Summary
الغرض من هذا البروتوكول هو تقييم ما إذا كانت تركيبات التمزق الاصطناعي المختلفة يمكن أن تحمي الخلايا الظهارية القرنية البشرية من الجفاف باستخدام نموذج في المختبر. بعد التعرض لمستحضرات المسيل للدموع الاصطناعية و المجففة، يتم تقييم الخلايا الظهارية القرنية البشرية للنشاط الأيضي.
Abstract
يتم تطوير تركيبات المسيل للدموع الاصطناعية المحتوية على الدهون للحد من تبخر المسيل للدموع عن طريق استعادة طبقة الدهون المسيل للدموع ناقصة. سوف تركيبات المسيل للدموع الاصطناعية التي تمنع الجفاف الخلية يؤدي إلى حماية سطح العين والحفاظ على النشاط الأيضي الخلية. أثناء الجفاف ، تخضع الخلايا لعملية فقدان النشاط الأيضي وموت الخلايا في وقت لاحق. يصف هذا العمل طريقة لتقييم فعالية تركيبات المسيل للدموع الاصطناعية. الصبغة الأيضية (أي ألاماربلو) تتغير من جزيء فلوري منخفض ريسازورين إلى جزيء فلوري ريسوروفين في خلايا قابلة للحياة. يتم قياس الأداء البيولوجي لصياغة المسيل للدموع الاصطناعية بقدرة التركيبة على (أ) الحفاظ على صلاحية الخلية و (ب) توفير حماية الخلية من الجفاف. تستخدم وسائط النمو والمحلول الملحي كعناصر تحكم لاختبارات قابلية الخلية للحياة/الجفاف. يتم احتضان الخلايا بمحلول اختبار لمدة 30 دقيقة ثم تحل لمدة 0 أو 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ورطوبة نسبية بنسبة 45٪. ثم يتم تحديد النشاط الأيضي الخلية بعد التعرض الأولي وبعد الجفاف الخلية. تظهر النتائج الآثار المقارنة لصياغات قطرة العين على النشاط الأيضي للخلايا وحماية الجفاف. يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار تركيبات العين الجافة المصممة لعلاج الأفراد الذين يعانون من جفاف العين التبخرية.
Introduction
هناك حاجة إلى العديد من المكونات المختلفة في حلول العيون متعددة الجرعة للحفاظ على الاستقرار، وhh، osmolarity، والفعالية. ومع ذلك، يمكن أن تسبب بعض المواد الكيميائية مثل المواد الحافظة أو المواد الخافرة لل سطح الماء في المحاليل العينية تلفا لظهارة القرنية1،2. يمكن إجراء اختبارات صلاحية الخلية باستخدام الخلايا الظهارية القرنية البشرية (HCEC) لتقييم الأضرار المحتملة الناجمة عن هذه المكونات المختلفة في تركيبات العيون. واحدة من المقايسات في المختبر التي هي مفيدة بشكل خاص لتقييم تلف الخلية هو الفحص alamarBlue3. في هذا المقايسة، تحتوي الصبغة الأيضية (أي alamarBlue) على ريسازورين، الذي يعمل كمؤشر على صلاحية الخلية. خلال التنفس الخلوي، يتم تقليل ريساسورين إلى ريسوروفين عن طريق قبول الإلكترونات4. انخفاض ريسوروفين يسبب تغييرا من جزيء غير الفلورسنت إلى جزيء الفلورسنت التي يمكن الكشف عنها باستخدام مقياس الطيف5.
يستخدم هذا التحقيق علاجين مختلفين للخلايا الظهارية القرنية لتحديد كيفية أداء منتجات العين الجافة في نموذج المختبر. في التقييم الأول ، يتم التعامل مع الخلايا مع هذه المنتجات لمدة 30 دقيقة. بعد العلاج ، يتم تقييم الخلايا بعد ذلك للنشاط الأيضي مباشرة بعد التعرض لمنتجات العين الجافة وبعد فترة زمنية للتعافي. يحدد هذا التقييم تأثير هذه المنتجات على الخلايا قبل الجفاف في غرفة الرطوبة. قد يكون للمواد الحافظة للحل أو المواد الخافضة للكتل أو المخازن المؤقتة في هذه الحلول بعض الآثار السامة للخلايا على الخلايا التي يمكن اكتشافها باستخدام الصبغة الأيضية.
