Summary
Descrevemos um método de indução de raízes peludas pela transformação mediada pelo Agrobacterium rhizogenesno trigo-sarraceno tartary(Fagopyrum tataricum). Isso pode ser usado para investigar funções genéticas e produção de metabólitos secundários em trigo sarraceno tartary, ser adotado para qualquer transformação genética, ou usado para outras plantas medicinais após a melhoria.
Abstract
O trigo-sarraceno tartary (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possui várias atividades biológicas e farmacológicas porque contém metabólitos secundários abundantes, como flavonoides, especialmente rutina. Os rizógeness agrobacterium têm sido gradualmente usados em todo o mundo para induzir raízes peludas em plantas medicinais para investigar funções genéticas e aumentar o rendimento de metabólitos secundários. Neste estudo, descrevemos um método detalhado para gerar raízes peludas mediadas por A. Rhizogenesna TB. Cotyledons e eixo hipocotyledonary em 7-10 dias foram selecionados como explants e infectados com A. rizogenes carregando um vetor binário, que induziu raízes peludas aveniosas que apareceram após 1 semana. A transformação da raiz peluda gerada foi identificada com base na morfologia, seleção de resistência (kanamicina) e expressão genética de repórter (proteína fluorescente verde). Posteriormente, as raízes peludas transformadas foram auto-propagadas conforme necessário. Enquanto isso, um fator de transcrição da mieloblastose (MYB), FtMYB116, foi transformado no genoma da TB usando as raízes peludas mediadas por A. rhizogenespara verificar o papel do FtMYB116 na sintetização dos flavonoides. Os resultados mostraram que a expressão de genes flavonoides e o rendimento de compostos flavonoides (rutina e quercetina) foram significativamente (p < 0,01) promovidos por FtMYB116, indicando que as raízes peludas mediadas por A. rhizogenespodem ser usadas como uma ferramenta alternativa eficaz para investigar as funções genéticas e a produção de metabólitos secundários. O protocolo detalhado passo a passo descrito neste estudo para a geração de raízes peludas pode ser adotado para qualquer transformação genética ou outras plantas medicinais após o ajuste.
Introduction
O trigo-sarraceno tartary (TB)(L.) Gaertn é um tipo de dicotyledon pertencente ao gênero Fagopyrum e à família Polygonaceae1. Como um tipo de alimento homólogo da medicina chinesa, a TB vem recebendo considerável interesse devido à sua composição química distinta e às diversas bioatividades contra doenças. A TB é principalmente rica em carboidratos, proteínas, vitaminas e carotenóides, bem como em polifenóis como ácidos fenólicos e flavonoides1. Várias atividades biológicas e farmacológicas de flavonoides, incluindo antioxidativo, anti-hipertensivo2, e anti-inflamatório, bem como propriedades anticancerígenas e antidiabéticas, foram demonstradas3.
Agrobacterium rhizogenes é uma bactéria do solo que contribui para o desenvolvimento de doenças radiculares peludas em várias plantas superiores, especialmente dicotyledons, infectando locais de feridas4,5. Este processo é iniciado pela transferência do T-DNA no plasmídeo 55,6 e é comumente acompanhado pela integração e expressão de um gene exógeno do plasmídeo Ri e os passos subsequentes de geração do fenótipo da raiz peluda7. A. rhizogenes-mediadas raízes transgênicas peludas, como uma poderosa ferramenta no campo da biotecnologia vegetal, têm sido mais amplamente utilizadas devido à sua estabilidade e alta produtividade e fácil obtenção em um curto período de tempo. Além disso, as raízes peludas induzidas por A. rizógenes são eficientemente distinguidas pelo seu desenvolvimento de raiz plagiota e crescimento altamente ramificado em um meio livre dehormônios 8. Eles podem ser usados em diversos campos de pesquisa, incluindo produção de sementes artificiais, pesquisa de nódulos radiculares e no estudo das interações com outros organismos, como fungos micorrízicos, nematóides e patógenos radiculares7,9. Além disso, culturas de transformação de raízes peludas têm sido amplamente utilizadas como um sistema experimental para investigar as vias bioquímicas e a sinalização química e produzir metabólitos secundários vegetais que são usados como fármacos, cosméticos e aditivos alimentares8,10. Os valiosos metabólitos secundários, incluindo alcalóides indobes, aconitos, alcalóides tropanos, terpenóides e flavonoides, sintetizados em raízes peludas do tipo selvagem têm sido investigados por várias décadas em inúmeras espécies, como ginsenoside em Panax ginseng11, coumarine em Ammi majus12, e compostos fenólicos na TB2,13.
