Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

Published: January 14, 2020 doi: 10.3791/60738
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

יצירת מערכות דימרזציה בתחום החלבונים עם הזיקה הרצויה וספציפיות לכל מולקולה קטנה שניתנה לפני הרבה מולקולות ובקשות חישה והגשמה. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה, הניתן להכליל עבור דה נובו הנדסה של מערכות דימריזציה הנגרמת כימית דרך הבחירה החורגת של קומבינטורית הציג phage בספרייה נוגדן יחיד בתחום.

Abstract

אירועים מדימריזציה של חלבונים המתרחשים רק בנוכחות של מולקולה קטנה ומאפשרים פיתוח של מולקולה קטנה ביולוגית לניתוח ומניפולציה של מסלולים ביולוגיים. כיום, רק מספר מוגבל של מערכות dimerization בהשפעת כימית (CID) קיימים והנדסה חדשים עם רגישות הרצויה וסלקטיביות עבור ליגניות מולקולות קטנות מסוימות נשאר אתגר בתחום הנדסת חלבונים. אנו מתארים את השיטה הקרנת תפוקה גבוהה, comביננדרס בן ders-e nabled הבחירות שלסיד (משלב סיד), עבור דה נובו הנדסה של סיד מערכות החלים על מגוון רחב של ליגנדס. שיטה זו משתמשת בבחירה בשני השלבים של הספרייה phage מוצג קומבינטורית ננוגוף כדי לקבל 1) "עוגן אוגדן" כי לאגד הראשון כדי להשיג ולאחר מכן 2) "dimerization קלסרים" כי רק לאגד עוגן מאגד-ליגנד מכלולי. כדי לבחור בקלסרים עוגן, ספריית קומבינטורית של מעל 109 האזור משלימה לקביעת (cdr)-ננוגופים אקראיים מוקרן עם ligtinylated וכניסות מאומתים עם ליגנד על ידי ביולוגי אינטרפרומטריה (בלי). כדי להשיג בקלסרים dimerization הספרייה הננו מוקרן עם העוגן קלסר-ligand מכלולי כמטרות עבור הקרנה חיובית ואוגדן עוגן מאוגד עבור הקרנה שלילית. משלבת-CID ישימה באופן כללי כדי לבחור בקלסרים CID עם חיסוני אחרים, non-חיסוני, או בחינה חישובית עוצב מתוכננת הפיגומים כדי ליצור ביוחיישנים עבור מבחנה ב-vivo זיהוי של תרופות, מטבוליטים, מולקולות איתות, וכו '.

Introduction

CID מערכות, שבו שני חלבונים dimerize רק בנוכחות של מולקולה קטנה (איור 1), מציעים כלים רב-תכליתי לניתוח ותפעול מטבולית, איתות, ומסלולים ביולוגיים אחרים1. הם הפגינו את הפוטנציאל בהפעלה ביולוגית, כגון הפעלה מבוקרת סמים T2 ו אפופטוזיס3,4, לשיפור הבטיחות והיעילות של טיפול תא T המאמצת. בנוסף, הם מספקים מתודולוגיה חדשה בvivo או בזיהוי מתורבת של מטרות מולקולות קטנות. לדוגמה, חלבונים CID יכול להיות התמזגו גנטית עם מערכות העיתונאי הניאון (g., העברת אנרגיה בתהודה של אור השמש (למשל)5 ו מעגליות חלבונים פלורסנט מושתק)6 עבור בזמן אמת במדידות vivo, או לשמש ריאגנטים אהדה עבור כריך האנזים מקושר חיסוני כפוף (אליסה)-כמו assays.

למרות היישומים הרחבים שלהם, יצירת מערכות CID חדשות שיכולות להיות נשלטות על-ידי מולקולה קטנה ובעלת אתגרים מרכזיים. הוקמה שיטות הנדסה חלבון קלסר כולל חיסון בעלי חיים7, בחירה מחוץ גופית8,9, ועיצוב חלבון חישובית10 יכול ליצור ליגנד מחייב חלבונים הפועלים באמצעות חלבון בינארי-ליגנד אינטראקציות. עם זאת, שיטות אלה יש קשיים ביצירת מתחם CID ליגארי המושרה. כמה שיטות ליצור סיד על ידי קישור כימי שני ליגניות כי באופן עצמאי לאגד את אותם חלבונים או שונים11,12,13,14,15,16 או להסתמך על בחירת חלבונים קלסר כגון נוגדנים ליעד מולקולה קטנה מולקולת חלבון מתחמים17,18, ולכן יש מבחר מוגבל של ליגנדס.

