Summary
这里介绍的是利用皮质肾提取物制备和总蛋白质正常化，以证明血管内皮生长因子和哺乳动物肾脏叶黄素激素之间的相关性的协议。
Abstract
血管内皮生长因子 （VEGF） 有助于控制肾脏的血管生成和血管渗透性。肾病，如糖尿病肾病，与肾脏的VEGF调节不良有关。肾脏生理条件下控制VEGF的因素没有很好地理解。叶黄激素 （LH）， 一种亲血管激素， 有助于调节生殖器官的生理 VEGF 表达.鉴于LH受体在肾脏中被发现，我们齐希克研究所在这里假设，LH也有助于调节肾脏中的VEGF表达。为了提供证据，我们旨在证明LH水平能够预测哺乳动物肾脏的VEGF水平。大多数涉及肾脏的VEGF相关调查都使用低阶哺乳动物作为模型（即啮齿动物和兔子）。为了将这项工作转化为人体，决定以高阶哺乳动物（即牛和猪模型）检查VEGF和LH之间的关系。该协议使用来自肾脏皮层的总蛋白质莱沙。这种方法成功的关键包括：死后立即从屠宰场动物那里采购肾脏，以及通过总蛋白质使麻醉剂水平（在肾脏提取物中）正常化。本研究成功地证明了牛和猪肾中的LH和VEGF之间的显著线性关系。结果在两个不同的物种中可重现。该研究提供了支持证据，证明使用牛和猪的肾脏提取物是肾脏生理学研究的优良、经济、丰富的资源，特别是用于检查VEGF与其他分析物之间的相关性。
Introduction
血管内皮生长因子A（VEGF-A），有助于调节血管生成和血管渗透性在肾脏和其他器官1，2（下称VEGF-A将称为VEGF）。肾脏的VEGF水平处于严格的静时控制之下。当肾VEGF水平升高或抑郁时，肾脏可能出现故障。例如，在出生后3周内，患有VEGF特异性杂合性小鼠会发展成内皮病和无血球蛋白（即，在人类先兆子宫颈癌中看到的肾病变），到3个月大时，这些异体细胞发生末期肾衰竭。波多细胞特异性同源性敲除在出生3，4的1天内死于水肿和肾衰竭。
另一方面，肾VEGF的过度表达导致蛋白尿和肾小球肥大3，4。例如，过度表达VEGF的转基因兔子在肾病早期表现出渐进蛋白尿，肾病早期肾球菌过滤率增加，随后在后期下降的球状过滤率3。糖尿病肾病是糖尿病成人终末期肾病的主要原因，与VEGF调节不良密切相关。在病理条件下，缺氧在诱导VEGF表达中的作用受到很大重视。然而，在生理条件下（肾脏和其他器官）控制VEGF的因素并不十分清楚2，6。识别与生理和病理VEGF调节有关的这些因素（氧气除外）是一项重要工作。
叶黄激素（LH），一种亲血管激素，有助于调节生殖器官（如卵巢和睾丸7、8）的生理VEGF表达。先前的研究已经提供了证据，LH也有助于调节非生殖器官的VEGF，如眼睛6，9，10。LH受体在肾的髓叶和皮层发现11，12。值得注意的是，肾管上皮细胞，以及LH受体，表达VEGF11，12，13，14。结合这两个观察，我们假设LH也有助于调节肾中的VEGF表达13，14。为了提供这种LH/VEGF关系的证据，提出的协议旨在表明LH水平能够预测肾脏中的VEGF水平。以前许多涉及肾脏的VEGF相关调查都使用了低阶哺乳动物模型（即啮齿动物和兔子）2。为了将这项工作转化为人体，该研究在高阶哺乳动物（这里，牛和猪模型）中考察了VEGF和LH之间的关系。为了达到这个目标，从牛和猪肾的皮层区域制备了总蛋白莱沙。
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Protocol
这项研究没有使用活体或实验动物。
1. 组织处理
- 从屠宰场屠宰后立即采购牛和猪全肾。冰上运输到实验室。
- 抵达实验室后，用50 mL的冰冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗肾脏。重复此步骤 2x 以完全清除血液。
- 将肾脏放在冰上（或冷藏），直到进一步提取。
2. 肾脏解剖
- 使用无菌剪刀、钳子、刀和培养皿解剖肾脏并切除所需的组织部分。
- 在肾脏切除前准备RIPA裂莱缓冲液。在双蒸馏水中溶解 5 mM NaCl、0.5 M EDTA、1 M Tris（pH = 8.0）、NP-40（ID = GEPAL CA-630）、10% 脱氧硫化钠和 10% SDS，然后彻底混合。不使用时冷藏 RIPA 裂液缓冲液。
- 轻轻地将肾脏切成两半（囊性平面），从肾脏中心皮层区域切出一块组织（50-70 mm2）（湿重重量为 80-100 mg）。
- 用刀将组织块切成小块，以帮助同质化过程。
- 切碎组织后，将它们转移到微熔管中，用1mL的冰冷1xRIPA裂化提取缓冲液。将管子放在冰上，直到进一步提取。
3. 组织均质化
- 用特定的样品细节标记微熔管，以便收集组织上清液。
- 使用带无菌探头的手持式均质器，然后在寒冷条件下（冰桶上的样品）将组织均质1-2分钟，直到看不到组织块。
- 立即将组织提取物置于冷冻离心机中，在9，600 x g下，在4°C下进行5分钟。
- 从离心机中取出管子，并将其放在冰桶上。
- 将上清液收集到新的标记微熔管中，并储存在冰上。丢弃颗粒。
