Summary
目前分析患者是否遵守复杂耐药结核病（DR-TB）方案的方法可能不准确且资源密集。我们的方法分析头发，一个易于收集和储存的基质，浓度为11个DR-TB药物。使用LC-MS/MS，我们可以确定亚纳米格药物水平，可用于更好地了解药物依从性。
Abstract
耐药结核病 （DR-TB） 是一个日益严重的公共卫生威胁，评估治疗药物水平可能具有重要的临床益处。血浆药物水平是当前的黄金标准评估，但需要肾切除术和冷链，并捕获只是最近依从。我们的方法使用头发，一个易于收集并反映长期依从性的矩阵，测试11种抗结核药物。我们小组以前的工作表明，头发中的抗逆转录病毒药物水平与艾滋病毒结果有关。我们的DR-TB药物方法使用2毫克的头发（3厘米接近根），这是粉碎和提取甲醇。用一种LC-MS/MS方法分析样品，在16分钟内量化11种药物。11种药物的定量（LLOQs）下限范围从0.01纳克/毫克到1纳克/毫克不等。 药物存在通过比较两种质谱过渡的比率得到确认。样品使用药物与脱硝、15N-或13C标记药物等值的面积比进行量化。我们使用的校准曲线范围为 0.001-100 ng/mg。 该方法在直接观察治疗（DOT）上从DR-TB患者采集的头发样本的方便样本中的应用表明，在11种药物中的9种（异酰胺、苯丙胺、ethambutol、线胶、levofloacin、莫西氟辛、氟胺、贝达奎林、头头体）的线性动态范围内，头发中的药物水平。没有病人使用蛋白苯酰胺，并且测得的液酰胺水平接近其LLOQ（通过进一步的工作，而不是检查依西酰胺的代谢物是否适合监测暴露）。总之，我们描述了头发DR-TB药物的多机解毒板的开发，作为耐药结核病治疗期间治疗药物监测的技术。
Introduction
在21世纪，耐药结核病（DR-TB）是本已薄弱的国家结核病控制计划中不断演变的灾难，仅在过去5年中，确诊病例就翻了一番，占全球抗微生物药物耐药性死亡总数的近三分之一,。与治疗对药物敏感的结核病相比，成功治疗DR-TB通常要求更长、毒性更大的二线治疗方案。此外，DR-TB患者在依从性方面往往存在重大挑战，导致最初出现耐药性。
与HIV感染不同，病毒载量可用于监测治疗，结核病治疗反应的代理终点在个别4级延迟且不可靠。监测患者依从性是亚治疗抗结核药物浓度和治疗失败的重要预测器，也是一项挑战。自我报告的依从性有召回偏见和取悦供应商的愿望55，6。6丸数和药物事件监测系统（MEMS）可以更客观7，但不测量实际药物消耗88，9，10。9,10生物基质中的药物水平可以提供依从性和药代动力学数据。因此，血浆药物水平通常用于治疗药物监测11，12。11,然而，在药物依从性监测方面，血浆水平代表短期接触，在确定适当的依从性参考范围时，受患者体内和患者间变异性的限制。"白衣"效应，在临床或研究访问之前，依从性改善，进一步复杂化血浆水平的能力，提供准确的药物依从模式13。
头发是一种替代生物基质，可以测量长期药物暴露1414，15。15许多药物和内源性代谢物结合到头发蛋白基质从系统循环，因为头发生长。随着头发生长过程中这种动态过程的继续，沉积在头发基质中的药物量取决于药物在循环中的连续存在，使头发成为药物摄入量的极佳时间读出。头发作为生物基质具有另一个优点，即易于收集，无需与血液相比，冷链进行储存和装运。此外，头发是非生物危害的，这提供了额外的可行性优势，在外地。
头发药物水平早已用于法医申请16。在过去十年中，头发抗逆转录病毒（ARV）水平在评估药物在艾滋病毒治疗和预防方面是否得到效用，我们小组对此作出了贡献。头发中的抗逆转录病毒药物水平已被证明是HIV感染治疗结果的最独立预测变量17、18、19、20、21。17,18,19,20,21为了确定DR-TB患者的头发水平在预测治疗结果方面是否具有相同的效用，我们使用LC-MS/MS来开发和验证一种分析小头发样本中11种DR-TB药物的方法。作为对测定性能的初步评估，我们在南非西开普22号对接受直接观察治疗的DR-TB患者的方便样本中测量了DR-TB药物水平。
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Protocol
所有患者在收集头发样本前都提供书面知情同意。我们获得了开普敦大学和加州大学旧金山分校的机构审查委员会的批准。
1. 头发取样
- 获得书面知情同意。
- 使用干净的剪刀从尽可能靠近头皮的区域切割大约20-30个头皮发丝。
- 在头发的远端放置胶带，以指示方向性。将头发样本折叠成铝箔正方形，并在室温下存放。标记头发的远端，以避免因对近端进行额外处理而可能存在的污染。
- 除了患者样本外，还收集"空白头发"：从未服用结核病药物的人那里采集头皮头发样本。收集大量的（每20个患者样本收集大量的空白头发）。
2. 药物提取
- 标签珠管。每个患者样本需要一根管子。标签 12 管从"C0"到"C11"，每 12 个校准点各一个。为低质量控制标记管、中质量控制管和高质量控制管。最后，为矩阵空白标记管。
- 打开铝箔方块，其中包含头发样本。如果头发样本长超过 3 厘米，则从近端切头发 3 厘米，并使用该近端部分进行分析。
- 将2毫克的头发样本称重到珠管中。
- 将 2 毫克的白发称重成 16 个额外的珠管。这些将用作校准点、质量控制和矩阵空白。管子将遵循与患者样本相同的提取程序，除了在步骤 2.8 和 2.9 中指示的水平上使用药物参考标准。
- 将所有珠管放入均质器中。以 6.95 m/s 的速度运行均质器。 运行两个周期，每个周期为 30 s，两个循环之间有 15 个静止周期。
- 进行内部标准混合并将其添加到样品中。
- 将 ±40 mL 甲醇加入 50 mL 体积瓶。
- 在琥珀色玻璃小瓶中，使用甲醇作为溶剂，混合表1所示的内部标准。
注：甲醇非常不稳定。在此过程中，将所有小瓶盖上，以防止蒸发损失。 - 从这些混合物中，将表 1所示的体积添加到 50 mL 体积瓶中。然后，用甲醇将烧瓶加满50mL。
- 盖上盖子，混合卷瓶。除了基体空白管外，将混合物的 500 μL 添加到每个粉碎的发管中。将 500 μL 甲醇添加到基体空白管中。
- 进行参考标准混合。
- 用甲醇构成以下药物的整洁参考标准，以获得步骤2.7.2表中所示的浓度。只需要以下浓度的 1 mL。
- 将 1768 μL 甲醇添加到小瓶中，然后将表 2 中列出的参考标准量添加到同一小瓶中，以获得 2 mL 的最终体积。标签这个小瓶"参考斯特混合1x"。涡。
- 在新的小瓶中，将100 μL从"参考刺1x"刺入900μL甲醇。标签这个小瓶"参考斯特混合10x"。涡。
- 在新的小瓶中，将100 μL从"参考刺10倍"刺入900μL甲醇。标签此小瓶 "参考 Std 混合 100x"。涡。
- 在新的小瓶中，将100 μL从"参考刺100x"刺入900μL甲醇。标签此小瓶 "参考 Std 混合 1000x"。涡。
- 通过添加表 3中描述的 Ref Std 混合量来尖峰校准曲线管。
- 创建 QC 混合和尖峰质量控制管。
- 标签 5 小瓶"QC-A"通过"QC-E"。
- 将以下数量的甲醇添加到五个标有小瓶的瓶中：
QC-A： 990 μL
QC-B： 940 μL
QC-C： 950 μL
QC-D： 980 μL
QC-E： 950 μL
- 使用步骤 2.7.1 中创建的 1 mg/mL 药物库存，在下面列出的特定小瓶中添加 10 μL。对于位于 0.5 mg/mL 的 BDQ 和 CLF 库存，在下面列出的小瓶中添加 20 μL。
QC-A： PTH
QC-B：EMB、CLF、BDQ、PTM
QC-C： INH， LFX， LZD， MFX， PZA
QC-D： PTH， EMB
QC-E：CLF、BDQ、PTM
注：有些药物存在于多种混合物中。 - 将小瓶标记为"QC-A df100"。将10μL的QC-A稀释成990μL甲醇。