פיתחנו לאחרונה מקוםהבחירה של החבר ' ה-e NABLEDהבחירות של סיד (משלבת סיד) שיטה עבור דה נובו הנדסה של סיד מערכות19. שיטה זו יכולה להשיג את היחודיות הגבוהה של דימרזציה (לדוגמה, קבוע עוגן-דימרזציה, kd (ללא Ligand)/kd (עם ligand) > 1,000). ספציפיות הדימרזציה מושגת באמצעות קלסרים עוגן עם אתרי קשירה גמישים שיכולים להציג שינויים מתרניים עם ליגנד מחייב, מתן בסיס לבחירה של קלסרים סלקטיבי מבחינה מבצעית רק לזהות ליגור העוגן אוגדן. הדגמנו הוכחה של עקרון על ידי יצירת קנאידיל (CBD) המושרה הטרודימרס של nanobodies, 12 – 15 מקטע נוגדן מסוג kda מתוך גמליים הכוללת פיגום אוניברסלי ושלושה cdr לולאות גמיש (איור 2)20, אשר יכול ליצור כיס מחייב עם הגדלים של מולקולהקטנה מולקולות21. בעיקר, הבחירה מחוץ גופית של ספריית החלבון קומבינטורית צריך להיות חסכוני וכללי עבור הנדסת CID, כי הספרייה באיכות גבוהה ניתן להחיל על ליגניות שונות.

בפרוטוקול זה וידאו, אנו מתמקדים בתיאור שני שלבים בחירת מבחנה ואימות של עוגן (איור 3A) ו dimerization קלסרים (איור 3ב) על ידי הקרנת ספריית קומבינטורית nanobody עם גיוון גבוה יותר 109 באמצעות CBD כיעד, אבל הפרוטוקול צריך להיות ישים לספריות חלבון אחרות או מולקולות קטנות מטרות. ההקרנה של בקלסרים CID לוקח בדרך כלל 6 – 10 שבועות (איור 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בניית ספרייה

  1. השתמש קומבינטורית סינתטי מתחם יחיד בספריית הנוגדן עם מגוון של ~ 1.23 – 7.14 x 109, כפי שתוארה בעבר19. בעוד שפרוטוקול זה אינו כולל בניית ספריות, ניתן להחילו על ספריות אוגדן אחרות הקומבינטורית.

2. ביוטילציה של ליג, מטרה או ליגטין

  1. Biotinylate אוחר the שנבחרו ligand, למשל, CBD ו tetrahydrocannabinol (THC)19, באמצעות אסטרטגיות סינתזה כימית שונים, בהתאם לאתרים הביוקטילציה מתאים של מטרה.

