Summary
여기에서, 우리는 절단된 축색및 그들의 시냅스의 형태학적 그리고 기능적인 보존을 평가하기 위하여 Drosophila melanogaster에 있는 3개의 간단한 상해 유도한 축사 변성 (축세포 죽음) 분석사를 능력을 발휘하는 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
축사 변성은 신경 퇴행성 질환과 신경계가 기계적 또는 화학적 힘에 의해 도전받을 때 공유되는 기능입니다. 그러나, 근본적인 축색 변성의 분자 기계장치에 대한 우리의 이해는 제한됩니다. 상해로 인한 축산 변성은 절단된 축슨이 자신의 분해(축산 죽음)를 어떻게 실행하는지 연구하는 간단한 모델역할을 합니다. 최근 몇 년 동안, 진화적으로 보존 된 축사 죽음 신호 캐스케이드는 부상 후 퇴화하기 위해 분리 된 축사에 필요한 포유동물로 파리에서 확인되었습니다. 반대로, 감쇠된 축슨 죽음 신호는 절단된 축색및 그들의 시냅스의 형태학적 및 기능적 보존의 결과. 여기에서, 우리는 차소 세포체, 또는 열매 파리 Drosophila에서신경 세포 체에서 절단 된 절단 된 축세포의 축사 및 시냅스 기능을 관찰 할 수있는 세 가지 간단하고 최근에 개발 된 프로토콜을 제시한다. 형태는 날개에서 관찰 될 수있다, 여기서 부분 부상은 같은 신경 번들 내에서 부상제어 축축의 나란히 축사 사망을 초래한다. 양자택일로, 축색성 형태는 또한 전체 신경 번들이 안테나 절제에 의해 시작되는 축사 죽음을 겪는 두뇌에서 관찰될 수 있습니다. 절단된 축색및 그들의 시냅스의 기능보존은 시냅스 후 그루밍 행동과 결합된 간단한 광유전학적 접근법에 의해 평가될 수 있습니다. 우리는 높은 와이어 기능 상실 돌연변이를 사용하여 dnmnat를과도하게 표현하여 몇 주에서 몇 달까지 축사 죽음을 지연시킬 수있는 예를 제시합니다. 중요한 것은, 이러한 프로토콜은 부상을 넘어 사용할 수 있습니다; 그(것)들은 신경 유지 요소, 축색 수송 및 축색 미토콘드리아의 특성화를 촉진합니다.
Introduction
뉴런의 형태학적 무결성은 평생 동안 지속적인 신경계 기능에 필수적입니다. 뉴런 볼륨의 대부분은 축사 에 의해 촬영1,,2; 따라서 특히 긴 축색의 평생 유지는 신경계에 대한 주요 생물학적 및 생체 에너지 도전이다. 여러 축삭 내재 및 신경교 외적 지원 메커니즘이 확인되어 평생 동안 축삭 생존을 보장합니다. 이들의 손상으로 인해 축색 변성3,이는 신경계의 일반적인 특징이며, 질병에서 어려움을 겪고 있으며 기계적 또는 화학적 힘에 의해4,,5. 그러나, 축색 변성의 근본적인 분자 기계장치는 어떤 문맥든지에서 제대로 이해되지 않는 남아, 축사 손실을 막기 위하여 효과적인 처리의 발달을 도전하는 만들기. 이러한 신경학적 조건에 대한 효과적인 치료법의 개발은 우리 사회에 엄청난 부담을 안겨주므로6.
부상으로 인한 축슨 변성은 절단된 축슨이 자신의 분해를 실행하는 방법을 연구하는 간단한 모델역할을 합니다. 1850년 아우구스투스 월러(Augustus Waller)의 이름을 따서 명명된 월레리안 변성(WD)은 분자 분리 가능한 두 가지 공정7을포함하는 우산 용어이다. 첫째, 축사 부상 후, 세포체에서 분리된 축새는 부상 후 1일 이내에 진화적으로 보존된 축슨 죽음 신호를 통해 자신의 자멸(축색사)을 적극적으로 실행한다8. 둘째, 주변 신경교세포와 전문 식세포가 3~5일 이내에 축산 파편을 교전하고 치웁트합니다. 축사 죽음 신호의 감쇠는9,10,,11,,12주동안 보존 된 절단 된 축사를 초래하며, 신경교 침몰의 감쇠는 생체 내13,14,,15에서몇 주 동안 지속되는 축색 파편에서 절정을 이룬다.