يحدد التقييم الثاني النشاط الأيضي للخلايا بعد التعرض لمنتجات العين الجافة والجفاف. في هذا التقييم، إذا كان علاج المنتج يوفر الحماية للخلايا من تلف الجفاف، سيتم الحفاظ على النشاط الأيضي للخلايا. قد تحدث حماية الخلية من الآثار الضارة للجفاف إذا كان منتج العين الجافة يمكن أن يغطي الخلايا بالدهون أو قد يمتص المنتج السائل من المناطق المحيطة مما يضيف الرطوبة إلى الخلايا.
تم تصميم هذا البروتوكول لمحاكاة الظروف القاسية من الإجهاد البيئي على الخلايا. وقد استخدمت دراسات أخرى نماذج مختلفة لخلق هذا الإجهاد الخارجي. وقد جفت بعض الدراسات الخلايا في أغطية تدفق صفح6،7،8، في حين أن البعض الآخر قد استخدمت درجة حرارة الغرفة والرطوبة النسبية المختلفة (RH) قيم9،10،11. وهناك طريقة لمحاكاة ظروف جفاف العين لزيادة osmolarity من الحل حضانة12،13. طريقة أخرى في المختبر لمحاكاة الظروف البيئية السلبية هي إضافة السيتوكينات إلى وسائط الخلية لمحاكاة السائل المسيل للدموع لمرضى العين الجافة14. على الرغم من أن هذه الاختبارات هي نماذج مثيرة للاهتمام التي يمكن تقييم كيفية المواد الكيميائية الحد من الإجهاد التناضح أو تحفيز الجهاز المناعي، وهذه النماذج لا تظهر مباشرة كيف تركيبات كيميائية يمكن أن تحمي الخلايا من الإجهاد الجفاف.
يستخدم نموذج الجفاف غرفة درجة الحرارة / الرطوبة 37 درجة مئوية و 45٪ RH. وهو يحاكي الظروف البيئية التي يمكن أن تسبب التبخر من سطح العين. ويمكن أيضا محاكاة الظروف البيئية المتطرفة الأخرى مثل الرطوبة المنخفضة الموجودة في كابينة الطائرة15 أو في البيئات الداخلية خلال أشهر الشتاء16 يمكن القيام به باستخدام هذه الطريقة.
يتم استخدام نمذجة ثقافة الخلية لمحاكاة تأثير الإجهاد الجفاف على القرنية البشرية. من أجل الكشف عن إجهاد الخلايا، يتم إجراء اختبار صلاحية الخلية لتحديد التأثير على صحة الخلية. يمكن إجراء العديد من الاختبارات الفسيولوجية المختلفة على الخلايا لتحديد ما إذا كانت وشدد17. يستخدم التحليل الذي تم إجراؤه في إجراء الاختبار هذا الصبغة الأيضية المتاحة تجاريا(جدول المواد). لديها ميزة على العديد من اختبارات الإجهاد الخلية الأخرى في أنه غير سامة, قابل للذوبان في وسائل الإعلام النمو ويمكن تقييم الخلايا دون تثبيت الخلية18. في هذا الإجراء يتم اختبار الخلايا للنشاط الأيضي مباشرة بعد كل علاج ويتم وضع مجموعة ثانية من الخلايا مرة أخرى في وسائل الإعلام النمو وتقييمها بعد 18 ساعة الانتعاش. السبب في اختبار فورا وبعد ذلك بعد فترة نقاهة هو تحديد تلف الخلايا التي تسبب آثارا فورية على النشاط الأيضي وتلف الخلايا التي تسبب آثار تأخر. كما أنه يتيح فرصة لتقييم تأثير هذه التركيبات على الضرر القصير الأجل مقابل الضرر الطويل الأجل وقدرة التركيبات على التعافي/عدم التعافي من الإهانة الأولية.
يستخدم هذا التحقيق لمقارنة مختلف منتجات العين الجافة المحتوية على الدهون لتأثيرها على النشاط الأيضي HCEC مع وبدون جفاف. المكونات في منتجات العين الجافة اختبارها هي موضحة في جدول المواد. المكونات في الحل #1 هي كاربوكسي ميثيلسليلوز الصوديوم (0.5٪)، الجلسرين (1٪)، والبوليسوربات 80 (0.5٪)، في حل #2 أنها زيت معدني خفيف (1.0٪) والزيوت المعدنية (4.5٪)، وفي حل #3 الدهون هو النفط المعدني وبروبيلين غليكول هو demulcent. هذه الدهون هي مكونات التركيب التي يتوقع أن توفر حماية من HCEC من الجفاف.
Protocol
1. الإنسان القرنية الظهارية ثقافة الخلية
- تنمو الخالدة HCEC19 في الكولاجين المغلفة 75 سم2 قوارير مع 20 مل من دولبيكو تعديل النسر المتوسطة / خليط المغذيات F-12 (DMEM/F12) تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / ستريبتوميسين في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
ملاحظة: الاهتزاز غير مطلوب. - تغيير الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام.
2. إعداد الخلايا للاختبار
- بعد الخلايا هي التقاء تقريبا إزالة وسائل الإعلام الثقافة.
- أضف 4−6 مل من محلول فصل الخلية لكل قارورة2 75 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا (حوالي 20-30 دقيقة)، وتتحقق تحت المجهر بشكل دوري.
- أضف 2−6 مل من DMEM/F12 تحتوي على 10٪ FBS لكل قارورة2 سم 75 سم.
- نقل محتويات القارورة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
- طاردة مركزية الخلايا في 450−500 x g لمدة 5 دقائق. Pipet من supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في وسائل الإعلام قبل الاحماء.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. حساب حجم الوسائط التي تحتوي على إجمالي 1 × 105 خلايا.
- إضافة 1 × 105 خلايا إلى كل بئر من 48 جيدا الكولاجين-1 طبق الثقافة المغلفة. إضافة ما يكفي من وسائل الإعلام إلى البئر بحيث الحجم النهائي من وسائل الإعلام في البئر هو 0.5 مل من الثقافة DMEM/F12 مع 10٪ FBS.
ملاحظة: قد تسبب تركيبة المسيل للدموع الاصطناعية السمية الخلوية التي يمكن قياسها عن طريق انخفاض في النشاط الأيضي لHCEC. يعتمد اتساق البيانات على إضافة نفس العدد من HCEC إلى كل بئر عند البذر. تركيز الثقافة الموصى به ل48 لوحات البئر هو 1 × 105. لأن خلايا الثدييات يمكن أن تستقر في أنبوب الطرد المركزي بعد إعادة الإنفاق، فمن المستحسن إعادة إنفاق الخلايا عن طريق التحريض في كثير من الأحيان في حين بذر لوحات مع الخلايا بحيث تعليق الخلية لديه HCEC موزعة بالتساوي. - احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
3. لا يوجد بروتوكول للتكف
- إجراء التحكم
- بعد الحضانة 24 ساعة إزالة وسائل الإعلام الثقافة من لوحة.
- علاج على الفور مع 150 ميكرولتر من صياغة اختبار والوسائط حل السيطرة.
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
- إزالة حلول الاختبار من الخلايا.
- إضافة 0.5 مل من محلول صبغة التمثيل الغذائي 10٪ لاختبار النشاط الأيضي. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- بعد فترة الحضانة 4 ساعة، وإزالة 100 ميكرولتر من محلول صبغ الأيض من كل بئر ووضع كل 100 ميكرولتر في بئر من لوحة بئر 96.
- قياس مضان كل بئر باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت(جدول المواد). تعيين الطول الموجي الإثارة في 540 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات في 590 نانومتر.
- لا يوجد بروتوكول للكف (إجراء الاسترداد)
- كرر الخطوات 3.1.1−3.1.4.
- إضافة 0.5 مل من وسائط DMEM/F12 إلى كل بئر.
- احتضان مجموعة واحدة من الثقافات لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- إزالة وسائل الإعلام وإضافة 0.5 مل من محلول صبغ الأيض 10٪. كرر الخطوتين 3.1.6 و3.1.7.
4. بروتوكول إزالة التشتيت
- إجراء التحكم
- بعد الحضانة 24 ساعة (الخطوة 2.8)، إزالة وسائل الإعلام الثقافة من لوحة.