3. הקרנת אוגדן עוגן

  1. תחילת הבחירה
    1. התחל כל סיבוב של בחירה על ידי הTG1 מושבה אחת-cell, גדל טרי ב 6 מ ל של 2YT ב 37 ° צ' ו 250 מהפכות לדקה (rpm) ל 600 nm (OD600) בספיגת ~ 0.5. דגירה את התאים על הקרח לשימוש בשלב 3.5.1.
  2. בחירה שלילית עם חרוזי streptavidin מאוגדים בביוטין
    1. הכינו את "חרוזי בחירה שליליים" על ידי שטיפת 300 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin באמצעות מתלה הפרדה מגנטית, 3x עם 0.05% פוספט באגירה מלוחים עם מאגר רצף (PBST, 1 x PBS עם 0.05% vol/vol רצף 20%) ו-2x עם 1 x PBS.
    2. להשעות את החרוזים עם 1 מ ל של 1% קזאין ב 1 x PBS (pH = 7.4), ולהרוות את החרוזים על ידי הוספת 5x קיבולת האיגוד המדווח באמצעות ביוטין. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) על מסובבי עבור 1 h.
    3. לשטוף את החרוזים 5x באמצעות 0.05% PBST ו 3x באמצעות 1 x PBS, עבור סך של שמונה שוטף.
    4. הוסיפו ~ 1013 חלקיקים phage ב 1% קזאין/1% bsa ב 1 x PBS (pH = 7.4) ו דגירה ב-RT על מסובבי במשך 1 h.
    5. לאחר הדגירה, לאסוף את הסופרנטאנט כדי לשמש בשלב 3.3.6.
  3. בחירה חיובית עם חרוזים streptavidin מאוגדים ביולוגיים
    1. הכינו את "חרוזי הבחירה החיוביים" ב1/2 את נפח החרוזים המשמשים את "חרוזי הבחירה השליליים" בצעדים הבאים 3.2.1.
    2. השהה מחדש את החרוזים עם 1 מ"ל 1% קזאין ב-1 × PBS, pH 7.4 ורוויה החרוזים על ידי הוספת 5x קיבולת הכריכה המלאה מחושבת בהתבסס על המדריך באמצעות ליגטילנטיב ביולוגי הבחירה. מודטה ב-RT על מסובבי במשך 1 h.
    3. לשטוף את החרוזים 5x באמצעות 0.05% PBST ו 3x באמצעות 1 x PBS, עבור סך של שמונה שוטף.
    4. לחסום את החרוזים עם 1 מ ל של 1% קזאין/1% BSA ב 1 x PBS (pH = 7.4) ו דגירה ב-RT על מסובבי עבור 1 h כדי למנוע קשירה לא ספציפית בין phages לבין חרוזי מגנטי streptavidin מצופה.
    5. לשטוף את streptavidin מצופה חרוזים מגנטיים 3x באמצעות 0.05% PBST ופעם אחת באמצעות 1 x PBS, עבור סך של ארבעה שוטף.
    6. השהה מחדש את streptavidin מצופה חרוזים מגנטיים באמצעות phages מאוגד נלקח משלב 3.2.5 ו דגירה ב RT על מסובבי עבור 1 h.
    7. מבלי להפריע. לחרוזים המגנטיים שמור את ה-phages הלא מאוגדים כקלט, שישמש בשלב 3.5.1.
    8. לשטוף את החרוזים 10x באמצעות 0.05% PBST ו 5x באמצעות 1 x PBS. בין כל שלוש שוטף להעביר אותם צינור חדש כדי למנוע phages מאוגד במיוחד אל קירות הצינור.
  4. הימנעות מהננו-רובוטים מוצגים
    1. מאגד תחרותי מאוגד באמצעות הוספת 450 μL של ליגטין לא-biotinylated, באמצעות ריכוז בטווח micromolar (למשל, 10 – 50 μm) ו דגירה ב RT על מסובבי עבור 30 דקות. ליגיון שנבחרו הריכוז התחרותי של phages מאוגד תלוי ב - K הרצוי של העוגן ". ליגדי ריכוזים יכולים להיות גבוהים יחסית בסיבובים של בחירה ראשונית ולאחר מכן להקטין בסיבובים מאוחרים יותר.
    2. לאסוף סופרנטאנט ולשמור את phages הפלט כמו תפוקה, כדי לשמש בשלב 3.5.2.
  5. חדירות קלט/פלט וזיהום
    1. עבור titration קלט, להכין מדלל טורי 10x ב 1 x PBS עד 109-קיפול עם הקלט phage משלב 3.3.7. השתמש 107-109 מדלל סדרתי כדי לעשות זיהומים על ידי העברת 10 μl קלט phage מכל דילול כדי 70 μl TG1 תאים (OD600 של ~ 0.5). מודקון ב 37 ° c עבור 45 דקות, צלחת TG1 תאים נגועים על 3 90 mm 2YT-אגר מנות המכילות 100 g/mL אמפיצילין ו 2% (wt/vol) גלוקוז, ו הדגירה לילה ב 37 ° c. מלוחות הלילה, ניתן לחשב קלט phage באופן הבא:
      Equation 1
    2. עבור זיהום הפלט ואת טיטור, העבר את מצנח phages משלב 3.4.2 כדי 3 מ ל של TG1 תאים (OD600 של ~ 0.5). דגירה באמבט מים ב 37 ° c עבור 45 דקות. לאחר מכן להכין מדלל טורי 10x ב 2YT עד 103-קיפול, צלחת כל דילול על 90 MM 2yt-אגר מנות, ו דגירה לילה ב 37 ° c. מלוחות הלילה, ניתן לחשב פלט phage באופן הבא:
      Equation 1
    3. לחלק את שאר התאים TG1 נגועים ב-3 150 mm 2YT-אגר לוחות המכילים 100 μg/mL אמפיצילין ו 2% (wt/vol) גלוקוז. לוחיות הרישוי של הלילה. ב-37 ° c
  6. הגברה והתאוששות של הספרייה לסיבובים נוספים של בחירה
    1. הוסף 3 מ ל של 2YT לצלחת, לגרד עם מגרד תא סטרילי ולאסוף את כל התאים בשפופרת 50 mL חרוט. מערבבים את התאים שנאספו עם גליצרול סטרילי (20% wt/כרך הריכוז הסופי). למדוד את OD600 של התערובת ולעשות 3 – 5 המניות מניות. חנות at-80 ° צ' לאחסון לטווח ארוך.
    2. עבור הצלה phage, לדלל את phagemid המכיל TG1 בקטריאלי באמצעות 25 מ ל של 2YT מדיה בתוספת 2% גלוקוז ו 100 μg/mL אמפיצילין כדי OD600 של ~ 0.1. התאים התרבותיים ב 37 ° צ' ו 250 rpm ל-OD600 של ~ 0.5.
    3. Superinfect את התאים על ידי הוספת CM13 עוזר phage ב 5 x 109 pfu/mL ו-דגירה ב 37 ° צ' ו 250 rpm עבור 45 דקות. CM13 עוזר phage מספק נדרש חלבונים מעיל phage להרכבה של חלקיקים phage להשלים.
    4. צנטריפוגה את התרבות ב 8,000 x g עבור 10 דקות כדי להסיר את הגלוקוז. להשעות מחדש את התאים באמצעות 50 mL של 2YT מדיה בתוספת 100 μg/mL אמפיצילין ו 50 μg/mL kanamycin ו-דגירה ב 25 ° צ' ו 250 rpm לילה.
    5. צנטריפוגה את התאים מן התרבות לילה ב 9,000 x g, 4 ° צ' עבור 30 דקות. העברת supernatant לצינור חדש מזרז phages ב-supernatant באמצעות 1/5 נפח יתד/הרוג פתרון (20% wt/vol-פוליאתילן גליקול-6,000 ו2.5 M הנאל). מערבבים בעדינות ומניחים על קרח במשך 1 h.
    6. לאסוף חלקיקים phage על ידי צנטריפוגה באמצעות 12,000 x g ב 4 ° c עבור 30 דקות. להשעות את כדורי באמצעות 1 mL של 1 x PBS, ולהעביר את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינור ב 20,000 x g ו 4 ° צ' עבור 10 דקות כדי להסיר חיידקים שיורית.
    7. מבלי להפריע. לגלולה החיידקית השתמש בדילול 1:100 כדי למדוד את הספיגה ב 269 nm ו 320 nm. ניתן לחשב את המספר הכולל של phages באמצעותהנוסחההבאה:
      Equation 3
    8. אחסן בספריית phage ב -4 ° c לשימוש לטווח קצר או עם 25% גליצרול ב-80 ° c לאחסון לטווח ארוך.
    9. חזור על סבבים של בחירה (שלבים 3.1 – 3.6) עבור 3 – 6 סיבובים או עד לקבלת העשרה רצויה (עיין בסעיף תוצאות). צלחת לבחור שיבוטים יחיד (סעיף 4) על מנת לאפיין את הזיקה שלהם ספציפיות לליטור (סעיפים 5 – 7).