Raízes peludas foram produzidas usando A. rizogenes em 79 espécies de plantas de 27 famílias14. Por exemplo, a transformação da raiz peluda mediada por A. rhizogenesfoi relatada na soja15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, e chicória(Cichorium intybus L.) 20. A transformação das raízes peludas da TB também foi investigada2. Poucos protocolos detalhados estão disponíveis em relação ao desenvolvimento de raízes peludas mediadas por A. rhizogenes ou carregando um vetor binário ou não. Por exemplo, Sandra et al.21 introduziram um método de produção de raízes transgênicas de batata peluda sustentadas em brotos do tipo selvagem. As raízes peludas totalmente desenvolvidas poderiam ser visualizadas 5-6 semanas após a injeção de A. rhizogenes carregando o gene gus reporter para o caule internode plantas de batata. Outro estudo também havia relatado um sistema de raiz peluda transgênica induzido por A. rhizogenes que abrigava o gene do repórter gusA na juta(Corchorus capsularis L.) 22. Além disso, Supaart et al.23 obtiveram raízes transgênicas de tabaco peludo usando A. rhizogenes transformados com a expressão vetorial pBI121 carregando o gene de Δ1-tetrahidrocanabinolic acid (THCA) para produzir THCA.
No entanto, um processo passo a passo para uma geração eficaz de transformação de raízes peludas, especialmente na TB, tem sido relativamente menos demonstrado. Neste estudo, descrevemos um protocolo detalhado usando A. rhizogenes carregando o gene do repórter(GFP),um marcador seletivo(Kan),e um gene de interesse(b4,um gene identificado do nosso grupo, mas um gene inédito da família hélice-loop-hélice básica (bHLH)para gerar transformação genética de raiz peluda na TB. O experimento durou de 5 a 6 semanas, desde a inoculação das sementes até a geração de raízes peludas, envolvendo a preparação explante, infecção, coculturing, subcultura e posterior propagação. Além disso, A. rizogenes contendo um plasmídeo binário que transporta o transgene de TB do fator de transcrição da mieloblastose 116 (FtMYB116) foi usado para determinar se ftMYB116 pode promover o acúmulo de flavonoides, particularmente rutina, em TB no nível genético e metabólico através da transformação da raiz peluda da TB. FtMYB116, que é um fator transcricional induzido pela luz, regula a síntese de rutin em diferentes condições de luz5. Calcone synthase(CHS),flavanone-3-hydroxylase(F3H),flavonoide-3'-hydroxylase(F3'H),e flavonol synthase(FLS)24 são enzimas-chave envolvidas na via metabólica da biossíntese rutina. Portanto, este estudo demonstra a superexpressão de FtMYB116 em raízes peludas da TB e a expressão de genes enzimáticos chave, bem como o conteúdo de rutin e outros flavonoides como a quercetina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
A TB utilizada neste estudo foi nomeada como BT18, que se originou da raça "JinQiao No.2" cultivada pelo Centro de Pesquisa de Pequenos Grãos Diversos da Academia shanxi de Ciências Agrícolas. Os passos primários deste protocolo são ilustrados na Figura 1.
NOTA: Opere rapidamente a manipulação relacionada às plantas e, quando possível, mantenha as placas de Petri fechadas para evitar murchas e contaminação. Salvo disposição em contrário, todas as incubações de explante foram conduzidas a condição de uma luz de 14 horas e um período de fotoperíodo escuro de 10 horas a 25 °C. Salvo indicação em contrário, todas as operações relacionadas com explantas ou bactérias foram realizadas condições assépticas em uma capa de fluxo laminar. Todos os ingredientes de mídia para A. rhizogenes e culturas de plantas in vitro são fornecidos na Tabela 1. Após o ajuste do pH, todas as mídias foram autoclaved a 120 °C por 20 min. As mídias solidificadas foram preparadas preenchendo 25 mL de meio em uma placa de Petri de 9 cm de diâmetro e permitindo que ela se solidifique.
ATENÇÃO: Deposite todas as bactérias e plantas geneticamente modificadas no recipiente de resíduos apropriado. Opere todos os produtos químicos perigosos em um armário de fumaça e deposite-os no recipiente de resíduos perigosos.
1. Preparação de explantas de TB
- Preparação de sementes de TB
- Selecione sementes de TB gordurosas e não danificadas(Figura 1A1)que tenham sido preservadas a uma temperatura inferior a 20 °C por no mais de 2 anos.
- Mergulhe as sementes em água a 28 °C por aproximadamente 20 min para que a camada de sementes possa ser facilmente descascada(Figura 1A2). Se necessário, use uma tesoura para cortar uma ranhura nas sementes para facilitar o peeling.
- Esterilização de sementes de TB
- Coloque 100-200 sementes descascadas em um frasco cônico esterilizado de 100 mL.
- Desinfete as sementes usando 75% de etanol para 30 s.
- Substitua o etanol por 5% de hipoclorito de sódio e desinfete por 15 min.
NOTA: A desinfecção utilizando bicloreto de mercúrio a uma concentração de 1 g/L por 8 min pode ser usada como esterilizador alternativo para substituir o hipoclorito de sódio em qualquer caso de esterilização inadequada.
ATENÇÃO: O bicloreto de mercúrio é perigoso e não é um material favorável ao meio ambiente. Opere-o no armário de fuming e deposite-o no recipiente de resíduos perigosos, se o bicloreto de mercúrio for usado em qualquer caso. - Despeje o hipoclorito de sódio.
- Lave as sementes com água desionizada estéril 5 vezes.
- Borreve as sementes com um papel bibuloso estéril.
- Preparação de mudas de TB
- Prepare 50 mL Murashige e Skoog (MS) meio basal (1962) complementado com 30 g/L de sacarose e 7 g/L em pó de ágar (MSSA) (Tabela 1) em uma garrafa de cultura de tecido vegetal de 300 mL.
- Ajuste o pH para 5,8 antes de autoclaving.
- Distribua 10 sementes uniformemente por garrafa de meio MSSA.
- Germinar as sementes em uma sala de cultura a 25 °C ± 1 °C a condição de luz por 7-10 dias.
- Preparação de explantas estéreis
- Selecione mudas robustas de TB(Figura 1C),quando as 2 peças de cotiledons forem desdobradas.
- Corte as mudas das raízes(Figura 1C pontas de flecha vermelhas),evitando o contato com o meio.
- Coloque-os em uma placa de Petri estéril.
- Corte os hipocotyls em segmentos de 0,8 a 1 cm e corte os cotiledons em aproximadamente 0,5 cm de pedaços.
- Pré-cultura estas explantes no meio MSSA a condição de luz por 24 horas.
- Transfira-os para um frasco cônico esterilizado de 100 mL, que agora está pronto para infecção.
2. Preparação de A. rhizogenes para transformação
NOTA: A cepa A. rhizogenes ACCC10060 foi gentilmente fornecida pelo Instituto de Desenvolvimento de Plantas Medicinais e preservada a -80 °C. A. rhizogenes foi transformado com o vetor binário pK7GWIWG2D (II) que abriga um T-DNA carregando o gene b4 acompanhando um GFP como gene indicador e o gene de resistência Kan como um marcador selecionável. O gene b4 é um membro da família bHLH fator de transcrição, que ainda não foi publicado. Para avaliar o potencial das raízes peludas da TB, A. rizogenes foi transformado com o vetor binário pK7WG2D contendo o gene MYB116 para investigar seu efeito na produção de metabólitos secundários, como flavonoides no nível de expressão genética e por análises metabólicas. Ativado A. rhizogenes deve estar bem preparado ao mesmo tempo com as explantas.
- Ativação de A. rhizogenes
- Descongele A. rhizogenes no gelo
- Mergulhe as bactérias e forre-as uniformemente no meio manitol de levedura (YEB) suplementado com pó de ágar de 15 g/L, 50 mg/L de rifampicina e 50 mg/L de espectinomicina (YEBARS, pH 7.0).
- Incubar a bactéria a 28 °C por 12-16 horas.
- Escolha uma colônia monoclonal e a cultigue em outra placa de Petri da mesma maneira descrita acima.
- Selecione colônias monoclonais e as cultura em um frasco cônico esterilizado de 100 mL contendo 20 mL de meio YEB suplementado com rifampicina de 50 mg/L e 50 mg/L de espectinomicina (YEBRS, pH 7.0) a 28 °C e 200 rpm por 16-18 h até que o valor deOD 600 atinja 2.0.
- Incubar 2%-4% da cultura acima mencionada em outro frasco cônico de 100 mL contendo 20 mL de meio YEBRS a 28 °C e 200 rpm por 4-5 h até que o valor deOD 600 atinja aproximadamente 0,5(Figura 1D).
3. Infecção e triagem de explantas de TB
NOTA: O objetivo deste protocolo é obter raízes peludas geneticamente transformadas. As raízes do tipo selvagem foram utilizadas como controle negativo para avaliar a expressão transgênica. Neste protocolo, A. rhizogenes foi transformado com vetor binário pK7WG2D carregando o gene de FtMYB116 ou pK7GWIWG2D (II) carregando o gene de b4 com antecedência.
- Resuspensão de A. rhizogenes
- Transfira a cultura obtida na etapa 2.1.6 para um tubo centrífugo esterilizado de 50 mL.
- Gire a 4.000 x g por 10 min a 20 °C.
- Remova o sobrenadante e resuspenda a pelota bacteriana com meio ms suplementado com sacarose de 30 g/L e acetosiringone de 300 μM (AS) (MSSAS, pH 5.8) a OD600 ◗ 0,2.
- Infecção de explantas
- Infundir a suspensão bacteriana obtida na etapa 3.1.3 em um frasco cônico contendo as explantas preparadas na etapa 1.4.6 por 10 min(Figura 1E).
- Tire as explantas e seque-as usando um papel bibuloso estéril.
4. Cocultura de explants com A. rhizogenes
- Coloque um papel filtro estéril de 9 cm de diâmetro no meio MS, que é solidificado utilizando pó de ágar de 7 g/L suplementado com 30 g/L de sacarose e 100 μM AS (meio MSSAAS, pH 5.2).
- Sobreponha as plantas no papel filtro a 25 °C por 3 dias no escuro (Figura 1F).
5. Indução e cultura seletiva
- Coloque aproximadamente 20 explantas infectadas no meio MSSA suplementado com 500 mg/L cefotaxime e 50 mg/L de kanamicina (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (Figura 1G).
- Incuba-los verticalmente a condição de luz a 25 °C ± 1 °C. As raízes peludas ocorrem aproximadamente 1 semana após a incubação(Figura 1H pontas de flecha sinuosa de traço preto indicam ocorrência de raízes peludas).
NOTA: Substitua o meio MSSACK a cada 15 dias, se necessário.
6. Subculturing TB raízes peludas
NOTA: Este procedimento visa colher raízes peludas vigorosas. Observe regularmente o crescimento de raízes peludas durante a propagação, e remova as contaminadas e inativadas em tempo hábil. Se necessário, repita os seguintes passos para propagar raízes mais peludas. Leva aproximadamente 10 a 14 dias desde a subculação até a colheita.
- Selecione as raízes peludas que mostram aparência branca e rápido crescimento.
- Corte-os em pedaços de 2-3 cm.
- É óbvio que estão em um banco limpo.
- Subcultura-los em um frasco cônico esterilizado de 100 mL contendo 5 mL de mS médio suplementado com 30 g/L de sacarose e 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) a uma velocidade rotativa de 80 rpm a 25 °C no escuro até que se espalhem para o fundo do frasco(Figura 1I).
7. Identificação de raízes peludas transformadas e conservação
NOTA: Raízes peludas transformadas podem ser identificadas com base nos aspectos da morfologia e nível genético. A identificação também pode ser realizada de acordo com o genoma da raiz peluda e resistência, que não estão cobertos neste protocolo. Este procedimento se concentra principalmente no gene do repórter e na identificação genética do alvo.
- Remova as raízes peludas e contaminadas e selecione aquelas com aparência branca.
- Avalie se há fluorescência verde um transiluminador ultravioleta duplo azul/leve.
- Selecione as raízes peludas que exibem um forte sinal de fluorescência nos tubos numerados ou embrulhadas usando um papel alumínio marcado depois de secá-las com um papel absorvente.
- Liofiliste-os em nitrogênio líquido, seguido de armazenar toda a colheita a −80 °C para investigação posterior.
- Identificação genética
- Triturar 0,1 g das raízes peludas em pó fino em nitrogênio líquido.
- Prepare o DNA genômico de linhas transgênicas independentes de TB usando o método de brometo de cetiltilamônio modificado (CTAB)25 de acordo com a instrução do fabricante do kit de DNA genômico da planta.
- Realize a reação em cadeia de polimerase (PCR) usando 100 ng de modelo de DNA genômico e primers listados na Tabela 2.
- Realize o ciclo de amplificação da seguinte forma: predenaturação a 94 °C por 5 min, desnaturação a 94 °C para 30 s, recozimento do primer a 55 °C para 30 s e extensão de primer a 72 °C para 30 s. Após 36 ciclos e uma etapa final de extensão a 72 °C por 10 min, analise os produtos de amplificação em géis de agarose de 1%.
- Manche os géis com coloração de ácido nucleico e visualize-os luz UV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agrobacterium rhizogenes-transformação de raiz peluda da TB mediada
Este estudo descreve o protocolo passo-a-passo que foi estabelecido para obter raízes peludas geneticamente transformadas usando A. rhizogenes. Levou aproximadamente 5-6 semanas desde a inoculação das sementes de TB até a colheita das raízes peludas identificadas, e alguns passos-chave são retratados na Figura 1 (A-H). Resumidamente, as sementes com casca esterilizadas foram inoculadas (Figura 1B) para alcançar uma germinação estéril mais rápida. A. rhizogenes (Figura 1D)e explantas estéreis devem ser ativadas e preparadas com antecedência, respectivamente. Isso é seguido por alguns passos-chave, incluindo a infecção de explantas com a ativação De A. rhizogenes (Figura 1E),cocultura(Figura 1F)e cultura seletiva(Figura 1G). As explantas infectadas devem ser colocadas uniformemente no meio solidificado de Esm e o espaço deve ser mantido entre elas para separar prontamente as diferentes linhas transgênicas. Raízes peludas aparecem com uma cor branca fofa de forma plagiota nos locais de feridas das explantas(Figura 1HH). As raízes peludas formam uma matriz altamente ramificada e intertravada e podem ser propagadas conforme necessário (Figura 1I). As raízes peludas colhidas podem ser usadas para investigar a função genética ou a interação gene- ou proteína-proteína. Alternativamente, as raízes peludas da TB podem ser maciçamente propagadas para produzir metabólitos secundários, como rutinem em bioreatores designados.
O método para induzir raízes peludas transgênicas na TB foi comprovado usando um vetor binário (pK7GWIWG2D (II)) que carrega os genes GFP e b4 (membro da família bHLH do fator transcricional, ainda não publicado). O gene repórter GFP foi usado para distinguir facilmente as raízes peludas transgênicas das não transgênicas, visualizando o sinal um transiluminador ultravioleta duplo azul/leve (Figura 2) ou identificando o gene alvo(Figura 3). As raízes peludas transformadas apresentaram fluorescência verde quando iluminadas luz azul ou ultravioleta (representadas usando pontas de flechas pretas na Figura 2A),enquanto as raízes peludas não transformadas não apresentavam a fluorescência verde(Figura 2B). As raízes peludas com alto sinal gfp foram propagadas por quinze dias, conforme ilustrado na Figura 2C.
Para identificar melhor se o vetor binário foi transformado com sucesso no genoma da TB, foram realizadas identificações genéticas. Resumidamente, o DNA genômico vegetal das raízes peludas da TB foi preparado para a análise de PCR com base no método CTAB modificado25. A PCR foi realizada por meio da amplificação dos genes(Kan, GFPe b4),que estavam presentes na Figura 3,respectivamente. Os primers estão listados na Tabela 2. A presença dos 3 genes em todas as linhas transgênicas (Figura 3, faixas 5-11) indicou que o vetor binário foi transformado com sucesso no genoma da TB. Kan e GFP estavam ausentes nas raízes do tipo selvagem(Figura 3, faixa 3) e controle negativo experimental(Figura 3, faixa4),enquanto b4 foi detectado nas raízes do tipo selvagem. Estes 3 genes foram, sem dúvida, apresentados no controle positivo (Figura 3,faixa 2), mas aparentemente ausentes no controle negativo(Figura 3, faixa4).
Avaliação do fator de transcrição induzida pela luz FtMYB116 em TB usando o sistema radicular peludo acima mencionado
FtMYB116 foi expresso por utilizar o protocolo acima mencionado de indução de raiz peluda. Isso foi realizado pré-inserindo o gene FtMYB116 no vetor binário pK7WG2D e, em seguida, infectando com A. rhizogenes para alcançar a superexpressão genética. Resumidamente, raízes peludas de 0,1 g foram trituradas em pó fino usando nitrogênio líquido. O RNA total foi extraído seguindo as instruções do fabricante do kit de isolamento rna da planta26. Em seguida, a transcrição reversa PCR e PCR em tempo real foram realizados para amplificar FtMYB116 e rutin sintetizando genes relacionados à via. Posteriormente, foram verificados os efeitos regulatórios do FtMYB116 na expressão genética relacionada à síntese de rutinas e o rendimento da rutina.
A Figura 4A mostra a expressão relativa de FtMYB116 nas linhas transgênicas de raízes peludas da TB. Em comparação com o grupo controle, a expressão relativa de FtMYB116 apresentou um aumento considerável em todas as 3 linhas transgênicas independentes. A Figura 4B e a Figura 4C ilustram a promoção da biossíntese da rutina e da quercetina no nível metabólico através da superexpressão ftmyb116. Os teores de rutina e quercetina no transgênico foram significativamente(p < 0,01) aumentados em comparação com os do tipo selvagem, atingindo 40 e 0,5 mg/g de FW, respectivamente, que foram 8 vezes aqueles do tipo selvagem. As expressões genéticas relativas de CHS, F3H, F3'He FLS em todas as 3 linhas transgênicas foram notavelmente maiores do que as do grupo controle(Figura 4D). Juntos, esses resultados confirmaram que a estratégia descrita neste estudo poderia ser utilizada com sucesso para gerar transformação de raízes peludas na TB e investigar a expressão genética e o rendimento metabólico dos metabólitos secundários.
Figura 1: Processos para induzir raízes transgênicas transgênicas mediadas por A. rhizogenesna TB. Imagens representativas de estágios críticos são exibidas: (A1) e (A2) representam antes e depois de descascar as camadas de sementes; (B) representa cada 10 sementes inoculadas em uma garrafa de tecido contendo meio MSSA; (C) denota as mudas de TB em 7-10 dias após a inoculação, e as pontas de seta vermelhas mostram os pontos de corte; (D) e(E) indicam a preparação de A. rizógenes (OD600 = 0,5) e a infecção de explantas, respectivamente; (F) e (G) simbolizam a codificação com A. rizogenes ativados no meio MSSAAS e na cultura seletiva no meio MSSACK, respectivamente; raízes peludas emergem de(H), como mostrado pelas pontas de flecha sinuosas de traço preto; e (I) mostra a propagação da formação de raízes peludas; as pontas de flecha sinuosas indicam as raízes peludas induzidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Transformação do vetor binário que carrega o gene do repórter GFP. (A) denota as raízes peludas induzidas após cultura seletiva examinada o transiluminador ultravioleta duplo azul/claro. (B) e(C) representam raiz do tipo selvagem e propagação de raízes peludas transformadas, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Amplificação pcr de genes(Kan, GFP, e b4) a partir de DNA genômico isolado de raiz selvagem e raízes peludas da TB em 7 linhas transgênicas independentes. ( A): Kan, (B): GFP, (C): b4. Faixa 1: marcadores de tamanho molecular (ponta de seta branca indica 750 bp), faixa 2: plasmid (vetor binário pK7GWIWG2D (II) carregando genes Kan, GFPe b4) como o controle positivo, faixa 3: raiz do tipo selvagem, faixa 4: purificado H2O como controle negativo, e faixas 5-11: as 7 linhas transgênicas independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Expressão relativa de FtMYB116 nas linhas transgênicas de raízes peludas da TB. (A) e o efeito promocional da superexpressão de FtMYB116 sobre a biosíntese de (B) rutin e (C) quercetin (Esta figura foi modificada a partir de Dong et al.5). Os experimentos foram realizados em triplicado e realizados 3 vezes. "**" indica uma diferença significativa em p < 0,01 usando o teste tde Student. (D) Expressão de genes relacionados com as vias de síntese flavonoide em linhas transgênicas. O nível relativo de expressão foi normalizado ao do controle da actina. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Mídia | Ingredientes médios | ||
| MSSA | Média murashige e skoog (MS) contendo sacarose em 30 g/L, e pó de ágar em 7 g/L, pH 5.8 | ||
| YEBARS | Levedura Manitol Medium (YEB) contendo pó de ágar a 15 g/L, rifampicina a 50 mg/L e espectinomicina a 50 mg/L, pH 7,0 | ||
| YEBRS | YEB contendo rifampicina a 50 mg/L, e espectinomicina a 50 mg/L, pH 7.0 | ||
| MSSAS | MS médio contendo sacarose a 30 g/L, e acetosyringone (AS) a 300 μM, pH 5.8 | ||
| MSSAA | MS médio contendo sacarose a 30 g/L, ágar em pó a 7g/L e AS a 100μM, pH 5.2 | ||
| MSSACK | MS médio contendo sacarose a 30 g/L, ágar em pó a 7 g/L, cefotaxima a 500 mg/L e kanamicina (kan) a 50 mg/L, pH 5.8 | ||
| MSSK | MS médio contendo sacarose a 30 g/L, e kan a 50 mg/L, pH 5.8 | ||
Tabela 1: Mídia e seus ingredientes.
| Primer | Seqüência (5'-3') | |
| GFP-F | CCACAAGTTCAGCGTGTCCG | |
| GFP-R | AAGTTCACCTTGATCGTTC | |
| b4-F | AAATCTTTCCCTGTGG | |
| b4-R | ATGCCATCATTGCCAAG | |
| Kan-F | ATTCGGCTATGACTGGGCAC | |
| Kan-R | TGAATCCAGAAAAAGGGCCA | |
Tabela 2: Seqüência de primer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A TB tem sido utilizada em diversos estudos relacionados a metabólitos secundários em níveis genéticos e metabólicos1,2,5,27,28. A cultura raiz peluda, como fonte única de produção metabólica, desempenha um papel fundamental na engenharia metabólica29 e pode ser usada para alterar vias metabólicas inserindo os genes relacionados. Kim et al.2 inicialmente introduziram o estabelecimento de culturas radiculares peludas da TB por A. rhizogenes-transformação mediada para alcançar a produção de compostos fenólicos. O teor de rutina que obtiveram nas raízes peludas da TB foi mais de 10 vezes maior do que nas raízes do tipo selvagem. No presente estudo, a introdução do FtMYB116 levou a uma maior expressão de genes rutin-relacionados e aumentou a produção de rutin nas raízes peludas da TB. Esta técnica foi confirmada como apta para caracterização fenotípica e expressão de genes relacionados com fenilpropanoides como FtF3H e FtFLS em raízes peludas de TB5,30,31. Zhang et al.32 usaram raízes peludas da TB para investigar a produção de rutin, expressando uma série de fatores transcricionais ftmyb. Zhou et al.33 observaram uma diminuição no conteúdo de rutin devido à superexpressão de FtMYB11 em raízes peludas da TB. Esses resultados, juntamente com nossos achados, indicam os efeitos viáveis da transformação das raízes peludas na interação entre fatores transcricionais ftmyb e genes relacionados à biosíntese rutina.
Embora existam dados limitados sobre um protocolo passo-a-passo para a indução de raízes peludas da TB, descrevemos aqui no protocolo passo-a-passo pela primeira vez para obter raízes peludas transgênicas de TB de forma eficiente e estável usando A. rhizogenes carregando um vetor binário. Durante esses processos experimentais, inúmeros fatores devem ser cuidadosamente considerados para obter as raízes peludas induzidas ótimas. Primeiro, a seleção de explantas é um fator determinante. As cultivares de TUBERCULOSE são conhecidas por afetar a morfologia das raízes peludas e a produção de compostos fenólicos. Thwe et al.30 ilustraram essa expressão genética na via biossintética fenilpropanoide e o conteúdo de compostos fenólicos variou entre as cultivares de TB. Eles também encontraram raízes peludas em uma cultivar, que era avermelhada-roxa profunda devido ao seu teor de antocianina13. Em nosso estudo, 2 cotiledons e hipocotyls foram selecionados como explantas. Isso porque as folhas jovens e macias favorecem uma alta taxa de indução de raiz peluda2,30, enquanto as células vegetais altamente diferenciadas e antigas afetam negativamente a indução da raiz peluda. Segundo, a cepa de A. rhizogenes tem um impacto significativo na indução da raiz peluda. Diferentes cepas bacterianas apresentam diferentes habilidades transformadoras em termos de morfologias e eficiência de indução de raízes peludas, que podem ser iluminadas pelos diferentes plasmídeos abrigados pelas cepas34. Aye et al.35 compararam os efeitos de várias cepas de A. rhizogenes (R1000, R1200, 15834, LBA9402 e A4) na indução da raiz peluda da TB e biossíntese fenilpropanoide e descobriram que a cepa mais promissora para a produção de raiz peluda na TB foi R1000. Este achado foi apoiado por Kim et al.2 No entanto, a cepa ACCC10060 que foi excluída no estudo de Aye et al. mas utilizada em nosso estudo apresentou eficiência satisfatória de infecção. A aparência branca fofa de raízes peludas obtidas usando nosso protocolo está de acordo com as raízes peludas geradas em Salvia miltiorrhiza36, onde a mesma cepa ACCC10060 carregando o vetor binário pK7GWIWG2D (II) foi usada para silenciar o gene alvo. Em terceiro lugar, a desgeração, incluindo o pré-tratamento de materiais e a concentração de cefotaxim na cultura seletiva, também desempenham papéis vitais na indução da raiz peluda. A desinfecção incompleta em qualquer passo pode levar ao fracasso da transformação da raiz peluda. Além disso, a concentração bacteriana tem uma influência significativa na produção de raízes transformadas. Altas concentrações podem reduzir as células vegetais por inibição competitiva, enquanto baixas concentrações podem causar baixa disponibilidade4.
Além disso, as condições culturais, como o meio de crescimento, o tempo adequado de pré-aculação e coculturing, e outros fatores bióticos ou abióticos desempenham um papel importante na indução da raiz peluda. Huang et al.37 recomendaram 1/2 ms médio contendo sacarose a uma concentração de 30 g/L para cocultivo para alcançar raízes peste máximas de TB. Isso pode ser explicado pelo alto meio salqueiro adequado para a formação de raízes peludas, enquanto um meio de sal baixo favorece a multiplicação bacteriana excessiva34. AS é um tipo de composto fenólico que pode facilitar a transformação mediada por A. rhizogenesem várias espécies vegetais pela transcrição da região vir do Agrobacterium34,38, e vir poderia ser efetivamente induzido em um meio com um pH de < 5.739,40. Por isso, recomendamos um meio de cocultura com pH 5.2 complementado com 100 μM de AS. Huang et al.37 relataram que as raízes peludas da TB viraram marrom após o dia 24 de amarelo branco e pálido. Portanto, eles subculturaram raízes peludas a cada 24 dias; no entanto, recomendamos subculação quinzenalmente para evitar a browning de raízes peludas. Além disso, condições ambientais como luz, hormônios, temperatura e radiação UV parecem afetar a expressão de genes relacionados à biossíntese flavonoide por transdução de sinal altamente estimulante ou deprimente41,42. O estudo anterior demonstrou a importância da luz muito vermelha no monitoramento da expressão genética relacionada à rutina nas raízes peludas da TB5.
A transformação mediada por A. rhizogenestem a vantagem de que qualquer gene exógeno de interesse inserido em um vetor binário pode ser transferido para o clone raiz peluda transformado34 para alcançar a superexpressão, perda de função via RNA silenciando43, ou descoberta de novos genes metabólicos por análises de transcriptome5. Raízes peludas têm grande potencial para produzir metabólitos secundários, proteínas recombinantes e evenanticorpos44. Isto deve-se principalmente ao seu fácil e rápido crescimento no meio sem hormônios, sendo menos caro, sem necessidade de regeneração em plantas completas21, e o rendimento relativamente alto de metabólitos secundários em comparação com o material vegetal inicial31. Essas raízes também podem ser separadas da explanta original para estabelecer clones radiculares de longo prazo, estáveis e caracterizados mantendo sua capacidade biossintética e fenótipos. Ao todo, com base nesses achados, este protocolo fornece um método rápido, distinto e eficiente para produzir raízes peludas transformadas para investigar a produção de metabólitos secundários e apresenta uma referência para indução de raiz peluda em outras plantas. No entanto, o potencial de explorar culturas radiculares peludas para gerar rendimentos maciços de compostos bioativos depende do sistema bioreator apropriado no qual determinados parâmetros, como o fornecimento deoxigênio,devem estar preocupados4,8. Este protocolo limita-se à produção de metabólitos secundários derivados de raízes peludas e a investigar o fenótipo visualizado de genes funcionais, como a variância de cor e o conteúdo de metabólitos secundários; no entanto, as alterações faiotípicas em toda a planta, independentemente da obtenção de plantas regeneradas a partir das raízes peludas, não puderam ser avaliadas neste estudo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos Fundos de Pesquisa Fundamentais para os institutos centrais de pesquisa de bem-estar público ZXKT17002.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L.
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , Chapter 13 (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al.
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