- علاج على الفور مع 150 ميكرولتر من صياغة اختبار والوسائط حل السيطرة.
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
- إزالة حلول الاختبار من الخلايا.
- ضع الخلايا في غرفة RH 37 درجة مئوية و 45٪ لمدة 5 دقائق لجفف الخلايا.
- إضافة 0.5 مل من محلول صبغة التمثيل الغذائي 10٪ لاختبار النشاط الأيضي. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- بعد فترة الحضانة 4 ساعة، وإزالة 100 ميكرولتر من محلول صبغ الأيض من كل بئر ووضع كل 100 ميكرولتر في بئر من لوحة بئر 96.
- قياس مضان كل بئر باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت. تعيين الطول الموجي الإثارة في 540 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات في 590 نانومتر.
- إجراء الاسترداد
- كرر الخطوات 4.1.1-4.1.5.
- إضافة 0.5 مل من وسائط DMEM/F12 إلى كل بئر.
- احتضان مجموعة واحدة من الثقافات لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- إزالة وسائل الإعلام وإضافة 0.5 مل من محلول صبغ الأيض 10٪. كرر الخطوتين 4.1.7 و4.1.8.
5. تحليل البيانات
- حساب متوسط الفلورسينس من السيطرة على وسائل الإعلام. حساب نسبة صلاحية العينة باستخدام الصيغة التالية:
نسبة صلاحية العينة = مضان عينة الاختبار / مضان التحكم في الوسائط × 100
ملاحظة: متوسط التحكم في الوسائط 100٪ البقاء. الصبغة الأيضية في حد ذاتها لديها كمية صغيرة من الفلورسينس المرتبطة به. يمكن طرح مضان كاشف الصبغة الأيضية من مضان عينة التحكم والاختبار قبل حساب ٪ صلاحية عينات الاختبار إلى التحكم في الوسائط. - إجراء اختبار طبيعي واختبار الفروق المتساوية على نماذج عنصر التحكم والاختبار.
- إذا كان اختبار عادي يمر والتباينات متساوية ثم تنفيذ ANOVA في اتجاه واحد. لتحديد الاختلافات الهامة بين مجموعات محددة إجراء مقارنات ثنائية بعد اختبار مخصص (أي اختبارات المقارنات المتعددة ل Tukey أو Dunnett).
- إذا كان اختبار طبيعي يمر والفروق مختلفة ثم تنفيذ ANOVA ويلش. لتحديد الاختلافات الهامة بين مجموعات محددة إجراء مقارنات pairwise اختبار ما بعد مخصص (أي Dunnett أو ألعاب هاويل اختبارات مقارنات متعددة).
- إذا فشل اختبار التطبيع استخدام اختبار غير قياسي (أي اختبار كروسكال واليس). لتحديد الاختلافات الهامة بين مجموعات محددة إجراء مقارنات pairwise اختبار ما بعد مخصص (أي، اختبار دان).
Representative Results
تظهر نتائج دراسة تقارن ثلاث تركيبات للعين الجافة في الشكل 1. ويبين هذا الرقم أن هناك اختلافات في تأثير المنتجات الثلاثة، #1 الحل، #2 الحل والحل #3(جدول المواد)على صلاحية HCEC. كان #1 الحل والحل #2 تأثير كبير على النشاط الأيضي ل HCEC قبل الجفاف. وهذا يعني أن هناك مكونات صياغة في هذه المنتجات التي يمكن أن تعطل النشاط الأيضي للHCEC. انخفاض إضافي في النشاط الأيضي الخلية التي وقعت بعد 18 ساعة من الانتعاش من الخلايا المعرضة للحل #1 يدل على أن HCEC أصيب في البداية وبعد 18 ساعة لم يتم إصلاح الإصابة. وبالمقارنة، لم يكن للحل #3 سوى تأثير خفيف على النشاط الأيضي ل HCEC.
ويبين الشكل 2 تأثير تركيبات العين الجافة المحتوية على الدهون على حماية الخلايا. مع ما يقرب من 0٪ النشاط الأيضي HCEC في الفاصل الزمني الانتعاش 18 ساعة، حل #1 والحل #2 لم تحمي الخلايا من الإجهاد الجفاف. غير أن #3 الحلول يوفر بعض الحماية من إجهاد الجفاف.
الشكل 1: تأثير جفاف العين الدهون تعزيز المنتجات على صلاحية الخلية. قابلية البقاء النسبية التي تقاس النشاط الأيضي HCEC بعد العلاج مع منتجات العين الجافة التي تحتوي على الدهون. * = الأهمية الإحصائية (ص < 0.05) بالنسبة إلى الحل #3، Δ = الأهمية الإحصائية (ص < 0.05) بالنسبة للسيطرة وسائل الإعلام لفترة الاسترداد المناسبة. يمثل ارتفاع الشريط القيمة المتوسطة، وقضبان الخطأ هي SD. الرجاء النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تأثير جفاف العين الدهون تعزيز المنتجات على حماية الجفاف. تأثير تركيبات العين الجافة المحتوية على الدهون على حماية الخلايا. لم #1 الحل والحل #2 الخلايا من إجهاد الجفاف ، ولم تتعافى من آثار الجفاف بمرور الوقت. وعلى النقيض من ذلك، #3 يوفر الحل بعض الحماية ضد إجهاد الجفاف. * = p < 0.05 بالنسبة إلى #3 الحل، و Δ = p < 0.05 بالنسبة إلى الوسائط غير المعالجة (التحكم) لوقت الاسترداد المناسب. يمثل ارتفاع الشريط القيمة المتوسطة، وقضبان الخطأ هي SD. الرجاء النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الشكل.
Discussion
تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد الآثار الوقائية لحلول المسيل للدموع الاصطناعية ضد الجفاف الخلية. في البداية ، تتعرض الخلايا لقطرات العين الجافة لتغطية الخلايا. بعد ذلك ، يتم تجفيف الخلايا ، ويتم مراقبة النشاط الأيضي لتقييم ما إذا كانت التركيبات يمكن أن تخفف من الآثار الضارة لإجهاد الجفاف. هذه الخطوات حاسمة لفهم التأثير العام لصياغات العين الجافة يمكن أن يكون على الجدوى الشاملة للخلايا الظهارية القرنية.
بعد إزالة معظم تركيبات العين الجافة من آبار الثقافة ، ستؤثر كيمياء الجزيئات المتبقية التي تتلامس مع الخلايا على جفاف الخلايا. بعض المنتجات تحتوي على مستحلبات صغيرة من الزيوت التي تقلل من تبخر الخلايا20. أظهرت دراسة قيمت تحليل الاحتكاك بعد الشطف الحفاظ على الاحتكاك المنخفض لبعض تركيبات العين الجافة التي قد تكون مؤشرا على وقت الإقامة المعزز لصياغات العين الجافة21. أحد القيود المفروضة على هذا الفحص هو أنه على الرغم من أنه يمكن تقييم حماية الجفاف بالمقارنة مع تركيبات قطرة العين الأخرى ، لا يمكن تحديد مدة هذه الحماية بسبب وقت التجفيف القصير الذي تم تقييمه. قد تتطلب أوقات التجفيف الأطول في هذا الفحص المختبري استخدام ثقافات متعددة الطبقات تحتوي على محتوى رطوبة أكثر بشكل عام من طبقة أحادية الخلية.