파리, 쥐, 쥐 및 얼룩말물고기에 대한 연구는 축사 죽음의 몇 가지 진화적으로 보존되고 필수적인 중재자를8. 축산 죽음 돌연변이는 축사 죽음을 겪지 않는 절단된 축색및 시냅스를 포함합니다; 그들은 세포 체 지원9,,10,,12,,13,1616,17,,18,,19,,20,2121,22,23의부재 속에서 몇 주 동안 형태학적으로 그리고 기능적으로 보존되어 있습니다. 이 중재자의 발견 그리고 특성은 축삭 죽음을 실행하는 분자 통로의 정의로 이끌어 냈습니다. 중요한 것은, 축사 죽음 신호는 축축이 절단, 분쇄 또는 뻗어 때뿐만 아니라활성화된다 24,,25; 그것은 또한 신경 조건의 명백한 동물 모형에 있는 기여자인 것처럼 보입니다 (예를 들면, 축산이 상해 독립적인 방식으로 퇴화하는4,그러나 유익한 결과의 범위4,,8). 따라서, 축슨 죽음이 부상 후 축슨 변성을 실행하는 방법을 이해하는 것은 간단한 부상 모델을 넘어 통찰력을 제공 할 수 있습니다; 그것은 또한 치료 내정간섭을 위한 표적을 제공할 수 있었습니다.
과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila)는 축세포 사멸 신호에 대한 귀중한 시스템으로 입증되었습니다.Drosophila 비행에 있는 연구는 4개의 필수적인 진화적으로 보존한 축산 죽음 유전자를 밝혔습니다: 하이와이어 (hiw)11,14, dnmnat12,,26, dsarm10 및 축사 (도끼)12., 이 중재자의 수정―히우ᆞ무장과 도끼의기능 상실 dsarm 돌연변이ᆞdnmnat의 과잉 표현―은 비행기간 동안 축사 죽음을 강력하게 막는다. 절단 된 야생 형 축슨은 1 일 이내에 축사 죽음을 겪는 동안, 절단 된 축색과 hiw, dsarm 또는 도끼가 부족한 시냅스는 형태학적으로뿐만 아니라 몇 주 동안 기능적으로 보존됩니다. 높은 수준의 dnmnat를 통해 기능 보존이 달성될 수 있는지 여부는 여전히 결정되어야 합니다.
여기에서, 우리는 세포 바디 지원의 부재에 있는 축세포 죽음을 공부하는 3개의 간단하고 최근에 개발된 프로토콜 (예를 들면, 절단한 축색및 그들의 시냅스의 형태 및 기능) 제출할 것입니다. 우리는 감쇠된 축산 죽음이 형태학적으로 기능dnmnatOE상실 돌연변이(hiw@N)로 hiw 보존되는 절단된 축사에서hiw∆N어떻게 발생하며, 감쇠된 축슨 사멸이 어떻게 절단된 축종과 시냅스가 dnmnat의 과잉 발현으로 적어도 7일 동안 기능적으로 보존되는지 를 보여줍니다. 이러한 프로토콜은 중추, 또는 말초 신경계(CNS 및 PNS 각각)에서 개별 축색 및 시냅스 형태를 관찰할 수 있게 해주며,13,,14,CNS에서 절단된 축색및 시냅스의 기능적 보존은 행동판독으로그루밍과 결합된 간단한 광유전학 적 설정의 사용에 의해 가시화될 수 있다.
Protocol
1. PNS에서 축사 죽음 도중 축슨 형태학의 관측
- 날개 부상: 축색 다이의 부분 부상
- 오른쪽 유전자형(그림4A,P 0세대)에서 처녀0 암컷 5명과 수컷 5개를 사용하여 실온(RT)에서 십자가를 수행한다. P0을 3~4일마다 새 유리병에 넣습니다. 매일 갓 밀폐된 성인 자손(F1세대)을 수집하고 7-14일 동안 나이를 들어오세요.
- CO2 패드로 날아다니는 마취. 마이크로 가위를 사용하여 날개 중앙의 앞쪽 날개 정맥을 대략 잘라냅니다(그림1A). 부상에 대해 한 날개를 사용하고 다른 날개는 나이가 맞는 부상 컨트롤로 사용하십시오. 날개당 부상을 한 번, 충분한 날개(약 15개의 날개)를 다치게 하십시오.
참고 : 전체 날개를 절단 할 수 있지만 전방 날개 정맥만 절단하는 것으로 충분합니다. 이것은 날개의 가장 강한 부분입니다. - 음식이 함유 된 바이알에서 파리를 회수하십시오.
- 축색의 날개 해부 및 시각화
- 전체 유리 슬라이드를 따라 파이펫과 함께 할로카본 오일(27)의 10 μL을 확산한다(그림1B).
- 부상당한 뿐만 아니라, 원하는 시점에서 부상당한 컨트롤 윙을 잘라냅니다(예: 부상 후 1일 또는 7일). 마이크로 가위를 사용하여 잘라내고 핀셋을 사용하여 날개를 잡습니다. 최대 4개의 날개를 할로카본 오일 27(그림1B)에장착하고 커버 슬라이드로 덮습니다.
- 회전 디스크 현미경을 사용하여 날개를 즉시 이미지화합니다. 0.33 μm 스텝 크기로 z축을 따라 일련의 광학 섹션을 획득하고 후속 분석을 위해 z-stack을 단일 파일로 압축합니다.
참고: 세포체와 축산이 보관되어 있는 전방 날개 정맥을 잡지 마십시오. 중앙에 날개를 잡아. 날개의 조직은 고정되지 않습니다. 8 분 미만이 이미징날개를 장착하는 데시간을 유지하십시오.
그림 1: 날개에서 축색사 사망 시 축색 형태관찰. (A)두 개의 희소한 GFP 표지 감각 뉴런을 가진 도식 비행 날개, 이는 또한 별도로 아래에 표시되어 있다. 부상 부위와 관찰 분야가 표시됩니다. (B)날개 이미징을 위한 회로도 설정. 부상 및 부상되지 않은 제어 날개(회색)는 유리 슬라이드(연한 파란색)에 할로카본 오일 27(빨간색)에 장착되고 커버 슬라이드(검은색)로 덮여 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. CNS에서 축사 사망 시 축슨 과 시냅스 형태학의 관찰
- 안테나 절제 : 전체 축산 번들의 부상
- 오른쪽 유전자형(그림5A,P0 세대)에서 처녀 암컷 5명과 남성 5개를 사용하여 3-4일마다 새로운 바이알에P0을 통과시크로스를 수행한다. 매일 갓 밀폐된 성인 자손(F1세대)을 수집하고 7일에서 14일까지 노화시키세요.
- CO2 패드로 날아다니는 마취. 핀셋을 사용하여 일방적인 절제에 대해 오른쪽3rd 안테나 세그먼트를 ablate; 또는 양측 절제에 대한 왼쪽 및 오른쪽 3rd 안테나 세그먼트(그림 2A-C). 이것은 그들의 축색 투영이 CNS에 남아 있는 동안 GFP 표지된 신경 세포 바디를 제거할 것입니다.
참고: 안테나 절제는 축산 전체 번들을 끊습니다. 일방적인 절제가 수행되면 반대측의 축삭 번들(비압 안테나)이 내부 제어 역할을 합니다. 충분한 안테나 절제 (약 15 동물)를 수행해야합니다. - 음식이 함유 된 바이알에서 파리를 회수하십시오.
- 축색의 뇌 해부 및 시각화
- 실리콘 엘라스토머 염기(9mL)와 경화제(1mL)를 부피 비율로 10:1로 혼합합니다. 각 5 mL 혼합물을 35 mm 조직 배양 판으로 옮기고, 밤새 연기 후드에 부드러운 교반과 혼합하여 유입된 공기를 감소시소. 혼합물은 24 시간 이내에 고화됩니다.
참고 : 해부 플레이트는 한 번만 준비해야하며 여러 번 사용할 수 있습니다. - CO2 패드로 날아가 원하는 시점(예: 안테나 절제 후 1일 또는 7일)에 두 개의 핀셋을 사용하여 성인 머리를 마취시면 됩니다. 한 핀저를 사용하여 목을 잡고 다른 핀위저를 사용하여 흉부 문제를 해결합니다. 목을 부드럽게 당기고 흉부에서 머리를 떼어냅니다.