4. בידוד לשכפול יחיד

  1. כדי לבודד שיבוטים בודדים מספריית משנה מועשר, להכין מדלל סדרתי 10x של תאים TG1 נגוע phage (שלב 3.5.2). מדלל את הלוח על 90 mm 2YT-אגר מנות המכילות 100 μg/mL אמפיצילין ו 2% (wt/vol) גלוקוז ו דגירה ב 37 ° צ' לילה.
  2. מתוך לוחות הלילה, לבחור מושבות יחיד לתוך 250 μL של מדיה 2YT בתוספת 100 μg/mL אמפיצילין per גם ב לוחיות היטב סטרילי עמוק ולצמוח ב 37 ° c לילה.
  3. מן התרבויות לילה, האיחסן 10 μL לתוך 500 μL של מדיה 2YT טריים בתוספת 100 μg/mL אמפיצילין.
  4. לגדול תאים כדי OD600 של ~ 0.5, להוסיף CM13 עוזר phage ב 5 x 109 pfu/mL ו-דגירה ב 37 ° צ' ו 250 סל ד עבור 45 min.
  5. הוסף 500 μL של 2YT מדיה בתוספת 100 μg/mL אמפיצילין ו 50 μg/mL kanamycin. דגירה ב 25 ° צ' ו 250 rpm לילה.
  6. צנטריפוגה את צלחות הבאר העמוקה מן התרבויות לילה ב 3,000 x g עבור 10 דקות. לאסוף את supernatant המכיל את חלקיקי phage מבלי להפריע את הגלולה התא.
  7. חלקיקי phage ניתן להשתמש כדי אליסה כדי לקבוע את הספציפיות של שיבוטים שנבחרו כדי ligand. Biotin או מבנה הומויומן של היעד ניתן להשתמש כפקד שלילי.

