Summary
Vi presenterer en protokoll for isolasjon, kultur og adipogen induksjon av neural crest avledet fettavledede stamceller (NCADSCs) fra periaortisk fettvev av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus. NCADSCs kan være en lett tilgjengelig kilde til ADSCs for modellering av adipogenese eller lipogenesis in vitro.
Abstract
En overdreven mengde fettvev rundt blodårene (perivaskulærfettvev, også kjent som PVAT) er forbundet med høy risiko for kardiovaskulær sykdom. ADSCer avledet fra forskjellige fettvev viser forskjellige funksjoner, og de fra PVAT har ikke vært godt karakterisert. I en nylig studie rapporterte vi at noen ADSCer i periaortisk buefettvev (PAAT) stammer fra nevrale crestceller (NCCer), en forbigående populasjon av trekkceller som stammer fra ektodermen.
I dette papiret beskriver vi en protokoll for å isolere rødt fluorescerende protein (RFP)-merkede NCCer fra PAAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus og indusere deres adipogenic differensiering in vitro. Kort sagt, stromal vaskulær fraksjon (SVF) er enzymatically dissosiert fra PAAT, og RFP+ neural crest avledede ADSCs (NCADSCs) er isolert av fluorescens aktivert celle sortering (FACS). NCADSCs differensiere til både brune og hvite adipocytter, kan kryokonservert, og beholde sitt adipogene potensial for ~ 3-5 passasjer. Vår protokoll kan generere rikelig ADSCer fra PVAT for modellering PVAT adipogenesis eller lipogenesis in vitro. Dermed kan disse NCADSCs gi et verdifullt system for å studere molekylære brytere som er involvert i PVAT-differensiering.
Introduction
Forekomsten av fedme øker over hele verden, noe som øker risikoen for relaterte kroniske sykdommer, inkludert kardiovaskulær sykdom og diabetes1. PVAT omgir blodkar og er en viktig kilde til endokrine og paracrine faktorer involvert i vaskulaturfunksjon. Kliniske studier viser at høyt PVAT-innhold er en uavhengig risikofaktor for kardiovaskulær sykdom2,3, og dens patologiske funksjon avhenger av fenotypen til bestanddelene avstolper avledede stamceller (ADSCer)4.
Selv om ADSC cellelinjer som murine 3T3-L1, 3T3-F442A og OP9 er nyttige cellulære modeller for å studere adipogenese eller lipogenesis5, er regulatoriske mekanismer for adipogenese forskjellig mellom cellelinjer og primære celler. ADSCs i stromal vaskulær celle fraksjon (SVF) isolert direkte fra fettvev og indusert til å skille seg inn i adipocytes mest sannsynlig rekapitulere in vivo adipogenesis og lipogenesis6. Men skjørhet, oppdrift og variasjonene i størrelse og immunfenotyper av ADSCs gjør deres direkte isolasjon utfordrende. I tillegg kan de ulike isolasjonsprosedyrene også påvirke fenotypen og adipogen potensiale til disse cellene7betydelig, og dermed understreke behovet for en protokoll som opprettholder ADSC-integritet.
Fettvev er vanligvis klassifisert som enten morfologisk og funksjonelt distinkt hvitt fettvev (WAT), eller det brune fettvevet (BAT)8, som har forskjellige ADSCs9. Mens ADSCs isolert fra perigonadal og inguinal subkutane WATs har vært preget i tidligere studier9,10,11,12, mindre er kjent om ADSCs fra PVAT som hovedsakelig består av BAT13.
I en nylig studie fant vi at en del av de bosatte ADSCene i periaortisk buefettvev (PAAT) er avledet fra nevrale crestceller (NCCer), en forbigående populasjon av trekkstamceller som stammer fra ektoderm14,15. Wnt1-Cre transgene mus ble brukt til sporing neural crest celle utvikling16,17. Vi krysset Wnt1-Cre+ mus med Rosa26RFP / + mus for å generere Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus, der NCCer og deres etterkommere er merket med rødt fluorescerende protein (RFP) og spores lett in vivo og in vitro15. Her beskriver vi en metode for å isolere nevrale crest avledede ADSCer (NC-avledede ADSCer eller NCADSCs) fra muse-PAAT og indusere NCADSCs til å skille seg inn i hvite adipocytter eller brune adipocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokollen er gjennomgått og godkjent av Dyreomsorgskomiteen ved Shanghai Jiao Tong University.
1. Generasjon av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mus
- Kryss Wnt-1 Cre+/- mus16 med Rosa26RFP/+ mus18 for å generere Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus. Husmus under en 12 t lys /mørk syklus i et patogenfritt anlegg ved 25 °C og 45 % fuktighet til de er 4–8 uker gamle.
2. Disseksjon av PAAT
MERK: Se figur 1.
