Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Valideret LC-MS/MS Panel til kvantificering af 11 resistente TB-medicin i små hårprøver

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60861
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, TB Hair Analysis Laboratory, University of California San Francisco, 2Department of Epidemiology and Biostatistics, University of California San Francisco, 3Department of Medicine, Division of HIV, Infectious Diseases, and Global Medicine, University of California San Francisco, 4Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California San Francisco

Summary

De nuværende metoder til analyse af patienternes overholdelse af komplekse resistente tuberkulose (DR-TB) regimer kan være unøjagtige og ressourcekrævende. Vores metode analyserer hår, en let indsamlet og lagret matrix, for koncentrationer af 11 DR-TB medicin. Ved hjælp af LC-MS/MS, Vi kan bestemme sub-nanogram narkotika niveauer, der kan udnyttes til bedre at forstå narkotika overholdelse.

Abstract

Lægemiddelresistent tuberkulose (DR-TB) er en voksende trussel mod folkesundheden, og vurdering af terapeutiske lægemiddelniveauer kan have betydelige kliniske fordele. Plasma stof niveauer er den nuværende guld standard vurdering, men kræver phlebotomi og en kold kæde, og fange kun meget nylig tilslutning. Vores metode bruger hår, en matrix, der er let indsamlet og afspejler langsigtet overholdelse, at teste for 11 anti-TB medicin. Tidligere arbejde af vores gruppe viser, at antiretrovirale lægemiddelniveauer i hår er forbundet med hiv-resultater. Vores metode til DR-TB narkotika bruger 2 mg hår (3 cm proksimalt til roden), som er pulveriseret og ekstraheret i methanol. Prøver analyseres med en enkelt LC-MS/MS-metode, kvantificere 11 lægemidler i en 16 min køre. Nedre grænser for kvantificering (LLOQs) for de 11 lægemidler spænder fra 0.01 NG/mg til 1 ng/mg. Narkotika tilstedeværelse bekræftes ved at sammenligne nøgletal af to massespektrometri overgange. Prøver kvantificeres ved hjælp af området forholdet mellem stoffet til deuterated, 15N-, eller 13C-mærket stof isotopologue. Vi brugte en kalibreringskurve fra 0,001 til 100 NG/mg. Anvendelse af metoden på en praktisk prøve af hårprøver indsamlet fra DR-TB patienter på direkte observeret behandling (DOT) angivet lægemiddelniveauer i hår inden for den lineære dynamikområde af ni af de elleve lægemidler (isoniazid, pyrazinamid, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimin, bedaquiline, pretomanid). Ingen patient var på prothionamid, og de målte niveauer for ethionamid lå tæt på lloq -niveauet (i stedet for yderligere arbejde, der undersøgte egnetheden af ethionamids metabolit til overvågning af eksponering). Sammenfattende beskriver vi udviklingen af et multi-analytpanel til DR-TB-lægemidler i hår som en teknik til terapeutisk lægemiddelovervågning under lægemiddelresistent TB-behandling.

Introduction

I det enogtyvende århundrede, resistente TB (DR-TB) er en udvikling katastrofe for allerede svage nationale TB kontrolprogrammer, med bekræftede tilfælde fordobling i de seneste 5 år alene, tegner sig for næsten en tredjedel af alle dødsfald i forbindelse med antimikrobiel resistens globalt1,2. Vellykket behandling af DR-TB har konventionelt krævet længere og mere giftige andenlinjeregimer end behandling for lægemiddelfølsom TB. Desuden har patienter med DR-TB ofte betydelige allerede eksisterende udfordringer med hensyn til overholdelse, hvilket bidrog til fremkomsten af resistens i første omgang3.

I modsætning til hiv-infektion, hvor virusbelastninger kan anvendes til at overvåge behandlingen, er surrogatendepunkter for behandlingsrespons i TB forsinket og upålidelige på individuelt niveau4. Overvågning af patientens overholdelse, en vigtig prædiktor for subterapeutisk anti-TB lægemiddelkoncentration og behandlingssvigt, er også udfordrende. Selvrapporteret overholdelse lider af tilbagekaldelse bias og ønsket om at behage udbydere5,6. Pilletællinger og systemer til overvågning af medicinhændelser (MEMS) kan være mere mål7, men måler ikke det faktiske narkotikaforbrug8,9,10. Drug niveauer i biomatrices kan give både overholdelse og farmakokinetiske data. Derfor er plasma stof niveauer almindeligt anvendt i terapeutisk stof overvågning11,12. I forbindelse med overvågning af lægemiddeloverholdelse repræsenterer plasmaniveauer imidlertid kortvarig eksponering og er begrænset af signifikant e-variation mellem og mellem patienten, når der fastlægges et passende referenceinterval for overholdelse. "White coat" effekter, hvor overholdelse forbedres forud for klinik eller studiebesøg, yderligere komplicerer muligheden for plasma niveauer til at give nøjagtige stof overholdelse mønstre13.

Hår er en alternativ biomatrix, der kan måle langtidseksponering af lægemidler14,15. Mange lægemidler og endogene metabolitter indarbejde i håret protein matrix fra den systemiske omsætning som hår vokser. Da denne dynamiske proces fortsætter under hårvækst, mængden af narkotika deponeret i håret matrix afhænger af den fortsatte tilstedeværelse af stoffet i omløb, hvilket gør håret en fremragende tidsmæssig udlæsning af stofindtag. Hår som en biomatrix har den ekstra fordel at være let indsamlet uden behov for kølekæde til opbevaring og forsendelse i forhold til blod. Desuden hår er ikke-biofarligt, hvilket giver yderligere gennemførlighedsfordele på området.

Hår narkotika niveauer har længe været brugt i retsmedicinske applikationer16. I løbet af de sidste ti år har hår antiretrovirale (ARV) niveauer vist nytte i vurderingen af narkotika overholdelse i hiv-behandling og forebyggelse, som vores gruppe bidraget. ARV-niveauet i håret har vist sig at være de stærkeste uafhængige prædiktorer for behandlingsresultater ved hiv-infektion17,18,19,20,21. For at afgøre, om hårniveauer af DR-TB patienter vil have samme nytte i at forudsige behandlingsresultatet, brugte vi LC-MS/MS til at udvikle og validere en metode til analyse af 11 DR-TB medicin i små hårprøver. Som en indledende vurdering af analysens ydeevne målte vi DR-TB-medicinniveauet i en praktisk prøve af patienter med DR-TB, der fik direkte observeret behandling (DOT) i Western Cape, Sydafrika22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke forud for indsamling af hårprøver. Vi fik Institutional Review Board godkendelse fra University of Cape Town og University of California, San Francisco.

1. Hår prøveudtagning

  1. Indhente skriftligt informeret samtykke.
  2. Brug ren saks til at skære ca 20-30 hovedbund hår tråde fra occipital regionen så tæt på hovedbunden som muligt.
  3. Placer tape omkring den distale side af håret for at angive retningsbestemthed. Fold hår prøve i en aluminiumsfolie firkant og opbevares ved stuetemperatur. Mærk den distale ende af håret for at undgå mulig kontaminering ved yderligere håndtering af den proksimale ende.
  4. Ud over patientprøver, indsamle "blankt hår": en hovedbund hår prøve fra en person, der ikke har taget TB medicin. Indsamle en stor mængde (> 30 mg blankt hår for hver 20 patientprøver).

2. Narkotikaudvinding

  1. Mærk perlerør. Hver patientprøve kræver et rør. Mærk 12 rør fra "C0" til "C11", et for hvert af de 12 kalibreringspunkter. Mærk et rør til lav kvalitetskontrol, et rør til medium kvalitetskontrol og et rør til høj kvalitetskontrol. Endelig skal du mærke et rør til Matrix Blank.
  2. Åbn aluminiumsfolie firkanten indeholder hår prøve. Hvis hårprøven er længere end 3 cm, klippes håret 3 cm fra den proksimale ende, og den proksimale del anvendes til analyse.
  3. 2 mg af hårprøven vejes i et perlerør.
  4. Der vejes 2 mg blankt hår i yderligere 16 perlerør. Disse vil blive brugt som kalibreringspunkter, kvalitetskontrol og matrix tom. Rørene vil følge den samme ekstraktionsprocedure som patientprøverne, bortset fra at være tilsat lægemiddelreferencestandarder på niveauer, der er angivet i trin 2.8 og 2.9.
  5. Læg alle perlerørene i homogenisatoren. Kør homogenisator ved hastighed 6,95 m/s. Kør i to cyklusser på 30 s hver, med en hvileperiode på 15 s mellem de to cyklusser.
  6. Lav intern standard mix og tilføje det til prøverne.
    1. Der tilsættes ~40 ml methanol til en 50 ml volumetrisk kolbe.
    2. I gule glashætteglas fremstilles blandingerne af de interne standarder, der er vist i tabel 1,ved hjælp af methanol som opløsningsmiddel.
      BEMÆRK: Methanol er meget flygtig. Lad alle hætteglas være begrænset under denne proces for at forhindre tab på grund af fordampning.
    3. Ud fra disse blandinger tilsættes den i tabel 1 viste volumen til 50 ml volumetrisk kolbe. Fyld derefter kolben til 50 ml med methanol.
    4. Hætten og bland den volumetriske kolbe. Der tilsættes 500 μL af blandingen til hvert af de pulveriserede hårrør, bortset fra matrixblindrøret. Der tilsættes 500 μL methanol til matrixblindrøret.
  7. Lav standardblandinger.
    1. Udgør pæne referencestandarder for følgende lægemidler med methanol for at få den koncentration, der er vist i tabellen i trin 2.7.2. Kun 1 ml af følgende koncentrationer er nødvendig.
    2. Der tilsættes 1768 μL methanol til et hætteglas, og de mængder referencestandard, der er anført i tabel 2, til det samme hætteglas for at få 2 ml slutvolumen. Mærk dette hætteglas "Ref Std Mix 1x". Vortex.
    3. Spike 100 μL fra "Ref Std Mix 1x" til 900 μL methanol i et nyt hætteglas. Mærk dette hætteglas "Ref Std Mix 10x". Vortex.
    4. Spike 100 μL fra "Ref Std Mix 10x" til 900 μL methanol i et nyt hætteglas. Mærk dette hætteglas "Ref Std Mix 100x". Vortex.
    5. Spike 100 μL fra "Ref Std Mix 100x" til 900 μL methanol i et nyt hætteglas. Mærk dette hætteglas "Ref Std Mix 1000x". Vortex.
  8. Kalibreringskurverørene tilføres ved at tilsætte den mængde Ref Std Mix, der er beskrevet i tabel 3.
  9. Opret QC blander og spike kvalitetskontrol rør.
    1. Etiket 5 hætteglas "QC-A" gennem "QC-E".
    2. Følgende mængder methanol tilsættes til de fem mærkede hætteglas:
      QC-A: 990 μL
      QC-B: 940 μL
      QC-C: 950 μL
      QC-D: 980 μL
      QC-E: 950 μL
       
    3. Ved hjælp af de 1 mg/ml-lægemiddellagre, der blev oprettet i trin 2.7.1, tilsættes 10 μL til de specifikke hætteglas, der er anført nedenfor. For BDQ- og CLF-lagrene, som er på 0,5 mg/ml, tilsættes 20 μL til de hætteglas, der er anført nedenfor.
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      QC-D: PTH, EMB
      QC-E: CLF, BDQ, PTM

      BEMÆRK: Nogle lægemidler er til stede i flere blandinger.
    4. Mærk et hætteglas som "QC-A df100". 10 μL QC-A fortyndes til 990 μL methanol.
    5. Mærk et hætteglas som "Low QC stock". Der tilsættes 1832 μL methanol til dette hætteglas. Tilsæt de mængder QC-blandinger, der er beskrevet nedenfor:
      QC-A df100: 80 μL
      QC-B: 8 μL
      QC-C: 80 μL
       
    6. Mærk et hætteglas som "Mid QC-aktier". Der tilsættes 760 μL methanol til dette hætteglas. Tilsæt de mængder QC-blandinger, der er beskrevet nedenfor:
      QC-A df100: 800 μL
      QC-B: 40 μL
      QC-C: 400 μL
       
    7. Mærk et hætteglas som "High QC stock". Der tilsættes 1376 μL methanol til dette hætteglas. Tilsæt de mængder QC-blandinger, der er beskrevet nedenfor:
      QC-D: 160 μL
      QC-E: 320 μL
      MFX, 1mg/ml lager: 16 μL
      INH, 1mg/ml lager: 32 μL
      LFX, 1mg/ml lager: 32 μL
      LZD, 1mg/ml lager: 32 μL
      PZA, 1mg/ml lager: 32 μL
       
    8. Spike 10 μL Lav QC-materiale i low QC perlerøret.
    9. Spike 10 μL Mid QC-materiale i Mid QC perlerøret.
    10. Spike 10 μL Høj QC-materiale i høj QC perlerøret.
  10. Alle rørene anbringes i varmrystning i 2 timer ved 37 °C. Omrystningen skal være langsom nok til, at vandet ikke sprøjter op på rørene.
  11. Fjern rørene fra shakeren. Væske overføres fra perlerør til nye mikrocentrifugerør. Mærk disse mikrocentrifugerør på samme måde.
  12. Der tilsættes 500 μL methanol til de gamle rør. Kasket og vortex.
  13. For anden gang overføres væske fra perlerørene til det tilsvarende mikrocentrifugerør. Det er okay at overføre pulveriseret hår. Dette vil i sidste ende blive centrifugeret ud.
  14. Mikrocentrifugerørene centrifugeres i 10 min ved 2.800 x g.
  15. Fjern forsigtigt væsken og overfør den til nye centrifugerør med tilsvarende etiketter. Pas på ikke at forstyrre eller overføre hårpellet.
  16. Væsken fordampes i centrifugeglassene til tørhed ved 32 °C.
  17. Prøverne rekonstitueres ved at tilsætte 200 μL mobil fase A (Vand af HPLC-kvalitet med 1% myresyre) til de tørre rør. Vortex.
  18. Væsken overføres til gule hætteglas med 250 μL skær.

3. FORBEREDELSE AF LC-MS/MS

  1. Lav en liter mobil fase A (HPLC-grade vand med 1% myresyre) ved at tilføje nogle HPLC-grade vand til en en-liters volumetrisk kolbe. Derefter tilsættes 10 ml > 95% myresyre til denne kolbe, og derefter fylde salt på linjen med HPLC-grade vand.
    1. Lav en liter mobil fase B (acetonitril med 0,1% myresyre) ved at tilføje nogle acetonitril til en en-liters volumetrisk kolbe. Derefter tilsættes 1 ml > 95% myresyre til denne kolbe, og derefter fyldes til linjen med acetonitril.
  2. Der installeres en 2 x 100 mm søjle med en partikelstørrelse på 2,5 μm og en porestørrelse på 100 Å med polær endeudjævnet, etherforbundne phenylperler, der er fremstillet af porøst silica i søjlerummet. Sørg for, at der også er installeret en anbefalet beskyttelsespatron i kolonnen.
  3. Åbn datahentningssoftwaren, og dobbeltklik på Hardwarekonfiguration. Fremhæv LCMS, og klik på Aktivér profil.
    1. Klik på Nyt underprojekt, eller klik på Kopiér underprojekt, hvis der allerede findes andre underprojekter . Navngiv underprojektet.
    2. Klik på Nyt dokument. Dobbeltklik på anskaffelsesmetode. Klik på Massespecifikation i vinduet Anskaffelsesmetode.
    3. Skift rullemenuen Scanningstype til MRM (MRM). Sørg for, at polariteten er indstillet til Positiv.
    4. Klik på Importliste, og vælg den .csv-fil MDR-TB LCMS-metodeovergange.csv, der er inkluderet i Supplerende materialer.
    5. Rul ned og indstil Varighed til 16,751 min. Den relevante cyklustid og det relevante antal cyklusser udfyldes automatisk.
    6. Klik på Integreret Valcoventili venstre sidebjælke . Sørg for, at stillingsnavnet for trin 0 er A. Skriv 0,4 i første række og 13 i den anden række i kolonnen Samlet tid (min).
    7. Angiv række 1 til B i kolonnen Placering, og række to til A.
    8. Klik på Binær pumpei venstre sidebjælke . Indstil forløbs- og strømningshastighedstabellen i henhold til tabel 4.
    9. Klik på Autosampleri venstre sidepanel. Skift injektionsvolumen til 10 μL. Klik på Temperaturkontrol aktiveret og indstil til 4 °C.
    10. Klik på Kolonnerumi venstre sidepanel . Indstil både højre og venstre temperatur til 50 °C.
    11. Metoden Luk og gem.
  4. Opret batch ved at klikke på Nyt dokument og vælge Anskaffelsesbatch. Skriv et sætnavn, og vælg den nyoprettede metode på rullelisten.
    1. I et regneark skal du oprette et batch, der følger denne rækkefølge: kalibreringskurve, kvalitetskontrol, patientprøver, kalibreringskurve, kvalitetskontrol, patientprøver, kalibreringskurve, kvalitetskontrol. Der tilsættes blanke injektioner med opløsningsmiddel i starten og slutningen af løbet samt før og efter kalibreringskurven, kvalitetskontrol og patientprøver. Der blev foretaget mindst otte blanke injektioner med opløsningsmiddel efter injektioner af kalibreringskurven og hætteglas med høj kvalitet for at reducere overførsel af analysand.
      BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at tilføje flere blanke injektioner med opløsningsmidler afhængigt af kolonnealderen.
    2. I den kolonne, der støder op til stikprøvenavnene, skal du skrive den relevante autosamplerposition for det tilsvarende hætteglas.
    3. Klik på Tilføj sæt. Skriv antallet af prøver i batchen i pop op-vinduet.
    4. Kopier og indsæt eksempelnavne og hætteglasplaceringer fra regnearket til den nyoprettede batch.
    5. Gå til fanen Send. Klik på knappen Send.
  5. Ligevægtssystem ved at indsætte opløsningsmiddellinje A i mobil fase A og opløsningsmiddellinje B i mobil fase B. Åbn udluftningsventilen på den binære pumpe.
    1. Opløsningsmiddelsammensætningen indstilles til 50% B ved 4 ml/min strømningshastighed. Slå binær pumpe til.
    2. Efter 5 min, fald flow til 0,3 ml / min. Luk udluftningsventilen. Tjek for eventuelle lækager.
    3. Tryk på Equilibrate på den øverste værktøjslinje i softwaren. Angiv tid til >5 OKmin.
    4. Når instrumentet er jævnet med det samme, vises modulerne nederst til højre i vinduet grønt. Kontroller, at trykket er stabiliseret, og start derefter batchen ved at klikke på Start eksempel.

4. Dataanalyse

  1. Når batchen er fuldført, skal du åbne kvantitationssoftwaren. Klik på tryllestavsikonet for at oprette en ny resultattabel.
    1. Klik på Gennemse for at navigere til den relevante mappe, og fremhæv derefter datafilen, og klik på den højrepil, der peger for at flytte dataene til det markerede område. Klik på Næste.
    2. Vælg Opret ny metode, og klik på Ny. Indtast navnet på den nye kvantitationsmetode, og tryk på Gem og derefter på Næste.
    3. Vælg den første injektion af det midterste kalibreringspunkt. Tryk på Næste.
    4. Sæt kryds ved at markere alle overgange for de interne standarder i IS-kolonnen.
    5. Vælg den tilsvarende IS i kolonnen IS-navn for referenceovergangene for referencestandarderne. Klik på Næste.
    6. Rul gennem overgange for at sikre, at den automatisk valgte opbevaringstid er nøjagtig. Sørg for, at Gaussisk udjævning er indstillet til 1,5. Alle andre standardindstillinger kan forblive, som de er (dvs. støjprocent 100 %, Oprindelig sub. Vindue 2,00 min, Peak Opdeling 2 point).
      BEMÆRK: Hvis det ønskes, skal du ændre automatiske integrationsparametre på dette tidspunkt. Da disse parametre ændres baseret på instrumentopsætning, har vi ikke inkluderet vores her.
    7. Klik på Udfør for at anvende kvantificeringsmetoden på batchen.
  2. Klik øverst til venstre Viser knappen til gennemgang af toppen for at få vist kromatogrammer. Naviger gennem overgange ved hjælp af venstre sidebjælke. Rul gennem hver injektion af hver kvantificerovergang, og integrer manuelt den korrekte top, hvis det er nødvendigt.
    1. Hvis du vil integrere en top manuelt, skal du klikke på knappen Aktivér manuel integrationstilstand, zoome ind på kromatogrammet ved at klikke og trække langs x- eller y-aksen og derefter tegne en linje fra den ene grundlinje til den anden grundlinje, der definerer toppen. Figur 3 viser to kromatogrammer: en, der har INH, og derfor er blevet manuelt integreret, og en anden, der ikke har INH.
      BEMÆRK: Alle injektioner skal integreres med de samme parametre. Topbredde kan give en retningslinje for at overholde disse parametre, men nogle gange vil topbredden være forskellig. For at kvantificere en spids belastning skal retentionstiden være inden for ±0,15 min af den forventede retentionstid for den pågældende analysand (som defineret af referencestandardspidserne), der kvalitativt bekræftes som havende det forventede kvantificeringsforhold mellem kvalificering (som vist i figur 2) og have et signal-støj-forhold på over 10.
  3. I kolonnen Prøvetype skal kalibreringskurveinjektionerne (med undtagelse af de tomme kalibreringskurveinjektioner) indstilles til Standard. Indstil kvalitetskontrolinjektionerne til Kvalitetskontrol. Lad de resterende injektioner være ukendt.
    BEMÆRK: Dette vil blive indstillet på tværs af alle overgange.
  4. I kolonnen Faktisk koncentration skal de koncentrationer, der findes i tabel 5, for alle kalibreringskurver og kvalitetskontrolinjektioner.
  5. Klik på det andet fra øverst e.kr.Viser kalibreringskurveknappen. Klik på knappen Regression.
  6. Indstil vægtningstype Type til 1/x, og tryk på OK.
  7. Valider kalibreringskurven og kvalitetskontrolprøverne for at sikre, at batchen kørte korrekt.
    1. For hver kvantificeringsreferenceovergang (ikke interne standardovergange) skal du se på hver kalibreringskurveinjektionsnøjagtighed (i kolonnen Nøjagtighed). Mindst to tredjedele af kalibreringspunkterne skal have en nøjagtighed inden for 80-120 %.
    2. For kalibreringspunkter langt uden for den forventede nøjagtighed kan injektionen være en outlier. Outliers udelukkes, hvis deres beregnede koncentration er mere end to standardafvigelser væk fra de to andre injektioner af det pågældende hætteglas. Hvis du klikker på "et peak til 'ikke fundet knappen over hvert kromatogram.
    3. Kontroller, at den R-værdi, der vises over kalibreringskurven, er >0,975.
    4. Kontroller, at alle kvalitetskontrol injektioner har en nøjagtighed inden for 80-120%.
  8. Hvis alle ovennævnte betingelser er opfyldt, er partiet gået, og prøverne kan kvantificeres. Klik på Rediger på værktøjslinjen, og klik derefter på Kopiér hele tabellen. Indsætte tabellen i et regneark.
  9. Der udtages gennemsnittet af den beregnede koncentration af de to prøveinjektioner for at bestemme den rapporterede koncentration af hver prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1viser en illustration af et kromatogram med bekræftede niveauer af alle 11 DR-TB-lægemidler . Opbevaringstiden for hver analysand kan ændre sig, når der anvendes forskellige instrumenter og kolonner, så den nøjagtige opbevaringstid skal bestemmes individuelt.

De ekstraherede Ion Chromatogrammer (EIC) for et bestemt lægemiddel (isoniazid, INH) i en af kalibratorerne (blank hårprøve tilsat DR-TB lægemiddelreferencestandarder) er vist i figur 2. Den kvantificeren og kvalifikationskamp overgange bruges til kvalitativt at bekræfte tilstedeværelsen af lægemidlet, som forholdet mellem område af kvantificering og område af kvalifikationskamp forbliver konstant på tværs af prøver. Den interne standard overvåges også for at sikre, at hver prøveinjektion normaliseres.

Med henblik på demonstration, analyserede vi en bekvemmelighed prøve på 15 hår prøver blandt en samlet undersøgelse befolkning på 96 patienter, der tager DR-TB medicin under DOT betingelser fra Western Cape, Sydafrika. Tabel 6 viser repræsentative niveauer af DR-TB-lægemidler på tværs af de laveste og højeste niveauer målt for hver analysand. Selv om data for 15 patientprøver præsenteres, havde hver analysand ikke 15 niveauer rapporteret, fordi hver patient er på en anden kombination af DR-TB medicin. Ingen af patienterne var på prothionamid, og kun en enkelt patient tog pretomanid.

Figure 1
Figur 1. En illustration af et repræsentativt kromatogram, der viser toppene af de 11 analysander i DR-TB-metoden (EMB= ethambutol; INH= isoniazid; PZA= pyrazinamid; ETH= ethionamid; PTH= prothionamid LFX= levofloxacin; MFX= moxifloxacin; LZD= linezolid; PTM= pretomanid; BDQ= bedaquiline; CLF= clofazimin). Fordi følsomheden af metoden for hver analysand er forskellig, INH, LZD, LFX, MFX og LZD blev tilsat på 20 NG/mg hår, mens BDQ, CLF, EMB, ETH, PTH og PTM blev spiked på 2 NG / mg hår. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. To ekstraherede Ion Chromatogrammer (EIC' er) fra en injektion af kalibreringspunkt 9 (C9), isoniazid (INH) ved 20 NG/mg. Den øverste EIC viser både INH-kvantificeringsovergangen (blå, mærket INH-2) og INH-kvalifikationsovergangen (rød, mærket INH-3). Den nederste EIC viser respons af INH-d4, den interne standard (IS), der anvendes til at kvantificere INH. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Skærmbilleder af kvantitationsprocessen. Den øverste del er en delvis prøveliste, der viser injektionsdata for en analysand (INH, isoniazid) på tværs af 12 kalibreringspunkter (mærket C0-C11), tre QC-niveauer og seks prøver. Nederste venstre del er kalibreringskurven, der spænder fra 0,5 ng/mg –100 ng/mg. Uigennemsigtige blå prikker er kalibreringspunkter. Gennemsigtige blå firkanter er kvalitetskontrolpunkter. R-værdien vises øverst til venstre (0,99722) med vægtning 1/x. De to kromatogrammer nederst til højre illustrerer en prøve med INH (topkromatogram) og en prøve uden INH (bundkromatogram). Klik her for at se en større version af dette tal.

Narkotika i hver blanding Koncentration af hvert lægemiddel i blanding Blandevolumen tilsat 50 ml vol. kolbe
Mix 1: CLF-d7, EMB-d4 10 μg/ml 40 μL
Bland 2: LFX-d8, PTH-d5 10 μg/ml 10 μL
Mix 3: BDQ-d6, LZD-d3, MFX 13C-d3, OPC (IS for PTM) 10 μg/ml 20 μL
Bland 4: PZA 15N-d3 10 μg/ml 200 μL
Bland 5: INH-d4 10 μg/ml 100 μL

Tabel 1. Koncentration og mængde af hver intern standard til at tilføje til en 50 ml volumetrisk kolbe.

Stof Lagerkoncentration Tilføjet diskenhed
BDQ delte et bdqsantal 0,5 mg/ml 8 μL
Clf 0,5 mg/ml 8 μL
Emb 1 mg/ml 4 μL
Pth 1 mg/ml 4 μL
Ptm 1 mg/ml 4 μL
Inh 1 mg/ml 40 μL
Lfx 1 mg/ml 40 μL
LZD (LZD) 1 mg/ml 40 μL
Mfx 1 mg/ml 40 μL
Pza 1 mg/ml 40 μL

Tabel 2. Mængden af hvert lægemiddel reference standard at tilføje til "Ref Std Mix 1" hætteglas.

Navn på etiket Hætteglas hentet fra Tilføjet diskenhed
Kr. Nielsen 0 μL
Kr. Ref Std Mix df1000 5 μL
Kr. Ref Std Mix df1000 10 μL
C3 . Ref Std Mix df1000 20 μL
Kr. Ref Std Mix df100 5 μL
C5 . Ref Std Mix df100 10 μL
Kr. Ref Std Mix df100 20 μL
Kr. Ref Std Mix df10 5 μL
Kr. Ref Std Mix df10 10 μL
Kr. Ref Std Mix df10 20 μL
Kr. Ref Std Mix df1 5 μL
Kr. Ref Std Mix df1 10 μL

Tabel 3. Mængden af hver Ref Std Mix-mellemprodukt, der skal føjes til de 12 kalibreringspunkter.

Samlet tid (min) Strømningshastighed (μL/min. A (%) B (%)
0 450 95 5
0.3 450 95 5
2.3 450 0 100
5 550 0 100
11 550 0 100
11.1 550 95 5
13 450 95 5
16.75 450 95 5

Tabel 4. Den strømningshastighed og det mobile faseforløb, der bruges til hver injektion.

Kalibreringspunkt Faktisk koncentration af BDQ, CLF, ETH, EMB, PTH, PTM (ng/mg) Faktisk koncentration af INH, LFX, LZD, MFX, PZA (ng/mg)
Kr. 0 0
Kr. 0.005 0.05
Kr. 0.01 0.1
C3 . 0.02 0.2
Kr. 0.05 0.5
C5 . 0.1 1
Kr. 0.2 2
Kr. 0.5 5
Kr. 1 10
Kr. 2 20
Kr. 5 50
Kr. 10 100

Tabel 5. Endelig koncentration af analysorer i hvert kalibreringspunkt.

Stof LOD
(ng/mg hår)		 Lloq
(ng/mg hår)		 ULOQ delte et link.
(ng/mg hår)		 Prøveværdier (ng/mg-hår)
Prøver: UC-04, UC-08, UC-11, UC-16, UC-25, UC-36, UC-69, UC-83, UC-89, UC-90, UC-91, UC-104, UC-105, UC-108, UC-109
Bedaquiline (Bedaquiline) 0.005 0.05 10 0.21, 0.38, 0.56, 0.86, 0.90, 1.04, 1.29, 2.15, 2.29, 5.64
Clofazimin (Clofazimine) 0.005 0.05 10 0.37, 0.61, 1.84, 2.20, 2.90, 3.41, 3.90, 6.03, 8.25, 10.66, 11.01
Ethambutol delte et link. 0.005 0.05 10 0.04, 0.05, 0.25, 0.42, 0.43, 0.5, 0.68, 0.92, 0.95, 1.01, 1.53, 1.54, 9.76
Ethionamid 0.01 0.01 10
Isoniazid (Isoniazid) 0.05 0.5 100
Levofloxacin delte et link. 0.1 0.5 100 8.01, 8.42, 15.37, 24.41, 39.45, 42.12, 56.15, 75.58, 119.96
Linezolid delte et et 0.1 0.5 100 0.87, 1.09, 3.51, 5.51, 7.80, 9.21, 15.68, 18.32, 19.13, 21.22
Moxifloxacin 0.05 0.5 100 0.35, 0.49, 1.58, 1.59, 6.23, 7.06, 13.14, 17.37, 21.72, 55.88, 86.64
Pretomanid (Pretomanid) 0.005 0.05 10 0.57
Prothionamid 0.002 0.01 10
Pyrazinamid 0.05 1 100 1.14, 1.74, 1.86, 3.21, 5.94, 11.39, 12.36, 12.71, 12.85, 14.38, 16.13, 44.17, 69.66

Tabel 6. Repræsentative niveauer af lægemidler målt hos 15 patienter, der tager DR-TB medicin under DOT. Detektionsgrænsen (LOD), nedre kvantificeringsgrænse (LLOQ) og øvre grænse for kvantificering (ULOQ) af metoden for hvert lægemiddel er angivet til sammenligning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi rapporterer her protokollen for den metode, vi udviklede og validerede til kvantificering af 11 anti-TB medicin, der anvendes til behandling af DR-TB i små hårprøver ved hjælp af LC-MS/MS. Ingen anden metode til kvantificering af disse 11 lægemidler i hår er tidligere blevet udviklet, valideret og offentliggjort. Vores metode kan kvantificere sub-nanogram niveauer af narkotika i kun 20-30 hår tråde på ca 3 centimeter (cm) i længden (~ 2 mg) og er allerede blevet valideret22. Den lave vægt af hår analyseret betyder, at patienter, der er involveret i undersøgelsen kan deltage diskret og potentielt vende tilbage til gentagne test uden frygt for at udsætte skaldet hovedbund. Vi har tidligere offentliggjort data om sammenhængen mellem DR-TB stof niveauer i hår og DR-behandling resultater23. Derfor repræsenterer udviklingen og valideringen af denne multi-analytpanelmetode et betydeligt fremskridt inden for dr-tb-behandling af terapeutiske lægemidler.

Hår kræver forskellige homogenisering teknikker end dem, der kræves med flydende biomatrices. Pulverisering af hår tråde tilladt effektiv adgang til ekstraktion smiddeltil analysanden i håret matrix. Således er et vigtigt element i vores metode den hurtige og nemme ekstraktionsproces af lægemidler fra hår ved hjælp af pulveriserede prøver. Inkubationstid under ekstraktionsprocessen er kun to timer på grund af det store tilgængelige overfladeareal af pulveriseret hår, og der er ingen oprydningstrin på grund af den lille prøvestørrelse (2 mg). Der skal dog udvises forsigtighed for at begrænse nedbrydningen af lægemidler under ekstraktionsprocessen. Protokollen bruger en to-cyklus pulverisering, med en 45 s afkøling periode i mellem cyklusser. Denne proces undgår overophedning og potentielt nedbrydende narkotika i håret.

I modsætning til mange hår analyser for narkotika af misbrug, denne metode ikke bruger en vask trin. DR-TB narkotika kommer i kapsel eller tablet form, begrænse mulige kilder til ekstern forurening og det efterfølgende behov for at vaske hår før analyse. Fremtidige undersøgelser kunne analysere vaske opløsningsmiddel fra DR-TB patient hår til at vurdere ekstern forurening.

Selv om hår pulverisering fremmer effektiv narkotika udvinding, det har sine egne begrænsninger. Vores laboratorium har konstateret, at hvis hår er pulveriseret i perle ruptor og venstre ved stuetemperatur, koncentrationen af nogle af de 11 lægemidler falder over uger og måneder. Dette kan skyldes det store overfladeareal af det pulveriserede hår udsat for atmosfæren, der kan fremme oxidation og andre nedbrydningsreaktioner. Hvis en stabilitet undersøgelse af narkotika i håret ønskes, hår kan skæres med en saks i små segmenter af <1 cm, homogeniseret i hånden, og derefter tilbage ved stuetemperatur i uger eller måneder under stabilitetsundersøgelsen. Når dette klippehår er pulveriseret på dagen for analyse, har vi ikke observeret nogen væsentlig nedbrydning af narkotika over tid. Derfor, i udførelsen af den beskrevne protokol, anbefaler vi, at håret skal pulveriseres den dag, det er udvundet. Ligeledes bør alle lægemiddelblandinger under 10 μg/ml koncentrationer fremstilles på ekstraktionsdagen.

Ingen tidligere offentliggjorte metoder er tilgængelige til at vurdere egnetheden af de lineære dynamiske områder (LLOQ-ULOQ) vi etableret for hver TB stof i multi-analysand metode. Men, den bekvemmelighed prøve af hår prøver fra Western Cape, Sydafrika, angiver egnetheden af den lineære dynamikområde af denne metode. Med undtagelse af ethionamid, pretomanid og prothionamid er mere end 95 % af de lægemiddelniveauer, vi målte hos disse patienter, inden for det lineære dynamiske område for hver analysand. Kun én patient tog pretomanid (som blev opdaget), og ingen patienter tog prothionamid. For ethionamid, vi hypotesen om, at stoffet ikke kan deponere til håret matrix godt, som vores LOD er 0.01 NG/mg hår (eller 10 pg/mg hår) og alligevel kun en af de otte patienter, der tager ethionamid har niveauer større end 0.02 NG/mg hår. Yderligere undersøgelse er berettiget til at bestemme farmakokinetik af forskellige TB narkotika i hår. For eksempel, et potentielt alternativ til overvågning af lægemidler som ethionamid er at udvikle en metode rettet mod deres metabolit (r) i stedet. Vi har lavet en lignende observation for delamanid, en roman DR-TB medicin, som oprindeligt var en del af dette panel. En metode rettet mod delamanid's metabolit er i øjeblikket i færd med at blive valideret i vores laboratorium, fordi metabolit findes i højere koncentrationer end moderselskabet stof. Den samme procedure kan udføres for ethionamid. Lægemiddelkoncentrationerne i tabel 6 præsenteres som en gruppe, fordi de enkelte resultater og kliniske resultater ikke er i fokus i dette metodepapir. Der er offentliggjort en individuel vurdering af denne patientgruppe andetsteds23.

De patienter, der bidrog med små hårprøver til demonstrationsundersøgelsen, blev administreret en række lægemiddelregimer via DOT i en indlæggelsesperiode, og alle regimer blev dokumenteret i henhold til sygeplejejournaler i indlæggelsesperioden. Men, som det er almindeligt blandt DR-TB patienter, tidligere, dårligt dokumenterede lægemiddel regimer var også blevet administreret før deres indlæggelse ophold. Dette førte til påvisning af lægemidler i patientens hår, der ikke blev noteret på deres indlæggelse optegnelser. Derfor kunne vi ikke bruge disse prøver til at bestemme specificiteten af metoden, da vi ikke kunne afgøre, om disse prøver virkelig var falske positiver. I stedet testede vi hår fra patienter, der ikke tog DR-TB-medicin. Der blev ikke påvist dr-tb-lægemidler i disse prøver, hvilket indikerer, at metoden er specifik.

Selv om vores metode viser nytten af at bruge hår til måling af DR-TB narkotika, hår analyse har sit eget sæt af begrænsninger. Fordi hår er en solid matrix, spiking af narkotika referencestandarder under metode validering ikke giver mulighed for standardernes fulde integration i matrix som med urin og blod. Således, recovery vurdering er begrænset til påvisning af narkotika efter spiking på den faste matrix, og ikke faktiske hentning fra matrix. Ligeledes, fordi hår er en alternativ matrix, der stadig er ved at blive undersøgt til test, ingen let tilgængelige referenceområder for medicin er til rådighed til at vurdere metode egnethed. Mere farmakokinetiske undersøgelser af inkorporering af lægemidler i håret vil være nyttigt at yderligere forstå nytten af hår stof niveauer i overholdelse overvågning. Endelig, den rette samling af hår prøver på marken steder har sin egen unikke udfordringer. Mens indsamling og opbevaring af hår prøver kræver færre ressourcer end andre biomatrices, skal der tages pleje til at identificere de distale og proksimale ender af ethvert hår tråde længere end 2 cm. Længere hår tråde kan have forskellige stof koncentrationer langs strengen, afhængigt af medicin brug over tid. Korrekt mærkning giver mulighed for analyse af specifikke segmenter af strengene; i tilfælde af vores metode, de tre centimeter af hår tættest på hovedbunden blev brugt til at bestemme de seneste data om medicin overholdelse. Korrekt mærkning kræver uddannelse og kvalitetssikringsprocedurer på stederne.

Sammenfattende har vi udviklet den første multi-analysand panel til at analysere TB medicin, der anvendes til DR-TB via LC-MS / MS i små hår prøver. I betragtning af muligheden for at indsamle og opbevare hår i ressourcebegrænsede indstillinger, vores metode repræsenterer et potentielt betydeligt fremskridt inden for TB terapeutisk lægemiddelovervågning. Objektive mål for lægemiddeleksponering, der tager hensyn til både overholdelse og individuel farmakokinetisk variabilitet, kan give tidlig indikation af ineffektive behandlingsregimer, hvorved både individuel behandling og begrænsning af fællesskabets overførsel af DR-TB24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Allergy and Infectious Diseases RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe og Monica Gandhi).

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke professor Keertan Dheda, Dr. Ali Esmail, og Marietjie Pretorius ved University of Cape Town Lung Institute, der lettede indsamlingen af hår prøver til undersøgelsen. Forfatterne anerkender endvidere taknemmeligt bidragene fra deltagerne i denne undersøgelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL injection vials Agilent Technologies 5182-0716
250 uL injection vial inserts Agilent Technologies 5181-8872
Bead ruptor 24 OMNI International 19001
Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) OMNI International 19628
Bedaquiline Toronto Research Chemicals B119550
Bedaquiline-d6 Toronto Research Chemicals B119552
Clofazimine Toronto Research Chemicals C324300
Clofazimine-d7 Toronto Research Chemicals C324302
Disposable lime glass culture tubes VWR 60825-425
Ethambutol Toronto Research Chemicals E889800
Ethambutol-d4 Toronto Research Chemicals E889802
Ethionamide Toronto Research Chemicals E890420
Ethionamide-d5 ClearSynth CS-O-06597
Formic acid Sigma-Aldrich F0507-100mL
Glass bottles Corning 1395-1L
Hot Shaker Bellco Glass Inc 7746-32110
HPLC Agilent Technologies Infinity 1260
HPLC grade acetonitrile Honeywell 015-4
HPLC grade methanol Honeywell 230-1L
HPLC grade water Aqua Solutions Inc W1089-4L
Isoniazid Toronto Research Chemicals I821450
Isoniazid-d4 Toronto Research Chemicals I821452
LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm Phenomenex 00D-4371-B0
LC guard cartridge Phenomenex AJ0-8788
LC guard cartridge holder Phenomenex AJ0-9000
LC-MS/MS quantitation software Sciex Multiquant 2.1
Levofloxacin Sigma-Aldrich 1362103-200MG
Levofloxacin-d8 Toronto Research Chemicals L360002
Linezolid Toronto Research Chemicals L466500
Linezolid-d3 Toronto Research Chemicals L466502
Micro centrifuge tubes E&K Scientific 695554
Moxifloxacin Toronto Research Chemicals M745000
Moxifloxacin-13C, d3 Toronto Research Chemicals M745003
MS/MS Sciex Triple Quad 5500
OPC 14714 Toronto Research Chemicals O667600
Pretomanid (PA-824) Toronto Research Chemicals P122500
Prothionamide Toronto Research Chemicals P839100
Prothionamide-d5 Toronto Research Chemicals P839102
Pyrazinamide Toronto Research Chemicals P840600
Pyrazinamide-15N, d3 Toronto Research Chemicals P840602
Septum caps for injection vials Agilent Technologies 5185-5862
Turbovap LV evaporator Biotage 103198/11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  2. WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
  3. Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
  4. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
  5. Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, Suppl 1 79-87 (2006).
  6. Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
  7. Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
  8. Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
  9. Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
  10. Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
  11. Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
  12. Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
  13. Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
  14. Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
  15. Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
  16. Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
  17. Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
  18. Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
  19. Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
  20. Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
  21. Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
  22. Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
  23. Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
  24. Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).

Tags

Medicin LC-MS/MS MDR-TB narkotika Hår analyse Overholdelse overvågning Terapeutisk lægemiddelovervågning Resistent TB
Valideret LC-MS/MS Panel til kvantificering af 11 resistente TB-medicin i små hårprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reckers, A., Wen, A., Aguilar, D.,… More

Reckers, A., Wen, A., Aguilar, D., Bacchetti, P., Gandhi, M., Metcalfe, J., Gerona, R. Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples. J. Vis. Exp. (159), e60861, doi:10.3791/60861 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter