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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Monitorización del conjunto eIF4F midiendo la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas

Published: May 1, 2020 doi: 10.3791/60850
Automatic Translation
, ,
1p53 Laboratory, Neuros/Immunos, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para medir la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas que permitiría al usuario evaluar la perturbación inducida por fármacos de dinámicas complejas eIF4F en formatos de cribado.

Abstract

Se ha demostrado que la formación del complejo eIF4F es el nodo descendente clave para la convergencia de vías de señalización que a menudo se someten a activación oncogénica en humanos. eIF4F es un complejo de unión a la tapa que participa en la fase de reclutamiento del ARNm-ribosoma de iniciación de traducción. En muchos modelos celulares y preclínicos de cáncer, la desregulación del eIF4F conduce a una mayor traducción de subconjuntos específicos de ARNm que están involucrados en la proliferación y supervivencia del cáncer. eIF4F es un complejo hetero-trimérico construido a partir de la subunidad de unión a la tapa eIF4E, el eIF4A helicaso y el subunit de andamios eIF4G. Fundamental para el montaje de complejos activos eIF4F es la interacción proteína-proteína entre las proteínas eIF4E y eIF4G. En este artículo, describimos un protocolo para medir el ensamblado eIF4F que supervisa el estado de la interacción eIF4E-eIF4G en celdas vivas. El ensayo de interacción proteína-proteína basado en células eIF4e:4G también permite evaluar con precisión y fiabilidad los cambios inducidos por fármacos en la integridad compleja del fei4F. Vislumbramos que este método puede aplicarse para verificar la actividad de compuestos disponibles comercialmente o para un mayor cribado de nuevos compuestos o modalidades que interrumpan eficientemente la formación del complejo eIF4F.

Introduction

El control de la expresión génica desempeña un papel fundamental en la correcta ejecución de programas celulares como la proliferación del crecimiento y la diferenciación. Se puede ejercer un mecanismo de control reglamentario ya sea a nivel de transcripción genética o a nivel de traducción de ARNm. En la última década, se ha hecho cada vez más evidente que el control traslacional mediante la modulación del proceso de iniciación en lugar de los pasos posteriores de alargamiento y terminación puede regular finamente la síntesis de subconjuntos específicos de proteínas que desempeñan una amplia gama de funciones biológicas.

El aumento de la traducción de los MRNAs implicados en la supervivencia, las respuestas anti-autofágicas y anti-apoptóticas se ha implicado en varios tipos de cáncer y también se ha relacionado causalmente con la activación aberrante o con la expresión excesiva de los factores de iniciación a la traducción1.

El complejo eIF4F es un regulador maestro de la iniciación de la traducción. Al enlazar la estructura de la tapa en el extremo de 5' de losRNAs, eIF4F está impulsando la contratación inicial de ARNm-ribosoma y, a su vez, aumentando la eficiencia de traducción de ARNm de ARNM eucariota débilmente traducida2. Se ha notificado una traducción mediada por eIF4F de los mRNAs relacionados con el cáncer para muchos modelos de cáncer que albergan la activación aberrante de las vías RAS/MAPK o AKT/TOR, lo que sugiere que las células cancerosas upregulan eIF4F para impulsar su propia actividad pro-neoplástica. La interrupción de este bucle avance mediante la inhibición de la formación compleja eIF4F es por lo tanto una estrategia terapéutica muy prometedora3,4.

