Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikasjon av komposittregenerativt perifert nervegrensesnitt (C-RPNI) hos voksenrotte

Published: February 25, 2020 doi: 10.3791/60841
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2
1Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Følgende manuskript beskriver en ny metode for å utvikle et biologisk, lukket loop neural feedback system kalt kompositt regenerative perifere nervegrensesnitt (C-RPNI). Denne konstruksjonen har evnen til å integrere med perifere nerver for å forsterke sprudlende motorsignaler samtidig som den gir afferent sensorisk tilbakemelding.

Abstract

Nylige fremskritt i nevroproteser har gjort det mulig for de som lever med ekstremitetstap å reprodusere mange funksjoner som er innfødt til den fraværende ekstremiteten, og dette oppnås ofte gjennom integrasjon med det perifere nervesystemet. Dessverre er metoder som brukes i dag ofte forbundet med betydelig vevsskade som forhindrer langvarig bruk. I tillegg mangler disse enhetene ofte noen meningsfull grad av sensorisk tilbakemelding, da deres komplekse konstruksjon demper eventuelle vibrasjoner eller andre opplevelser en bruker tidligere kan ha vært avhengig av når de bruker enklere proteser. Det sammensatte regenerative perifere nervegrensesnittet (C-RPNI) ble utviklet som en stabil, biologisk konstruksjon med evnen til å forsterke sprudlende motornervesignaler samtidig som det gir samtidig afferent sensorisk tilbakemelding. C-RPNI består av et segment av fri dermal og muskeltransplantat sikret rundt et mål blandet sensorisk nerve, med fortrinnsrett motor nerve reinnervation av muskelgraftet og sensorisk nerve reinnervation av dermal graft. Hos rotter har denne konstruksjonen vist generering av sammensatte muskelhandlingspotensialer (CMAP), som forsterker målnervens signal fra mikro- til milli-volts nivå, med signal til støyforhold i snitt ca. 30-50. Stimulering av dermal komponenten av konstruksjonen genererer sammensatte sensoriske nerve handling potensialer (CSNAPs) på proksimale nerve. Som sådan har denne konstruksjonen lovende fremtidig verktøy mot realisering av den ideelle, intuitive protesen.

Introduction

Ekstremitetamputasjoner påvirker nesten 1 av 190 amerikanere1, og deres utbredelse er anslått å øke fra 1,6 millioner i dag til over 3,6 millioner innen 20502. Til tross for dokumentert bruk i over et årtusen, har den ideelle protesen ennå ikke blitt realisert3. For tiden finnes det komplekse proteser som er i stand til flere felles manipulasjoner med potensial til å reprodusere mange motorfunksjoner av den opprinnelige ekstremiteten4,5. Disse enhetene anses imidlertid ikke som intuitive, da ønsket protesebevegelse vanligvis er funksjonelt atskilt fra inngangskontrollsignalet. Brukere vanligvis vurdere disse "avanserte proteser" vanskelig å lære og derfor ikke egnet for daglig bruk1,6. I tillegg gir komplekse proteser som for tiden er på markedet, ingen merkbar grad av subtil sensorisk tilbakemelding for tilstrekkelig kontroll. Følelsen av berøring og proprioception er avgjørende for å utføre daglige oppgaver, og uten disse blir enkle handlinger som å plukke opp en kopp kaffe tyngende da den er helt avhengig av visuelle signaler7,8,9. Av disse grunnene er avanserte proteser forbundet med en betydelig grad av mental tretthet og blir ofte beskrevet som tyngende og utilfredsstillende5,10,11. For å løse dette har noen forskningslaboratorier utviklet proteser som er i stand til å gi en begrenset grad av sensorisk tilbakemelding via direkte nevrale interaksjon12,13,14,15, men tilbakemeldinger er ofte begrenset til små, spredte områder på hender og fingre12,13, og opplevelser ble notert å være smertefulle og unaturlige til tider15. Mange av disse studiene mangler dessverre noen merkbar langsiktig oppfølging og nervehistologi for å avgrense lokale vevseffekter, mens de merker grensesnittsvikt på skalaen av uker til måneder16.

For denne populasjonen ville den ideelle proteseenheten gi høy kvalitet motorkontroll sammen med meningsfulle somatosensoriske tilbakemeldinger fra den enkeltes miljø gjennom hele levetiden. Kritisk til utformingen av nevnte ideell protese er utviklingen av et stabilt, pålitelig grensesnitt som ville tillate samtidig overføring av afferent somatosensorisk informasjon med sprudlende motorsignaler. Den mest lovende av dagens menneskelige maskin grensesnitt er de som samhandler med det perifere nervesystemet direkte, og den siste utviklingen innen nevrointegrerte proteser har jobbet mot å bygge bro mellom bioelektriske og mekaniske signaler17. Nåværende grensesnitt benyttes inkluderer: fleksible nerveplater14,15,18, ekstra-neural mansjett elektroder13,19,20,21,22,23, vev penetrerende elektroder24,25,31,32, og intrafascicular elektroder26,27 ,28. Imidlertid har hver av disse metodene vist begrensninger med hensyn til nervespesifisitet, vevsskade, aksonal degenerasjon, myelinuttømming og / eller arrvevdannelse forbundet med kronisk indwelling fremmedlegemerrespons 16,17,18,19. Mer nylig har det blitt postulert at en driver bak eventuell implantert elektrodesvikt er den betydelige forskjellen i Youngs moduli mellom elektronisk materiale og innfødt nevrale vev. Hjernevev er utsatt for betydelig mikrooppbevegelse daglig, og det har blitt teoretisert at skjærstresset forårsaket av forskjeller i Youngs moduli forårsaker betennelse og eventuell permanent arrdannelse30,31,32. Denne effekten er ofte forsterket i ekstremiteter, hvor perifere nerver er gjenstand for både fysiologisk mikromotion og forsettlig ekstremitet makromotion. På grunn av denne konstante bevegelsen er det rimelig å konkludere med at utnyttelse av et helt abiotisk perifert nervegrensesnitt ikke er ideelt, og et grensesnitt med en biologisk komponent ville være mer egnet.

