/-;Rosa26RFP/+マウスと心臓と肺を露出するマウスの縦方向の解剖を行います;(B) 肺と胸腺を取り除く;(C) PAAT、大オータアーチ、および心臓を公開する。(D)PVAT、大オータ、心臓をプレクールHBSSバッファに取り除く。(E) PAAT を収穫し、プレクール HBSS バッファーに転送します。H = ハート;AA = 大アクタアーチ;T = 胸腺;L = 肺。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PAATから単離されたNCADSCの有分分離(A) NCADSC (RFP) 集団を特徴付け、ソートするための一般的なgatingスキーム。(B) 蛍光顕微鏡画像は、NCAdscsが12ウェル培養プレート上で96時間播種した後に付着し、拡大したことを示す。(C–G)油赤Oが食化誘導後にPAATからNCAdsCを染色したことを示す代表的な画像。(C) コントロール(誘導なし)。(D) 白色の食後誘導の 10 日後にプライマリ NCAdsC および (E) 3x の継代型 NcAdsc.(F) 褐色の二元素誘導の10日後にプライマリNcAdscおよび(G)3x通過型NADSC。(H) 8日間のアディポゲン誘導後のPAATからの一次および3倍の継代NCAdsCの油赤染色領域の統計結果。n = 6。値は、平均値±標準偏差(SD)で表されます。スケールバー = 50 μm.この図の大きいバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図3:NCAdsCの白色および褐色の有数誘導の特徴付け(A) 白色脂肪分化したCADSCにおける脂肪細胞特異的タンパク質(ペリリピン、PPARγ、セbp/α)の発現レベルを示す免疫ブロット。(B) 脂肪細胞特異的遺伝子の誘導を示すqRT-PCRの結果は、Cebp/α、PPARγ、ペリリピン、Fabp4の白色および褐色脂肪分化NCAdsCの中に含まれる。(C) 褐色のアディポサイト特異的遺伝子の誘導を示すqRT-PCRの結果、白色および褐色の色分化されたNCAdsCにおけるPgc1α、UCP-1、PPARα、PRDM16。発現レベルはHPRTに対して正規化され、Ct(δδCt)法で測定された。n=3独立実験の代表的な結果。値は、2つのグループ間の比較に対比されていない2尾の学生t検定を使用した平均±SDで表されます。*P < 0.05.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、Wnt-1 Cre+/-のPVATから抽出されたNCACの分離、培養、および食化誘導のための信頼できる方法を提示する。RFP+ ADCを製造するように設計されたRosa26RFP/+トランスジェニックマウス。これまでの報告では、NCACおよび非NCAdsC2における一般的な多能性間葉系幹細胞(CS)マーカーの発現に有意差はなく、NCAdsCはビトロ15,22,23の中でジポサイトに分化する可能性が強いことを示している。したがって、このプロトコルで分離されたNCAdscsは、ほとんどのADSC研究に適しているべきである。
本方法の利点は、トランスジェニックNCAdscsに固有の蛍光レポーターが、抗体またはプローブベースのFACS、または磁気活性化細胞選別24を必要とせずに単離プロセスをシンプルかつ経済的に行なう点である。また、RFPの蛍光強度はFITCよりも強く、FACSの効率がさらに向上します。
このプロトコルの鍵は、若いマウスの利用です。古くて大きなマウスはより多くの脂肪組織を生じることができるが、NCCは主にPAAT15の初期の発達に寄与するため、PAATにおけるNC由来脂肪細胞の割合は年齢とともに減少する。したがって、これらの細胞の有分化ポテンシャルは、年齢とともに低下する。我々の実験に基づいて、マウスにおけるNCADSC分離のための最適な時間枠は4-8週間である。
我々の方法は、簡素で実用的であり、インビトロでPVAT脂肪形成または脂肪形成の研究のために豊富なACを生成し、肥満および心血管疾患に対する新薬をテストすることができる。さらに、Wnt-1 Cre+/-の NCCC ;Rosa26RFP/+マウスは、他の研究分野に有効なインビトロシステムにもなります。しかし、いくつかの注意点が残っています:まず、これらの細胞は不死化したアディポサイトラインよりも敏感で壊れやすいです。第二に、彼らの高い増殖率と有分化分化は、最大5節の後に彼らの有性可能性を失う傾向があるという事実によって打ち消される。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
中国国家主要研究開発プログラム(2018YFC1312504)、中国自然科学財団(81970378、81670360、81870293)、上海市科学技術委員会(174119710000、17140902402)が提供した。.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
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