5. בדיקת העוגן על ידי אליסה

  1. מעיל 96 היטב לוחיות הרישוי באמצעות 100 μL של 5 μg/mL streptavidin במאגר ציפוי (100 mM קרבונט מאגר, pH = 8.6) ב 4 ° צלזיוס לילה.
  2. לשטוף את הצלחות אליסה 3x באמצעות 0.05% PBST ולהוסיף 100 μL של 1 μM היעד biotinylated היעד בארות. הוסף 100 μL של ביוטין 1 μM או מטרה הומובול לבקרת הבקרה. . בסדר.
  3. לשטוף את הצלחות 5x באמצעות 0.05% PBST ולחסום איגוד ספציפי על ידי הוספת 300 μL של 1% קזאין ב 1 x PBS. . בסדר.
  4. שוטפים את לוחיות ה-דיאגנוסטיקה 3x באמצעות 0.05%-PBST ומוסיפים את הפייגה הטהורה של phage. . מודטה בשביל 1 h ב-RT
  5. לשטוף את הצלחות אליסה 10x באמצעות 0.05% PBST ולהוסיף 100 μL peroxidase (HRP)-M13 מעיל הגדול נוגדן חלבון (1:10000 דילול עם 1 x PBS עם 1% קזאין). . בסדר.
  6. שטוף את צלחות אליסה 3x באמצעות 0.05% PBST ולהוסיף 100 μL טטרמתיד (TMB) המצע. דגירה עבור 10 דקות או עד שינוי צבע גלוי הוא נצפתה. להפסיק את התגובה על ידי הוספת 100 μL של HCl 1 M. לקרוא את הצלחת ב 450 ננומטר על ספקטרוסקופיה.
  7. עבור ביטוי חלבון וטיהור, בחר את המשובטים מראה אהדה גבוהה וספציפיות עבור המטרה (ראה דיון).

6. ביטוי חלבון, טיהור וביוטילציה

  1. כפי שדווח בעבר19, משנה שיבוטים שנבחרו מסעיף 5 ולהביע כמו C-טרמינל Avi-tagged ו-מתויג שלו ננוגופים.
  2. לבטא ננו-רובוטים שנבחרו בפריפלמטר של E. coli WK6 תאים (בדרך כלל בתרבות 1 L), לשחרר על ידי הלם אוסמוטי, ולטהר באמצעות העמודה ניקל-נ. ת. ע (ראה טבלת חומרים).
  3. מאגר Exchange עם טור התפלה (1 x PBS עם 5% גליצרול; ראו טבלת חומרים).
  4. ננוגופים בbiotinylate אוחרים באמצעות ערכה מסחרית (ראו טבלת חומרים) לשימוש נוסף.

7. אפיון עוגן על ידי בבלי

  1. לנתח את האהדה ואת הקינטיקה של קלסרים עוגן נבחר על ידי השתק 200 ננומטר ביוטילנטיל העוגן על streptavidin bioחיישנים (ראה טבלת חומרים) עם מאגר שיטת מחייב (1 x PBS (pH = 7.4), 0.05% יצירת רצף 20, 0.2% bsa, 3% מתנול).
  2. חישוב קבועי דיסוציאציה (KD) של מאגד עוגן-ליגניות ואינטראקציות באמצעות ניתוח מצב יציב באמצעות תוכנת ניתוח נתונים (ראה טבלת חומרים). התקבלו ערכי K בדרך כלל טווח בין מיקרומטר יחיד לספרה כפולה.

8. הקרנת אוגדן דימרזציה

הערה: הקרנת הביואננינג של "קלסרים לפירוק" דומה לזו של קלסרים עוגן, למעט שני שלבים קריטיים: 1) קלסרים Dimerization נבחרים באמצעות קלסר העוגן הנבחר biotinylated ואת העוגן-ligand מורכב עבור שלילי ובחירות חיוביות, בהתאמה. 2) במהלך הצעד, ה100 מילימטר triethyine משמש כדי להשתמש בפייגים שנבחרו באופן חיובי, שהיו מאוגדים רק לכורך העוגן--ליגס ומתחם היעד. הפתרון 100 mM trimethylamine (pH = 11.5) משמש כדי לשכפל שיבוטים חיוביים על ידי שיבוש אינטראקציות החלבון.