For å løse dette behovet for en biologisk komponent utviklet laboratoriet et biotisk nervegrensesnitt kalt Regenerative Peripheral Nerve Interface (RPNI) for å integrere transponerte perifere nerver i et gjenværende lem med en proteseenhet. RPNI fabrikasjon innebærer kirurgisk implantering av en perifer nerve i en autolog fri muskeltransplantat, som senere revaskumerer og reinnervates. Vårt laboratorium har utviklet dette biologiske nervegrensesnittet det siste tiåret, med suksess i å forsterke og overføre motorsignaler kombinert med implanterte elektroder i både dyre- og menneskelige forsøk, noe som åpner for egnet protesekontroll med flere frihetsgrader2,34. I tillegg har vi separat vist sensorisk tilbakemelding gjennom bruk av perifere nerver innebygd i dermal grafts, kalt Dermal Sensorisk Interface (DSI)3,35. I mer distale amputasjoner er bruk av disse konstruksjonene samtidig mulig, da motor- og sensoriske fascikler i målets perifere nerve kan skilles kirurgisk. Men for mer proksimale amputasjoner er dette ikke mulig på grunn av innløsning av motor- og sensoriske fibre. Kompositt regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI) ble utviklet for mer proksimale amputasjoner, og det innebærer å implantere en blandet sensorisk nerve i en konstruksjon bestående av gratis muskeltransplantat sikret til et segment av dermal graft (Figur 1). Perifere nerver viser fortrinnsrett målrettet reinnervation, og dermed sensoriske fibre vil re-innervate dermal graft og motorfibre, muskeltransplantatet. Denne konstruksjonen har dermed muligheten til å samtidig forsterke motorsignaler samtidig som den gir somatosensorisk tilbakemelding36 (Figur 2),noe som gir mulighet for realisering av den ideelle, intuitive, komplekse protesen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk utføres under godkjenning av University of Michigan's Committee on the Use and Care of Animals.

MERK: Donorrotter får fri tilgang til mat og vann før hud- og muskeldonasjonsprosedyrer. Eutanasi utføres under dyp anestesi etterfulgt av intra-hjerte kaliumklorid injeksjon med en sekundær metode for bilateral pneumothorax. Enhver stamme av rotte kan teoretisk brukes med dette eksperimentet; Laboratoriet vårt har imidlertid oppnådd konsistente resultater hos både mannlige og kvinnelige Fischer F344 rotter (~ 200-250 g) ved to til fire måneders alder. Donorrotter må være isogene for de eksperimentelle rotter.

1. Utarbeidelse av dermal graft

  1. Bedøve donorrotte i et induksjonskammer ved hjelp av en løsning på 5 % isofluran i oksygen ved 0,8-1 L/min. Når rotten er bedøvet, fjern fra induksjonskammeret og legg på en pustenesekjegle, senking av isoflurantil 2-2,5% for vedlikehold av anestesi.
  2. Administrer en løsning på 0,02-0,03 ml Carprofen (50 mg/ml) i 0,2 ml steril saltvann skutant mellom skulderbladene for analgesi.
  3. Påfør kunstige tårer salve på begge øynene for å forhindre hornhinnesår.
  4. Bruk klippere, barber hele nedre bakben(er), ankelregionen og sidene av pote(er).
  5. Rens valgt bakben og plantar overflate av pote med alkohol, etterfulgt av iodopovidon løsning, slutter med en endelig rens med alkohol for å fjerne gjenværende iodopovidon.
  6. Ved hjelp av en håndholdt mikromotor høyhastighets drill med en avtagbar rund fin grus polering stein (4000 rpm), burr plantar overflaten av poten for å fjerne epidermis. Mens burring, påfør drypp av saltvann som å ikke brenne huden. Den underliggende dermis vil ha et skinnende utseende med pinpoint blødning.
  7. Påfør en turniquet til nedre ekstremitet for å bremse blodstrømmen.
  8. Fjern plantarhuden kraftig med en #15 skalpell og legg i saltvannsfuktet gasbind for å forhindre uttørking. Noen sene og bindevev vil iboende bli fjernet med huden i dette trinnet og vil bli fjernet senere.
  9. Påfør gasbind wrap til blødningfoten for å bremse blødning. Gjenta trinn 1.5-1.9 hvis du gjør to konstruksjoner.
  10. Under et mikroskop (20x forstørrelse) fjerner du det sene vevet og bindevevet fra det dype laget av hudtransplantatet ved hjelp av mikrosaks. Pass på at du ikke lager hull i transplantatet. Den tynne dermal transplantatet skal være litt ugjennomsiktig som bare inneholder dermis, og måler ca. 0,5 cm x 1,0 cm i størrelse.
  11. Plasser i saltvannsfuktet gasbind til klar for C-RPNI konstruere fabrikasjon. Grafts bør benyttes innen 2 timer etter innhøsting.