- Steriliser alle kirurgiske verktøy (f.eks. kirurgisk saks, standard tang og mikrokirurgisk saks og tang) ved autoklaving ved 121 °C i 30 min.
- Forbered fordøyelsesmediet (High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium [HDMEM] som inneholder 2 mg / ml kollagenase type I). Forbered kulturmediet (HDMEM som inneholder 10 % føtal storfeserum [FBS] og 1 % v/v penicillin-streptomycin [PS]). Steriliser ved hjelp av et sprøytefilter på 0,22 μm før bruk.
- Steriliser cellekulturreagengensene ved hjelp av UV, etanol, filtrering eller damp, etter behov.
- Forbered en Petri-skål med Hanks' balanserte saltvannsløsning (HBSS) og et 15 ml konisk rør med 10 ml HBSS supplert med 1 % v/v ps-løsning. Hold begge på is.
- Bedøve musene15 med isofluran og offer ved cervical dislokasjon. Fordyp kroppene i et beger fylt med 75% alkohol (200 ml) i 5 min for å sterilisere hudoverflaten.
- Klipp og skill huden på magen og kutt langs ventralmidtlinjen fra bekkenet til nakken. Åpne magen og beveg leveren for å eksponere membranen19.
- Skjær membranen og ribbeina på begge sider av midtlinjen og utsett hjertet og lungene ved å peeling tilbake ribbeina.
- Fjern lunge og tymus og trekk ut PAAT sammen med aorta og hjerte.
- Klipp av aorta ved aortaroten for å fjerne hjertet. Lag et kutt mellom aortabuen og synkende aorta og forsiktig skille fettvev rundt begge strukturer og venstre og høyre vanlige carotis arterier fra bakre brystveggen. Overfør vevet til den iskalde HBSS-bufferen i Petri-fatet.
- Bruk sterile tang, fjern så mye av vaskulaturen (f.eks. aorta, vanlige halspulsårer og andre små vaskulatur) og fascia som mulig, og overfør fettvevet til de 2 ml Eppendorf-rørene inneholder 0,5 ml iskalde HBSS-buffer på is.
3. Isolering av SVF
Samle PAAT av 5-6 mus i en 2 ml microcentrifuge rør som inneholder 1 ml nyforberedt fordøyelsemedium og kjøttdeig vevet ved hjelp av kirurgisk saks i et Eppendorf rør ved romtemperatur (RT).
- Overfør blandingen til 50 ml rør som inneholder 9 ml fordøyelsesmediet. Homogeniser vevet ved å pipettere opp og ned med en 1 ml pipette 10x.
- Inkuber rørene ved 37 °C med konstant risting ved 100 o/min i 30–45 min og kontroller hver 5–10 min for å forhindre overfordøyelse. Dette er avgjørende for å forbedre cellelevedyktighet og utbytte.
MERK: God vevsfordøyelse vil resultere i et homogent, lys gult fettvev som er synlig for det blotte øye ved forsiktig virvlende røret. - Stopp fordøyelsen ved å legge til 5 ml HDMEM som inneholder 10% FBS og 1% v / v PS ved RT og bland godt ved pipettering.
- Sentrifuge cellesuspensjonen ved 500 x g i 5 min ved RT. SVF vil være synlig som en brunaktig pellet. Forsiktig aspirer de flytende adipocytter og dekanterde de gjenværende supernatant uten å forstyrre SVF. Løs opp SVF-pelleten i 10 ml kulturmedium og filtrer gjennom en 70 μm cellesil.
- Sentrifuge cellesuspensjonen ved 500 x g i 5 min, fjern supernatanten, og resuspender pellet forsiktig i 5 ml erytrocyttlysisbuffer i et 15 ml konisk rør i 10 min ved RT.
- Stopp reaksjonen ved å legge til 10 ml 1x PBS som inneholder 1% FBS. Sentrifuge cellesuspensjonen ved 500 x g i 5 min ved 4 °C, fjern supernatanten og resuspendere pelleten i 10 ml 1x PBS som inneholder 1 % FBS.
- Sentrifuge cellene igjen ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml kulturmedium i et 15 ml konisk rør ved 4 °C.
- Etter en siste runde med sentrifugering (500 x g i 5 min ved 4 °C), resuspendere pelleted cellene i 5 ml FACS buffer (PBS som inneholder 10% FBS, 100 enheter / ml DNA I, og 1% v / v PS) på is, og telle cellene med et hemocytometer.
4. Isolering av NCADSCs av FACS
- Konfigurer og optimaliser cellesorteringen ved å følge bruksanvisningen. Velg 100 μm dyse, steriliser oppsamlingsrørene, installer den nødvendige innsamlingsenheten og sett opp sidestrømmene20.
- En 561 nm gul/grønn laser og optisk filter 579/16 anbefales for sortering av RFP+ celler. Utfør kompensasjonen ved hjelp av den negative kontrollen og de enkeltfargede positive kontrollene. Se figur 2A for gatingordningen.
- Filtrer cellene gjennom en 40 μm sil, sentrifuge ved 500 x g i 5 min, og resuspender cellene i 2 ml FACS-buffer med en tetthet på 0,5–1 x 107/ml. Overfør cellene til tydelig merket 5 ml runde nedre polystyrenrør, og last inn i sorteringen.
- Kjør det eksperimentelle prøverøret ved 4 °C, slå på avbøyningsplatene og sorter i et 15 ml konisk rør forhåndsbelagt med RPMI som inneholder 1 % FBS og 1 % v/v PS.
MERK: Beskytt prøvene mot sterkt lys for å minimere RFP-slukking.
5. Kultur av NCADSCs
- Plate de sorterte cellene med en tetthet på 5000 celler / cm2 i en 12 brønnkulturplate i komplett kulturmedium og inkuber ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO2 for 20-24 timer.
- Fjern kulturmediet, vask cellene med prewarmed (37 °C) PBS for å fjerne celleavfall og legge til fersk kulturmedium.
- Når cellene er 80–90% konfluent, fordøye monolayer ved hjelp av en 0,25% trypsin EDTA løsning ved 37 ° C i en inkubator i 3-5 min, og nøytralisere med 2 ml kulturmedium.
- Sentrifuge de høstede cellene i 15 min ved 250 x g ved RT, fjern supernatanten, og resuspender cellene i 1 ml kulturmedium. Tell cellene med et hemocytometer.
- Frø cellene i en 12 brønnkulturplate ved tettheten av 5000 celler/ cm2.
- Resuspender de resterende cellene i kulturmedium som inneholder 10% DMSO, fryse, og lagre i flytende nitrogen.
6. Adipogen ic Induksjon av NCADSCs
- Indusere adipogen differensiering av NCADSCs ved 80–90% samflyt og standard kulturforhold21.
- For brun adipogen induksjon behandler du først de kultiverte cellene med brunt adipogeninduksjonsmedium (HDMEM, 10 % FBS, 1 % v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 μM/L-deksametason, 1 μM/l rosiglitazon, 10 nmol/L triiodothyronine og 1 μg/ml insulin) i 2 dager. Vask cellene med PBS 2x og erstatt med friskt medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 μM/L rosiglitazon, 10 nmol/L triiodothyronine og 1 μg/ml insulin). Endre dette mediet annenhver dag i totalt 3–5 x.
- For hvit adipogen induksjon må du først behandle cellene med hvitt adipogeninduksjonsmedium (HDMEM, 10 % FBS, 1 % v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 μM/L deksametason og 1 μg/ml insulin) i 2 dager. Vask cellene med PBS 2x og erstatt med friskt medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v /v PS og 1 μg/ml insulin). Endre dette mediet annenhver dag for totalt 3-5x.
- Analyser adipogencellene etter behov.
MERK: Vær forsiktig når du vasker cellene med PBS. Differensierte adipocytter kan enkelt vaske bort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, fikk vi ~0,5–1,0 x 106 ANNONSEANNONSER fra 5–6 Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus (48 uker gammel, mann eller kvinne).
Flytskjemaet for samling av PAAT fra mus presenteres i figur 1. Morfologien til NCADSCs var lik ADSC fra andre mus fett vev. De kultiverte NCADSCs nådde 80–90% samflyt etter 7-8 dager med kultur, og NCADSCs hadde en utvidet fibroblast-lignende morfologi (Figur 2B, C).
For ytterligere å bekrefte at NCADSCs hadde adipogenpotensial, ble differensiering av NCADSCene til hvite eller brune adipocytter indusert. Oljerød farging ble brukt til å oppdage de modne adipocytter (Figur 2). NCADSCs viste sterkt adipogenic potensial for både hvite og brune adipocytter etter induksjon. Modne adipocytter ble observert etter 8 dager med hvit eller brun adipogen induksjon, med over 60% av NCADSCs som viser adipogen differensiering(Figur 2D, F,H). Forlenge adipogen induksjonstid forbedret høstingshastigheten av modne adipocytter (data ikke vist). NCADSCs hadde sterkt redusert adipogenpotensial etter passering (Figur 2E, G, H).
Immunblotting og kvantitativ eliminasjon i sanntid PCR (qRT-PCR) (se Tilleggsfil 1 for primere som brukes) viste at uttrykksnivåene av adipocyte-spesifikke relative proteiner og gener (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) i adipogenically differensierte NCADSCs betydelig økt etter 8 dager med hvit adipogenininduksjon (Figur 3A,B). QRT-PCR resultatene viste at induksjon av adipocyte-spesifikke gener (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) og brun adipocyte-spesifikke gener (Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16) betydelig økt i 8 dager med brun adipogenic induksjon av NCADSCs (Figur 3B, C, D).