- 分别为LH和VEGF-A酶链接免疫吸附测定（ELISA）和总蛋白分析制备单独的附分物，以避免冻融周期。
4. 牛和猪 LH ELISA Assay
- 将市售的叶黄素激素 （LH） ELISA 试剂盒（见材料表）中包括的所有 ELISA 测定成分储存在 2-8 °C。这包括抗体、HRP偶联物、测定板（96孔）、校准器、洗涤缓冲液（20x浓缩物）、基板A、基板B和停止溶液。按照制造商的说明，准备所有试剂。
- 在开始测定之前，将所有试剂和测定板带到室温（RT）。使用所需数量的井进行测定、密封，并将未使用的井保持在 4°C，直到使用。
- 用双蒸馏水将洗涤缓冲液（20x 浓缩液的 15 mL）稀释至 300 mL
- 设置空白井，无需任何解决方案。
- 向每口井（n = 2）添加50μL的标准或样品，然后向每口井再添加50μL的马萝卜过氧化物酶（hrp）偶联。立即向每个井中再添加 50 μL 的抗体溶液。密封板，混合好，并在37°C下孵育1小时。
- 用1x洗涤缓冲液（200 μL/井）清洗水井，然后重复4倍。
- 在每个孔中加入50μL的基板A和50μL的基板B，轻轻敲击侧面的板，将混合均匀。密封板，在黑暗中37°C孵育15分钟。
- 在每个孔中加入 50 μL 的停止溶液，轻轻轻敲板，并使用设置为 450 nm 波长的分光光度计读取板。
- 使牛和猪LH水平正常化至总蛋白质（见第6节）。
5. 牛和猪VEGF-A ELISA测定
- 将市售的血管内皮生长因子-A ELISA试剂盒（见材料表）中包括的所有ELISA测定成分储存在2-8°C。这包括抗体、HRP偶联物、测定板（96孔）、校准器、洗涤缓冲液（20x浓缩物）、基板A、基板B和停止溶液。按照制造商的说明，准备所有试剂。
- 在开始测定之前，将所有试剂和测定板带到RT.使用所需数量的孔进行测定、密封，并将未使用的孔保持在4°C，直到使用。
- 用双蒸馏水将洗涤缓冲液（20x 浓缩液的 15 mL）稀释至 300 mL
- 将标准或样品的 100 μL 添加到每个井（n = 2）。密封板，混合好，并在37°C下孵育2小时。
- 取出每口孔中的液体，在每个孔中加入100 μL检测试剂A，密封板，并在37°C下孵育1小时。
- 用1x洗涤缓冲液（400 μL/井）清洗水井，然后重复4倍。
- 在每个孔中加入100 μL检测试剂B，轻轻敲击侧面的板，将混合良好。密封板并在 37°C 下孵育板 1 小时。
- 用1x洗涤缓冲液（400 μL/井）清洗水井，然后重复4倍。
- 在每个孔中加入90μL的基板溶液，轻轻敲击板，在37°C下孵育1小时。
- 在每个孔中加入 50 μL 的停止溶液，轻轻轻敲板，并使用设置为 450 nm 波长的分光光度计读取板。
- 使牛和猪VEGF-A水平正常化至总蛋白质（第6节）。
6. 总蛋白质估计
- 根据制造商的建议，使用商业试剂盒（参见材料表）使用标准牛血清白蛋白 （BSA） 测定牛和猪肾提取物的总蛋白质。
7. 统计分析
- 计算每个anlyate的均值、中位数和标准偏差。
- 测试样品分布与正态利用科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫测试的背离，以决定参数与。非参数统计测试。如果数据是正态分布的，则通过参数测试执行统计测试。
- 在适当情况下（如正态数据分布），利用回归模型检查 LH 和 VEGF-A 之间的线性关系。
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Representative Results
按动物类型和性别分列的LH和VEGF的平均值和中位数显示在表1中。在用科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫的正态测试验证了数据的正态性后，利用线性回归模型来检验LH和VEGF之间的关系。LH在牛和猪肾脏中是VEGF的强而显著的预测剂（牛肾模型：n = 7，R2 = 0.86，p = 0.002;猪肾模型：n = 7;R2 = 0.66，p = 0.025）。
LH/VEGF 线性关系如图1（牛回归模型）和图 2（猪回归模型）所示。牛线性方程如下：VEGF电平 = 2.156 x LH 电平 = 68.75。猪线性方程如下：VEGF电平 = 196.7 x LH 电平 = 47.94。
| 样品类型 | 男性 | 女性 | 所有 |
| 牛肾 | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH（mIU/mg总蛋白） | 平均： 27.47 （SD 13.3） | 平均： 19.5 （SD 2.1） | 平均： 24.06 （SD 10.8） |
| 中位数： 25.7 | 中位数： 19.9 | 中位数： 19.9 | |
| VEGF（pg/mg总蛋白） | 平均： 126.2 （SD 25.8） | 平均： 106.0 （SD 14.5） | 平均： 120.6 （SD 25.1） |
| 中位数： 131.6 | 中位数： 103.5 | 中位数： 110.8 | |
| 猪肾 | n = 4 | n = 3 | n = 7 |
| LH（mIU/mg总蛋白） | 平均： 13.2 （SD 3.6） | 平均： 12.3 （SD 5.5） | 平均： 12.8 （SD 4.5） |
| 中位数： 13.6 | 中位数： 10.3 | 中位数： 11.2 | |
| VEGF（pg/mg总蛋白） | 平均： 2987.2 （SD 772.5） | 平均： 2354.1 （SD 932.4） | 平均： 2715.9 （SD 901.0） |
| 中位数： 3324.67 | 中位数： 2377.3 | 中位数： 3226.4 |
表1：按动物类型和性别分列的LH和VEGF水平平均值和中位数。
图1：成年牛肾的LH/VEGF线性关系（n = 7）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：成人猪肾的LH/VEGF线性关系（n = 7）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
动物死亡后立即从屠宰场获取肾脏是这种方法成功的关键。这是利用牛和猪器官而不是人类尸体的主要优势。通常从死亡时间到人类尸体器官被采购至少需要12-24小时。由于人体器官的化学成分在15日2小时内发生显著变化，16日，人类尸体肾脏的VEGF研究可能并不反映真实情况。尽管该议定书非常强调在提取动物器官后立即采购和放置在冰上的重要性，但不知道其他研究人员是否也优先考虑这一步骤。例如，最近一项研究的方法部分（利用牛和猪肾检测抗生素残留物）没有具体说明动物死亡与器官采购/冷藏之间的时间延迟17。
这项研究用商业上可用的、物种特定的ELISA测量感兴趣的分析物（VEGF和LH）。ELISA高度敏感，易于进行检测，并产生可靠的结果18。该协议的一个关键步骤是（ELISA测量的）由总蛋白质对酶酸盐水平的规范化。皮质肾提取物是一种高度异质的生物物质。鉴于此，校正因子至关重要，以便动物之间的麻醉剂水平可以进行比较。因此，通过总蛋白进行标准化，因为我们和其他人已经成功地以同样的方式使其他异质生物物质（如尿液、干血斑和葡萄球体）正常化9，19，20。
先前的研究表明，在葡萄干液（来自牛和猪眼）中的LH和VEGF之间的相关性只有在总蛋白6正常化后才会显现出来。重要的是，在已发表的VEGF研究中，特别是在涉及ELISA检测的研究中，经常省略这种规范化步骤。相反，VEGF水平通常以单位表示，如每毫升的pigram（而不是每毫克总蛋白质的皮克）。例如，在九个不同的ELISA研究中（包含在vitreveGF审查文章中）中，任何修正方法21、22均没有对vitreVEGF测量进行归化。ELISA研究中缺乏VEGF正常化可能部分解释为什么VEGF尚未被验证为有效的生物标志物21，22。
尽管代表性数据的样本量有限（牛，n = 7;猪，n = 7），但该协议表明，牛和猪肾中的LH和VEGF之间存在强而显著的线性关系。也就是说，样本量不足以执行根据性别调整的多变量分析。我们计划以较大的样本大小重复此研究，以便进行此类分析。然而，所提出的结果支持了哺乳动物肾脏中的LH和VEGF之间的潜在关联。
预计这项工作将有助于进一步理解肾脏VEGF的静时调节。该方法的质量和结果的鲁棒性都通过两个不同物种结果的可重复性得到说明。由于用于肉类生产的动物是健康的，使用屠宰场动物的肾脏提取物主要用于研究生理学;然而，他们的器官对研究病理学没有多大帮助，这是它们使用的主要限制。总之，使用牛和猪的肾提取物是研究正常成人肾脏的优良、经济、丰富的资源。最后，该协议演示了利用总蛋白进行规范化的有效性，特别是在检查VEGF与其他分析物之间的相关性时。
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Disclosures
Zietchick研究所（ZRI）是一个私营（营利性）研究机构，Tammy Movsas博士（ZRI的创始人和主任）拥有一项正在申请的专利申请和经验证的专利，用于治疗眼病的促性腺激素拮抗剂和糖尿病。除了是ZRI的员工（生物化学家），A.Muthusamy博士没有其他财务冲突要报告。A. Arivalagan（ZRI暑期实习生，密歇根大学本科生）没有其他财务冲突要报告。
Acknowledgments
作者感谢肖尔的屠宰场（布利斯菲尔德，MI）提供牛和猪肾。这项研究没有利用赠款资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
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