قد تحتاج أوقات الحضانة المحددة للصياغات على الخلايا ومدة وقت التجفيف إلى تعديل إذا تم تغيير قيم درجة الحرارة والرطوبة. اختيار درجة الحرارة، RH وتدفق الهواء لمحاكاة ظروف الإجهاد البيئي التي يمكن أن تسهم في جفاف العين يمكن أن يكون صعبا كما الظروف البيئية الموسمية والمحلية هي متغيرة جدا21. غرف البيئة الحديثة للدراسات البشرية يمكن أن تختلف درجة الحرارة بين 5 °C و 35 °C ، وRH بين 5٪ و 95٪22. باستخدام مقياس إيفابوريمتر ونظارات واقية مجهزة بإحكام تقرر أنه في RH من 40−45٪ كان معدل التبخر من القرنية 0.037 ميكرولتر / سم2/ دقيقة وفي RH من 20−25٪ كان معدل التبخر 0.065 ميكرولتر / سم2/ دقيقة23. إذا كان النموذج في المختبر يبحث في التأثير الوقائي للتركيبات في ظل ظروف RH منخفضة للغاية كما هو الحال في الطائرات15، الصحاري ، أو البيئات الداخلية الجافة16، قد تحتاج أوقات الحضانة إلى تقليلها لاستيعاب معدلات التبخر المحسنة من الخلايا. في السائل المسيل للدموع البشرية، ومجموعة متنوعة من الدهون المستمدة من الغدد الميبومية وغيرها من الغدد موجودة التي تحمي الدموع من التبخر. هذه الدهون لها نقاط انصهارمختلفة 24. يمكن أن تؤثر التغيرات في درجة الحرارة على سيولة السائل المسيل للدموع بحيث يمكن أن يكون للاختبارات التي أجريت في درجة الحرارة المحيطة معدلات تبخر مختلفة بشكل كبير عن الاختبارات التي أجريت عند 37 درجة مئوية. نظرا لأن متوسط درجة حرارة سطح العين يتراوح من 32.9 إلى 36 درجة مئوية25، يوصى بإجراء الاختبار بالقرب من نطاق درجة الحرارة هذا.
بالإضافة إلى الصبغة الأيضية (alamarBlue) المستخدمة في هذا البروتوكول ، هناك كواشف كيميائية أخرى يمكن استخدامها لتقييم آثار تركيبات المنتج على نشاط التمثيل الغذائي للخلايا. أملاح رباعية الزوليوم (MTT، XTT، MTS، WST) هي مواد كيميائية بديلة يمكن استخدامها. الفرق في أملاح رباعية الزوليوم هو أن MTT هو جزيء مشحون بشكل إيجابي حتى يتمكن من دخول السيتوبلازم من الخلايا الحية26. MTT يصبح غير قابل للذوبان بعد تخفيضه من قبل NAD (P)H27. يجب أن يكون solubilized قبل امتصاص القراءة على قارئ لوحة. أما أملاح التترازوليوم الأخرى فهي مشحونة سلبيا28. يجب تخفيضها بواسطة جزيئات ثانوية خارج الخلية الحية لأنها لا تستطيع دخول الخلية والتفاعل مباشرة مع الجزيئات داخل الخلايا29. بالنسبة ل XTT و MTS و WST-1 ، يمكن لإضافة عامل اقتران إلكترون 1-methoxy phenazine methosulfate (PMS) تحسين أداء المقايسات30. على النقيض من المقايسات الأيضية التي تستخدم أملاح التترازوليوم ، لا يتطلب alamarBlue عوامل إضافية للتشحيم أو اقتران الإلكترون. أيضا، على عكس XTT، MTS أو WST-1، alamarBlue تخترق أغشية الخلايا ويمكن تخفيضها مباشرة عن طريق الإنزيمات الخلوية27،29. وقد أظهرت المقارنة المباشرة من alamarBlue لأملاح tetrazolium أن alamarBlue هو أكثر حساسية لتقييم النشاط الأيضي من خطوط الخلية المختلفة بما في ذلك HCEC3،27،31،32.
ويمكن أيضا النظر في نقاط النهاية الكيميائية الحيوية الأخرى لتقييم حماية الخلايا الظهارية القرنية البشرية عن طريق الجفاف. يمكن استخدام الأصباغ الفلورية للكشف عن نفاذية غشاء الخلية ونشاط استراز الخلية1. أيضا، يمكن الكشف عن موت الخلايا المبرمج عن طريق تلطيخ لعلامات المبرمج على سطح الخلية أو عن طريق قياس لنشاط caspase1،33. وقد حددت المقايسات الأخرى آثار منتجات العيون على تقاطعات ضيقة HCEC34. ويمكن إدراج هذه المقايسات في التقييمات المقبلة باستخدام إجراءات الجفاف الموصوفة في هذه المادة.
هناك العديد من أسباب جفاف العين. يمكن أن يكون سبب جفاف العين انخفاض إفراز الدموع، وزيادة التهاب سطح العين أو زيادة الجفاف على سطح العين. بالنسبة للأفراد الذين لديهم استخدام العين الجافة التبخر من قطرة العين الجافة التي تمنع خلاياهم من التجفيف أثناء ظروف الجفاف قد تخفف من أعراض جفاف العين. واحدة من المشاكل في بعض تركيبات العين الجافة هو وجود المواد الحافظة التي قد تضر سطح العين. إصابة الخلايا ليست مفيدة لمرضى جفاف العين لأنها يمكن أن تسبب المزيد من الخلايا للموت والخلايا المصابة هي أكثر عرضة للإجهاد الجفاف35.
مقالة استعراض حديثة من Garrigue et al.36 تقدم تقييما للمعرفة الحالية لكيفية عمل المنتجات القائمة على الدهون لتخفيف جفاف العين التبخرية. إضافة الدهون إلى الدموع ناقصة الدهون يمكن أن تمنع التبخر، وبالتالي حماية الخلايا من الجفاف. وبالإضافة إلى ذلك، humectants هي الجزيئات التي تجذب وتحتفظ المياه على سطح العين37. كل من الجلسرين في حل #1 وبروبيلين غليكول في الحل #3 هي humectants. وأظهرت #3 الحل تأثير وقائي أكبر من HCEC التي قد تكون ناجمة عن خصائص الدهون وhumectant من المكونات صياغة.
تم تصميم هذا البروتوكول لتقييم النشاط الأيضي لHCEC بعد التعرض لمستحضرات العين الجافة والإجهاد الجفاف. باستخدام الأساليب الموصوفة في هذه المقالة، يمكن تطوير قطرات العين غير المهتضبة والوقائية الجديدة للأشخاص الذين يعانون من جفاف العين التبخرية.
Disclosures
ثلاثة مؤلفين (ريكا رانجاراجان، هوارد أ. كيتلسون، لاكشمان سوبارامان) هم من موظفي ألكون. ألكون هي المصدر الوحيد لتمويل ورعاية هذا المشروع. ليندون جونز ، على مدى السنوات ال 3 الماضية ، تلقت الدعم البحثي أو المحاضرات الفخرية من الشركات التالية : ألكون ، Allergan ، كونتاماك ، CooperVision ، GL Chemtec ، Inflamax البحوث ، J J الرؤية ، Menicon ، طريقة الطبيعة ، نوفارتيس ، PS العلاج ، سانتن ، شيري ، SightGlass وVisioneering. ليندون جونز هو أيضا مستشار و / أو يعمل في مجلس استشاري لشركة ألكون، كوبرفيجن، J & J الرؤية، نوفارتيس وOphtecs. القائمة التالية من المؤلفين ليس لديهم ما يكشف: ريتشارد دو، ديفيد ماكانا، أديلين سوكو، داريل إنستون، جايا دانتام.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون ألكون على تقديم الدعم المالي لهذه الدراسات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES | Gibco | 11039-021 | There is No Phenol Red in this media |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72. |
| Humidity/Temperature Chamber | Associated Environmental Systems | LH-1.5 | Economy Line Humidity Chamber |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media |
| Refresh Optive Advanced (solution #1) | Allergan, Inc | Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH. | |
| Soothe XP (solution #2) | Bausch & Lomb | Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH). | |
| Systane Complete (solution #3) | Alcon Inc. | Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH. | |
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Maurer, J. K., et al. Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy. Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).
- Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).
- Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity. Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation. Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).
- Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells. Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).
- Ubels, J. L., et al. Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent. Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).
- Hovakimyan, M., et al. Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium. Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).
- Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration. Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).
- Matsuo, T. Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying. British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).
- Zheng, Q., et al. Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients. Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).
- Hua, X., et al. Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).
- Schulze, U., et al. Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).
- Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights. Building and Environment. 67, 69-81 (2013).
- van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).
- Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).
- Zachari, M. A., et al. Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments. Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Benelli, U. Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness. Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).
- Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health. Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).
- Calonge, M., et al. Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research. Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).
- McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. Impact of evaporation on aqueous tear loss. Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).
- Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. Functional aspects of the tear film lipid layer. Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).
- Purslow, C., Wolffsohn, J. S. Ocular surface temperature: a review. Eye & Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
- Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Rampersad, S. N. Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays. Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).
- Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro. Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).
- Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).
- Uzunoglu, S., et al. Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol). Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).
- McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716 (2015).
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F.
- Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).
- Lievens, C., et al. Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study. Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).