2. Utarbeidelse av muskeltransplantatet

  1. Lag et langsgående snitt langs det framrenske aspektet av nedre bakben fra like over ankelen til like under kneet med en #15 skalpell. Dissekere gjennom subkutant vev for å eksponere den underliggende muskulaturen.
  2. På det distale aspektet av snittet, eksponer de sene innsettinger av nedre lem muskulatur. Tibialis anterior (TA) er vanligvis den største og mest anterior av musklene, og like under og bakre til denne muskelen ligger extensor digitorum longus (EDL). Isoler den distale EDL-senen fra de andre senene i området, og vær forsiktig så du ikke incise innsettingen på dette tidspunktet.
  3. Sørg for isolasjon av den riktige senen ved å sette inn begge tindene av en tang under senen og utøve oppadgående trykk ved å åpne tang for å forårsake seneutflukt. Manipulering av denne senen bør føre til at alle tærne strekker seg samtidig.
  4. Utfør en distale tenotomy med skarp irissaks og skill muskelen fra det omkringliggende vevet rett ut med tenotomies (eller annen stump-tippet saks) som arbeider proximally for å finne den sene opprinnelsen.
  5. Når den proksimale senen er visualisert, igjen utføre en tenotomy ved hjelp av skarpe iris saks. Plasser muskeltransplantatet i en saltvannsfuktet gasbind for å forhindre uttørking.
  6. Når alle ønskede grafts er fjernet fra en donorrotte, euthanize primært ved intra-hjerte KCl injeksjon (1-2 mEq K + / kg) etterfulgt av sekundær eutanasi med bilateral punktering pneumothorax med et #15 blad.

3. Vanlig peroneal nerveisolasjon og forberedelse

  1. Bedøve og gi analgesi til den eksperimentelle rotten i henhold til protokollen som er skissert i trinn 1.1-1.3.
  2. Barber ønsket lår og rens med alkohol, betadin, som slutter med alkohol for å fjerne spor av betadin.
  3. Flytt dyret fra kirurgisk prep bord til kirurgisk mikroskop bord og legg på oppvarming pad med temperaturprobe for kroppstemperatur vedlikehold. Vedlikehold isofluran ei på 2-2,5 % og oksygen ved 0,8-1 L/min.
  4. Merk snittet, som strekker seg fra bare distale til sciatisk hakk til den dårligere delen av kneet. Denne merkingen bør være dårligere enn, og vinklet bort fra, lårbenet. Gjør snittet med et #15 blad som går gjennom den underliggende biceps femoris fascia.
  5. Disseker forsiktig gjennom biceps femoris muskelen med enten en hemostat eller stump-tippet mikrosaks til plassen underliggende biceps femoris.
    MERK: Den isjiasnerven reiser omtrent i samme retning som det første snittet som ble gjort. Det er tre grener, vanligvis med sural nerve bakre og vanlig peroneal og tibial nerve reiser overfladisk og dypt til kneet, henholdsvis.
  6. Etter identifisering av den vanlige peroneale (CP) nerven, ved hjelp av et par mikro-, fintippede tang og mikrosaks, isolerer forsiktig CP-nerven fra de andre sciatiske grenene og fjerner langvarig bindevev distalt.
  7. På det punktet hvor nerven krysser overflaten av kneet, skarpt transect nerven med et par mikrosaks.
    MERK: Bruk av skarp saks er ekstremt viktig i dette trinnet, da det å forårsake betydelig traumer i nerven kan øke risikoen for neuromadannelse.
  8. Forsiktig frigjøre eventuelle gjenværende bindevev fra CP-nerven og arbeid proximally for å frigjøre nerven til en lengde på ca 2 cm.

4. C-RPNI konstruere fabrikasjon

  1. Fjern muskeltransplantatet fra saltvannsfuktet gasbind og fjern alt sentralt senevev samt et lite sentralt segment av epimysium. La de sene endene være intakte.
  2. Bruke en 8-0 nylon sutur, sikre epineurium av den transponerte enden av CP-nerven til området av muskeltransplantatet blottet for epimysium med to avbrutte masker på hver side av nerven.
  3. Sikre muskeltransplantatet til lårbenet periosteum med en enkelt 6-0 nylon avbrutt søm både proximally og distally med nerve-muskel krysset vendt bort fra lårbenet.
    MERK: Fest muskelen slik at den er i normal avslappet lengde. Prøv å ikke strekke muskelen betydelig eller la for mye slapphet når du sikrer.
  4. Plasser en 8-0 nylon søm på dårligere, sentral margin av muskel graft epimysium, sikre den til CP nerve epineurium på en måte som å skape slapphet i nerven i muskeltransplantatet og bidra til å lindre eventuelle fremtidige spenninger det kan bli utsatt for med senere ambulation.
  5. Fjern hudtransplantatet fra saltvannsfuktet gasbind og ordne den på muskeltransplantatet på en slik måte å dekke nerven og flertallet av muskelen. Sørg for at den dype marginen til dermis hviler på muskelen. Trim eventuelle dermis som strekker seg utover grensen av muskelen.
  6. Sikre huden graft til muskel graft omkrets ved hjelp av 8-0 nylon avbrutt suturer. Vanligvis brukes 4-8 totale suturer avhengig av størrelsen på konstruksjonen.
  7. Lukk biceps femoris fascia over konstruksjonen i en løpende måte med 5-0 krom sutur.
  8. Lukk den overliggende huden med 4-0 krotisk sutur i løpemote.
  9. Vattpinne det kirurgiske området med en alkoholpute og bruk antibiotikasalve.
  10. Oppslutt innåndingsbedøvelse og la rotte komme seg med mat- og vannkilder atskilt fra burkamerater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Konstruere fabrikasjon anses mislykket hvis rotter utvikler en infeksjon eller ikke overlever kirurgisk anestesi. Tidligere forskning har indikert at disse konstruksjonene krever ca tre måneder å revaskularisere og reinnervate2,3,17,36. Etter tre måneders gjenopprettingsperiode kan konstruksjonstesting forfølges for å undersøke levedyktighet. Kirurgisk eksponering av konstruksjonene etter tre måneder vil avsløre revaskunedmuskel og hud hvis vellykket (Figur 3). Til tider kan de frie muskel- og dermalgraftene bestå utelukkende av arrvev, og/eller nerven vil ikke bli festet til konstruksjonen; disse funnene indikerer et mislykket forsøk. Men hvis vellykket, mild klemming av den vanlige peroneal nerve med tang proksimal til konstruksjonen vil resultere i synlig muskel sammentrekning (Video 1). Histologisk analyse av konstruksjoner bør vise levedyktig hud, nerve og muskel (Figur 4). Immunfarging vil også avsløre motor og sensorisk nervereinering til henholdsvis nevromuskulære veikryss og sensoriske endeorganer (henholdsvis figur 5). Hvis den vanlige peroneale nerven ikke reinnervate disse vevene, vil immunflekker ikke demonstrere noen individuelle nervefibre i konstruksjonen med unntak av den implanterte nerven selv.