  1. תחילת הבחירה
    1. התחל כל סיבוב של בחירה על ידי הTG1 מושבת התא יחיד, גדל טרי על מדיה מינימלית, ב 6 מ ל 2YT ב 37 ° c ו 250 rpm ל-OD600 של ~ 0.5. . התאים האלה בקרח
  2. הסרה של ננוגופים שלילית שנבחרו
    1. הכן את "צינור חיסור" באמצעות 400 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin מצופה ולאחר שלב 3.2. עם זאת, במקום לטפל בביוטין, הוסף 5x את קיבולת האיגוד המלאה המחושבת באמצעות קלסר העוגן הנבחר של biotinylated ושמור את ה-phages הלא מאוגדים לשימוש בשלב 8.3.3.
  3. מבחר של ננוגופים שנבחרו באופן חיובי
    1. הכן את "שפופרת לכידת" באמצעות 1/2 הנפח של חרוזים מגנטיים streptavidin מצופה המשמש "צינור חיסור" והשלבים הבאים 3.3.2 כדי 3.3.3. עם זאת, במקום לשבת עם ligtinylated, הוסף פי חמש את קיבולת האיגוד המלאה המחושבת באמצעות קלסר העוגןהנבחר.
    2. כדי ליצור את קלסר העוגן-ליגנד מורכב עבור בחירת האוגדן dimerization חיובית, להוסיף ריכוז מספיק גבוה של ligtinylated לא. הדבר יאפשר לstreptavidin העוגן המאוגד ביותר ליצור את המכלול המאוגד ליגולי.
    3. בצע את השלבים 3.3.3 to 3.3.8, באמצעות phages לא מאוגד נלקח "צינור חיסור".
  4. הימנעות של ננוגופים שנבחרו באופן חיובי
    1. Elute phages מאוגד העוגן מאגד-ligand מורכב על ידי הוספת 450 μL של 100 mM triethylamine, ו הדגירה ב RT על מסובבי עבור 10 דקות.
    2. לאסוף את הפייגים התחרותיים ולעקוב אחר הצעדים ה3.4.1 ל3.4.2.
  5. סבבים נוספים של בחירת אוגדן דימרזציה
    1. בצע את השלבים 3.5 ו 3.6 כדי להגביר ולשחזר את הספרייה כדי לבצע סיבובים נוספים של בחירה. חזור על סבבים של בחירה עבור 3 – 6 סיבובים או עד לקבלת העשרה רצויה. צלחת לבחור שיבוטים יחיד (להתייחס לסעיף 4) על מנת לאפיין את הזיקה שלהם ספציפיות למטרה.

9. אפיון של אוגדן דימרוניזציה מאת אליסה

  1. בצע את השלבים בסעיף 4 כדי לבודד שיבוטים בודדים לאפיון דרך אליסה.
  2. כדי לבדוק את האהדה של מועמדים באוגדן dimerization כדי לעגן את העוגן-ligand מורכבים, המעיל צלחת היעד של אליסה באמצעות 100 μL של 100 מאגד העוגן biotinylated. לאחר הדגירה של 1 h, להוסיף 1 μm של ליגנד היעד כדי ליצור מאגד עוגן-ליגנד מורכב.
  3. לוחית הבקרה צריכה להיות מצופה באמצעות קלסר העוגן biotinylated לבד כדי למסך את המשובטים כי יכול גם לאגד לאוגדן עוגן חינם. להוסיף 100 μL של 100 מאגד העוגן biotinylated ו מודטה ב RT עבור 1 h.
  4. בצע את סעיפים 5.3 – 5.7.

10. אפיון של אוגדן דימרזציה מאת בלי

  1. הזיקה הכבילה והקינטיקה של אוגדן הדימרזציה לאוגדן העוגן-ניתן לנתח את מורכבות המידע על-ידי שינופי קלסרים ביולוגיים ביולוגיים על streptavidin (SA) bioחיישנים עם מאגר שיטת הכריכה ולאחר מכן מקבל 1 μM עיגון עוגן מראש באמצעות דיעות טוריות של ligand. KD, konו- kמחוץ לאינטראקציות ניתן לחשב באמצעות שיטה מדווחת19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מתארים את שני השלבים בבחירת מבחנה ואימות של העוגן ו dimerization קלסרים על ידי הקרנת הספרייה קומבינטורית ננוbody עם גיוון גבוה יותר 109 באמצעות CBD כיעד. הערכת העשרת ביואננינג במהלך הסיבובים הרצופים של בחירת העוגן והדימרזציה, חשובה ביותר. תוצאות העשרה טיפוסיות לאחר 4 – 6 סיבובים של בחירה כפי שמוצג באיור 5 הם אינדיקציה טובה כי יש יחס גבוה של פגיעות פוטנציאליות בספריות המשנה, כך ייתכן סבבים נוספים של הבחירה לא יהיה צורך.