Figur 1: Flytskjema for samling av PAAT fra mus. (A) Bedøvelse og ofre Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus og utføre langsgående disseksjon av musen for å avsløre hjerte og lunger; (B) Fjern lungene og thymus; (C) Utsett PAAT, aorta bue og hjerte; (D) Fjern PVAT, aorta og hjerte i forhåndskjølt HBSS Buffer; (E) Harvest PAAT og overføre til forhåndskjølt HBSS buffer. H = Hjerte; AA = Aorta bue; T = Thymus; L = Lunge. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Adipogen ic differensiering av NCADSCs isolert fra PAAT. (A) Generell gating ordningen for karakterisering og sortering ncadscs (RFP) populasjoner. (B) Fluorescens mikroskopbilder viser at NCADSCs holdt seg og utvidet etter 96 timer seeding på en 12 brønnkulturplate. -Jeg har ikke noe å si. Representative bilder som viser at oljerøde O-farget NCADSCer fra PAAT etter adipogen induksjon. (C) Kontroll (ingen induksjon). (D) Primære NCADSCs og (E) 3x-passaged NCADSCs etter 10 dager med hvit adipogen induksjon. (F) Primære NCADSCs og (G) 3x-passaged NCADSCs etter 10 dager med brun adipogen induksjon. (H)Statistiske resultater av oljerøde flekker området av primære og 3x passasje NCADSCs fra PAAT etter 8 dager med adipogen induksjon. n = 6. Verdier uttrykkes som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD). Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av den hvite og brune adipogeniske induksjonen av NCADSCs. (A) Immunoblot viser uttrykksnivåer av adipocyte-spesifikke proteiner (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) i de hvite adipogene differensierte NCADSCene. (B) qRT-PCR resultater som viser induksjon av adipocyte-spesifikke gener, Cebp / α, PPARγ, Perilipin, Fabp4 i den hvite og brune adipogenically differensiert NCADSCs. (C) qRT-PCR resultater som viser induksjon av brune adipocyte-spesifikke gener, Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16 i den hvite og brune adipogenically differensiert NCADSCs. Uttrykksnivåene ble normalisert mot HPRT og målt ved ct -metoden (Ct). Representativt resultat av n = 3 uavhengige eksperimenter. Verdier uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD. Unpaired 2-tailed Student t-test ble brukt til sammenligninger mellom de to gruppene. *P < 0,05. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien presenterer vi en pålitelig metode for isolasjon, kultur og adipogen induksjon av NCADSCs hentet fra PVAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgene mus designet for å produsere RFP+ ADSCer. Tidligere rapporter viser at det ikke er noen signifikant forskjell i uttrykket av generelle multipotente mesenchymale stamceller (MSCer) markører i NCADSCs og ikke NCADSCs22, og at NCADSCs har et sterkt potensial til å skille seg inn i adipocytes in vitro15,22,23. Dermed bør NCADSCs isolert med denne protokollen være egnet for de fleste ADSC-studier.
Fordelen med den nåværende metoden er at den iboende fluorescerende reporteren i de transgene NCADSCene gjør isolasjonsprosessen enkel og økonomisk uten behov for antistoffer eller sondebaserte FACS, eller magnetisk aktivert cellesortering24. I tillegg er fluorescensintensiteten til RFP sterkere enn FITC, noe som ytterligere forbedrer effektiviteten til FACS.
Nøkkelen til denne protokollen er utnyttelse av unge mus. Selv om eldre og større mus kan gi en større mengde fettvev, reduseres andelen nc-avledede adipocytter i PAAT med alderen fordi NCCene primært bidrar til tidlig utvikling av PAAT15. Dermed avtar adipogenpotensialet til disse cellene med alderen. Basert på eksperimentene våre er det optimale tidsvinduet for NCADSC-isolasjon hos mus 4–8 uker.
Vår metode er enkel, praktisk, og kan generere rikelig ADSCs for studiet av PVAT adipogenese eller lipogenesis in vitro, og for å teste nye legemidler mot fedme og kardiovaskulær sykdom. Videre ncadscs av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ mus kan også være et effektivt in vitro-system for andre forskningsfelt. Imidlertid gjenstår flere advarsler: For det første er disse cellene mer følsomme og skjøre enn udødelige adipocyte linjer. For det andre motvirkes deres høye spredningsrate og adipogenic differensiering av det faktum at de har en tendens til å miste sitt adipogene potensial etter maksimalt fem passasjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), og Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17411971000, 17140902402) ga midler til denne studien .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R.
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