Elektrofysiologisk testing kan utføres på disse konstruksjonene in vivo (Figur 6); tidligere forskning er utført ved 3 og 9 måneder etter C-RPNI fabrikasjon36 (Tabell 1). Etter maksimal stimulering med en krokelektrode ved proksimale vanlige peroneal nerve bare distale til sin takeoff fra isjiasnerven, sammensatte muskelhandling potensialer (CMAP) kan måles på muskelkomponenten med synlig muskelsammentrekning. Typen elektrode som brukes ved muskelen kan variere i henhold til preferanse, men epimysial patch, epimysial pad, og bipolar sonde elektroder har blitt brukt med hell i denne forskningen. Gjennomsnittlig CMAP amplitude registrert på muskelen var 8,7 ± 1,6 mV ved 3 måneder og 10,2 ± 2,1 mV ved 9 måneder. Gjennomsnittlig ledningshastighet var 10 ± 1,2 m/s ved 3 måneder og 9,5 ± 0,6 m/s ved 9 måneder. Til sammenligning, CMAPs generert av fysiologisk EDL muskel vanligvis varierer fra 10-18 mV37. Etter stimulering ved dermalkomponenten i C-RPNI ble det produsert sammensatte sensoriske nervehandlingspotensialer (CSNAPs) ved den proksimale felles peronealnerve, med gjennomsnittlig CSNAP-amplitude som måler 113,7 ± 35,1 μV ved 3 måneder og 142,9 ± 63,7 μV ved 9 måneder. Figur 7 illustrerer CMAP- og CSNAP-signaler som er oppnådd under elektrofysiologisk testing i et grafisk format.

C-RPNI tjener til å forsterke nervens iboende mikrovoltsignal, og tidligere forskning har vist tilstrekkelig forsterkning fra mikrovolt til millivolt nivå38. Derfor, hvis en konstruksjon ikke gir dette nivået av forsterkning, anses det ikke som vellykket. Hvis enten dermal, muskel, eller begge komponentene i C-RPNI mislykkes, testing ville resultere i opptak som etterligner stimuleringsignal et benyttet. For muskelkomponenten spesielt, en suboptimal resultat (men en som fortsatt anses operativ) ville være en som har CMAP amplitude og ledning hastighet i området som faller mellom signalstimulering verdi og at av fysiologiskE EDL muskel. I tillegg kan disse signalene bli fortenuated og mangler den karakteristiske CMAP bølgeform (Figur 8A). Suboptimale resultater på nivået av dermalkomponenten kan oppstå, men er vanskelige å kvantifisere gitt at rotter ikke kan uttrykke kvaliteten på følelsen de opplever. Disse suboptimale resultatene innebærer vanligvis demping av bølgeformen med betydelig bakgrunnsstøy (Figur 8B). Men hvis det er betydelig arrdannelse eller kalling av hudtransplantatet, eller minimalt pode overlevde, vil ingen CSNAPs bli verdsatt til den proksimale felles peronealnerve uavhengig av stimuleringsverdi.