לשכפול יחיד מתאים לניתוח הזיקה היחסית והסלקטיביות של העוגן והדימרזציה. איור 6A היא בחירה של קלסר עוגן מייצג לאחר שישה סיבובים של ביואננינג. ניתן להשוות בין המשובטים לגבוהים (לדוגמה, #87) או נמוך (לדוגמה, #27) ליגטיביות ולסלקטיביות. שיבוטים בסלקטיביות גבוהה צריך להיבחר כמועמדים לאוגדן עוגן. באופן דומה, איור 6B מציג את תוצאות בחירת האוגדן dimerization לאחר ארבעה סיבובים של ביואננינג. בדרך כלל צפינו שיבוטים שיצרו הטרודימר עם קלסר עוגן עם קיבוע רק עם ליגנד (למשל, #49) או ללא (למשל, #80). יש לבחור באפשרות הקודמת, המציגה את הדימריזציה, לצורך אימות נוסף.

קלסר העוגן אליסה מסתמכת על השימוש במטרה biotinylated. לכן, אנחנו צריכים להשתמש בלי לאשר את הכריכה למטרה שאינה מתויג. בלי גם מאפשר אפיון של קינטיקה מחייבת. הנציג התוצאות בלי לראות את העוגן ואת דימרזציה מוצגים באיור 7א ו -7 ב, בהתאמה. הפאנלים השמאליים מראים את הכריכה התלויה בריכוז, ומרמזת כי הם מתאימים לבניית מערכת CID. הלוחות הימניים מציגים את הפקדים השליליים. מחושב KD של עוגן ואינטראקציות dimerization לאגד בנוכחות של ליגנד בדרך כלל נע בין nanomolar דו-ספרתי כפול ספרות כפולה. הם עשויים להשתנות בהתאם לליגקומבינטורית ולספריית הבחירה ה.

מידה אנליטית של הוצאה מהכלל (SEC) בוצעה כדי לאשר את היווצרות הטרודימר בין העוגן והדימרזציה לאוגדן. פסגת דימרזציה נצפתה כאשר העוגן והדימרזציה בקלסרים היו מעורבים (איור 8א, קו אדום). לעומת זאת, לא התגלתה פסגת דימרזציה בהיעדר CBD (איור 8A, קו כחול) או כאשר כל אוגדן נטען לעמודה בלבד (איור 8ב). הצלב הכימי שימש לייצוב מכלולי CID, ו ננוגופים מקושרים במקצת יש הגדלת במעט גדלים המתאימים פסגות מוקדם יותר.

Figure 1
איור 1: מנגנון השפעת החלבון הנגרם באמצעות כימית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סכמטית של הדור של ספריית ננוגוף קומבינטורית סינתטי. הספרייה נבנית על ידי שימוש בפיגום אוניברסלי של ננו-גוף ושילוב הפצות של חומצות אמינו לכל מיקום אקראי בשלושה אזורים מורכבים (CDRs) על-ידי הטכנולוגיה של טרינטוקלאוסיס (TRIM) 24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תרשים זרימה של (א) עוגן ו (ב) דימרזציה הקרנת אוגדן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ציר הזמן של קומביינים-CID. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: העשרת הפתיתים הבאים בעקבות כל סיבוב של ביואננינג לבחירת קלסר העוגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: מייצג התוצאות של אליסה מראה חיובי (+) ושיבוטים שליליים (*). (A) העוגןבקלסראליסה תוצאות מ 96 באקראי לאסוף שיבוטים לאחר שישה סיבובים של בחירה. (ב) דימרזציה בינדר תוצאות אליסה של 96 באקראי לאסוף שיבוטים לאחר ארבעה סיבובים של בחירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: בדיקה קינטית של העוגן והדימרזציה על ידי בלי. (א) ניתוח של מאגד עוגן עם CBD ללא תווית (משמאל) ו-THC (מימין). מאגד עוגן biotinylated היה ללא קיבוע על Super Streptavidin (SSA) bioחיישני הביולוגיה עם ריכוזים שונים של CBD. נתונים שנמדדו עבור איגוד CBD (עקומות אדומות) הותאמו באופן גלובלי (קווים אפורים). (ב) שמאל, ניתוח ללא מחקר של BIOSENSOR SA-מאגד הכורך אוגדן מחייב את קלסר עוגן מראש עם ריכוזים שונים של CBD. נכון, את הריכוז קלסר העוגן היה מאוגד וכרוך באוגדן הדימריזציה בהיעדר המע ר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: שניה ניתוח של הטרודימרזציה בין העוגן והדימרזציה לאוגדן. (א) הדימרזציה ואוגדן העוגן (5 μm כל אחד) בנוכחות או העדר של CBD היו מקושרים על ידי 100 μm Bis-N-סוכות-(פנטאתילן גליקול) אסתר עבור 30 דקות ב-RT לפני הניתוח. כמויות של חלבונים של תקני חלבון מסומנים על ידי משולשים. (ב) עוגן בלתי מקושר ואוגדן דימרזציה (30 μm כל אחד) הוזרק בנפרד. כרומטוגרמות ב-A ו-B מוצגים בסולמות Y שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חשוב לבחור את הריכוזים הנכונים של ספריות phage קלט עבור סיבובים שונים של ביואננינג. אנחנו בדרך כלל התחלנו מספריית הקלט של ~ 1012– 1013 phage חלקיקים עם גיוון > 109, המאפשר ~ 100-1000 עותקים של כל שיבוט phage להיות מוצג בתוך שיטת המשיכה למטה. אם הריכוז phage בתוך הסדר מחייב הוא גבוה מדי או נמוך, הסבירות של מחייב לא ספציפי או אובדן של שיבוטים חיוביים יגדל. בחירת העוגן או הדימרזציה מורכבת בדרך כלל משלושה עד שישה סיבובים של ביונינג, וספירות הפלט של phage מתחילות בדרך כלל מ-~ 104 ומגדילה ל-~10 – 109. הוא מתאים לבחור שיבוטים יחיד לאימות אליסה לאחר התבוננות כגון העשרה. סיבובים נוספים של ביונינג עלול להקטין את הסיכוי לזהות שיבוטים חיוביים נמוכים ומתאימים.