El complejo eIF4F consiste en (i) eIF4E, la subunidad de unión a la tapa de eIF4F que interactúa con la estructura de la tapa que se encuentra en el 5' UTR de ARNm, (ii) eIF4A, la helicasa de ARN y (iii) eIF4G, la proteína andamio que interactúa tanto con eIF4A como con eIF4E y que finalmente recluta el 40S ribosomal subu5nit. La asociación eIF4G con eIF4E es el paso limitante de velocidad para el montaje de complejos funcionales eIF4F y está regulada negativamente por las proteínas de unión eIF4E (4EBPs, miembros 1, 2 y 3))6. Al competir con el enlace eIF4G a eIF4E a través de una interfaz que consiste en secuencias de enlace eIF4E canónicas y no canónicas7,8,9 (región que abarca aa 604-646 en eIF4E humano), 4EBP reduce el grupo de eIF4E involucrado activamente en la traducción y prevención de la formación compleja eIF4F. La interacción entre estas interacciones proteína-proteína está regulada principalmente por el objetivo de los mamíferos de la fosforilación mediada por la rapamicina (mTOR) de 4EBP. Tras los estímulos mitogénicos, mTOR fosforila directamente a los miembros de la familia proteica 4E-BP, disminuyendo su asociación con eIF4E y, por lo tanto, promoviendo la interacción eIF4E-eIF4G y la formación de complejos funcionales eIF4F10.

A pesar del gran esfuerzo en el desarrollo de compuestos dirigidos a la integridad compleja eIF4F, la falta de ensayos que miden la interrupción directa de la interacción eIF4E-eIF4G en las células vivas ha limitado la búsqueda de compuestos de golpe activo celular. Hemos aplicado un ensayo luciferasa basado en un análogo de coelenterazina (por ejemplo, ensayo de complementación basado en Nanoluc) para monitorear en tiempo real el estado de integridad de eIF4F a través de la interacción eIF4E-eIF4G. El sistema de proteínas de complementación luciferasa consiste en un fragmento de proteína de 18 kDa (SubA) y 11 fragmentos de péptido de aminoácidos (SubB) optimizados para una mínima auto-asociación y estabilidad11. Una vez expresado como un producto de fusión con el eIF4E de longitud completa humana y el dominio de interacción eIF4E del eiF4G1 humano (aa 604-646), las dos proteínas que interactúan acercarán el fragmento SubA y SubB entre sí e inducirán la formación de la luciferasa activa que, en presencia de un sustrato permeable celular, eventualmente generará una señal luminiscente brillante(Figura 1). Hemos informado en otros lugares de la construcción y validación del sistema de complementación eIF4E:eIF4G604-646 16.

Aquí, describimos cómo el sistema de complementación eIF4E:eIF4G604-646 (disponible bajo petición) se puede aplicar para medir con precisión la interrupción eIF4E-eIF4G mediada por 4EBP1 en las células vivas. Además, demostramos su utilidad midiendo los efectos de varios inhibidores de mTOR que actualmente están bajo ensayos clínicos como posibles fármacos terapéuticos contra el cáncer12. Debido a que los efectos fuera del objetivo a menudo enmascaran la actividad específica de drogas, también describimos cómo la versatilidad de la medición del sistema eIF4E:eIF4G604-646 se puede ampliar con mediciones ortogonales de viabilidad celular para tenerlas en cuenta.

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Protocol

La línea celular HEK293 se utilizó para el protocolo y fue cultivada en el Medio águila modificada de Dulbecco complementado con 10% suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, y 100 penicilina U/mL/ estreptomicina. Las células se cultivaban a 37 °C con un 5% de CO2 en un ambiente humidificado.

1. Evaluación cuantitativa de la interrupción compleja del fei4F a través de eIF4E:eIF4G604-646 ensayo de complementación

  1. Cultivo celular y transfección transitoria de eIF4E:eIF4G604-646 ensayo de complementación
    1. Utilice células recién descongeladas con menos de 20 pasajes para todos los experimentos. El día 1, determine el número de celda mediante un contador de celdas estándar y cuente las celdas viables totales mediante el método de exclusión azul Trypan13.
    2. Semillas 6-well placas con 0.9 - 1.2 x 106 de HEK 293 células por pozo en 2 mL de medio de crecimiento estándar.
      NOTA: Con el fin de lograr la mejor eficiencia de transfección dentro de las líneas celulares indicadas anteriormente, asegúrese de que las células chapadas sean 70-90% confluentes el día después de la siembra.
    3. En la mañana del día 2, co-transfectar células con SubA-eIF4E y eIF4G604-646-Plásmido SubB utilizando un reactivo de transfección basado en lípidos (ver Tabla de Materiales)como se describe a continuación.
      1. Diluir 9 μL de solución a base de liposomas en un tubo que contenga 125 μL de medio sérico reducido sin rojo fenol (ver Tabla de Materiales)para cada transfección e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
      2. Preparar la mezcla maestra de ADN diluyendo 3 μg de cada plásmido en 125 μL de medio sérico reducido para cada tubo de transfección.
      3. Añadir 12 μL de reactivos potenciadores al tubo de mezcla maestro del ADN, mezclar bien e inmediatamente añadir el ADN: mezcla maestra potenciador a cada tubo de liposomas diluidos en una relación 1:1. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
      4. Añadir el complejo ADN-lípidos a cada pozo e incubar las células en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2 para 24 h.
    4. En la mañana del día 3, enjuague cada pozo con 1 ml de PBS.
    5. Retire el PBS e incuba las células en cada pozo con 0,3 ml de trypsin durante 5 minutos a 37 °C.
    6. Neutralize la trippsina añadiendo 2 ml del medio sérico reducido sin rojo fenol que contenga un 0% de FCS en cada pozo y transfiera las células transfectadas a un tubo de 15 ml.
      NOTA: Phenol rojo puede interferir con la actividad luciferasa; por lo tanto, las células deben ser manejadas a partir de este paso hacia adelante en medio sin fenol rojo.
    7. Gire hacia abajo las células durante 5 minutos a 290 x g y aspire el medio. Resuspend las células en 2 ml del medio sérico reducido sin fenol rojo que contiene 0% FCS. Cuente como se describe en el paso 1.1.
    8. Células HEK 293 transfectadas por semillas en 96 placas opacas de pozo a una densidad de 30.000 células por pozo en 90 μL de medio sin fenol rojo que contenga un 0% de FCS. Con el fin de obtener 3 réplicas técnicas dentro del mismo experimento para 3 compuestos diferentes, sembrar 60 pozos de las placas con células excluyendo los pozos en los bordes.
    9. Inmediatamente después de sembrar las células transfectadas, agregue 10 μL de solución compuesta DMSO al 10% (ver paso 1.2).
  2. Preparación de compuestos
    1. Prepare soluciones de stock compuesto de 1 mM disolviendo el compuesto de interés en 100% DMSO (v/v). Para tener 3 réplicas para cada valoración compuesta, utilice 8 μL de la solución de stock compuesto de 1 mM.
      NOTA: El volumen de compuesto de stock de 1 mM utilizado es más de lo que se necesita. Esto se hace para tener en cuenta los errores de pipeteo si los hay.
    2. Realice una dilución serie de 2 veces la solución compuesta de stock con 4 μL de la caldo de 1 mM en 4 μL de 100% DMSO para cada punto de valoración.
      NOTA: Para una valoración compuesta completa, realice 9 diluciones en serie del stock inicial en 100% DMSO. Si es necesario probar varios compuestos, utilice una placa de pozo 96 y una pipeta multicanal para facilitar este paso y las diluciones posteriores.
    3. Añadir 36 μL de agua estéril de grado HPLC para cada punto de la dilución serie de 2 veces para preparar un 40 μL de soluciones de trabajo de 10x en un 10% de DMSO (v/v) (es decir. 100 μM a 0,39 μM 10% serie de stock DMSO dará lugar a una solución final de 10 μM a 0,039 μM, en 1% DMSO cuando se agrega a las células). En cuanto al control del tratamiento, también prepare una solución de stock dmso del 10% en agua estéril de grado HPLC.
    4. Añadir 10 μL de soluciones de trabajo de 10x a las células de la placa opaca de 96 pozos para producir la concentración final prevista con una concentración dmso residual del 1% (v/v) en un volumen total de 100 μL e incubar durante 3 h a 37 °C con un 5% de CO atmosférico v/v2.
  3. Ensayo de complementación y viabilidad luciferasa
    1. Después de 3 h de drogado, comience a preparar el reactivo de sustrato luciferasa combinando 1 volumen de sustrato con 19 volúmenes del reactivo de dilución (consulte las instrucciones del fabricante).
      NOTA: El ensayo luciferasa se realiza utilizando un kit disponible comercialmente (véase Tabla de materiales).
    2. Utilice una pipeta multicanal para añadir inmediatamente 25 μL de reactivo de sustrato.
    3. Agitar la placa a 350 rpm durante 50 minutos en un agitador orbital a temperatura ambiente.
    4. Evalúe la luminiscencia utilizando un lector de placas. Para ello, ajuste el lector de espejos sobre la luminiscencia y el filtro de emisión en 455. Utilice una altura de medición de 6,5 mm con un tiempo de medición de 1 s.
    5. Con el fin de asesar la viabilidad de la célula, añadir 33 μL de reactivo de ensayo de viabilidad y luego volver a medir la luminiscencia de nuevo después de 15 min a temperatura ambiente, utilizando el lector de placas.
    6. Evalúe la luminiscencia con el lector de placas estableciendo el lector de espejos en Luminiscencia y el filtro de emisión en 600 nm. Utilice una altura de medición de 6,5 mm con un tiempo de medición de 1 s.
      NOTA: La viabilidad se evalúa midiendo el nivel intracelular de ATP en la lisis celular según las instrucciones del fabricante. Multiplexación es posible en este caso ya que el ensayo de viabilidad utiliza una luciferasa diferente con una longitud de onda de emisión diferente.
    7. Utilice los datos para determinar los valores IC50 de cada compuesto ajustando los datos a una ecuación de curva de ajuste de 4 parámetros:
      Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B)))) + D
      Los valores numéricos D y A deben restringirse en el proceso de ajuste de curva:
      D = valor luminiscente en el eje Y para un asimptoto de curva mínimo o un nivel teórico mínimo de respuesta esperado del ensayo de complementación eIF4E:4G.
      A = valor luminiscente en el eje Y para asímptoto de curva máxima o respuesta máxima de nivel teórico esperada del ensayo de complementación eIF4E:4G.
      NOTA: El valor de la respuesta mínima se deriva del tratamiento de control 1% DMSO (v/v) y el valor de la respuesta máxima se deriva de la respuesta máxima de un inhibidor de mTOR de alta afinidad que se ha estancado sin ningún efecto sobre la viabilidad celular.

2. Correlación eIF4E:eIF4G604-646 inhibición del ensayo con interrupción del complejo eIF4F en las células

  1. Para confirmar que la señal que está midiendo el ensayo corresponde a la interrupción física de la interacción eIF4E-eIF4G por el compuesto, células de semillas como se describe en el paso 1.1.
  2. Al día siguiente, sustituir el medio por 1 ml de medio sérico reducido que no contenga fenol rojo e incubar durante 4 h por el compuesto de interés. Asegurar una concentración residual de DMSO del 1% (v/v) en un volumen total de 1 mL.
    NOTA: Con el fin de permitir fácilmente una correlación con el resultado, utilice concentraciones compuestas al principio, punto medio y punto final de la curva de valoración del ensayo de complemento medido.
  3. Lilas y realizóm7GTP tirar hacia abajo para aislar los complejos eIF4F y eIF4E:4EBP1. Los procedimientos detallados sobre cómo realizar el m7GTP pull down experiment se pueden encontrar en otro lugar14.
  4. Detecte los nivelesdeproteína eIF4G, eIF4E y 4EBP1 vinculados a m7 GTP mediante el análisis de manchas occidentales y, a continuación, correlacione con la interrupción del complejo eIF4F con la inhibición de la señal de ensayo de complemento.

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Representative Results

Con el fin de validar la sensibilidad del sistema de complementación eIF4E:eIF4G604-646, se evaluó la inhibición mediada de 4EBP1 del conjunto complejo eIF4F mediante inhibidores de mTOR. Al inhibir la fosforilación dependiente de la quinasa mTORC1 de la familia de proteínas 4EBP, la inhibición del mTOR mejora la asociación 4EBP1 a eIF4E y, por lo tanto, el desmontaje eIF4F15. Se probaron dos clases de inhibidor mecanicísticamente diferente de las quinasas mTOR: los rapalogs (por ejemplo, rapamicina) que son inhibidores alotéricos de mTORC1 pero no de inhibidores basados en la competencia de la ATP (por ejemplo, PP242) que están diseñados para inhibir específicamente la actividad catalítica de la quinasa mTORC1 y mTORC2.

Las células HEK293 fueron transfectadas con el sistema de complementación eIF4E:eIF4G604-646 como se describe en el paso 1. Después de 24 h de transfección, las células fueron re-sembradas y tratadas con los inhibidores de mTOR PP242 y rapamicina (como se describe en el paso 1.2). Cuatro horas después del tratamiento, se evaluó la luminiscencia, como se describió anteriormente, seguida de la viabilidad celular. Como se muestra en la Figura 2,PP242 produce una inhibición dependiente de la dosis de la señal con un IC50 calculado de 0,72 ± 0,04 μM, mientras que un IC50 de 6,88 ± 0,88 μM se deriva para la rapamicina (Figura 2A). A continuación, las placas se multiplexaron para el ensayo de viabilidad celular (Figura 2D). Este análisis muestra que ni PP242 ni rapamicina producen una disminución significativa en la viabilidad celular, lo que demuestra que la disminución de la luminiscencia en el sistema de complementación eIF4E:eIF4G604-646 no se debe a la muerte celular inespecífica, sino a la interrupción de la interacción eIF4E:4G.

Un experimento de extracción de m7GTP realizado mediante la incubación de células no infectadas con concentraciones compuestas que corresponden a los puntos inicial, medio y final de la curva de valoración medida en la Figura 2A muestra que la interrupción mediada por 4EBP1 de la interacción eIF4E-eIF4G endógena se correlaciona con la señal de ensayo eIF4E:eIF4G604-646 medida ( Figura2B, 2C). En consonancia con estos resultados, PP242 se muestra como un inhibidor más potente de la fosforilación total 4EBP1 que la rapamicina en las condiciones experimentales probadas en las células HEK 293(Figura 3A),mientras que ambos inhibidores mostraron un impacto en la señalización mTOR normalmente, con la rapamicina siendo más activa contra los sustratos mTORC1 y PP242 apuntando tanto a mTORC1 como a mTORC2(Figura 3B).

En conjunto, estos resultados mostraron que PP242 es más eficaz para interrumpir la formación compleja eIF4F que la rapamicina en células HEK293 y demuestran además que el sistema eIF4E:eIF4G604-646 puede medir con precisión el conjunto complejo eIF4F en las células vivas.

Figure 1
Figura 1: eIF4E:eIF4G604-646 sistema de complementación. La representación esquemática que muestra cómo la interacción de la proteína X (eIF4E) y la proteína Y (eIF4G604-646)permite que las fusiones SubA y SubB se acercan entre sí y reconstituyen la luciferasa activa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Interrupción mediada por 4EBP1 del complejo eIF4F. (A) PP242 y rapamicina eIF4E:eIF4G604-646 ensayo de valoración modelando la interacción entre eIF4E y eIF4G en células HEK 293 transfectadas. (B,C) Análisis de manchas occidentales que muestran el nivel endógeno de eIF4E, eIF4G y 4EBP1 en extractos HEK 293 y en m7GTP tirar hacia abajo después de la incubación de células cultivadas con diferente concentración de PP242 o Rapamicina respectivamente. (D) Células tratadas en A donde se multiplexaron para la viabilidad celular y la luminiscencia evaluadas. Todos los valores representan la media ± SD (n=3). Esta cifra se ha modificado a partir de16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Efecto diferencial de la inhibición del mTOR en la phoshorylation 4EBP1. (A) Análisis de mancha occidental del estado de fosforilación de 4EBP1 en células HEK293 no transfectadas tratadas con concentración indicada de PP242 y rapamicina. B) Análisis de mancha occidental del estado de fosforilación AKT y S6 en células HEK293 no transfectadas tratadas con los inhibidores de sitios activos duales MTORC1/2 PP242, o el inhibidor alotérico de la rapamicina mTORC1. Beta actin se visualizó para el control de carga, así como un total de 4EBP1, AKT y S6. Esta cifra se ha modificado a partir de16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El método descrito en este artículo utiliza un ensayo de complementación basado en luciferasa para monitorear cuantitativamente el montaje complejo eIF4F a través de la medición directa de la interacción eIF4G-eIF4E en células vivas. Hemos proporcionado detalles para el uso del sistema de complementación eIF4E-eIF4G y también hemos demostrado que el sistema es extremadamente preciso en la medición de la disociación mediada por 4EBP1 inducida por fármacos de la interacción eIF4E-eIF4G16. Con el fin de facilitar el rendimiento de este ensayo, la configuración experimental descrita en este artículo ha sido diseñada para un uso de formato de microplaca de 96 pozos.

Para obtener resultados óptimos, se deben considerar dos pasos críticos al realizar el ensayo. En primer lugar, la eficiencia de transfección entre experimentos debe seguir siendo similar. Esto se puede asegurar mediante el uso de células de número de paso bajo, y contando rigurosamente las células el día de la siembra. La confluencia celular también debe evaluarse antes de que se lleve a cabo la transfección del ADN, ya que no se recomienda transfectar células con reactivo de transfección a base de lípidos si la confluencia celular es inferior al 70-90%. En segundo lugar, es importante multiplexar el ensayo de complementación con un ensayo de viabilidad celular. Algunos compuestos pueden afectar la señal luciferasa principalmente mediante la disminución del número de células viables a través de efectos perjudiciales. Por lo tanto, es importante medir la viabilidad de la célula inmediatamente después del ensayo de complementación eIF4E:eIF4G604-646 para abordar los efectos fuera de objetivo y no específicos.

Las interfaces proteína-proteínas, como la entre eIF4E y eIF4G, que están desprovistas de hendiduras hidrofóbicas y son relativamente grandes y planas, generalmente se consideran "poco farmacológicas" por las terapias convencionales de moléculas pequeñas (<500 MW)17. Por lo tanto, existe un creciente interés en el desarrollo de modalidades novedosas que interactúen eficientemente con este tipo de superficies (por ejemplo, compuestos macrocíclicos y péptidos). Sin embargo, muchas de estas modalidades novedosas no son innatamente capaces de cruzar la membrana celular y atacar a su objetivo. Para eludir estos problemas, muchos grupos de investigación están llevando a cabo investigaciones sobre nuevas estrategias de optimización química y entrega celular. Imaginamos que el ensayo PPI de células vivas eIF4E:eIF4G604-646 y otros ensayos derivados de IBP similares desempeñarán un papel fundamental en el fomento de estas estrategias y su validación.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el presupuesto básico del p53lab (BMSI, A*STAR) y la subvención VIP de JCO (A*STAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
Cell culture microplate 96 well, F-Bottom greiner bio-one 655083
Cell titer Glo 2.0 PROMEGA G9241
Envision Multilabel Reader PerkinElmer not applcable
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml Thermo Fisher Scientific 4662070
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml Thermo Fisher Scientific 4662050
FUGENE6 PROMEGA E2692
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems PROMEGA N2014
Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red Thermo Fisher Scientific 11058021
Orbital shaker Eppendorf not appicable
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose Jena Bioscience AC-155S

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References

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Investigación del cáncer Número 159 Biología Celular complejo eIF4F Control traslacional Ensayo de complementación luciferasa señalización mTOR interacciones proteína-proteína
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Frosi, Y., Ramlan, S. R., Brown, C.… More

Frosi, Y., Ramlan, S. R., Brown, C. J. Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells. J. Vis. Exp. (159), e60850, doi:10.3791/60850 (2020).

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