Figure 1
Figur 1: Illustrerende skjematisk av C-RPNI-konstruksjonen. Den vanlige peroneal nerve kan sees sikret mellom toppen dermal lag og bunn muskellag. Denne konstruksjonen er sikret til femur periosteum proximally og distally via EDLs sene veikryss. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: En billedlig representasjon av C-RPNI hos en pasient med transradial amputasjon. Brukeren danner en ønsket motorintensjon på hjernenivå (f.eks. pincer-grep), som overføres som et sprudlende motorsignal til C-RPNI via den implanterte perifere nerven. Dette signalet genererer et sammensatt muskelhandlingspotensial (CMAP) på muskelkomponenten, som registreres av implanterte elektroder og gjenkjennes av proteseenheten, og genererer ønsket bevegelse. Sensorer på enhetens fingertuppene gjenkjenner mengden trykk som genereres, og videresender denne informasjonen til en elektrode implantert i dermalkomponenten i C-RPNI. Disse signalene aktiverer de tilsvarende sensoriske endeorganene, og genererer et afferent sammensatt sensorisk nervehandlingspotensial (CSNAP) som overføres gjennom den perifere nerven til sensorisk cortex. Et eksempelsignal som genereres på hver komponent, er avbildet i de blå boksene som er avbildet ved siden av hver komponent. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: C-RPNI in vivo. (A) En C-RPNI umiddelbart etter fabrikasjon og ved (B) 3 måneder etter bygging på tidspunktet for elektrofysiologisk testing. Muskelkomponenten er det dype laget av konstruksjonen og dermal, overfladisk. Muskelvev er preget av (M), dermis (D) og vanlig peroneal nerve (N). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: C-RPNI histologi 6 måneder. C-RPNI H&E ved 6 måneder i (A) tverrsnitt og (B) langsgående seksjon. Muskel notert av (M), dermis (D) og nerve (N). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Immunbeisering av C-RPNI. (A) Representativt eksempel på et tverrsnitt av muskelvev, med røde piler som identifiserer nevromuskulære veikryss. En høyere forstørrelse av det sentrale nevromuskulære krysset (NMJ) er avbildet nederst til høyre. (B) Nærbilde av et nevromuskulært veikryss som er nevnt i prøven. For (A) og (B), rød farging (alfa-bungarotoxin) indikerer tilstedeværelse av kolinerge reseptorer i muskelvev; blå (neurofilament 200) spesifiserer tilstedeværelse av nevrofilamenter i nevronalt vev; og grønn (kolin acetyltransferase) bemerker spesielt motor neuron tilstedeværelse. (C)Representativt eksempel på et iDISCO-bilde med fokus på dermal-krysset, med røde piler som markerer sensoriske nevroner (hvit) som kommer inn i dermis. (D) On-lay visning av iDISCO demonstrere flere sensoriske nevroner (hvit, neurofilament 200). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Elektrofysiologisk testing skjematisk. Det øverste bildet er en illustrasjon av standard elektrodearrangement for testing av C-RPNI-konstruksjonene. Det er en patch og / eller sonde elektrode plassert på både muskel og dermal komponenter av C-RPNI, med en dobbel krok elektrode plassert på felles peroneal nerve proximally. Det nederste bildet er et in vivo eksempel på testordningen på et rotteemne. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Typisk C-RPNI elektrofysiologisk signalering. (A) Et enkelt CMAP-signal registrert på muskelkomponenten etter et 5,00 mA-signal som brukes på CP-nerven. (B) 24 CMAP generert av 5,00 mA stimulering på nerven. (C) Et enkelt CSNAP-signal registrert fra den proksimale CP-nerven etter dermalkomponentstimulering ved 900 μA. (D) En serie CSNAPs registrert fra den proksimale CP-nerven etter økende stimulering ved dermalkomponenten fra 500 μA til 1000 μA. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: Unormal C-RPNI-signalering. (A) En serie cmap innhentet mens ramping CP nerve stimulering fra 0,2 til 4 mA. Waveforms topp på forskjellige punkter og ikke klarer å gå tilbake til baseline, muligens indikerer defekte elektroder eller utilstrekkelig total konstruksjon funksjon. (B) Summering av CSNAPs oppnådd under stimulerende dermal komponent, ramping 0,1 til 5 mA. Disse funnene kan oppstå av en rekke årsaker, inkludert funksjonsfeil elektroden(e), dermal graft arrdannelse, og / eller nerveskade. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

3 måneders data CMAP Data (Stimulere CP nerve og registrere fra muskel graft) CSNAP Data (Stimulere hudtransplantat og ta opp fra CP-nerve)
Rotte-ID-nummer Konstruere vekt (g) Stimulering Amplitude (mA) Ledningshastighet (m/s) V Topp-til-Topp (mV) Stimulering Amplitude (mA) Ledningshastighet (m/s) V Topp-til-topp (μV)
4607 0.087 4.17 11.3 10.3 18 11.1 121
4608 0.15 1.65 11.1 17.1 7.7 6.5 136
4611 0.113 8.3 9.6 11.2 10 10 121
4613 0.116 3.18 10 9.6 1.44 8.3 134
4614 0.189 3 10.8 9.6 7.39 9 151
4616 0.122 5.2 9.4 14.9 1.8 9.1 100
4620 0.118 2.91 7.6 7.4 8.7 10 219
9 måneders data CMAP Data (Stimulere CP nerve og registrere fra muskel graft) CSNAP Data (Stimulere hudtransplantat og ta opp fra CP-nerve)
Rotte-ID-nummer Konstruere vekt (g) Stimulering Amplitude (mA) Ledningshastighet (m/s) V Topp-til-Topp (mV) Stimulering Amplitude (mA) Ledningshastighet (m/s) V Topp-til-topp (μV)
4687 0.238 1.35 9.6 18.2 0.99 11 181
4688 0.131 1.08 10 8.8 1.11 8 132
4689 0.26 1.26 9.6 21.8 1.9 8.6 237
4690 0.192 4.2 8.3 12.8 N/a N/a N/a
4691 0.213 1.38 10 18.6 6.6 8 153
4693 0.178 1.11 9.6 15.1 8.7 8.3 306

Tabell 1: Elektrofysiologisk testing av C-RPNIer ved 3- og 9-måneders etterbygging. For å få CMAP ble en opptakselektrode plassert på muskelen med en stimulerende elektrode på den proksimale vanlige peronealnerven. En rekke stimuleringer som økte i amplitude ble påført nerven til maksimale CMAP-verdier ble oppnådd og resultatene registrert. En lignende metodikk ble brukt på dermalkomponenten, men med opptakselektroden plassert på nerven og stimulerende elektrode på dermis. For sensorisk evaluering av rotte 4690 ved 9 måneder ble dermaltransplantatet funnet å være for arret til å tillate testing.

Video 1
Video 1: Muskelsammentrekning i en C-RPNI. Et par tang kan ses til venstre for videoen forsiktig klemme proksimale felles peroneal nerve. Dette resulterer i sammentrekning av muskelkomponenten i en 3 måneder gammel C-RPNI som er synlig for betrakteren. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C-RPNI er en ny konstruksjon som gir samtidig forsterkning av en målnerve motorefferent signaler med levering av afferent sensorisk tilbakemelding. Spesielt har C-RPNI unikt verktøy for de som lever med proksimale amputasjoner som deres motor og sensoriske fascicles kan ikke lett skilles mekanisk under operasjonen. I stedet benytter C-RPNI de iboende fortrinnsrett reinnervation egenskapene til nerven selv for å oppmuntre sensorisk fiber reinnervation å dermal sensoriske endeorganer og motorfibre til nevromuskulære veikryss.