חשוב להגדיר פקדים ובחירות שליליים מתאימים כדי לשפר את הצלחת הבחירות. לדוגמה, השימוש באנלוגיות מבנית של ליגויעדים יקל על בחירת הליגניות והספציפיות. בעבודה שלנו, אנלוגי דומה מאוד, THC, שימש שליטה ל-CBD ב-אליסה ובאימות בלי להשתמש באוגדן ובקלסרים לדימרזציה19. בבחירת האוגדן dimerization, אם יש לאוגדן העוגן זיקה נמוכה יחסית, ניתן להציג את הכריכה של העוגן בחינם ומאוגד כמטרות בבחירה החיובית. לכן, חשוב להסיר ביסודיות את הקלסרים לאגד את העוגן בחינם במהלך הבחירה השלילית. זה יכול להיות מושגת על ידי ביצוע סיבובים מרובים של החיסור עם קלסרים עוגן בחינם.

מגבלה של הפרוטוקול שלנו היא כי מולקולות היעד צריך להיות biotinylated עבור בחירת קלסר עוגן רק אחד או כמה קלסרים עוגן ניתן להשתמש לבחירה dimerization. השימוש במטרות biotinylated יכול להעשיר את האוגדן הכרוך באופן חלקי לקשר בין ביוטין ליעדים. לפיכך, חשוב לאמת את הפגיעות באמצעות מטרות שאינן מסומנות באמצעות שיטות אחרות. בחירת יחיד או מספר כאוגדן עוגן עבור בחירת קלסר dimerization יכול להפחית את הסיכוי לזהות מערכות CID עם רגישות מתאימה וספציפיות. לפיכך, יכולת הבחירה של הקטע הנבחר ממתינה לשיפור נוסף באמצעות צימוד לטכניקות אחרות-לדוגמה, רצף של אינטראקציה בין-מולקולרית (SMI-Seq) המאפשר הקרנה של "ספרייה על-ידי-ספרייה" לאינטראקציה חלבון חלבון25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

פטנט זמני הקשור לעבודה זו הוגשה על ידי אוניברסיטת וושינגטון.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי פרס החדשנות אוניברסיטת וושינגטון (כדי L.G.), מענק של U.S. המכונים הלאומיים לבריאות (1R35GM128918 כדי L.G.), ו קרן אתחול של אוניברסיטת וושינגטון (כדי L.G.). H.J. היתה נתמכת על ידי מלגת קרן וושינגטון למחקר. K.W. נתמכת על ידי מלגת לתואר ראשון מהמכון לעיצוב חלבונים באוניברסיטת וושינגטון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).

Tags

ביוכימיה סוגיה 155 dimerization הנגרמת כימית קומבינטורית נוגדן הספרייה ננוגוף קנאידיל הצגת phage האנזים מקושר אנזימים הטיפול מכופף
יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gomez-Castillo, L., Watanabe, K.,… More

Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter