Summary
Presentamos un protocolo para inmovilizar macromoléculas individuales en dispositivos microfluídicos y cuantificar los cambios en sus conformaciones bajo el flujo de cizallamiento. Este protocolo es útil para caracterizar las propiedades biomecánicas y funcionales de biomoléculas como proteínas y ADN en un entorno de flujo.
Abstract
El comportamiento de una sola molécula bajo perturbación mecánica se ha caracterizado ampliamente para entender muchos procesos biológicos. Sin embargo, métodos como la microscopía de fuerza atómica tienen una resolución temporal limitada, mientras que la transferencia de energía por resonancia de ferster (FRET) solo permite deducir las conformaciones. La microscopía de fluorescencia, por otro lado, permite la visualización in situ en tiempo real de moléculas individuales en diversas condiciones de flujo. Nuestro protocolo describe los pasos para capturar los cambios de conformación de biomoléculas individuales en diferentes entornos de flujo de cizallamiento mediante microscopía de fluorescencia. El flujo de cizallamiento se crea dentro de canales microfluídicos y se controla mediante una bomba de jeringa. Como demostraciones del método, el factor von Willebrand (VWF) y el ADN lambda están etiquetados con biotina y fluoróforo y luego se inmovilizan en la superficie del canal. Sus conformaciones se monitorean continuamente bajo flujo de cizallamiento variable utilizando la reflexión interna total (TIRF) y la microscopía de fluorescencia confocal. La dinámica reversible de desenmaraña de VWF es útil para entender cómo su función está regulada en la sangre humana, mientras que la conformación del ADN lambda ofrece información sobre la biofísica de las macromoléculas. El protocolo también se puede aplicar ampliamente para estudiar el comportamiento de los polímeros, especialmente los biopolímeros, en diferentes condiciones de flujo e investigar la reología de fluidos complejos.
Introduction
Se han estudiado ampliamente los mecanismos de cómo las biomoléculas responden a los estímulos ambientales. En un entorno de flujo en particular, las fuerzas de cizallamiento y elongacional regulan los cambios de conformación y potencialmente la función de las biomoléculas. Ejemplos típicos incluyen el desenmarañamiento inducido por cizallamiento del ADN lambda y el factor von Willebrand (VWF). Lambda DNA se ha utilizado como herramienta para comprender la dinámica conformacional de las cadenas de polímeros individuales y flexibles y la reología de las soluciones poliméricas1,2,3,4. El VWF es un sensor de flujo natural que agrega plaquetas en los sitios de las heridas de los vasos sanguíneos con tasas de cizallamiento y patrones de flujo anormales. El desenmarañamiento de VWF es esencial para activar la unión de plaquetas al dominio A1 y la unión de colágeno al dominio A3. Además, el desdoblamiento del dominio A2 inducido por alto cizallamiento permite el escisión del VWF, que regula su distribución del peso molecular en la circulación5,6. Por lo tanto, la visualización directa de cómo estas moléculas se comportan bajo el flujo puede mejorar en gran medida nuestra comprensión fundamental de su biomecánica y función, lo que a su vez puede permitir nuevas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.
Las metodologías típicas para caracterizar las conformaciones de una sola molécula incluyen pinzas ópticas/magnéticas, microscopía de fuerza atómica (AFM) y transferencia de energía de resonancia de una sola molécula (FRET)7. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula es una poderosa herramienta para investigar la fuerza y el movimiento asociados con los cambios de conformación de las biomoléculas. Sin embargo, carece de la capacidad de mapear las conformaciones moleculares generales8. AFM es capaz de crear imágenes con alta resolución espacial, pero está limitada en resolución temporal9,10. Además, el contacto entre la punta y la muestra puede confundir la respuesta inducida por el flujo. Otros métodos como el FRET y el análisis de nanoporos determinan los estados de plegado y despliegue de proteínas de una sola molécula en función de la detección de la distancia intramolecular y los volúmenes excluidos. Sin embargo, estos métodos todavía están en su infancia y limitados en su observación directa de las conformaciones de una sola molécula11,12,13,14.
Por otro lado, observar directamente macromoléculas con alta resolución temporal y espacial bajo microscopía de fluorescencia ha mejorado nuestra comprensión de la dinámica de una sola molécula en muchos procesos biológicos15,16. Por ejemplo, Fu y otros lograron recientemente la visualización simultánea del alargamiento VWF y la unión del receptor de plaquetas por primera vez. En su trabajo, las moléculas de VWF fueron inmovilizadas en la superficie de un canal microfluídico a través de interacciones biotina-estreptavidina e imágenes bajo microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) en diferentes ambientes de flujo de cizallamiento17. Aplicando un método similar al de Fu, aquí demostramos que las conformaciones de VWF y ADN lambda se pueden observar directamente bajo TIRF y microscopía de fluorescencia confocal. Como se muestra en la Figura 1,los dispositivos microfluídicos se utilizan para crear y controlar el flujo de cizallamiento, y las biomoléculas se inmovilizan en la superficie del canal. Tras la aplicación de diferentes tasas de cizallamiento, se registran conformaciones de la misma molécula para medir la longitud de la extensión, también se muestra en la Figura 1. El método podría aplicarse ampliamente para explorar otros comportamientos de polímeros en entornos de flujo complejos para estudios reológicos y biológicos.
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Protocol
1. Preparación de La VWF
- Reconstituir el VWF de plasma humano para prepararlo para las reacciones de etiquetado. Añadir 100 l de agua desionizada (DI) a 100 g de FVW liofilizado para crear una solución de stock de VWF de 1 mg/ml.
- Solución de stock dialíze VWF para eliminar el exceso de glicina, aumentando así la eficiencia de etiquetado de biotina y fluoróforo.
- Transfiera 50 ml de solución de material DeVWF a una unidad de diálisis de 0,1 ml con un corte de peso molecular de 10.000 y cierre con una tapa. Almacene la solución de stock restante a -20 oC. Las existencias de VWF serán estables hasta 1 año a -20 oC.
- Ejecute la diálisis en 500 ml de 1 solución salina estéril con fosfato (PBS) (0,01 M fosfato disódico, 0,0018 fosfato monopotásico, cloruro de potasio de 0,0027 M, cloruro sódico de 0,137 M, pH 7,4 a 25 oC) durante 1 h a 4 oC con agitación lenta. Repita la diálisis durante una hora adicional con 500 ml de PBS fresco.
- Comience la reacción de etiquetado de la biotina. Preparar una solución de 2 mM de NHS-PEG4-biotina disolviendo el sólido en agua DI inmediatamente antes de la reacción. Permitir que la biotina NHS-PEG4permanezca en agua durante un tiempo prolongado hará que el grupo NHS-éster se hidrólilos, disminuyendo así la eficiencia de etiquetado.
- Añadir 2,5 ml de 2 mM de NHS-PEG4-biotina a la unidad de diálisis que contiene la solución de material DeVWF. Esto resultará en un exceso molar de biotina de 20 veces en comparación con los monómeros DeVF. Las aminas primarias de VWF reaccionarán con los grupos del NHS-éster, por lo que la unión covalente a los grupos de PEG4-biotina a través de enlaces de amida.
- Coloque la unidad de diálisis dentro de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Selle la unidad de diálisis con su tapa correspondiente. Asegure el conjunto de diálisis de tubo con Parafilm. Manténgase erguido y deje a temperatura ambiente durante 40 min.
- Inicie la reacción de etiquetado del fluoróforo. Preparar una solución de 2,8 mM de Alexa 488 tetrafluorofenil-éster (TFP-éster) colorante fluorescente (excitaciónmáx. 498 nm,emisión máxima a 519 nm) mediante la disolución del sólido fluoróforo en agua DI. Haga esto inmediatamente antes de la reacción para evitar que el grupo de éster de PTF se hidrólilos.
- Añadir 2,9 l del fluoróforo de 2,8 mM 488 a la unidad de diálisis. Esto resultará en un exceso molar de 34 veces de fluoróforo en comparación con los monómeros VWF. Las aminas primarias restantes de VWF reaccionarán con los grupos de éster de PTF, por lo que la unión covalente a los fluoróforos a través de enlaces de amida.
- Añadir 2,0 l de bicarbonato sódico de 1 M (disuelto en agua DI) a la unidad de diálisis. Esto ajusta el pH de la reacción más cerca de 8.0, lo que aumenta la eficiencia del éster de PTF y la reacción primaria de amina.
- Asegure la unidad de diálisis en un tubo de microcentrífuga tal como se encuentra en el paso 1.3.2. Conservar en la oscuridad para evitar fotoblanqueos y dejar a temperatura ambiente durante 1 h y 30 min.
- Coloque la unidad de diálisis en 900 ml de 1 PBS estéril y dializar durante la noche a 4 oC. Esto producirá aproximadamente 70 ml de FVW etiquetado a una concentración de 0,71 mg/ml o 2,84 oM (concentración de monómeros).
- Transfiera el VWF etiquetado a un tubo de microcentrífuga. Cubra el tubo con papel de aluminio y proteja de la luz. Conservar a 4oC. Para el almacenamiento a largo plazo, agregue azida sódica de agente antimicrobiano a una concentración final de 0,02% (p/v).
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Preparación del ADN Lambda
- Biotinylate linear lambda DNA rellenando sus sitios finales cohesivos (cos sitios) con nucleótidos biotina-14-dCTP según protocolos estándar, repetidos aquí en el paso 2.118. Rellene el resto de los sitios de cos con nucleótidos dATP, dTTP y dGTP.
- Preparar soluciones de 1 mM de dATP, dTTP, dGTP y biotina-14-dCTP en un tampón de reacción 10x (500 mM de cloruro de sodio, 100 mM de clorhidrato Tris, cloruro de magnesio de 100 mM, dithiothreitol de 10 mM, pH 7,9 a 25 oC).
- Colocar 48 sl de ADN lambda de 500 ng/L en un tubo de PCR y calentar durante 5 min a 65 oC. Los sitios de ADN lambda circular se separarán bajo el calor, linealizando la molécula y haciendo que los voladizos de una sola cadena estén listos para la biotinylación. Inmediatamente después, colóquelo en hielo para evitar que los sitios de cos vuelvan a lado.
- Añadir 5 ml de 1 mM de dATP, dTTP y dGTP y 4 l de biotina de 1 mM-14-dCTP al ADN lambda. También añadir 2,5 l de 5 U / L fragmento de Klenow (3'5' exo-) para catalizar la síntesis de ADN.
- Incubar la mezcla de reacción durante 1 h a 37oC.
- Añadir 1,2 l de 0,5 M EDTA. A continuación, calentar la mezcla de reacción durante 5 min a 70 oC. Esto desactivará el fragmento de Klenow y la reacción de biotinylación.
- Elimine el exceso de nucleótidos del ADN lambda utilizando una columna de espín que puede contener 10-70 l y tiene un corte de peso molecular de 6.000.
- Coloque la columna dentro de un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Centrifugar la columna y el tubo a 1000 x g durante 2 min. Deseche el flujo que se acumula en el tubo.
- Reemplace el búfer de columna por una solución 1x del mismo búfer de reacción del paso 2.1.1. Para ello, agregue 500 sl de búfer 1x a la columna. Centrífuga durante 1 min a 1000 x g. Deseche el flujo. Repita estos 2 veces más para que se haya agregado un total de 1500 l a la columna.
- Coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Agregue cuidadosamente la solución del paso 2.1.5 a la capa superior de la columna. Centrífuga durante 4 min a 1000 x g.
- Recoger el flujo a través (40-70 l) del tubo de microcentrífuga y colocar en un tubo PCR. Contiene el ADN lambda purificado y biotinilado.
- Etiquetar ADN lambda con tinte fluorescente YOYO-1 (excitaciónmáx. 490 nm,emisión máx. 509 nm) de acuerdo con los protocolos estándar, repetido aquí en el paso 2.3.120.
- Preparar una solución de tinte YOYO-1 y ADN lambda con una relación molar de tinte a par base de 1:10. Supongamos que no se perdió ADN en el paso de purificación para calcular la concentración del par base de ADN lambda. El ADN lambda de longitud completa tiene 48.502 pares base.
NOTA: Por ejemplo, si se recuperó 50 l de solución del paso 2.2.4, agregue 7,4 l de tinte YOYO-1 de 500 m. - Calentar la solución durante 2 h a 50 oC en la oscuridad para completar la reacción.
- Cubra el tubo con papel de aluminio y proteja de la luz. Conservar a 4oC. La solución ya está lista para ser inyectada en dispositivos microfluídicos.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
- Preparar una solución de tinte YOYO-1 y ADN lambda con una relación molar de tinte a par base de 1:10. Supongamos que no se perdió ADN en el paso de purificación para calcular la concentración del par base de ADN lambda. El ADN lambda de longitud completa tiene 48.502 pares base.
3. Creación de moldes de canal microfluídico en obleas de silicio
- Utilice la fotolitografía para crear canales microfluídicos con dimensiones adecuadas(Figura 2) en una oblea de silicio maestra de acuerdo con los protocolos estándar19.
4. Preparación del dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano (PDMS)
- Agregue 5 piezas de base de elastómero de silicona a 1 parte de agente de curado (por masa) en un bote de pesaje. Revuelva el contenido a fondo durante 1 min para crear una solución PDMS precurada.
- Coloque la oblea de silicio maestra en un plato de plástico de Petri. Vierta la solución PDMS sobre la oblea para crear una capa de 5 mm. Cubra el plato y déjelo en un desecador al vacío durante 1 h para eliminar las burbujas de aire.
- Incubar la placa de Petri cubierta a 60 oC durante la noche para curar PDMS en un sólido flexible. El curado dará como resultado canales microfluídicos moldeados en PDMS en la interfaz PDMS-wafer.
- Corta rectángulos de 20 x 10 mm en el PDMS, alrededor de cada canal microfluídico, usando una maquinilla de afeitar. Retire los bloques rectangulares PDMS con pinzas.
- Utilice una aguja de extremo romo de 25 G con bordes afilados para perforar un agujero de 0,5 mm de diámetro en un extremo del canal, asegurándose de que el agujero pase completamente a través del bloque PDMS(Figura 2). Utilice una aguja delgada para perforar PDMS desde el agujero. Repita esto en el otro extremo del canal. Esto creará una entrada y una salida para el flujo a través del canal.
- Limpie la superficie del bloque PDMS con cinta de vinilo para salas limpias. Sople gas nitrógeno comprimido sobre un cubreobjetos No. 1 1/2, 22 x 50 mm para eliminar los residuos.
- Coloque el bloque PDMS con el lado del canal hacia arriba y el cubreobjetos en la cámara de una máquina de unión de plasma. Comience el tratamiento.
- Cuando finalice el tratamiento, coloque rápidamente el bloque PDMS en un cubreobjetos para que el canal esté en contacto con el resbalón. Aplique presión a lo largo de los bordes del bloque. Coloque el conjunto coverslip-PDMS en una placa caliente a 115 oC durante 15 minutos para reforzar la unión permanente.
- Inserte tubos de 10 cm de largo y 0,25 mm de diámetro interior en el orificio de salida en la parte superior del bloque PDMS. Esto permite que el fluido fluya fácilmente fuera del canal. El dispositivo ya está completo.
5. Tratamiento de la superficie del dispositivo microfluídico
- Inyectar <10 l de albúmina sérica bovina biotinilada de 10 g/ml (BSA-biotina) disuelta en 1x PBS estéril en la entrada del dispositivo microfluídico para experimentos de VWF. Inyectar <10 l de 1 mg/ml de biotina BSA para experimentos de ADN lambda. Sostenga unos pocos microlitros de bSA biotina en la punta de la pipeta después de la inyección y permita que la punta permanezca incrustada en la entrada.
- Mantenga siempre una gota de agua DI alrededor de la punta. Esto evitará que las burbujas de aire entren en el canal. Aplique esta técnica cada vez que se inyecte una nueva solución en el canal.
- Deje que la biotina BSA incubar en el dispositivo durante 2 h. La BSA se unirá no específicamente a la superficie de encubrimiento(Figura 3A).
- Retire la punta de la pipeta. Inyectar <10 l de solución de bloqueo de caseína en el canal y permitir que se incuba durante 30 minutos. La caseína bloqueará cualquier sitio libre, reduciendo la unión inespecífica de biomoléculas a la superficie(Figura 3B).
- Retire la punta e inyecte <10 l de estreptavidina de 10 g/ml disuelta en PBS estéril 1x en el canal para experimentos de VWF. Utilice estreptavidina de 100 g/ml para experimentos de ADN lambda. Incubar durante 10 min. La estreptavidina se unirá a los grupos de biotina de la BSA-biotina(Figura 3C).
- Retire la punta e inyecte <10 ml de 1 x solución detergente (0,05% Tween 20 en PBS) en el canal para lavar el exceso de estreptavidina.
- Retire la punta e inyecte <10 l de 28,4 nM VWF diluido en solución de caseína o ADN lambda del paso 2.3.3. Incubar VWF durante 3 min. Incubar ADN lambda durante 45 min(Figura 3D).
- Retire la punta e inyecte <10 l de biotina libre de 5 mM diluida en solución de caseína. La biotina libre bloqueará el exceso de sitios de unión de estreptavidina en la superficie del canal(Figura 3E).
6. Visualización del VWF y el ADN lambda bajo microscopía de fluorescencia
- Preparar 1 ml de solución de bloqueo de caseína con ácido protocatecúico de 2,2 mM y protocatechuato de 37 nM-3,4-dioxigenasa (para minimizar el fotoblanqueo). Cargue en una jeringa y fíjela en una bomba de jeringa. Tome tubos de 30 cm de largo y 0,25 mm de diámetro interior y conecte un extremo a la aguja de la jeringa. Flujo en la solución para eliminar las burbujas de aire. Fije el otro extremo del tubo a la entrada del dispositivo microfluídico. Se recomienda hacer esto 3 minutos después del paso 5.6.
- Seleccione el objetivo de aumento más alto (es decir, 60-100X) de un microscopio de reflexión interna total (TIRF) o de fluorescencia confocal. Añada una gota de aceite de inmersión a su objetivo si es necesario. Coloque el dispositivo microfluídico en la etapa del microscopio para que el cubreobjetos esté al ras con el objetivo.
- Empiece la microscopía de campo brillante. Ajuste el enfoque para que las entidades, como los residuos y las burbujas, sean visibles. A continuación, ajuste la etapa en la dirección X e Y hasta que el borde del canal microfluídico sea visible y biseque el marco.
- Cambie al canal 488 (FITC). Ajuste el nivel Z y el ángulo TIRF según sea necesario hasta que se puedan distinguir las moléculas globulares verdes individuales. Estas son moléculas de ADN VWF o lambda.
- Ajuste el tiempo de exposición y la intensidad del láser para visualizar las moléculas fluorescentes sin fotoblanquearlas demasiado rápido. Ajuste el contraste para visualizar también las moléculas con mayor claridad.
- Arranque el flujo de la bomba de la jeringa para que la solución de bloqueo de caseína fluya hacia el canal y fuera de la salida. Haga esto exactamente 5 minutos después del paso 5.6. Detener y comenzar el flujo para observar los cambios en la conformación de moléculas. Al aplicar el flujo, utilice velocidades entre 5.000 y 30.000 l/h. Repita esto en varias áreas del dispositivo microfluídico. Continúe este proceso para localizar moléculas que pueden extenderse y relajarse en múltiples ciclos de detener e iniciar el flujo.
- Observe cuánto tiempo tardan las moléculas en alcanzar la máxima extensión y relájese completamente en los globos. Graba vídeos del comportamiento continuo de las moléculas bajo flujo de cizallamiento, seleccionando el mejor tiempo de exposición, frecuencia de exposición y duración del vídeo que capturará toda la gama de comportamientos de extensión y minimizará el fotoblanqueo.
- Guarde los vídeos como . AVI con una barra de escala.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
7. Análisis de imagen de los cambios de conformación
- Calcular la velocidad de
cizallamiento de pared ( ) aplicada a las macromoléculas utilizando el caudal (Q) y la altura (h) y la anchura (w) del canal microfluídico rectangular. Utilice la siguiente ecuación para hacerlo:
- Determine la longitud de cualquier biomolécula bajo varias velocidades de cizallamiento utilizando un código MATLAB personalizado (consulte Archivos complementarios). Cree una carpeta titulada análisis de vídeos que incluya los siguientes códigos MATLAB: main.m, save_each_frame.m, get_length.m y get_length.fig. Crea una subcarpeta dentro del análisis de vídeos titulada videos y añade . AVI para ser analizado en él.
- Abra main.m con MATLAB 2019a y ejecute el código. Escriba el nombre del archivo de vídeo que se analizará en la ventana de comandos en Por favor, introduzca el archivode datos para analizar: .
- En la interfaz gráfica de usuario (GUI) abierta, establezca el umbral (texto en el cuadro en la parte superior derecha de la ventana) en 20 y haga clic en el botón Establecer umbral para confirmar.
- Utilice el cursor de datos en la barra de herramientas superior de la ventana para elegir un píxel en cualquier lugar de la barra de escala. Haga clic en Punto de inicio en la sección Barra de escala a la derecha de la ventana. La posición (x,y) del píxel elegido aparecerá a la derecha del botón. Haga clic en el botón Tamaño de píxel ( m). El tamaño de píxel debe medirse solo una vez en cada vídeo.
- Elija cualquier píxel en la molécula de interés. Haga clic en Punto de inicio en la sección VWF. Después de que la posición del píxel elegido aparezca en el cuadro de texto de la derecha, haga clic en Extremo izquierdo, Extremo derecho y Longitud de cadena para obtener la longitud molecular en la imagen.
NOTA: Este paso se puede utilizar para analizar los cambios de conformación de cualquier biomolécula, a pesar de que el código tiene una sección específica denominada VWF. - Compruebe dos veces el extremo izquierdo y derecho de la molécula. Amplíe y utilice el cursor de datos para comprobar la posición del píxel de interés. Elija manualmente el píxel como fin y vuelva a calcular la longitud (en píxeles) cuando sea necesario.
- Registre el tamaño de píxel en el número de píxel y la longitud de la cadena en una hoja de Excel y calcule la longitud de la cadena en el número de píxeles.
- Repita los pasos anteriores para cada imagen. Utilice el botón Last, Next en la esquina inferior derecha de la GUI para cambiar entre imágenes en el mismo archivo de vídeo. Haga clic en Cerrar para cerrar la ventana GUI.
cizallamiento de pared ( ) aplicada a las macromoléculas utilizando el caudal (Q) y la altura (h) y la anchura (w) del canal microfluídico rectangular. Utilice la siguiente ecuación para hacerlo:
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Representative Results
Observar el comportamiento dinámico de biomoléculas como El VWF y el ADN lambda depende en gran medida de optimizar su unión a la superficie del dispositivo. Incubar tratamientos superficiales para los tiempos recomendados en el dispositivo microfluídico es crucial para obtener la unión con algunos puntos de anclaje, de modo que las moléculas puedan extenderse libremente y relajarse al cambiar de flujo. Si las proteínas o el ADN están unidos demasiado fuertemente con múltiples enlaces, se extenderán a longitudes limitadas o no se extenderán en absoluto. Esto ocurre particularmente con El VWF cuando permanece sin flujo en la superficie del dispositivo durante más de 3 minutos antes del bloqueo libre de la biotina. Cuanto más tiempo permanezca VWF en la superficie estancada, más grupos de biotina VWF se unen a los grupos de estrupvidina superficial y menor flexibilidad tiene la molécula para desentrañarse. Si las moléculas están unidas demasiado débilmente, por otro lado, se separarán al fluir y desaparecerán de la vista. Esto puede ocurrir si el VWF o el ADN lambda se incuban durante períodos demasiado cortos, causando que se formen muy pocas interacciones con biotina-estreptavidina. Las moléculas también pueden liberarse cuando se aplican tasas de cizallamiento extremadamente altas (>200.000 s-1), debilitando las interacciones biotina-streptavidina.
Una molécula ideal se une a tal punto que puede desentrañarse y relajarse en múltiples ciclos de detener y comenzar el flujo. La flexibilidad de una molécula para cambiar la conformación como esta a menudo se demuestra por su capacidad de extenderse a longitudes crecientes como tasas de cizallamiento más altas se aplican dentro de un rango de flujo creciente. Las imágenes de VWF obtenidas con la microscopía TIRF demuestran esta relación en Video 1. La curva de velocidad de cizallamiento de la extensión frente a la curva de velocidad de cizallamiento de esta misma molécula De VWF en la Figura 4 captura con precisión el comportamiento inducido por cizallamiento de una molécula de VWF y es útil para caracterizar las propiedades biomecánicas de la proteína. Las imágenes de ADN lambda obtenidos con microscopía de fluorescencia confocal muestran igualmente una mayor extensión sobre tasas de cizallamiento más altas y relajación gradual durante 2 min, como se captura en Video 2 y Video 3. Las características de retroceso del ADN lambda después del flujo detenido también se representan gráficamente en la Figura 5.
Figura 1: Esquemas de experimento de flujo de una sola molécula en canal microfluídico bajo microscopía de fluorescencia. La superficie del canal está recubierta con biotina BSA y bloqueada con caseína. La estreptavidina se une con la biotina en la superficie del canal y también el ADN Biotinylated VWF/lambda para inmovilizar moléculas individuales en la superficie. A medida que la velocidad de cizallamiento aumenta de A a C,la molécula se estira de un estado plegado a un estado alargado a lo largo de la dirección del flujo de izquierda a derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Dimensiones del canal microfluídico. La forma y la estructura del dispositivo microfluídico PDMS se muestran junto con las dimensiones del canal. El canal mide 50 m de altura y oscila entre 0,1 y 1,0 mm de ancho. La región de estrechamiento en el centro del canal es de 0,7 mm de longitud. La entrada y la salida son de 0.5144 mm (25 G) de diámetro. La dirección del flujo es de izquierda a derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pasos de tratamiento superficial para la inmovilización de una sola molécula. Todos los pasos se producen a temperatura ambiente. (A). BSA-biotina se recubre en la superficie durante 2 h. (B). La caseína se inyecta en el canal durante 30 minutos para bloquear la superficie. (C). La estreptavidina se incuba en el canal durante 10 minutos para unirse con la biotina BSA. (D). Después de lavar el exceso de moléculas en los pasos anteriores, el fluoróforo y la biotina etiquetados ADN VWF/lambda se inyectan en el canal e inmovilizan mediante la unión con estreptavidina. (E). La biotina libre fluye en, bloqueando sitios adicionales de unión a la estreptavidina para minimizar su interferencia con la molécula durante los cambios de conformación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comportamiento extensional de VWF bajo flujo de cizallamiento. La molécula se desenvasa reversiblemente a 7 velocidades de cizallamiento diferentes: 0 s-1, 33.333 s-1, 66,667 s-1, 100,000 s-1, 133,333 s-1, 166,667 s-1 y 200,000 s-1. La longitud de la molécula estirada aumenta de 0,52 m a velocidad de cizallamiento cero a 3,44 m a una velocidad de cizallamiento de 200.000 s-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Comportamiento de relajación del ADN lambda después de que se detiene el flujo de cizallamiento. El flujo con 33.000 s-1 y 66.667 s-1 velocidades de cizallamiento se aplican de 0 a 30 s a la misma molécula. La relajación se registra de 30 s a 150 s. A una velocidad de cizallamiento de 66.667 s-1, la molécula de ADN se alarga a 15,00 m y se relaja de nuevo a 5,83 m después de que el flujo se ha detenido durante 2 minutos. A una velocidad de cizallamiento de 33.333 s-1, la molécula se extiende sólo a 8,75 m y tiene una longitud de 3,33 m después de 2 minutos de relajación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo 1: Desenmarañamiento reversible del VWF bajo tasas de cizallamiento crecientes utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). La molécula en el centro de la vista se desenreda reversiblemente a diferentes longitudes a velocidades de cizallamiento 33.333 s-1, 66,667 s-1, 100.000 s-1 y 133.333 s-1. Se utiliza una bomba de jeringa para controlar el caudal a partir del cual se calculan las tasas de cizallamiento. La dirección del flujo es de izquierda a derecha. Las imágenes se toman con intervalos de 15 s para permitir procesos completos de relajación y extensión. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Video 2: Relajación del ADN lambda después de 33.333 s-1 de velocidad de cizallamiento. Las imágenes se toman bajo microscopía de fluorescencia confocal. El ADN lambda se estira bajo un flujo de cizallamiento de 33.333s-1 y se relaja de nuevo a un estado plegado después de que el flujo se detiene a 30 s. La duración de la relajación es de 2 min. La dirección del flujo es de izquierda a derecha. Las imágenes se toman con intervalos de 30 s en el medio. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Vídeo 3: Relajación del ADN lambda después de 66.667 s-1 de velocidad de cizallamiento. Los ajustes son idénticos a los de Video 2, excepto por la velocidad de cizallamiento inicial. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Archivos suplementarios: códigos MATLAB. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Para obtener datos de alta calidad de cambios de conformación de una sola molécula utilizando la microscopía de fluorescencia como se describe en este método, es fundamental incubar la molécula durante el tiempo adecuado, minimizar sus interacciones inespecíficas con la superficie y establecer ajustes de microscopio que reduzcan el fotoblanqueo. La capacidad de la molécula para cambiar libremente la conformación está relacionada con el número de interacciones biotina-estreptavidina formadas entre la molécula y la superficie. Como se mencionó anteriormente, esto debe ser controlado incubando la molécula sin flujo durante la cantidad adecuada de tiempo. Además, la proteína o el ADN pueden unirse no específicamente a la capa si la cubierta no está bloqueada de manera efectiva. Sin la solución de bloqueo recomendada, las moléculas pueden adherirse al vidrio no específicamente y no responder a ningún caudal aplicado. La aplicación del bloque de caseína durante el tratamiento superficial temprano y el mantenimiento de su presencia durante el flujo es esencial para reducir estas interacciones inespecíficas. Por último, la captura del comportamiento continuo y dinámico de una sola molécula requiere una excitación frecuente del fluoróforo durante la captura de imágenes. Esto puede causar un fotoblanqueo rápido si la intensidad del láser, el tiempo de exposición y la frecuencia de exposición son demasiado altos. Por lo tanto, es necesario ajustar estos ajustes en tándem y crear estrategias para reducir sus valores sin comprometer el tiempo o la resolución de la imagen de los datos.
Si no se observa la extensión y relajación de la molécula, se deben seguir pasos adicionales. Incubar la molécula en el dispositivo durante tiempos más largos y cortos que lo que se aconseja en el protocolo. Para cada vez que se prueba, variar las concentraciones de BSA-biotina y estreptavidina por factores de 10. Estas pruebas pueden ser necesarias para optimizar el número de puntos de anclaje de biotina-stretaviinformado formados entre la molécula y la superficie. Por ejemplo, si la densidad de etiquetado de la biotina es muy alta, debido a las desviaciones de las concentraciones o reactivos recomendados en el protocolo de etiquetado, puede ser necesario un tiempo de incubación molecular más corto y concentraciones más bajas de BSA biotina y estreptavidina. Para mejorar aún más el éxito del experimento, escanee todo el dispositivo microfluídico en busca de moléculas que se desenmarañan de forma reversible. La superficie no puede ser tratada uniformemente con estreptavidina o bloque de caseína, lo que hace que las moléculas en ciertas áreas tengan respuestas desenmembradas mayores que otras.
Este método está limitado por la falta de información sobre el tamaño y los puntos de anclaje de la molécula, la dificultad para producir una tasa de cizallamiento de 0 s-1 y la resolución óptica de los microscopios de fluorescencia. Los trabajos anteriores han mostrado una gran variación en el comportamiento de desenmarañamiento de VWF, potencialmente explicado por la amplia distribución en el número y la ubicación de los puntos de amarre de biotina-streptavidina y el peso molecular de cada molécula de VWF18. Por el momento, el método que presentamos no puede definir puntos de ate y tamaño molecular. Sin embargo, las simulaciones de dinámica browniana de un modelo de VWF de grano grueso publicado por Wang et al. incorporan estas variables y se pueden ejecutar junto con hallazgos experimentales para explicar dicha variación18. Además, el flujo no se detiene instantáneamente cuando se detiene la bomba de la jeringa, confundiendo la observación de la dinámica de retroceso. Esto se debe a la deformación y ligera dilatación del canal PDMS durante el período de flujo previsto. Cuando se detiene la bomba, el fluido continúa fluyendo hasta que el PDMS está completamente relajado. Un sistema mejorado debe utilizar PDMS más rígido o microcanales fabricados en materiales plásticos duros, lo que permite que el fluido alcance una velocidad de cizallamiento de 0s-1 más rápidamente. Por último, sólo se pueden resolver moléculas cuyo tamaño está en el mismo orden de magnitud que la resolución óptica del microscopio de fluorescencia, que puede no ser menor que unos pocos cientos de nanómetros. Por lo tanto, hay un requisito de tamaño mínimo para las moléculas que se pueden observar directamente con este método.
El protocolo actual se refiere principalmente a la cuantificación de los cambios conformacionales de las moléculas de proteína y ADN bajo flujo fisiológico. Sin embargo, el método también se puede utilizar para visualizar interacciones en tiempo real entre moléculas biológicas y caracterizar aún más la función de proteínas y ADN. Por ejemplo, Fu et al. han demostrado que el VWF atado puede activarse bajo un alto flujo de cizallamiento y capturar aún más la molécula de adhesión plaquetaria GPIb en condiciones de flujo variable17. Este evento de unión se conserva incluso cuando VWF está unido a la superficie mediante enlaces biotina-estreptavidina, lo que demuestra la eficacia de este protocolo para estudiar las funciones y mecánicas fisiológicamente relevantes17. Se podrían obtener conocimientos mecanicistas similares mientras se estudian las interacciones entre el ADN desentrañado y las proteínas reguladoras en entornos de flujo21,22. Además, nuestro método se refiere principalmente a la observación de cambios conformacionales en macromoléculas. Sin embargo, se podría adaptar con el propósito de estudiar moléculas más pequeñas que son lo suficientemente grandes como para ser resueltas bajo microscopía de fluorescencia. Por ejemplo, al unir de forma no covalente o covalente una molécula pequeña a un ADN lambda mucho más grande e inmovilizado, se podría aumentar la sensibilidad al cizallamiento de la molécula más pequeña y observar más fácilmente su comportamiento. En conclusión, otros métodos de caracterización de una sola molécula, como AFM o pinzas ópticas, proporcionan datos de alta resolución sobre las propiedades estructurales y funcionales de las macromoléculas; sin embargo, estos métodos alternativos no pueden observar los cambios dinámicos y conformacionales de las proteínas y el ADN que tienen lugar en un entorno de flujo fisiológico, como se presenta en este protocolo.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias DMS-1463234, los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL082808 y AI133634, y la financiación interna de la Universidad de Lehigh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
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