Som C-RPNI fabrikasjon er avhengig av reinnervation evner av målet nerve, forsiktig håndtering av nerven er avgjørende under prosedyren. Under disseksjon, unngå direkte manipulering av, og traumer til, målet nerve. Hvis nerven må håndteres, anbefales det å manipulere epineurium eller omkringliggende bindevev i stedet. Selv om laboratoriet vårt ikke har møtt nevromadannelse i denne konstruksjonen, kan teoretisk sett betydelig nervetraumer øke risikoen. Et ekstra viktig skritt i prosessen er høsting av dermal grafts. Alt epidermalvev må fjernes fra hindpaw graft som beholdt epidermis kan øke risikoen for infeksjon og inkludering cyster under helbredelsesprosessen. Videre må dermal graftet være tilstrekkelig tynnet for å fremme imbibition og revaskularisering gjennom graftet og unngå betydelig iskemi og nekrose.

Selv om de fleste studier utført med C-RPNI har blitt utført på den vanlige peronealnerve, kan enhver blandet sensorisk nerve erstattes. En ren motor eller ren sensorisk nerve kan benyttes, men resultatene er vanskelige å forutsi og vil sannsynligvis resultere i enten i stor grad muskel eller dermal reinnervation, henholdsvis. Med hensyn til muskeltransplantatet, så lenge epimysium fjernes fra den delen som kontakter nerven, kan eventuelle muskeltransplantater som ligner i størrelse, benyttes så lenge det inneholdt tendinøs eller fascialvev i begge ender egnet for forankring til nærliggende periosteum. For dermal graft brukes glabrøst vev spesielt på grunn av potensialet for hårvekst etter pode. Ikke-glabrous hud ble tidligere forsøkt, men på grunn av vanskeligheten med å fjerne individuelle hårsekker, alle resulterende konstruksjoner hadde betydelig hårvekst, betennelse, og arrdannelse etter tre måneders modningsperioden. I tillegg kan andre rottearter brukes, men Lewis og Fischer rotter anbefales for dette eksperimentet, da mange andre rottearter vil selvlemleste sekundært til nervetransseksjon39,40.

Gitt forsinkelsen mellom prosedyre og resultater, er det vanskelig å vite på forhånd om noen endringer må gjøres til metoden. Infeksjon er en teoretisk risiko som sjelden oppstår av laboratoriet vårt, men hvis infeksjon oppstår, er det vanligvis responsivt på antibiotika. Av og til tygger rotter på snittene som forårsaker avsky, og dette kan behandles med utvasking, debridement og re-lukking. Hvis konstruksjonen etter tre måneder på eksponeringstidspunktet viser seg å være ikke-funksjonell og/eller arrete, er det flere mulige årsaker. Til tider, hvis nerven ikke er festet riktig til konstruksjonen med minst tre suturer, kan nerven rive fra konstruksjonen med ambulation. I tillegg kan muskel- og/eller dermaltransplantatene neketre, noe som forårsaker svikt. Vanligvis er dette et resultat av enten gjentatt infeksjon, dermal graft et for tykt, eller muskelen for skadet ved innhøsting for å gjenopprette riktig. I tillegg, hvis muskelen ikke er festet til periosteum ved hvilelengde, kan sammentrekning svekkes forårsaker utilstrekkelige signaler under testing. Til tider vil konstruksjonen virke levedyktig, men ikke klarer å produsere tilstrekkelige CMAP/CSNAPs på testing (5-10% av konstruksjoner, i gjennomsnitt). Dette kan være sekundært til svikt i utstyr, forhøyet elektrodeimpedans eller betydelig hudkalling. Hudkalling kan dempe og fullstendig blokkere signaltransduksjon hvis dermis ikke er tynnet riktig under fabrikasjon. Hvis noen av de foregående beskrevne hendelsene ses ofte under testprosessen, må man gå tilbake til protokollen og gjøre nødvendige endringer. I laboratoriets erfaring med over 90 vellykkede C-RPNI-konstruksjoner er feilfrekvensen vår <5 % og tilskrives vanligvis kirurgisk feil under fabrikasjon.

Metoder som vanligvis brukes til å forsterke eller registrere nervesignaler inkluderer fleksible nerveplater18,ekstra-nevrale mansjettelektroder19,20,21,22,23, vev penetrerende elektroder24,25,31,32, og intrafascicular elektroder26,27,28, som alle har blitt assosiert med vevsskade, aksonendegenerasjon og/eller arrvevdannelse. Denne arrdannelse er ofte tilskrevet kronisk indwelling fremmedlegemer respons29 og skjær stress indusert av forskjeller i Youngs moduli30. C-RPNI er imidlertid en biologisk konstruksjon og induserer dermed ikke antistoffrespons i nevrale vev. I tillegg er de mekaniske egenskapene flere faktorer nærmere nevrale vev enn elektroder. Histologisk analyse av disse prøvene har ikke vist noen signifikant grad av arrvevdannelse i nerven med kronisk bruk, slik at C-RPNI kan grensesnitt med nerven i lengre perioder sammenlignet med metodene som er nevnt ovenfor. Selv om denne metoden er svært effektiv ved forsterkning av efferent motorsignaler, er den begrenset med hensyn til sensorisk afferent signalproduksjon. Vi har målt og preget signaltransduksjon produsert med mekanisk og elektrisk stimulering av dermalkomponenten i C-RPNI36; Disse rotteforsøkene kan imidlertid ikke kvalifisere typen eller graden av opplevelser som fremkommer fra stimulering av denne konstruksjonen. Som sådan, på dette tidspunktet er det umulig å vite hva slags effekt C-RPNI produserer med hensyn til sensasjon. Fremtidige retninger for denne konstruksjonen vil omfatte karakterisering av signaler produsert i proksimale nerve følgende spesifikke gitte stimuli (f.eks varme, smerte, trykk, etc.) samt korrelasjon med somatosensorisk fremkalt potensialer generert i sensorisk cortex av gnagerhjernen. Det er laboratoriets mål å etablere et omfattende grunnlag for C-RPNIer som vil bane vei for klinisk oversettelse til menneskelige.

Forgjengeren til C-RPNI, RPNI (regenerativ perifernervegrensesnitt), består av en fri muskeltransplantat festet til en transreist nerve, med motorfibre som reinnerverer tidligere bulket nevromuskulære veikryss. RPNI har vist nytte hos mennesker, med flere pasienter som kontrollerer avanserte proteser fra signaler forsterket av og registrert fra disse RPNIs34. Videre har disse RPNIene vist gunstige behandlingseffekter utover protesekontroll, med flere foreløpige retrospektive og prospektive studier som viser redusert neuromadannelse, kronisksmerte og fantomlemsmerter hos de pasientene med ekstremitetamputasjoner. Til tross for disse suksessene, en vanlig klage for de som bruker disse avanserte proteser, er imidlertid behovet for å visualisere protesen under bruk som disse protesene mangler proprioception og gi minimal sensorisk tilbakemelding. C-RPNI kan være en løsning på denne vanlige kritikken ved å gi en måte å levere sensorisk tilbakemelding via dermal komponenten, noe som fører til realisering av den etterlengtede, ideelle protesen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Jana Moon for ekspert teknisk assistanse. Studier som ble presentert i denne artikkelen ble finansiert gjennom et R21 (R21NS104584) stipend til SK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#15 Scalpel Aspen Surgical, Inc Ref 371115 Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15)
4-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 1654G P-3 Reverse Cutting Needle
5-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 687G P-3 Reverse Cutting Needle
6-0 Ethilon Suture Ethicon SKU# 697G P-1 Reverse Cutting Needle (Nylon suture)
8-0 Monofilament Suture AROSurgical T06A08N14-13 Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle
Experimental Rats Envigo F344-NH-sd Rats are Fischer F344 Strain
Fluriso (Isofluorane) VetOne 13985-528-40 Inhalational Anesthetic
Micro Motor High Speed Drill with Stone Master Mechanic Model 151369 Handheld rotary tool; kit comes with multiple fine grit stones
Oxygen Cryogenic Gases UN1072 Standard medical grade oxygen canisters
Potassium Chloride APP Pharmaceuticals 63323-965-20 Injectable form, 2 mEq/mL
Povidone Iodine USP MediChoice 65517-0009-1 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps
Puralube Vet Opthalmic Ointment Dechra 17033-211-38 Corneal protective ointment for use during procedure
Rimadyl (Caprofen) Zoetis, Inc. NADA# 141-199 Injectable form, 50 mg/mL
Stereo Microscope Leica Model M60 User can adjust magnification to their preference
Surgical Instruments Fine Science Tools Various User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab
Triple Antibiotic Ointment MediChoice 39892-0830-2 Ointment comes in sterile, disposable packets
VaporStick 3 Surgivet V7015 Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister
Webcol Alcohol Prep Coviden Ref 6818 Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biddiss, E. A., Chau, T. T. Upper limb prosthesis use and abandonment: A survey of the last 25 years. Prosthetics and Orthotics International. 31 (3), 236-257 (2007).
  2. Kung, T. A., et al. Regenerative peripheralnerve interface viability and signal transduction with an implanted electrode. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1380-1394 (2014).
  3. Larson, J. V., et al. Prototype Sensory Regenerative Peripheral Nerve Interface for Artificial Limb Somatosensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3 Suppl), 26-27 (2014).
  4. Hijjawi, J. B., et al. Improved myoelectric prosthesis control accomplished using multiple nerve transfers. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (7), 1573-1578 (2006).
  5. Pylatiuk, C., Schulz, S., Döderlein, L. Results of an Internet survey of myoelectric prosthetic hand users. Prosthetics and Orthotics International. 31 (4), 362-370 (2007).
  6. Baghmanli, Z., et al. Biological and electrophysiologic effects of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) on regenerating peripheral nerve fibers. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (2), 374-385 (2013).
  7. Dhillon, G. S., Horch, K. W. Direct neural sensory feedback and control of a prosthetic arm. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 13 (4), 468-472 (2005).
  8. Romo, R., Hernández, A., Zainos, A., Salinos, E. Somatosensory discrimination based on cortical microstimulation. Nature. 392, 387-390 (1998).
  9. O'Doherty, J., et al. Active tactile exploration using a brain-machine-brain interface. Nature. 479, 228-231 (2011).
  10. Stein, R. B., Walley, M. Functional comparison of upper extremity amputees using myoelectric and conventional prostheses. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 64 (6), 243-248 (1983).
  11. Millstein, S. G., Heger, H., Hunter, G. A. Prosthetic Use in Adult Upper Limb Amputees: A Comparison of the Body Powered and Electrically Powered Prostheses. Prosthetics and Orthotics International. 10 (1), 27-34 (1986).
  12. Zollo, L., et al. Restoring tactile sensations via neural interfaces for real-time force-and-slippage closed-loop control of bionic hands. Science Robotics. 4 (27), eaau9924 (2019).
  13. Tan, D. W., et al. A neural interface provides long-term stable natural touch perception. Science Translational Medicine. 6 (257), 257ra138 (2014).
  14. Stieglitz, T., et al. On Biocompatibility and Stability of Transversal Intrafascicular Multichannel Electrodes-TIME. Converging Clinical and Engineering Research on Neurorehabilitation II. 15, 731-735 (2017).
  15. Petrini, F. M., et al. Six-months assessment of a hand prosthesis with intraneural tactile feedback. Annals of Neurology. 85 (1), 137-154 (2019).
  16. Jung, R., Abbas, J., Kuntaegowdanahalli, S., Thota, A. Bionic intrafascicular interfaces for recording and stimulating peripheral nerve fibers. Bioelectronics in Medicine. 1 (1), 55-69 (2018).
  17. Micera, S., Navarro, X., Yoshida, K. Interfacing With the Peripheral Nervous System to Develop Innovative Neuroprostheses. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (5), 417-419 (2009).
  18. Stieglitz, T., Schuettler, M., Schneider, A., Valderrama, E., Navarro, X. Noninvasive measurement of torque development in the rat foot: measurement setup and results from stimulation of the sciatic nerve with polyimide-based cuff electrodes. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 11 (4), 427-437 (2003).
  19. Polasek, K. H., Hoyen, H. A., Keith, M. W., Tyler, D. J. Human nerve stimulation thresholds and selectivity using a multi-contact nerve cuff electrode. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 15 (1), 76-82 (2007).
  20. Nielson, K. D., Watts, C., Clark, W. K. Peripheral nerve injury from implantation of chronic stimulating electrodes for pain control. Surgical Neurology. 5 (1), 51-53 (1976).
  21. Waters, R. L., McNeal, D. R., Faloon, W., Clifford, B. Functional electrical stimulation of the peroneal nerve for hemiplegia. Long-term clinical follow-up. Journal of Bone and Joint Surgery. 67 (5), 792-793 (1985).
  22. Larsen, J. O., Thomsen, M., Haugland, M., Sinkjaer, T. Degeneration and regeneration in rabbit peripheral nerve with long-term nerve cuff electrode implant: a stereological study of myelinated and unmyelinated axons. Acta Neuropathologica. 96 (4), 365-378 (1998).
  23. Krarup, C., Loeb, G. E., Pezeshkpour, G. H. Conduction studies in peripheral cat nerve using implanted electrodes: III. The effects of prolonged constriction on the distal nerve segment. Muscle Nerve. 12 (11), 915-928 (1989).
  24. Micera, S., Navarro, X. Bidirectional interfaces with the peripheral nervous system. International Review of Neurobiology. 86, 23-38 (2009).
  25. Urbanchek, M. G., et al. Microscale Electrode Implantation during Nerve Repair: Effects on Nerve Morphology, Electromyography, and Recovery of Muscle Contractile Function. Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (4), 270e-278e (2011).
  26. Yoshida, K., Horch, K. Selective stimulation of peripheral nerve fibers using dual intrafascicular electrodes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (5), 492-494 (1993).
  27. Branner, A., Stein, R. B., Normann, R. A. Selective stimulation of cat sciatic nerve using an array of varying length microelectrodes. Journal of Neurophysiology. 85 (4), 1585-1594 (2001).
  28. Zheng, X. J., Zhang, J., Chen, T., Chen, Z. Longitudinally implanted intrascicular electrodes for stimulating and recording fascicular physioelectrical signals in the sciatic nerve of rabbits. Microsurgery. 23, 268-273 (2003).
  29. del Valle, J., Navarro, X. Interfaces with the peripheral nerve for the control of neuroprostheses. International Review of Neurobiology. 109, 63-83 (2013).
  30. Stiller, A. M., et al. A Meta-Analysis of Intracortical Device Stiffness and Its Correlation with Histological Outcomes. Micromachines. 9 (9), 443 (2018).
  31. Hanson, T., Diaz-Botia, C., Kharazia, V., Maharbiz, M., Sabes, P. The "sewing machine" for minimally invasive neural recording. bioRxiv. , Published online (2019).
  32. Yang, X., et al. Bioinspired neuron-like electronics. Nature Materials. 18, 510-517 (2019).
  33. Irwin, Z. T., et al. Chronic recording of hand prosthesis control signals via a regenerative peripheral nerve interface in a rhesus macaque. Journal of Neural Engineering. 13 (4), 046007 (2016).
  34. Kubiak, C. A., et al. Abstract 24: Successful Control of Virtual and Robotic Hands using Neuroprosthetic Signals from Regenerative Peripheral Nerve Interfaces in a Human Subject. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (4), 19-20 (2018).
  35. Sando, I. C., et al. Dermal-Based Peripheral Nerve Interface for Transduction of Sensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (4 Suppl), 19-20 (2015).
  36. Kubiak, C. A., et al. Abstract 36: Viability and Signal Transduction with the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI). Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4), 26-27 (2019).
  37. Kubiak, C. A., et al. Abstract QS18: Neural Signal Transduction with the Muscle Cuff Regenerative Peripheral Nerve Interface. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4 Suppl), 114 (2019).
  38. Woo, S. L., et al. Utilizing nonvascularized partial skeletal muscle grafts in peripheral nerve interfaces for prosthetic control. Journal of the American College of Surgeons. 219 (4), e136-e137 (2014).
  39. Sporel-Özakat, R. E., Edwards, P. M., Hepgul, K. T., Savas, A., Gispen, W. H. A simple method for reducing autotomy in rats after peripheral nerve lesions. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 263-265 (1991).
  40. Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).

Tags

Bioengineering Utgave 156 perifert nervegrensesnitt protesekontroll C-RPNI nevrale tilbakemeldingssystem
Fabrikasjon av komposittregenerativt perifert nervegrensesnitt (C-RPNI) hos voksenrotte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Svientek, S. R., Ursu, D. C.,… More

Svientek, S. R., Ursu, D. C., Cederna, P. S., Kemp, S. W. P. Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (156), e60841, doi:10.3791/60841 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter