Summary
Beskrevet her er en nærhet merking metode for identifisering av interaksjonpartnere av TIR-domenet til NLR immunreseptoren i Nicotiana benthamiana bladvev. Også gitt er en detaljert protokoll for identifisering av interaksjoner mellom andre proteiner av interesse ved hjelp av denne teknikken i Nikotiana og andre plantearter.
Abstract
Nærhetmerkingsteknikker (PL) ved hjelp av konstruertascorbat peroksidase (APEX) eller Escherichia coli biotin ligase BirA (kjent som BioID) har blitt brukt til identifisering av proteinproteininteraksjoner (PPI) i pattedyrceller. Kravene til giftig hydrogenperoksid (H2O2) i APEX-basert PL, lengre inkubasjonstid med biotin (16–24 timer) og høyere inkubasjonstemperatur (37 °C) i BioID-basert PL begrenser sine applikasjoner alvorlig i planter. Den nylig beskrevne TurboID-baserte PL-en tar for seg mange begrensninger av BioID og APEX. TurboID tillater rask nærhetmerking av proteiner på bare 10 minutter under romtemperatur (RT) forhold. Selv om nytten av TurboID har blitt demonstrert i dyremodeller, viste vi nylig at TurboID-baserte PL utfører bedre i planter sammenlignet med BioID for merking av proteiner som er proksimale til et protein av interesse. Forutsatt her er en trinnvis protokoll for identifisering av protein interaksjon partnere ved hjelp av N-terminal Toll / interleukin-1 reseptor (TIR) domene av nucleotide-bindende leucine-rik gjenta (NLR) protein familie som modell. Metoden beskriver vektorkonstruksjon, agroinfiltrasjon av proteinuttrykkskonstruksjoner, biotinbehandling, proteinekstraksjon og desalting, kvantifisering og berikelse av de biotinylated proteinene ved affinitetsrensing. Protokollen som er beskrevet her, kan lett tilpasses for å studere andre proteiner av interesse for Nicotiana og andre plantearter.
Introduction
PPI er grunnlaget for ulike cellulære prosesser. Tradisjonelle metoder for å identifisere PPIer inkluderer gjær-to-hybrid (Y2H) screening og immunoprecipitation kombinert med massespektrometri (IP-MS)1. Men begge lider av noen ulemper. For eksempel krever Y2H screening tilgjengeligheten av Y2H-biblioteket til målanlegget eller dyrearter. Byggingen av disse bibliotekene er arbeidskrevende og dyrt. Videre utføres Y2H-tilnærmingen i heterologøs encellede eukaryotisk organismegjær, som kanskje ikke representerer cellulær status for høyere eukaryoetiske celler.
Ip-MS viser derimot lav effektivitet i å fange forbigående eller svake PPI-er, og det er også uegnet for de proteinene med lav overflod eller høy hydrofobiitet. Mange viktige proteiner involvert i anlegget signalisering veier som reseptor-lignende kinaser (RLKs) eller NLR familien av immunreseptorer uttrykkes på lave nivåer og ofte samhandle med andre proteiner transiently. Derfor begrenser det i stor grad forståelsen av mekanismer som ligger til grunn for reguleringen av disse proteinene.
Nylig er nærhetsmerking (PL) metoder basert på konstruert askcorbat peroksidase (APEX) og en mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (kjent som BioID) utviklet og benyttet for studiet av PPIs2,3,4. Prinsippet om PL er at et målprotein av interesse er smeltet sammen med et enzym, som katalyserer dannelsen av labile biotinyl-AMP (bio-AMP). Disse gratis bio-AMP frigjøres av PL enzymer og diffustil nærheten av målet protein, slik at biotinylation av proksimale proteiner ved de primære aminer innenfor en estimert radius på 10 nm5.
Denne tilnærmingen har betydelige fordeler i forhold til de tradisjonelle Y2H- og IP-MS-tilnærmingene, for eksempel evnen til å fange forbigående eller svake PPI-er. Videre tillater PL merking av proksimale proteiner av målproteinet i sine innfødte cellulære miljøer. Ulike PL enzymer har unike ulemper når du bruker dem på forskjellige systemer. For eksempel, selv om APEX tilbyr høyere tagging kinetikk sammenlignet med BioID og er vellykket brukt i pattedyr systemer, kravet om giftig hydrogenperoksid (H2O2) i denne tilnærmingen gjør det uegnet for PL studier i planter.
BioID-baserte PL unngår derimot bruk av giftig H2O2, men merkingshastigheten er langsom (krever 18–24 timer for å fullføre biotinylation), og dermed gjøre fangsten av forbigående PPIer mindre effektiv. Videre introduserer høyere inkubasjonstemperatur (37 °C) som kreves for effektiv PL av BioID, ekstern stress for enkelte organismer, for eksempel planter4. Derfor er begrenset distribusjon av BioID-basert PL i planter (dvs. risprotoplast, arabidopsis og N. benthamiana) rapportert6,,7,8,9. Det nylig beskrevne TurboID-enzymet overvinner manglene til APEX og BioID-baserte PL. TurboID viste høy aktivitet som muliggjør oppnåelse av PL innen 10 minutter ved RT10. TurboID-basert PL har blitt brukt i pattedyrceller, fluer og ormer10. Nylig optimaliserte og utvidet vi og andre forskningsgrupper uavhengig av TurboID-baserte PL for å studere PPI-er i forskjellige plantesystemer, inkludert N. benthamiana og Arabidopsis planter og tomat hårete røtter11,12,13,14. Komparative analyser indikerte at TurboID yter bedre for PL i anlegg sammenlignet med BioID11,14. Det har også vist robustheten til TurboID-baserte PL i planta ved å identifisere en rekke nye interaksjoner med en NLR immunreseptor11, et protein hvis interaksjonspartnere vanligvis er vanskelige å få ved hjelp av tradisjonelle metoder.
Denne protokollen illustrerer Den TurboID-baserte PL i planta ved å beskrive identifisering av interaksjonsproteiner i N-terminal TIR-domenet til NLR-immunreseptoren i N. benthamiana-planter. Metoden kan utvides til alle proteiner av interesse i N. benthamiana. Enda viktigere, det gir en viktig referanse for å undersøke PPIer i andre plantearter som Arabidopsis,tomat og andre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: En oversikt over metoden vises i figur 1.
1. Forberedelse av plantemateriale
- Grow N. benthamiana frø i våt jord ved høy tetthet og opprettholde dem i et klimakammer med en 16 h lys (ca 75 μmol / m2s) og 8 t mørk fotoperiode ved 23-25 °C.
- Omtrent 1 uke senere, nøye overføre hver ung frøplante til 4 'x 4 ' potter og holde plantene i samme kammer.
- Vedlikehold plantene i kammeret i ca 4 uker til de vokser til et bladstadium på 4-8 for påfølgende agroinfiltrasjon15.
2. Bygging av TurboID fusjoner
- Bruk standard molekylær kloning teknikk for å generere fusjon av målet protein med TurboID (PCR TurboID fra Addgene plasmid #107177). Her brukte vi N-terminal TIR-domenet til NLR-immunreseptoren som målprotein av interesse og konstruerte TIR smeltet til TurboID under kontroll av Blomkålmosaikkvirus 35S-arrangøren (p35S::TIR-TurboID).
MERK: Fusjon av TurboID-enzymet til karboksyl-terminus eller aminoterminus av målproteinet vil avhenge av proteinet av interesse. Vanligvis, for et cytoplasmatisk protein, bør begge termini være akseptabelt, så lenge TurboID-fusjonen ikke påvirker funksjonen til målproteinet. Men for et membranlokalisert protein bør proteintopologien karakteriseres på forhånd før man bestemmer hvilken endeinus som er best for TurboID-fusjon. - Konstruer en TurboID-smeltet citrin under samme promotor for å tjene som kontroll for påfølgende kvantitativ proteomisk analyse.
MERK: Det er viktig å konstruere en TurboID-kontroll for å identifisere proteomproksimal til målproteinet. TurboID-fusjonskontrollen skal vise et uttrykksnivå som ligner på TurboID-smeltet målprotein. Dette kan bestemmes empirisk ved å justere Agrobacterium konsentrasjonen under agroinfiltrasjon. I tillegg er det viktig at kontrollproteinet har et subcellulært lokaliseringsmønster som ligner på målproteinet av interesse.
3. Agroinfiltrasjon
- Transformasjon av plasmids til Agrobacterium
- Tilsett 0,5 μg av plasmidene som genereres fra trinn 2.1 og 2.2 til 50 μL Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101 kompetente celler, utarbeidet som beskrevet tidligere16.
MERK: Andre Agrobacterium stammer, for eksempel GV2260, kan også brukes. - Inkuber på is i 30 min.
- Varme sjokk i et vannbad ved 42 °C i 60 s.
- Tilsett 400 μL LB medium (10 g/ L tryptone, 5 g / L gjær ekstrakt, og 10 g / L NaCl; pH = 7,0) til Agrobacterium og inkubere ved 28 ° C i 90 min.
- Plate hele innholdet i røret på LB agar supplert med passende antibiotika for å velge plasmid, samt for Agrobacterium (for GV3101: 50 mg / L gentamicin og 50 mg / L rifampicin).
- Inkuber plater ved 28 °C i 36–48 timer til individuelle kolonier er synlige.
- Tilsett 0,5 μg av plasmidene som genereres fra trinn 2.1 og 2.2 til 50 μL Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101 kompetente celler, utarbeidet som beskrevet tidligere16.
- Plukk og strek flere individuelle kolonier på en frisk LB agar plate med antibiotika (se trinn 3.1.5) og vokse ved 28 °C over natten.
MERK: Det er mer optimalt å utføre kolonien PCR for å bekrefte tilstedeværelsen av den spesifikke binære konstruksjonen i Agrobacterium. I vår erfaring inneholder over 95% av koloniene de introduserte binære konstruksjonene. - Inokuler3 ml LB medium pluss passende antibiotika (se trinn 3.1.4) med Agrobacterium koloni som huser konstruksjonen av interesse, og inkuberer ved å riste over natten ved 28 °C til OD600 av Agrobacterium-kulturen når 2,0.
- Sentrifugercellene på 3000 x g og resuspender dem til OD600 = 1,0 i agroinfiltrasjonsbuffer (10 mM MgCl2,10 mM MES [pH = 5,6], 250 μM acetosyringone).
MERK: Selv om det er optimalt å inkubere inoculumet for 2 timer ved RT før agroinfiltrasjon, har det i vår erfaring med GV3101-stammen ikke vært en stor forskjell mellom målproteinuttrykket med vs. uten inkubasjon. - Bruk en 1 ml nålesprøytesprøyte til å infiltrere innokulatet i (abaxial) epidermis av de helt modne N. benthamiana bladene.
MERK: For å forberede en tilstrekkelig mengde bladmaterialer for tre biologiske replikater: et helt blad er vanligvis infiltrert, tre blader infiltreres per plante, og tre til fire planter brukes til hver konstruksjon. For hvert blad er 1,5–2,0 ml resuspenderte agrobakterier tilstrekkelig. - Etter 36 h post-infiltrasjon (hpi), infiltrere 200 μM biotin (i 10 mM MgCl2 løsning) i bladene pre-infiltrert med TurboID konstruksjoner.
- Vedlikehold anlegget i ytterligere 3–12 timer før du høster bladvevet som beskrevet i avsnitt 4.
MERK: Årsaken til å velge 36 hpi for biotininfiltrasjon er at målet protein uttrykk topper på dette tidspunktet i henhold til tidligere studier11. Det anbefales å bestemme tiden som kreves for optimal uttrykk for målproteinav interesse. Inkubasjonstiden etter biotinfiltrasjon en avhenger av eksperimentell design og målprotein under studien. Vanligvis tillater 3–12 timer biotinbehandling merking av de fleste proteiner proksimale til målproteinet ved TurboID-fusjonene.
4. Blad prøvesamling
MERK: For etterfølgende behandling av bladprøvene, bruk sterile hansker for å unngå keratinkontaminering av prøvene. Alle reagenser bør også være så keratinfrie som mulig.
- Klipp de infiltrerte bladene ved bunnen av petiole, fjern bladvenen, og blits bladvevet i flytende nitrogen.
- Grind bladvevet ved hjelp av en pestle og mørtel og oppbevar bladpulveret i 15 ml eller 50 ml falkerør ved -80 °C for etterfølgende bruk.
MERK: Ta tre til fire stykker blader for hver av de tre biologiske replikatene fra forskjellige planter. Protokollen kan settes på pause her. Før påfølgende trinn anbefales det å vurdere proteinuttrykk og biotinylation av målproteinet ved immunoblotanalyser. Typiske vestlige blots er vist i figur 2.
5. Ekstraksjon av blad total protein
- Overfør ca. 0,35 g bladpulver til et 2 ml rør. Forbered to rør for hver prøve.
FORSIKTIG: Bruk hansker når du berører gjenstander som avkjøles av flytende nitrogen. - Tilsett 700 μL RIPA lysisbuffer (50 mM Tris-HCl [pH = 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [m/v], 0,5% natriumdeoksykcholate [w/v], 1 mM DTT, 1 tablett proteasehemmercocktail) til 0,35 g bladpulver.
- Vortex rørene i 10 min.
- La prøvene stå på is i 30 min.
- Bland innholdet hver 4–5 min ved å snu rørene opp ned flere ganger.
6. Fjerning av gratis biotin ved å desalte
MERK: Denne delen tar ca. 50 min.
- Likevekten av desaltingskolonnen.
- Fjern sealeren nederst i desaltingskolonnen og legg kolonnen i et 50 ml rør.
- Fjern lagringsløsningen ved sentrifugering ved 1000 x g og 4 °C i 2 min og pass på at hetten løsnes.
- Sett avsaltingskolonnen i et 50 ml rør. Likevekten kolonnen 3x med 5 ml RIPA lysis buffer, hver gang sentrifuging ved 1000 x g og 4 °C i 2 min og forkaste gjennomstrømningen.
- Overfør avsaltingskolonnen til et nytt 50 ml rør og oppbevar midlertidig ved 4 °C for senere bruk.
- Snurrørene fra trinn 5,4 ved 16 500 x g og 4 °C i 10 min og overfør supernatanten fra de to rørene til et nytt 2 ml rør.
- Tilsett 1500 μL proteinekstrakt til toppen av harpiksen i den likevektede desaltingskolonnen (fra trinn 6.1.4). Når proteinekstraktet kommer inn i harpiksen, tilsett ytterligere 100 μL RIPA-lyssebuffer.
MERK: Selv om 1400 μL RIPA lysisbuffer ble brukt til proteinekstraksjon fra bladene, ble det totale volumet etter proteinekstraksjon og desalting alltid økt til en viss grad i forhold til det opprinnelige volumet. Derfor kan en kombinasjon av prøvene fra hver gruppe som beskrevet i trinn 5.1 og 5.4 resultere i minst 1500 μL proteinekstrakt per prøve. - Sentrifuge ved 1000 x g og 4 °C i 2 min og la de saltede prøvene være på is midlertidig.
7. Kvantifisering av desaltede proteinekstrakter ved hjelp av en Bradford-analyse
- Forbered 50 μL av hver gradering BSA-løsning: 0 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml og 1 mg/ml.
- Fortynn det desaltede proteinekstraktet ved å blande en 5 μL-prøve med 45 μL ddH2O.
- Forbered 1x Bradford regent ved å fortynne 5x Bradford regent (100 mg Coomassie strålende blå G250, 47 ml metanol, 100 ml 85% fosforsyre, 53 ml ddH2O).
- Tilsett 50 μL av hver gradient BSA-løsning og 50 μL fortynnet proteinekstrakt til 2,5 ml 1x Bradford-regent.
- Inkuber ved RT i 10 min.
- Tilsett 200 μL oppløsning av hver prøve til en brønn av en ELISA-plate (tre tekniske replikater per prøve).
- Mål OD595 ved hjelp av en mikroplateleser.
- Tegn standardkurven basert på verdien av gradient BSA-løsningen og beregn konsentrasjonen av desaltede proteinprøvene. Vanligvis varierer den totale proteinkonsentrasjonen hentet fra 0,7 g blader fra 3–6 mg/ml.
- Forbered 6–8 mg desaltet proteinekstrakt for påfølgende affinitetsrensing.
8. Berikelse av biotinylated proteiner
- Ta 200 μL streptavidn-C1-konjugerte magnetiske perler inn i et 2 ml rør.
- Likevekten de streptavidn-C1-konjugerte magnetiske perlene med 1 ml RIPA lysis buffer i 1 min ved RT.
- Etter hver vask, bruk magnetstativet til adsorberer perlene i 3 min og fjern forsiktig oppløsningen ved pipettering.
- Gjenta trinn 8.2 og 8.3.
- Overfør det desaltede proteinekstraktet til de likevektede streptavidn-C1-konjugerte magnetiske perler.
- Inkuber røret ved 4 °C i 12 timer (eller over natten) på en rotator for å beine de biotinylated proteinene.
- Fang perlene på et magnetisk stativ i 4 min ved RT til perlene samler seg på den ene siden av røret, og fjern deretter forsiktig supernatanten med pipette.
- Tilsett 1,7 ml vaskebuffer I (2% SDS i vann) til røret og hold den på rotatoren ved RT i 8 min. Gjenta trinn 8.3.
- Tilsett 1,7 ml vaskebuffer II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoksykolsyre [w/v], 1% Triton X-100) til røret og hold den på rotatoren ved RT i 8 min. Gjenta trinn 8.3.
- Tilsett 1,7 ml vaskebuffer III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoksykolsyre [w/v], 1 % NP40 [v/v]) til røret og hold den på rotatoren ved RT i 8 min. Gjenta trinn 8.3.
- Tilsett 1,7 ml 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5) for å fjerne vaskemiddelet, og gjenta deretter trinn 8.3.
- Overfør perlene til et nytt 1,5 ml rør, og gjenta trinn 8,11 og 8,3.
- Vask perlene 6x i 5 min hver med 50 mM ammoniumbikarbonatbuffer ved RT.
- Tilsett 1 ml 50 mAmmoniumbikarbonatbuffer til de magnetiske perlene og bland godt.
- Fjern 100 μL perler for immunoblotanalyse for å bekrefte berikelsen av biotinylated proteiner. En typisk vestlig flekk vises i figur 3.
- Blits resten av proteinprøvene og oppbevares ved -80 °C eller send dem umiddelbart for LC-MS/MS-analyse på tørris.
MERK: Typiske MS-resultater vises i en tidligere publikasjon (Zhang et al. 2019; Figur 2, tilleggsdata 1 og tilleggsdata 2)11. Hele datasettene er tilgjengelige på MassIVE (finnes på
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representative dataene, som illustrerer de forventede resultatene basert på den beskrevne protokollen, er tilpasset fra Zhang et al11. Figur 1 oppsummerer prosedyrene for å utføre TurboID-basert PL i N. benthamiana. Figur 2 viser proteinuttrykket og biotinylasjonen i de infiltrerte N. benthamianabladene. Figur 3 viser at de biotinylated proteinene i de infiltrerte bladene ble effektivt beriket for påfølgende massespektrometrianalyse. Det bør bemerkes at etter berikelse av biotinylated proteiner ved hjelp av streptavidn-C1-konjugerte magnetiske perler, forskjellige proteiner med varierte størrelser ble fanget, og vestlige flekkanalyse av de berikede proteinene viste smurte bånd (Figur 3). Lignende observasjoner er gjort i flere nylig publiserte studier6,7,13,14.
Figur 1: Oversikt over Den TurboID-baserte PL-metoden i N. benthamiana. Agrobacterium som huser TurboID-fusjonskonstruksjonene ble infiltrert i N. benthamianablader. 36 h post-infiltrasjon, 200 μM biotin infiltreres til de samme bladene for å initiere biotinylation av endogene proteiner som er proksimale til TurboID-smeltet målprotein. De infiltrerte plantene inkuberes deretter ved RT i 3–12 timer, etterfulgt av bladhøsting og sliping i flytende nitrogen. Bladpulver er lysed i RIPA lysis buffer, og en desalting kolonne er ansatt for å fjerne gratis biotin i proteinekstraktet. De biotinylated proteiner ble deretter affinitet-renset med streptavidin-konjugerte perler og identifisert av massespektrometri. Dette tallet er tilpasset fra tilleggstall 3 fra Zhang et al11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Immunoblot analyse av proteinekstrakter oppnådd i trinn 4.2. (A) Vestlig blot analyse av proteiner ekstrahert fra agroinfiltrated blader med antistoff mot HA tag. (B) Vestlig blot analyse av biotinylated proteiner i agroinfiltrated blader med streptavidin-HRP. Dette tallet er tilpasset fra tilleggstall 6B av Zhang et al11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vestlig blotanalyse av perler oppnådd i trinn 8.15 for å bekrefte berikelsen av biotinylated proteiner. For hver konstruksjon er det tre uavhengige replikater (1, 2 og 3). Streptavidin-HRP ble brukt til analyse av biotinylated proteiner i forskjellige prøver. Dette tallet er tilpasset fra tilleggstall 7 fra Zhang et al11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TurboID biotin ligase genereres av gjær skjermbasert rettet utvikling av BioID10. Den har mange fordeler fremfor andre PL-enzymer. TurboID tillater bruk av PL til andre modellsystemer, inkludert fluer og ormer, hvis optimale veksttemperatur er rundt 25 °C10. Selv om PL-tilnærmingen har blitt mye brukt i dyresystemer, er bruken i planter begrenset. Protokollen som er beskrevet her gir en trinnvis prosedyre for å etablere Den TurboID-baserte PL i N. benthamiana, et modellanlegg som har blitt mye brukt i interaksjonsstudier på plantepatogen. Denne protokollen skisserer bladprøveforberedelse, fjerning av gratis biotin, kvantifisering av de ekstraherte proteinene og berikelsen av de biotinylated proteinene.
Selv om gratis biotin i dyrecellekultursystemer i stor grad kan fjernes ved å vaske cellene med PBS buffer4, kan ikke den frie biotinen i bladvevet fjernes ved enkel vasking. En fersk studie indikerte at det frie biotinet kan påvirke den påfølgende berikelsen av de biotinylated proteinene11. I denne protokollen benyttes en desaltende kolonne til å fjerne gratis biotin i proteinekstraktene, slik at effektiv binding av biotinylated proteiner til streptavidinperlene.
Videre fungerer denne protokollen som en viktig referanse for å gjennomføre PL i andre plantesystemer. Nylig har tre rapporter brukt TurboID-baserte PL i Arabidopsis12,13,14 og tomat hårete rot12, foruten N. benthamiana beskrevet her. I likhet med dyrecellekultursystemer ble fjerning av den frie biotinen oppnådd ved å vaske planteprotoplastene før proteinekstraksjon6. Imidlertid eksisterte lavere mengder gratis biotinmolekyler som ikke var integrert i proteinet i det indre av cellen, noe som påvirket effektiviteten av påfølgende berikelse av de biotinylated proteinene. Derfor anbefales en desaltingsprosedyre for fullstendig fjerning av gratis biotin, og øker dermed utvinningseffektiviteten til biotinylated proteiner.
To typer kolonner, PD-10 og Zeba, har blitt brukt til gratis biotin fjerning11,12,13,14. Det kan være av interesse i fremtiden å sammenligne effektiviteten av disse to kolonnene i å fjerne gratis biotin i bladproteinekstrakter. Videre benytter denne protokollen en kanonisk sprøytemediert agroinfiltrasjonsmetode for å forkortuttrykke målproteinet av interesse for N. benthamiana blader. Deretter refiltreres biotinsubstratet i bladene for merking av proteiner som er proksimale til målproteinet. Lignende operasjoner har også blitt benyttet i andre to nylig rapporterte studier12,13. Som en alternativ metode gjelder vakuummediert infiltrasjon av biotin for både N. benthamiana og Arabidopsis14. I tillegg, i planter som ikke er egnet for agroinfiltrasjon, kan cellekulturer forvandles for målproteinuttrykk, etterfulgt av biotinbehandling og nærhetsmerkingsanalyse12. Disse nyere studiene har understøttet robustheten til TurboID-baserte PL i å studere PPI-er og har lagt grunnlaget for fremtidige anvendelser av TurboID-baserte PL i forskjellige plantearter.
I denne protokollen er veletablerte Agrobacterium-mediert forbigående uttrykk i N. benthamiana ansatt for å identifisere PPIer av målproteinet av interesse. Forbigående uttrykk kan føre til overuttrykk av fusjonsproteinene. Derfor er et mer optimalt alternativ å konstruere TurboID-fusjonen under kontroll av en innfødt promotor og uttrykke den ved agroinfiltrasjon eller generering av stabile transgene linjer. Med utviklingen av genomredigeringsteknologi er det også mulig å banke inn TurboID-fragmentet direkte inn i den innfødte genomiske loci av gener av interesse.
En annen viktig faktor som må vurderes er å sikre at TurboID-fusjonen ikke endrer funksjonen til målproteinet av interesse. I en tidligere studie ble funksjonen til NLR immunreseptoren smeltet til TurboID bekreftet ved å teste sin evne til å indusere den forsvarsmedierte celledøden i nærvær av tobakkmosaikkvirus p50 effektor11. TurboID er relativt større (dvs. 35 kDa) enn GFP, og fusjonen til et målprotein kan påvirke funksjonen til et målprotein. I slike tilfeller kan den mindre miniTurboID10 brukes.
Det er også viktig å avgjøre hvilken endeinus av målproteinet som er egnet for fiksering med TurboID. En generell tilnærming til slike funksjonelle tester er å avgjøre om TurboID-fusjonen vil utfylle den muterte plantelinjen til målgenet. Alternativt kan analyse av samspillet mellom TurboID-fusjonen med en tidligere kjent interaksjonspartner av målproteinet brukes. I de fleste tilfeller, for cytoplasmatiske proteiner, N-terminal eller C-terminal merking av TurboID kan produsere sammenlignbare datasett i påfølgende massespektrometri analyse. Men for membranlokaliserte proteiner er det viktig å bestemme topologien før vektorkonstruksjon. Ellers vil fusjon av TurboID oppstrøms eller nedstrøms av kodesekvensen av gener av interesse generere helt forskjellige resultater. Derfor er det viktig å bestemme de vendte sidene (f.eks. cytoplasmatisk- eller lumenvendt) av N-terminus eller C-terminus av membranlokaliserte proteiner. Dette sikrer at forventet proksimal proteome av målproteinet kan oppnås.
Selv om PL har flere fordeler over de tradisjonelle IP-MS-tilnærmingene for å oppdage forbigående eller svake PPI-er, har den sine egne indre begrensninger. For det første innebærer identifisering av en kandidat interaksjonproteiner ikke umiddelbart en direkte eller indirekte interaksjon med agnproteinet, men det gjenspeiler bare nærhet2. Derfor kan uavhengige in vivo-analyser (dvs. co-immunnedbør, bimolekylær fluorescenskomplement [BiFC], eller in vitro GST-pull down analyse) utføres for å ytterligere verifisere PPIer.
For det andre kan falske negativer eller falske positiver oppstå fra PL-analyse på grunn av ulike årsaker. Falske negativer kan for eksempel oppstå når proteinet som mangler tilgjengelige primære aminer. I tillegg viste nyere studier av BIN2-interactors i planter en delvis overlapping mellom data fra to eksperimenter13, noe som indikerer eksistensen av falske negative resultater på grunn av utilstrekkelig MS-dekning. Noen interactors av målet protein kan også være svakt biotinylated av TurboID-smeltet kontroll, noe som resulterer i en fold berikelse under cutoff terskelen og til slutt tap av noen sanne interactors13,14. Derfor bør tilstrekkeligbiologiske replikater med passende kontroller og cutoff-verdier settes for å minimere antall falske negativer11,14.
Videre kan en lang biotinbehandlingsperiode øke biotinylasjonen av uspesifikke proteiner, noe som resulterer i falske positiver10. Derfor er det viktig å optimalisere in vivo merking tid vinduer for å redusere uspesifikk biotinylation, mens også ikke påvirker produksjonen av biotinylated proteiner for analyse11,,12,13,14. I tillegg anbefales hard ekstraksjon og strenge vaskeforhold for å redusere de falske positive avledet fra uspesifikk binding av proteiner til perlene17. Foruten forbeholdene beskrevet ovenfor, er utformingen av en skikkelig negativ kontroll avgjørende for å skille sanne interactors fra falske interactors og unngå mangler av sanne interactors11,12,13,14.
TurboID viste sterkt forbedret merking kinetikk sammenlignet med BioID10,11. Dette kan imidlertid også føre til høyere bakgrunn under PL-analyse. Derfor må passende kontroller inkluderes for å eliminere bakgrunnssignalene. Vi brukte citrine-smeltet TurboID i denne protokollen11, og en lignende kontroll har blitt benyttet i tidligere studier18. For målproteinene som lokaliseres til en bestemt organellemembran, fikser TurboID med et signalpeptid som retter seg mot samme organellemembran, en bedre kontroll enn TurboID-fiksering med en som uttrykkes i cytoplasma14.
Videre, hvis informasjon om nøkkeldomenet eller aminosyrene i målproteinet som bestemmer interaksjonene med andre partnere er kjent, kan du fusjonere TurboID med et målprotein med en mutasjon i nøkkeldomenet eller aminosyrene være den beste kontrollen og vil maksimalt redusere bakgrunnssignalene som genereres av målproteinet. I tillegg krever TurboID-enzymer spesifikke temperaturer samt riktige pH-forhold. For de fleste organeller i cellen som ER, kjerne og mitokondrier, merket TurboID de proksimale proteinene10. Noen spesielle organeller (dvs. vacuoles i planteceller, hvis pH er svært lav19) kan imidlertid ikke være egnet for å studere PPI-er ved hjelp av PL-tilnærmingen. Videre kan endringer i pH-nivåene eller oksidasjonsreduserende tilstander i det subcellulære miljøet under stressresponsen påvirke merkeeffektiviteten til TurboID.
Oppsummert, protokollen beskrevet her gir grunnlag for å undersøke PPID ved hjelp av TurboID i N. benthamiana, en modell plante system som har vært mye brukt i mange aspekter av plantebiologi20. Med de nylig beskrevne TurboID-baserte PL-studiene i Arabidopsis planter og tomat hårete røtter12,13,14, er det forventet at denne metoden vil bli gjeldende for andre plantearter. Det forventes at TurboID-baserte PL vil spille en viktig rolle i å studere PPI i plantebiologi forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 til Y.Z.), National Natural Science Foundation of China (31872637 til Y.Z.), og Fundamental Research Funds for the Central Universities (2019TC028 til Y.Z.), og NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, og NIH-GM132582-01 til S.P.D.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