- 将小瓶标记为"低 QC 库存"。在此小瓶中加入 1832 μL 甲醇。添加下面详述的 QC 混合量：
QC-A df100： 80 μL
QC-B： 8 μL
QC-C： 80 μL
- 将小瓶标记为"中质库存"。在此小瓶中加入 760 μL 甲醇。添加下面详述的 QC 混合量：
QC-A df100： 800 μL
QC-B： 40 μL
QC-C： 400 μL
- 将小瓶标记为"高 QC 库存"。在此小瓶中加入 1376 μL 甲醇。添加下面详述的 QC 混合量：
QC-D： 160 μL
QC-E： 320 μL
MFX，1mg/mL 库存：16 μL
INH，1mg/mL 库存：32 μL
LFX，1mg/mL 库存：32 μL
LZD，1mg/mL 库存：32 μL
PZA，1mg/mL 库存：32 μL
- 尖峰 10 μL 低 QC 库存进入低 QC 珠管。
- 尖峰 10 μL 中 QC 库存进入中 QC 珠管。
- 尖峰 10 μL 高 QC 库存进入高 QC 珠管。
- 在 37 °C 下将所有管放入热摇床 2 小时。摇动速度应足够慢，水不会溅到管子上。
- 从摇床中取出管。将液体从珠管转移到新的微离心管中。以同样的方式标记这些微离心管。
- 在旧管中加入 500 μL 甲醇。盖和漩涡。
- 第二次，将液体从珠管转移到相应的微离心管中。可以转移粉碎的头发。这最终将被离心机。
- 在 2，800 x g下使微离心管离心 10 分钟。
- 小心地取出液体并将其转移到带有相应标签的新离心管中。小心不要打扰或转移头发颗粒。
- 蒸发离心管中的液体，以32°C干燥。
- 通过在干管中加入200μL的移动相A（HPLC级水，1%的酸）来重组样品。涡。
- 用 250 μL 刀片将液体转移到琥珀小瓶中。
3. LC-MS/MS 制备
- 通过在一升体积瓶中加入一些 HPLC 级水，使一升移动相 A（HPLC 级水，1% 的酸度）。然后加入10 mL的 >95% 的酸到该烧瓶，然后用 HPLC 级水填充到生产线上。
- 通过在一升体积瓶中加入一些醋酸，使一升移动阶段B（甲氧乙酸与0.1%的甲酸） 。然后加入1 mL的 >95% 的酸到该烧瓶，然后用醋酸填充到行中。
- 在柱舱中安装一个 2 x 100 mm 柱，颗粒大小为 2.5 μm，孔径为 100 °孔，具有极性端盖、乙醚连带苯基珠，完全由多孔二氧化硅制成。确保列还安装了制造商推荐的防护盒。
- 打开数据采集软件和双击硬件配置。突出显示LCMS并单击"激活配置文件"。
- 单击"新建子项目"，或者，如果其他子项目已存在，请单击"复制子项目"。为子项目命名。
- 单击"新文档"。双击采集方法。单击"获取方法"窗口中的"质量规格"。
- 将扫描类型下拉列表更改为MRM （MRM）。确保极性设置为"正"。
- 单击"导入列表"并选择补充材料中包含的 .csv 文件MDR-TB LCMS 方法转换.csv。
- 向下滚动并将持续时间设置为 16.751 分钟。相应的循环时间和周期数将自动填充。
- 在左侧侧边栏中，单击集成瓦尔科阀。确保步骤 0 的位置名称为 A。在"总时间（分钟）"列中，在第一行键入 0.4，在第二行键入 13。
- 在"位置"列中，将第一行设置为 B，将第 2 行设置为 A。
- 在左侧侧边栏中，单击二进制泵。根据表 4设置梯度和流速表。
- 在左侧侧边栏中，单击"自动采样器"。将注射量更改为 10 μL。单击启用的温度控制并将其设置为 4 °C。
- 在左侧侧边栏中，单击"列隔间"。将左右温度设置为 50 °C。
- 关闭并保存方法。
- 通过单击"新文档"并选择"采购批次"创建批次。键入集名称，并从下拉栏中选择新创建的方法。
- 在电子表格中，创建遵循此顺序的批次：校准曲线、质量控制、患者样本、校准曲线、质量控制、患者样本、校准曲线、质量控制。在运行开始和结束时以及校准曲线、质量控制和患者样本之前和之后添加溶剂空白注射。在注入校准曲线和高质量控制小瓶后，至少注射 8 次溶剂空白，以减少脂质结转。
注：根据柱龄，可能需要添加更多溶剂空白注射。 - 在示例名称旁边的列中，键入相应小瓶的相应自动采样器位置。
- 单击"添加集"。在弹出窗口中，键入批处理中的样本数。
- 将示例名称和小瓶位置从电子表格复制到新创建的批处理。
- 转到"提交"选项卡。单击"提交"按钮。
- 在电子表格中，创建遵循此顺序的批次：校准曲线、质量控制、患者样本、校准曲线、质量控制、患者样本、校准曲线、质量控制。在运行开始和结束时以及校准曲线、质量控制和患者样本之前和之后添加溶剂空白注射。在注入校准曲线和高质量控制小瓶后，至少注射 8 次溶剂空白，以减少脂质结转。
- 通过将溶剂线 A 插入移动阶段 A 和溶剂线 B 到移动相 B 中，将分清系统插入二进制泵上打开净化阀。
- 以 4 mL/min 流速将溶剂成分设置为 50% B。打开二进制泵。
- 5 分钟后，将流量降至 0.3 mL/min。 关闭净化阀。检查是否有泄漏。
- 在软件中，按顶部工具栏上的"平衡"。将时间设置为 >5 分钟，按"确定"。
- 仪器平衡后，窗口右下角的模块将显示为绿色。检查压力稳定，然后单击"开始采样"启动批处理。
4. 数据分析
- 批处理完成后，打开量化软件。单击魔杖图标可创建新的结果表。
- 单击"浏览"以导航到相应的文件夹，然后突出显示数据文件，然后单击右指向箭头将数据移动到"选定"区域。单击"下一步"。
- 选择"创建新方法"，然后单击"新建"。输入新的量化方法名称，然后按"保存"，然后按"下一步"。
- 选择中间校准点的第一次注入。按下一个。
- 勾选标记IS列中内部标准的所有转换。
- 对于参考标准的量化器转换，请在"IS 名称"列中选择相应的 IS。单击"下一步"。
- 滚动过渡以确保自动选择的保留时间准确无误。确保高斯平滑设置为 1.5。所有其他默认设置可以保持原样（即，噪声百分比 100%，基线子。窗口 2.00 分钟，峰值拆分 2 点）。
注：如果需要，此时修改自动集成参数。由于这些参数根据仪器设置而变化，因此我们这里没有包括我们的参数。 - 单击"完成"将量化方法应用于批处理。
- 单击左上角显示峰值查看按钮以查看色度图。使用左侧侧边栏导航过渡。滚动浏览每个量化器转换的每个注入，并在必要时手动集成正确的峰值。
- 要手动集成峰值，请单击"启用手动集成模式"按钮，通过单击并沿 x 或 y 轴拖动放大色谱图，然后从一个基线绘制一条线到另一个基线，定义峰值。图 3显示了两个色谱图：一个具有 INH，因此已手动集成，另一个没有 INH。
注：必须使用相同的参数集成所有注入。峰值宽度可以为遵循这些参数提供指南，但有时峰值宽度会有所不同。要量化峰值，保留时间必须在该该确认物的预期保留时间 ±0.15 分钟内（由参考标准峰值定义），定性确认为具有预期定量器与限定符的比率（如图2所示），并且信噪比大于 10。
- 要手动集成峰值，请单击"启用手动集成模式"按钮，通过单击并沿 x 或 y 轴拖动放大色谱图，然后从一个基线绘制一条线到另一个基线，定义峰值。图 3显示了两个色谱图：一个具有 INH，因此已手动集成，另一个没有 INH。
- 在"样本类型"列中，将校准曲线注入（空白校准曲线注入除外）设置为标准。将质量控制注入设置为质量控制。将剩余的注射保留为未知。
注： 这将在所有转换中设置。 - 在"实际浓度"列中，键入表 5中所有校准曲线和质量控制喷射的浓度。
- 单击左上角的第二个 显示校准曲线按钮。单击"回归"按钮。
- 将"加权类型"设置为1/x，然后按"确定"。
- 验证校准曲线和质量控制样品，以确保批次成功运行。
- 对于每个定量器参考过渡（不是内部标准过渡），查看每个校准曲线喷射精度（在精度列中）。至少三分之二的校准点的精度必须在 80-120% 以内。
- 对于远超出预期精度的校准点，喷射可能是异常值。如果异常值的计算浓度超过两个标准差，则排除异常值。单击"和峰值到'未找到按钮在每个色谱图上方。
- 检查校准曲线上方显示的 R 值是否为 >0.975。
- 检查所有质量控制注射的精度在 80-120% 以内。
- 如果满足上述所有条件，则批次已通过，并且可以量化样本。单击工具栏中的"编辑"，然后单击"复制整个表"。将表粘贴到电子表格中。
- 以两个样品注射的计算浓度平均值为例，以确定每个样品的报告浓度。
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Representative Results
图1显示了所有11种DR-TB药物的确诊水平的色谱图图图。使用不同的仪器和列时，每个护身奶的保留时间可能会更改，因此应单独确定确切的保留时间。
图2显示了一种特定药物（isoniazid，INH）在一种校准器（空白头发样本与DR-TB药物参考标准尖刺）的提取的Ion色谱仪（EIC）。定量器和限定符过渡用于定性地确认药物的存在，因为定量器面积和限定符区域之间的比率在样品之间保持不变。内部标准也得到监控，以确保每个样品注射都规范化。
为了进行演示，我们分析了来自南非西开普的96名在DOT条件下服用DR-TB药物的96名患者的15个头发样本的方便样本。表6列出了针对每种机解利剂测量的最低和最高水平的DR-TB药物的代表性水平。虽然提供了15个患者样本的数据，但每个的分析物没有报告15个级别，因为每个患者都服用了不同组合的DR-TB药物。没有一个病人服用蛋白酰胺，只有一个病人服用前体。
图 1.代表色谱图的插图，显示了DR-TB方法（EMB+ethambutol;INH_ isoniazid;PZA= 苯丙胺;ETH= 苯酰胺;PTH= 蛋白酰胺;LFX= 列福洛西辛;MFX= 莫西氟沙辛;LZD= 线子;PTM= 前托马尼;BDQ= 贝达基林;CLF= 克拉法齐胺）。由于每种分析物方法的灵敏度不同，INH、LZD、LFX、MFX和LZD在20纳克/mg头发处被峰值，而BDQ、CLF、EMB、ETH、PTH和PTM在2纳克/mg头发处被峰值。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2.两个提取的Ion色谱图（EIC）从注注校准点9（C9），在20纳克/毫克的isonazid（INH）。顶部 EIC 同时显示 INH 限定符转换（蓝色，标记为 INH-2）和 INH 限定符过渡（红色，标记为 INH-3）。底部 EIC 显示 INH-d4 的响应，INH-d4 是用于量化 INH 的内部标准 （IS）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3.量化过程的屏幕截图。顶部部分是一个部分样本列表，显示 12 个校准点（标记为 C0-C11）、3 个质量控制级别和 6 个样本的一个安解剂 （INH， isoniazid） 的注入数据。左下角是校准曲线，范围从 0.5 ng/mg =100 ng/mg. 不透明蓝点是校准点。透明蓝色方块是质量控制点。R 值显示在左上角 （0.99722），权重为 1/x。右下角的两个色谱图说明了一个带有INH（顶部色谱图）的样本和一个没有INH的样本（底部色谱图）。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 每种混合物中的药物 | 混合每种药物的浓度 | 混合体积添加到 50mL vol. 烧瓶 |
| 混合 1：CLF-d7，EMB-d4 | 10 微克/米L | 40 μL |
| 混合 2： LFX-d8， PTH-d5 | 10 微克/米L | 10 μL |
| 混合 3： BDQ-d6， LZD-d3， MFX 13C-d3， OPC （PTM 的 IS） | 10 微克/米L | 20 μL |
| 混合 4： PZA 15N-d3 | 10 微克/米L | 200 μL |
| 混合 5： INH-d4 | 10 微克/米L | 100 μL |
表1.浓度和量每个内部标准添加到50 mL体积瓶。
| 药物 | 库存浓度 | 添加的卷 |
| BDQ | 0.5毫克/米拉 | 8 μL |
| CLF | 0.5毫克/米拉 | 8 μL |
| 教 统 局 | 1毫克/米拉 | 4 μL |
| Pth | 1毫克/米拉 | 4 μL |
| PTM | 1毫克/米拉 | 4 μL |
| INH | 1毫克/米拉 | 40 μL |
| LFX | 1毫克/米拉 | 40 μL |
| LZD | 1毫克/米拉 | 40 μL |
| MFX | 1毫克/米拉 | 40 μL |
| PZA | 1毫克/米拉 | 40 μL |
表2.添加到"参考药混合1"小瓶的每个药物参考标准的数量。
| 标签名称 | 维拉尔从 | 添加的卷 |
| C0 | 不适用 | 0 μL |
| C1 | 参考斯特德混合df1000 | 5 μL |
| C2 | 参考斯特德混合df1000 | 10 μL |
| C3 | 参考斯特德混合df1000 | 20 μL |
| C4 | 参考斯特德混合df100 | 5 μL |
| C5 | 参考斯特德混合df100 | 10 μL |
| C6 | 参考斯特德混合df100 | 20 μL |
| C7 | 参考斯特德混合df10 | 5 μL |
| C8 | 参考斯特德混合df10 | 10 μL |
| C9 | 参考斯特德混合df10 | 20 μL |
| C10 | 参考斯特德混合df1 | 5 μL |
| C11 | 参考斯特德混合df1 | 10 μL |
表3.添加到 12 个校准点的每个参考类型混合中间体的数量。
| 总时间（分钟） | 流速（μL/分钟） | A （%） | B （%） |
| 0 | 450 | 95 | 5 |
| 0.3 | 450 | 95 | 5 |
| 2.3 | 450 | 0 | 100 |
| 5 | 550 | 0 | 100 |
| 11 | 550 | 0 | 100 |
| 11.1 | 550 | 95 | 5 |
| 13 | 450 | 95 | 5 |
| 16.75 | 450 | 95 | 5 |
表4.每次喷射使用的流速和移动相位梯度。
| 校准点 | BDQ、CLF、ETH、EMB、PTH、PTM（ng/mg）的实际浓度 | INH、LFX、LZD、MFX、PZA（ng/mg）的实际浓度 |
| C0 | 0 | 0 |
| C1 | 0.005 | 0.05 |
| C2 | 0.01 | 0.1 |
| C3 | 0.02 | 0.2 |
| C4 | 0.05 | 0.5 |
| C5 | 0.1 | 1 |
| C6 | 0.2 | 2 |
| C7 | 0.5 | 5 |
| C8 | 1 | 10 |
| C9 | 2 | 20 |
| C10 | 5 | 50 |
| C11 | 10 | 100 |
表5.每个校准点分析物的最终浓度。
| 药物 | Lod （ng/mg 头发） |
LLOQ （ng/mg 头发） |
ULOQ （ng/mg 头发） |
样本值（ng/mg 头发） 样品：UC-04、UC-08、UC-11、UC-16、UC-25、UC-36、UC-69、UC-83、UC-89、UC-90、UC-91、UC-104、UC-105、UC-108、UC-109 |
| 贝达基林 | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.21, 0.38, 0.56, 0.86, 0.90, 1.04, 1.29, 2.15, 2.29, 5.64 |
| 克洛帕齐明 | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.37, 0.61, 1.84, 2.20, 2.90, 3.41, 3.90, 6.03, 8.25, 10.66, 11.01 |
| 埃坦布托尔 | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.04, 0.05, 0.25, 0.42, 0.43, 0.5, 0.68, 0.92, 0.95, 1.01, 1.53, 1.54, 9.76 |
| 苯酰胺 | 0.01 | 0.01 | 10 | |
| 异 烟 肼 | 0.05 | 0.5 | 100 | |
| 氧 氟 沙 星 | 0.1 | 0.5 | 100 | 8.01, 8.42, 15.37, 24.41, 39.45, 42.12, 56.15, 75.58, 119.96 |
| 林佐利德 | 0.1 | 0.5 | 100 | 0.87, 1.09, 3.51, 5.51, 7.80, 9.21, 15.68, 18.32, 19.13, 21.22 |
| 莫西沙 星 | 0.05 | 0.5 | 100 | 0.35, 0.49, 1.58, 1.59, 6.23, 7.06, 13.14, 17.37, 21.72, 55.88, 86.64 |
| 普雷托马尼德 | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.57 |
| 蛋白酰胺 | 0.002 | 0.01 | 10 | |
| 皮拉齐内酰胺 | 0.05 | 1 | 100 | 1.14, 1.74, 1.86, 3.21, 5.94, 11.39, 12.36, 12.71, 12.85, 14.38, 16.13, 44.17, 69.66 |
表6.在15名服用DOT下DR-TB药物的患者中测量的代表性药物水平。给出了每种药物的检测量限（LOD）、定量的下限（LLOQ）和定量（ULOQ）的上限。
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Discussion
我们在这里报告我们开发和验证的方法的协议，用于量化11种抗结核病药物，用于治疗使用LC-MS/MS的小头发样本中的DR-TB。以前没有其他方法来量化头发中的这11种药物，但已经开发、验证和发布。我们的方法可以量化亚纳米克的药物水平，只有20-30发丝长约3厘米（约2毫克），并已经过验证22。头发分析的低重量意味着参与研究的患者可以谨慎参与，并有可能返回重复测试，而不必担心暴露秃头皮。我们先前已公布有关头发DR-TB药物水平与DR治疗结果23日之间的关联数据。因此，这种多机类面板方法的开发和验证标志着DR-TB治疗药物监测领域的一个重大进展。
头发需要与液体生物基质所需的不同均质技术。毛丝的粉碎允许提取溶剂有效地进入头发基质中的分析物。因此，我们方法的一个重要特征是使用粉碎样品快速、简便地提取头发中的药物。提取过程中的孵育时间只有两小时，由于粉碎头发的表面面积大，而且由于样品体积小（2毫克），没有清理步骤。不过，必须注意在提取过程中限制药物降解。该协议使用双循环粉碎，周期之间的冷却周期为 45 s。这个过程可以避免过热，并可能降低头发中的药物。
与许多滥用药物的头发分析不同，这种方法不使用洗涤步骤。DR-TB 药物以胶囊或片剂形式提供，限制了外部污染的可能来源，并随后需要在分析前洗头。未来的研究可以分析DR-TB患者头发的洗涤溶剂，以评估外部污染。
虽然头发粉碎促进有效的药物提取，它有其自身的局限性。我们的实验室发现，如果头发在珠子鲁本中粉碎，并在室温下留下，11种药物中的一些浓度在数周和数月内会下降。这可能是由于粉状头发暴露在大气中的大面积表面积，可以促进氧化和其他降解反应。如果需要对头发中的药物进行稳定性研究，头发可以用剪刀切成1厘米的小块，用手均匀化，然后在稳定性研究期间在室温下留下数周或数月。当这种剪发在分析当天被粉碎时，我们并没有观察到任何显著的药物降解随着时间的推移。因此，在执行描述的协议时，我们建议在头发提取的当天粉碎头发。同样，所有浓度低于10μg/mL的药物混合物应在提取当天制备。
在多机解毒剂方法中，我们为每个结核病药物建立的线性动态范围（LLOQ-ULOQ）的适用性没有以前发布的方法。然而，来自南非西开普的毛发样本的方便样本表明该方法的线性动态范围适宜性。除苯甲酰胺、前体酰胺和蛋白石酰胺外，我们在这些患者中测得的药物水平超过95%在每种淀粉样蛋白的线性动态范围内。只有一名患者正在服用孕酮（已检测出来），没有患者服用蛋白酰胺。对于苯酰胺，我们假设药物可能不会沉积到头发基质好，因为我们的LOD是0.01 ng/mg头发（或10 pg/mg头发），但只有一个患者服用苯酰胺的水平大于0.02纳克/毫克的头发。需要进一步检查，以确定头发中不同结核病药物的药代动力学。例如，监测药物（如苯酰胺）的一种潜在替代方法是开发一种针对其代谢物的方法。我们对德拉马尼德（一种新型DR-TB药物）也做了类似的观察，这种药物最初是这个小组的一部分。一种针对德拉马尼德代谢物的方法目前正在我们的实验室中验证，因为代谢物的浓度高于母药。对苯酰胺可以执行相同的过程。表6中的药物浓度作为一个组表示，因为个别结果和临床结果不是本方法文件的重点。对这组病人的个别评估已于23日公布。
为示范研究提供小头发样本的患者在住院环境中通过DOT进行各种药物治疗方案，所有治疗方案均根据住院期间的护理记录进行记录。然而，正如DR-TB患者所常见，以前记录不佳的药物方案在住院前也进行了施用。这导致在病人头发中检测，这些药物在住院记录中没有注明。因此，我们不能使用这些示例来确定该方法的特异性，因为我们无法确定这些样本是否是真正的误报。相反，我们测试了未服用DR-TB药物的患者的头发。这些样本中未检测到 DR-TB 药物，表明该方法是特定的。
尽管我们的方法证明了使用头发在测量DR-TB药物方面的效用，但头发分析有其自身的局限性。由于头发是一个固体基质，在方法验证期间，药物参考标准的尖峰不允许标准与尿液和血液一样完全融入基质。因此，恢复评估仅限于在刺到固体矩阵后检测药物，而不是从矩阵中实际检索。同样，由于头发是一种仍在探索测试的替代矩阵，因此没有现成的药物参考范围来评估方法的适用性。更多有关药物纳入头发的药代动力学研究将有助于进一步了解头发药物水平在依从性监测中的效用。最后，在现场正确收集头发样本有其独特的挑战。虽然收集和储存头发样本所需的资源比其他生物基质少，但必须注意识别任何头发链的远端和近端，超过2厘米。 较长的发丝可能沿头发链有不同的药物浓度，具体取决于药物使用随时间的延长。适当的标签允许分析链的特定段;在我们的方法的情况下，三厘米的头发最接近头皮被用来确定药物依从性的最新数据。适当的标签需要在现场培训和质量保证程序。
总之，我们开发了第一个多分析物面板，用于通过小头发样本中的LC-MS/MS分析用于DR-TB的结核病药物。鉴于在资源有限的环境中收集和储存头发的可行性，我们的方法代表了结核病治疗药物监测领域的潜在重大进展。客观的药物暴露措施，考虑到依从性和个别药代动力学变异性，可能提供早期指示无效的治疗方案，从而有助于个人治疗以及限制DR-TB24的社区传播。
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Disclosures
这项工作得到了国家过敏和传染病研究所RO1 AI123024（共同机构：约翰·梅特卡夫和莫妮卡·甘地）的支持。
Acknowledgments
作者要感谢开普敦大学肺研究所的基尔坦·迪达教授、阿里·伊斯梅尔博士和玛丽特杰·普雷托利斯教授为这项研究收集头发样本提供便利。作者还感谢本研究参与者的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
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