Summary
Detta protokoll beskriver en effektiv elektroporationmetod för transfection av fyra olika gastrointestinala organoidenheter med större plasmider (i den grad av 10 kB). Det kan utföras inom en dag och behöver inte omfattande förberedelse eller speciella, kostnadsintensiva elektroporation buffertar.
Abstract
Elektroporation är en vanlig metod för transfection med olika typer av molekyler genom elektrisk permeabilisering av plasmamembranet. Med den ökande användningen av organoider som en odlingsmetod för primärt patientmaterial under de senaste åren, effektiva överföringsmetoder av komponenter för genteknik i detta 3D-kultursystem är i behov. Speciellt för organoider beror effektiviteten av genetiska manipulationer på en framgångsrik transfection. Således utvecklades detta protokoll för att underlätta elektroporation av organoider och att bevisa sin universella funktionalitet i olika enheter. Human kolorektal, pankreas, lever och magcancer organoider var framgångsrikt elektroporated med små och stora plasmider i jämförelse. Baserat på GFP-kodningsvektorer bestämdes transfectioneffektiviteten av FACS. Ingen omfattande beredning av cellerna eller speciella, kostnadsintensiva elektroporationbuffertar är nödvändiga, och protokollet kan utföras inom en dag.
Introduction
Under de senaste åren har ett nytt 3D-cellskultursystem, kallat organoider, utvecklats för olika normala och cancerogena vävnader. Organoider är funktionellt och morfologiskt mycket nära sin vävnad av ursprung. De kan genereras från olika arter, är lätt utbyggbara, genomiskt stabila och genetiskt modifierbara, vilket gör dem till ett idealiskt modellsystem för genetiska undersökningar1,2,3. Genteknik tekniker som CRISPR (Clustered Regelbundet Interspaced Short Palindromic Upprepar)/Cas9-systemet möjliggör olika manipulationer. Valet av kloner kan realiseras genom definierade medievillkor, till exempel av WNT ligand tillbakadragande för APC (Adenomatosis Polyposis Coli) knockout kloner4,5. Alternativt måste urvalsmarkörer införas genom homologriktad reparation av en inriktningsvektor6,7. På grund av det faktum att ofta mer än en plasmid måste införas, blir en effektiv transfection en avgörande parameter. Dessutom, för att minska ospecifika off-target effekter, ett övergående uttryck för Cas9 endonuclease är önskvärt8.
Elektroporation är en jämförelsevis enkel metod för transfect celler med DNA, RNA, proteiner eller andra makromolekyler. Med hjälp av elektriska pulser blir cellmembranet mer genomsläppligt och orsakar ett ökat upptag9. I ett tidigare publicerat elektroporationsprotokoll av kolonorganoider nåddes en 30% effektivitet med en piggy-bac GFP (grönt fluorescerande protein) som uttrycker vektor (7,4 kB) i ett fyra dagar förfarande10. Följande protokoll utvecklades för att underlätta en effektiv transfection av cancerogena eller friska organoider med stora plasmider kodning för enda guide RNA (sgRNA) och Cas9 endonuclease sekvens (t.ex. px458 som vektor med 9,3 kb). Hela elektroporationsprocessen kan utföras inom en dag, utan speciella elektroporationsbuffertar, och med åtminstone jämförbara effektivitetsvinster mellan olika gastrointestinala organoider, nämligen bukspottskörteln duktal adenocarcinom (PDAC), kolorektal cancer (CRC), cholangiocarcinoma (CCC) och magcancer (GC) organoider.
Protocol
Etiskt godkännande erhölls från TU Dresdens etiska kommitté (#EK451122014).
1. Organoid kultur och preparat före elektroporation
- Upprätta organoider genom vävnadsnedbrytning som beskrivits tidigare och utöka dem med motsvarande enhet specifika kulturmedium i en källare matris (översikt se tabell 1 och Materialtabell)11,12,13,14,15,16,17.
OBS: För mänskliga vävnadsprover informeras samtycke och godkännande av studien av en etisk kommitté är nödvändigt. - Förvärm 48-brunnsplattor vid 37 °C för postelektroporationssådd.
- Förbered basalmedium w/o antibiotika samt enhetspecifika organoidodlingsmedium w/o antibiotika (se tabell 1) inklusive 10 μM Y-27632 och 3 μM CHIR99021.
OBS: Tillbakadragandet av antibiotika är viktigt för att minska toxiska effekter. Y-27632 och CHIR99021 förbättra cell återvinning10. -
Beredning av organoiderna (se figur 1)
- Odla 5 brunnar av organoider i en 48-brunn platta per elektroporation prov i kulturmedium.
OBS: Proliferative organoider bör användas (ca 2-3 dagar efter sista delningen). - Förbered 230 μl dissociationsreagens (se materialtabell)inklusive 10 μM Y-27632 per brunn.
- Ta bort odlingsmediet från varje brunn och separera organoiderna mekaniskt i 230 μL av den beredda dissociationsblandningen. Pool 5 brunnar per elektroporation prov i en 15 ml rör.
- Blanda genom virvlande och inkubera i 5-15 min vid 37 °C tills kluster av 10-15 celler förekommer. Kontrollera därför dissociationmikroskopiskt. Stoppa matsmältningen genom att lägga till basala medium w /o antibiotika upp till 10 ml.
OBS: Detta steg är mycket kritisk! Elektroporationseffektiviteten kommer att minskas, när inkubationen är för kort, men lång matsmältning kommer att minska överlevnadsförmågan. - Centrifugera vid 450 x g i 5 min vid rumstemperatur, kassera supernatant en och tvätta två gånger med 4 ml elektroporationsbuffert (se Materialtabell).
- Odla 5 brunnar av organoider i en 48-brunn platta per elektroporation prov i kulturmedium.
2. Elektroporation
OBS: Följande protokoll är utvecklat för elektroporatorer som kan kvadratiska vågor och separerade poring och överföra pulssekvenser (se figur 2). Impedansvärden och de spänningar, strömmar och energier som överförs till provet kan eventuellt mätas som kontroll för reproducerbara experiment.
- Resuspend organoidpelleten i 100 μL elektroporationsbuffert (se Materialtabell)som innehåller 30 μg plasmid DNA.
OBS: Koncentrationen av det använda plasmid-DNA bör överstiga 5 μg/μl för en optimal saltkoncentration under elektroporationsprocessen. Därför rekommenderas endofree plasmid maxi kit (se Table of Materials)för beredning av vektorer. Totalt upp till 45 μg DNA kan användas utan cytotoxiska effekter. - Fördela den kompletta DNA-organoidblandningen till en elektroporationscuvette med 2 mm mellanrumsbredd utan att producera luftbubblor.
- Ställ in elektroporationsparametrarna enligt Fujii et al.10 (se tabell 2, figur 2).
- Blanda cellerna något utan skumning genom att trycka på cuvett med ett finger. Placera cuvett en i cuvettekammaren.
- Tryck på elektroporatorens Ω-knapp och notera impedansvärdet.
OBS: En impedans mellan 30-40 Ω visade de bästa resultaten. I allmänhet bör det vara i intervallet mellan 30-55 Ω. Om så inte är fallet, kontrollera följande aspekter: mellanrumsbredd för den cuvette som används, elektroporatorens kabelanslutningar, eventuella luftbubblor, korrekt volym och saltkoncentration av elektroporationsblandningen. - Tryck på Start-knappen för att köra elektroporationsprogrammet och kontrollera värdena på strömmar, spänningar och energier som visas.
OBS: Värdena för uppmätta spänningar, strömmar och energier bör motsvara de inställda elektroporationsparametrarna. För jämförelse av upprepade experiment kan det vara bra att notera dessa data. - Efter elektroporation, tillsätt omedelbart 500 μl kulturmedium w/o antibiotika (med CHIR99021 och Y-27632; se steg 1.3). Blanda genom att pipetta upp och ner för att separera det vita skummet.
OBS: Det vita skummet uppträder efter elektroporationsprocessen och ett betydande antal celler är fäst vid den. Så, dissociation av det är mycket viktigt för att inte förlora celler. - Överför provet helt från cuvetten till ett nytt 15 ml-rör med hjälp av pipetten som hör till elektroporationscuvetterna (se Materialtabell). Skölja cuvett en gång med basalmedium rekommenderas för att få kvarvarande celler.
- För regenerering av cellerna, inkubera dem i 40 min vid rumstemperatur.
3. Sådd av celler
- Centrifugera cellerna vid 450 x g i 5 min vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Resuspend pelleten i 100 μL av källarmatris och frö 20 μL droppar i en förwarmed 48-brunnsplatta (se steg 1.2). Inkubera i 10 min vid 37 °C för polymerisering och tillsätt 250 μl odlingsmedium, som kompletteras med Y-27632 och CHIR99021 fram till nästa uppdelning av de odlade organoiderna (ca 5-7 dagar).
4. Fastställande av transfection effektivitet
OBS: I allmänhet rekommenderas att elektroporat en vektor som bär en fluorescensmarkör som ytterligare transfection kontroll. Beroende på den valda markören och dess kromoformognad kommer fluorescensen att synas inom omkring 24-48 h posttransfection18.
- Kontrollera fluorescensmikroskopiskt efter 24-48 h i transfection-kontrollen (se figur 4B).
-
Fluorescerande aktiverad cellskanning (FACS)
- Skörda cellerna analogt till steg 1.4.2-1.4.4 och smälta runt 10-20 min tills det finns enstaka celler. Lägg till upp till 10 ml fosfatbuffrad saline (PBS).
- Centrifugera vid 450 x g i 5 min vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Alternativt för diskriminering av levande celler: Resuspend pelleten i 1 ml fosfat-buffrad saline (PBS) och tillsätt en lämplig antikropp (se Materialtabell)eller propidiumjodid (PI). Blanda mycket noggrant endast genom att knacka och inkubera i 30 min vid rumstemperatur i mörkret. Tvätta med 10 ml PBS, centrifugera och kassera supernatanten.
- Resuspend cellpelleten i 200 μL PBS och eventuellt filtrera suspensionen genom en 100 μm cell sil i ett FACS-rör.
- Analysera cellerna av en FACS-maskin med hjälp av en lämplig gatingstrategi (se figur 3; Figur 4A)och bestämma transfectioneffektiviteten.
Representative Results
Organoider av fyra olika cancerenheter (CRC, CCC, PDAC, GC) var elektropoerade minst 3 gånger med 30 μg av en liten plasmid (pCMV-EGFP, 4,2 kb) eller en stor plasmid (px458, 9,3 kb). Båda vektorerna bär en GFP-kassett som gör det möjligt att bebestämma transfectioneffektivitet 48 h efter elektroporation genom flödecytometri. För att bara analysera levande celler, färgning med en livsdöd antikropp innan skanning utfördes. Gating-strategin visas i figur 3.
I alla fyra organoidenheter transfecteds 4.2 kB storlekplasmid med högre effektivitet jämfört med den större (se figurera 4). Den effektivaste transfectionen av den lilla plasmiden uppnåddes i PDAC-organoider med 92,1 ± 5,2 % GFP-positiva celler, medan den stora plasmiden transfected med en effektivitet på 46,7 ± 3,7 % (medelvärde ± standardavvikelse n = 3). Jämfört med organoider i bukspottskörteln, var den större plasmiden mer effektivt transfected i CRC organoider med en genomsnittlig effektivitet på 53,4 ± 11,7 %, medan den lilla plasmiden transfected med en genomsnittlig effektivitet på 84,3 ± 5,8%. Den svåraste enheten till transfect var organoider för magcancer: för både den stora och den lilla plasmiden uppnåddes den lägsta transfectioneffektiviteten i denna enhet (32,3 ± 12,7 % respektive 74,1 ± 5,5 %). CCC-organoider visade en genomsnittlig transfectioneffektivitet på 83,0 ± 13,1 % för den lilla plasmiden och för den stora plasmid 39,5 ± 10,4 % erhölls.
Som bevis på koncept, mänskliga normala magorganoider var elektroporated med en px458_Conc2 plasmid kodning för Cas9, GFP och två sgRNAs inriktning TP53. Cas9-inducerad dubbel sträng raster på exon 8 reparerades av icke-homologend-anslutning (NHEJ), vilket resulterar i frameshifts och därmed en knockout av genen (se Tillägg Figur 1).
Tabell 1: Sammansättning av basala medier, matsmältningsblandningar och odlingsmedier. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Tabell 2: Elektroporationinställningar enligt Fujii et al.10.
Bild 1: Arbetsflöde för förberedelse till elektroporation. Först organoider bör separeras till kluster av 10-15 celler och antibiotika bör tvättas ut. Efter elektroporation det vita skummet måste separeras. Celler kan sås efter regenerera i 40 min i rumstemperatur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tvåstegselektroporation. Två poringpulser med högre spänning och kort varaktighet (175 V och 157,5 V, vardera för 5 ms, paus för 50 ms, spänningsfall 10%) leda till bildandet av porer i cellmembranen. Följande överföringspulser levererar DNA i cellerna: fem positiva överföringspulser (med 20 V, 12 V, 7,2 V, 4,32 V och 2 592 V, vardera för 50 ms, paus för 50 ms, spänningsfall 40%), följt av fem polariteter utbytta transferpulser (med 20 V, 12 V, 7,2 V, 4,32 V och 2 592 V, var och en för 50 ms, paus för 50 ms, spänningsfall 40%). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativ gating strategi som visas av CCC organoider. Alla elektroporated organoider analyserades av flöde cytometri 48 h efter elektroporation. Celler elektropoerade utan plasmid DNA användes som negativa kontroller. Grindarna var inställda på följande sätt: (A)gating för cellform, (B,C) gating för enstaka celler (dubbel diskriminering), (D) gating för levande celler (färgas med en antikropp för apoptotiska celler) och (E,F) slutligen gating för eGFP uttrycker celler (FITC kanal). FSC = framåtspridning; SSC = sidospridning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Elektroporationseffektivitet hos fyra organoida enheter. (A) FACS analys (n = 34, genomsnittlig standardavvikelse och varje enskilt värde visas) och (B)visuell jämförelse av fluorescensmikroskop. Skala bar = 1000 μm. BF = ljust fält; CCC = cholangiocarcinoma; CRC = kolorektal cancer; GC = magcancer; PDAC = bukspottskörteln duktal adenocarcinom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Exemplarisk CRISPR/Cas9-baserad knockout av TP53 i normala humana magorganoider. Den px458_Conc2 vektorn (se Table of Materials) klonades genom att kombinera 2 gRNA-concatemervektorn, en generös gåva från Bon-Kyoung Koo19, med px45820, vilket resulterade i en plasmidkodning för 2 sgRNAs, Cas9 och GFP. Två sgRNAs inriktning TP53 infördes i px458_Conc2 vektor genom golden gate kloning (analogt till Andersson-Rolf et al.19). 10 μg plasmid DNA elektropoerades i humannormal magorganoider (A). Kloner valdes ut av Nutlin3 administration (B) och TP53 knockout bekräftades av TOPO TA kloning och sekvensering av allelerna, här exemplariskt visas för en klon (C). SgRNAs understryks i referensen. Skala bar = 200 μm. BF = ljust fält. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll ger detaljerade instruktioner för en effektiv, snabb och lätt att utföra elektroporation av olika organoidenheter. Utöver den presenterade tumör organoider från PDAC, CRC, CCC och GC, det fungerar framgångsrikt för organoider som härrör från frisk vävnad också. Protokollet kan utföras inom en dag. I publicerade organoid transfection protokoll hela förfarandet varade fyra dagar inklusive två dagar av preparat med olika typer av odlingsmedier10,21. I vårt protokoll krävs ingen särskild förbehandling. Genom att tvätta med elektroporation buffert innan elektroporation de antibiotiska komponenterna i media spolades ut och en justering av mättnadkoncentrationer för optimala impedansvärden uppnåddes. Vissa kritiska aspekter bör dock övervägas för en framgångsrik elektroporation:
Celler
I elektroporationprotokollet av Fujii et al.10 rekommenderas att ta isär organoider till enstaka celler och filtrera dem genom en 20 μm cellsil. I våra händer matsmältningen till enstaka celler minskar starkt överlevnadsförmågan hos celler. Som föreslås i Merenda et al.21,vi också separerat organoider till kluster av 10-15 celler och kunde inte bestämma en minskad effektivitet jämfört med enstaka celldissociation. Efter elektroporation är det ett mycket viktigt steg för att separera det vita skummet, så att inga bifogade celler går vilse.
För 2D cellkultur har det visat sig att en regenereringstid efter elektroporation på mer än 10 min upp till 40 min ökar överlevnadsförmågan och transfection effektivitet särskilt av stora plasmider22. I testexperiment kan detsamma dokumenteras för organoider, vilket leder till ett inkubationssteg på 40 min efter elektroporation i detta protokoll. För att öka återhämtningen från elektroporationen odlade vi dem med Rho-associerade proteinkinas (ROCK) hämmare Y-27632 i fem till sju dagar23. På samma sätt är ytterligare tillskott av glykogen syntas kinas 3 (GSK3) hämmare CHIR99021 tänkt att hjälpa enstaka celler att återhämta sig10.
Inställningar
En av fördelarna med den använda elektroporatorären är att impedansen kan mätas före elektroporation för optimala förhållanden. Enligt tillverkaren ska impedansvärdena vara 30-55 Ω. I våra händer har impedansvärden på 30-40 Ω visat optimal effektivitet. I ett preliminärt experiment varierades olika spänningar och pulslängdsvärden i poringpulsen för att hitta den optimala andelen effektivitet till överlevnadsförmåga. Sammanfattningsvis kan vi bekräfta de beskrivna värdena för Fujii et al.10 i de olika enheter som beskrivs här.
Dna
Effekten av olika DNA-mängder testades i preliminära experiment upp till 45 μg DNA per prov. Inga cytotoxiska effekter kunde upptäckas. Transfection effektiviteten ökade på ett dosberoende sätt med mättnad > 30 μg. Så använde vi 30 μg per prov i slutprotokollet, men naturligtvis kan det ökas (t.ex. för elektroporation av fler plasmider parallellt). Dessutom verkar renhet och koncentration av DNA vara mycket viktigt. En koncentration som överstiger 5 μg/μL har visat optimal transfection effektivitet.
Som väntat kan 9,3 kB plasmid transfected med en lägre effektivitet än den mindre 4,2 kB plasmid (se figur 4). Användningen av ännu större plasmider än 10 kB förväntas ytterligare minska effektiviteten. För framtida tillämpningar kan det vara intressant att testa minicircle DNA som vektor, eftersom dessa genbärare saknar bakterieryggraden i en plasmid som gör dem mindre24. Detta bör leda till en förbättrad transfection effektivitet. Dessutom, för CRISPR-baserade manipulationer av organoider en direkt elektroporation av sgRNAs bunden till Cas9 som en ribonucleoprotein (RNP) komplex kan vara ett alternativ eller tillägg25.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke och Max Heiduk för utmärkt teknisk hjälp. Finansiering tillhandahölls av Deutsche Krebshilfe (nr 111350 och 70112925), Sander Stiftung (nr 2014.104.1), Hector Stiftung (nr M65.2) och Europeiska unionen (ERC nr 639050).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For establishment and culture medium | |||
| [Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
| D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
| Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
| EDTA | Roth | 8040 | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
| mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | |
| Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
| N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
| PBS | Gibco | 14190169 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
| Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
| Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Consumables | |||
| Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
| 48-well plate | Corning | 3548 | |
| Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
| Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
| Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
| Equipment | |||
| Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
| EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
| LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
| Reagents and plasmids | |||
| Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
| 2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
| pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
| px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
| px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
| sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. |  |
| sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. |  |
| sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. |  |
| sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. |  |
References
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Werner, K., Weitz, J., Stange, D. E. Organoids as Model Systems for Gastrointestinal Diseases: Tissue Engineering Meets Genetic Engineering. Current Pathobiology Reports. 4 (1), 1-9 (2016).
- Olayanju, A., Jones, L., Greco, K., Goldring, C. E., Ansari, T. Application of porcine gastrointestinal organoid units as a potential in vitro tool for drug discovery and development. Journal of applied toxicology. 39 (1), 4-15 (2019).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Drost, J., et al. Use of CRISPR-modified human stem cell organoids to study the origin of mutational signatures in cancer. Science. 358 (6360), 234-238 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy Nucleic Acids. 4, e264 (2015).
- Tsong, T. Y.
- Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Hennig, A., et al. CFTR Expression Analysis for Subtyping of Human Pancreatic Cancer Organoids. Stem Cells Int. 2019, 1024614 (2019).
- Seidlitz, T., et al. Human gastric cancer modelling using organoids. Gut. 68 (2), 207-217 (2019).
- Stepanenko, O. V., Verkhusha, V. V., Kuznetsova, I. M., Uversky, V. N., Turoverov, K. K. Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes. Current protein & peptide science. 9 (4), 338-369 (2008).
- Andersson-Rolf, A., et al. Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids. Dev Biol. 420 (2), 271-277 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8, 2281 (2013).
- Merenda, A., et al. A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Lesueur, L. L., Mir, L. M., Andre, F. M. Overcoming the Specific Toxicity of Large Plasmids Electrotransfer in Primary Cells In Vitro. Molecular Therapy Nucleic Acids. 5, e291 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Darquet, A. M., Cameron, B., Wils, P., Scherman, D., Crouzet, J. A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle. Gene Therapy. 4 (12), 1341-1349 (1997).
- Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