참고: 원하는 숫자가 달성될 때까지 CO2 패드에 머리를 두지 말고 30분 이내에 다음 단계로 진행해야 합니다. - 모든 헤드를 4% 파라포름알데히드(PFA) 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 1mL 의 고정용액을 함유하는 1.5 mL 마이크로원심지 튜브로 이송하여 고정용액에 담근 핀셋을 사용하여 인산완충 식염수(PBS)에 넣습니다.
참고 : 플라이 헤드는 젖은 핀셋에 잘 붙어 있습니다. 모든 헤드를 미세 원심분리튜브로 쉽게 이송하는 것이 가능합니다. - RT에서 부드러운 교반으로 20 분 동안 머리를 고정하십시오. 피펫으로 상류를 제거하고 RT에서 부드러운 교반으로 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 세척 버퍼 1 mL로 5 개의 2 분 세척으로이 절차를 반복하여 잔류 고정 용액을 제거합니다.
참고 : 성인 초파리 뇌를 해부하는 방법에 대한 비디오는 쉽게 사용할 수 있습니다27. - 유리 파이펫으로 머리를 세척 버퍼로 채워진 해부 판으로 옮김. 한 핀처를 사용하여 다른 핀처와 머리를 잡고 머리에서 proboscis를 잡아 당깁니다. 이는 외골격에 부착된 프로보시스가 있던 구멍을 남길 것이다.
- 두 개의 핀셋을 사용하여 구멍과 각 복합 눈 사이의 외골격을 제거합니다. 이것은 두 핀셋으로 머리 구조를 열고, 부드럽게 내부의 뇌를 긁어 수 있게 합니다.
- 기관이나 지방을 제거하여 각 뇌를 청소하십시오(그림 2D,상단). 뇌가 세척되면, 얼음에 세척 버퍼의 1 mL를 포함하는 새로운 미세 원심 분리튜브에 넣어.
참고 : 손상되거나 잃어버린 광학 엽은 뇌의 중심에있는 후각 엽에 영향을 미치지 않습니다(그림 2D, 상단). - 모든 뇌가 미생물 원심 분리튜브 의 바닥에 수집되고 축적되면 세척 버퍼를 1 mL의 고정 용액으로 교체하십시오. RT에서 흔들면서 10 분 동안 뇌를 수정한 다음 RT에서 흔들면서 1 mL의 세척 버퍼에서 5 2 분 세척하십시오.
- 1차 항체(1:500)를 밤새 4°C에서 흔들어 세척한 다음 RT에서 흔들린 1 mL의 세척 버퍼를 사용하여 2시간 동안 10회 세척합니다.
- 이차 항체 (1:500)를 RT에서 흔들어 세척 버퍼 2 h에 적용하고 빛을 차단하기 위해 알루미늄 호일에 미세 원심 분리 튜브를 포장하십시오. 절차의 나머지 부분에 대한 알루미늄 호일로 덮여 미세 원심 분리튜브를 유지합니다. RT에서 흔들면서 2시간 동안 1mL의 세척 버퍼로 10개의 세척을 적용합니다.
- 상급체를 제거하고 한 방울의 안티페이드 시약을 사용하여 미세 원심 분리튜브의 뇌를 덮습니다. 4 °C에서 적어도 30 분 동안 뇌를 배양한 후 장착 및 이미징을 준비합니다.
- 표지 슬라이드를 준비하고 랩 테이프를 붙이고 테이프에서 "T"와 같은 모양을 잘라냅니다(그림2D,아래). 생성된 공간은 뇌-함유 안티페이드시약(28)이 두 챔버 내로 피펫화되는 영역으로서 작용한다.
참고: 팁의 3mm가 잘려파이펫의 개구부를 넓힌 20-200 μL 파이펫 팁을 사용하십시오. 이것은 뇌가 함유 된 안티 페이드 시약을 파이펫하는 것이 가능할 것입니다. 조심스럽게 커버 슬라이드로 뇌를 덮습니다. - 점토를 사용하여 두 개의 작은 짝수 롤을 준비하십시오. 점토 롤이 유리 슬라이드높이보다 높지 않은지 확인하십시오. 점토 롤을 유리 슬라이드에 붙입니다(그림 2D,아래). 뇌가 들어있는 커버 슬라이드 샌드위치를 점토 롤 위에 놓습니다.
참고: GFP 라벨이 부착된 축색과 시냅스는 뇌 의 전면에 있습니다. 따라서 정면에서 이미지화하기가 더 쉽습니다. 그러나 뇌는 위를 향하거나 커버 슬라이드 샌드위치를 아래로 향하게 합니다. 클레이 롤은 샌드위치 홀더역할을 하며, 이미징 중에 샌드위치를 거꾸로 뒤집을 수 있습니다. 이것은 모든 두뇌에서 정면에서 심상을 취득하는 것을 가능하게 할 것입니다. - 공초점 현미경을 사용하여 1.0 μm 스텝 크기로 z축을 따라 일련의 광학 섹션을 획득하고 z-stack을 단일 파일로 압축하여 후속 분석을 위해 그대로 남아 있는 축축 투영수를 평가합니다.
- 실리콘 엘라스토머 염기(9mL)와 경화제(1mL)를 부피 비율로 10:1로 혼합합니다. 각 5 mL 혼합물을 35 mm 조직 배양 판으로 옮기고, 밤새 연기 후드에 부드러운 교반과 혼합하여 유입된 공기를 감소시소. 혼합물은 24 시간 이내에 고화됩니다.
그림 2: 뇌의 축사 사망 시 축축액 및 시냅스 형태학적 관찰. (A)GFP 표지 된 세포체, 축사 및 시냅스가있는 개략적 플라이 헤드의 측면보기. (B)GPF 표지된 후각 수용체 뉴런 및 그들의 축색 및 시냅스의 고배율 전면도. 세포 체는 3rd 안테나 세그먼트에 보관되며 축산은 CNS에 투영됩니다. 축삭은 왼쪽 후각 엽의 사구체에서 시냅스를 형성하고, 중간선을 교차시키고 반대측 후각 엽의 사구체에서 시냅스를 형성합니다. (C)일방적 인 안테나 절제와 플라이 헤드의 예. 상단: 부상을 입지 않은 컨트롤. 중간:3rd 안테나 세그먼트의 절제. 하단 : 2nd (따라서 또한 3rd)안테나 세그먼트의 절제. (D)뇌 준비. 상단: 시야에서 표시된 후각 엽 및 축색 돌기와 도식 해부 비행 뇌. 하단: 뇌 이미징을 위한 회로도 설정. 두 개의 점토 롤 (녹색)은 유리 슬라이드 (밝은 파란색)에 장착되고, 플라이 브레인 (회색)을 포함하는 커버 슬라이드 샌드위치를 운반합니다. 뇌는 안티 페이드 시약 (보라색)에 장착되고 실험실 테이프 (주황색)로 둘러싸여 있으며 두 개의 커버 슬라이드 (검은 색)로 덮여 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 축세포와 시냅스 기능에 대한 판독으로 광유전학에 의해 유도 그루밍
- 광유전학 설정
- 어두운 방에서 광유전학 실험을 수행하십시오. 설정은 어둠 속에서 파리를 조명하는 850 nm 적외선 (IR) LED 스포트라이트로 구성되어 있는지 확인(그림 3A),CsChrimson을 표현하는 뉴런을 활성화하기 위해 깜박이는 660 nm 빨간색 LED 스포트 라이트, 그리고 붉은 빛 깜박임의 기록을 방지 700 nm 롱 패스 필터와 흑백 카메라.
- 3D 프린터를 사용하여 직경 1cm의 작은 원형 동작 챔버를 생성하고 커버 슬라이드로 덮고 챔버 옆에 빨간색 LED 스포트라이트에 결합된 860 nm 방사체를 배치합니다(그림3B).
참고: 방사체는 빨간색 LED 스포트라이트가 켜진 시기를 나타내므로 뉴런이 활성화됩니다. - LED 스포트라이트와 카메라를 챔버 상단에 장착합니다(그림3A, C).
- 10s 동안 10Hz 깜박임으로 뉴런을 활성화합니다. 활성화 기간은 실험 설계에 따라 조정할 수 있습니다.
- 광유전학을 위한 파리 준비
- 플라이 푸드를 전자레인지에 녹입니다. 음식이 식힌 후, 고화하기 전에, 에탄올 (EtOH)에 있는 모든 트랜스 망막의 1:100을 200 μM의 최종 농도에 추가하고, 음식을 빈 유리병에 즉시 부어 넣습니다.
참고 : 뜨거운 음식에 모든 트랜스 망막을 추가하지 마십시오, 이것은 덜 효율적인 광유전학귀착될 수 있습니다. - 플러그 나 면봉으로 고형 식품이 들어있는 바이알을 덮으십시오. 알루미늄 호일로 바이알을 감싸고 있습니다. 그런 다음 음식이 들어있는 바이알을 어둡고 차가운 방에 보관하십시오.
- 오른쪽 유전자형에서 5명의 처녀 암컷과 5명의 수컷(그림6A,세대Figure 6P0)을사용하여 3~4일마다 새로운 바이알에P0을 통과시다. 매일 바닥에 갓 밀폐된 성인1자손(F1 세대)을 수집하고 플라이 푸드에서 200 μM의 모든 망막이 들어있는 알루미늄 으로 덮인 바이알에서 최대 7 일 동안 노화시키십시오.
- 음식이 들어있는 바이알에서 음식이 없는 빈 유리병에 파리를 두드려 파리를 수집합니다. 약 30초 동안 얼음이 함유된 물로 바이알을 식히십시오. 커버 슬라이드로 덮여 작은 챔버에 빠르게 개별 파리를 넣어(그림 3B).
참고: 파리가 따뜻해지자마자 잠에서 깨어날 수 있습니다. 개별 파리를 단일 챔버로 신속하게 확산하는 것이 중요합니다. CO2 패드가 파리를 마취하는 것을 피하십시오, 이것은 그들의 행동에 영향을 미칠 것입니다. - 안테나 그루밍을 유도하기 위해 광유전학을 수행합니다. 여기서 프로토콜은 다음과 같은 간격으로 구성됩니다 : 적색광이 없는 30 s, 10 Hz에서 10 초의 적색 광 노출이 뒤따르고 이 절차를 총 3 회 반복한 다음 빨간색 표시등이 없는 추가 30 s 간격이12,,29,,30입니다.
참고: 이 프로토콜은 실험 선호도에 따라 조정할 수 있습니다. - CO2 패드의 각 챔버에서 개별 파리를 수집합니다. 안테나 부상을 입어보십시오. 왼쪽 및 오른쪽2nd 안테나 세그먼트를 모두 절제합니다(그림2C). 이것은 존스턴의 기관의 세포 체를 제거할 것 이다 (JO) 뉴런, 축 색 돌기 는 CNS에 남아 있는 동안. 200 μM의 모든 트랜스 망막이 들어있는 알루미늄 커버 바이알에서 파리를 회수하십시오.
참고: 광유전학에 의해 유도된 안테나 그루밍의 경우, 감각 신경 세포 체는2nd 안테나 세그먼트에 보관된다(그림2C). - 해당 시점(예: 7일 후 안테나 절제)에서 피사체는 다른 그루밍 분석(3.2.4단계로 돌아가기)으로 날아갑니다.
- 플라이 푸드를 전자레인지에 녹입니다. 음식이 식힌 후, 고화하기 전에, 에탄올 (EtOH)에 있는 모든 트랜스 망막의 1:100을 200 μM의 최종 농도에 추가하고, 음식을 빈 유리병에 즉시 부어 넣습니다.
그림 3: 축세포 및 시냅스 기능에 대한 판독으로 그루밍을 유도하는 광유전학 적 설정. (A)광유전학에 필요한 조립 성분의 그림. 적외선(IR) LED 스포트라이트, 카메라 및 빨간색 LED 스포트라이트(왼쪽에서 오른쪽으로 각각). 자세한 설명을 포함한 구성 요소는 재료 표에나열됩니다. (B)빨간색 LED 스포트라이트 활성화를 나타내기 위해 IR 이미터를 포함한 비헤이비어 챔버의 상단 뷰 그림. (C)단일 마운트 설정의 그림. 두 개의 LED 스포트라이트와 카메라에는 각각 총 3개의 마운트 설정이 필요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
위에서, 우리는 절단된 축색및 그들의 시냅스의 형태와 기능을 연구하는 세 가지 방법을 기술했습니다. 첫 번째 방법은 PNS에서 개별 축색의 고해상도 관찰을 허용합니다. 그것은 MARCM 기술14,,31에의해 생성 된 클론이 필요합니다. 여기서, 우리는 야생형 및 고와이어 돌연변이인 MARCM 클론을 생성하기 위해 십자가를 수행하였다(도4A). 날개 의 중간에 간단한 절단은 말단 (예를 들어, 날개의 바깥쪽에) 보관 뉴런의 축축한 부상을 유도, 근위 뉴런 동안 (예를 들어, 절단 사이트와 흉부 사이) 부상되지 않은 상태로 남아. 이 접근법은 동일한 신경 번들에서 부상되지 않은 대조군 축아의 축사 죽음을 나란히 관찰하는 것이 가능해진다(그림1A, 도 4B). 여기서, 우리는 GFP 표지된 클론의 낮은 수의 결과로 유전적 배경을 사용했다(예를 들어, 각 실험14에서2개). 우리는 야생 형 축색의 부상 후 1 및 7 일의 예를 제시, 제어 축색의 예를 제공하기 위해, 축사 죽음을 겪고 축사, 축색 조각은 주변 glia에 의해 각각 지워지고. 또한, 우리는 우리가 부상 후 7 일 결과를 분석 높은 와이어 돌연변이에 축축한 부상을 반복했다.
부상당한 컨트롤 날개는 두 개의 야생 형 클론을 항구, 따라서 두 GFP 라벨 야생 형 축슨(그림 4B,야생 유형, 부상되지 않은 제어). 마이크로 가위를 사용하여 날개의 중간을 절단 한 후, 축삭 죽음은 세포체가 절단 부위에 말단하는 GFP 라벨 축삭에서 유도되고, 근위식 보관 된 세포체의 축삭은 동일한 신경 번들 내에서 내부 제어 역할을합니다(그림 4B,야생 유형, 1 일 후 부상). 화살표로 표시된 상부의 축색 파편 흔적을 주목하십시오. 축색 상해 후 7 일, GFP 표지 축사 파편은 주변 glia에 의해 삭제되고, GFP 표시되지 않은 통제 축새는 신경 묶음에 남아 있는 동안(그림 4B,야생 모형, 7 일 포스트 상해, 화살표). 대조적으로, 7 일 동안 절단 된 고선 돌연변이 축은 이전 연구 결과11,,14 (그림 4B, highwire,7 일 후 부상, 화살표)와 일치하는 형태학적으로 보존 된 상태로 남아 있습니다. 이러한 결과는 초파리 날개의 강력한 시각적 해상도를 보여줍니다. 축사 죽음은 동일한 신경 번들에서 부상되지 않은 컨트롤의 나란히 관찰 될 수있다. 야생형 축산은 부상 후 1일 이내에 축사 사망을 겪고 그 결과 파편은 7일 이내에 제거되지만, 축사 사망 결핍 고와이어 돌연변이체는 7일 동안 형태학적으로 보존되어 있습니다.
그림 4: 날개에 GFP 표지된 감각 신경 축삭의 축삭 죽음을 연구하는 접근법. (A)날개에 야생형 및 하이와이어 클론을 생성하는 도식 십자가(각각P0 및F1 세대). 처녀 여성은 왼쪽에, 오른쪽에 남성. 유전자형 세부 사항은 재료 표를 참조하십시오. (B)GFP 라벨이 부착된 축색 의 제어 및 부상의 예. 시야는(그림 1A)에표시됩니다. 왼쪽에서 오른쪽으로: 부상을 입지 않은 야생형 대조축, 야생형 축사 1일 후 부상, 야생형 축사 7일 후 부상, 고선 돌연변이 축축7일 후 부상. 화살표는 잘된 축색, 배율 표시줄 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
두 번째 방법은 왼쪽 및 오른쪽 안테나모두에 보관된 뉴런에 속하는 시냅스를 형성하는 CNS에 투영되는 전체 축슨 번들을 시각화하는 방법을 설명합니다(그림2A-C). 여기서, 우리는 야생형 및 고와이어 돌연변이인 MARCM 클론을 생성하기 위해 십자가를 수행하였다(도5A). 부상을 입지 않은 GFP 라벨 축과 시냅스는 부상이 없는 상태에서 며칠에서 몇 주동안 시각화할 수있습니다(그림 5B,야생 형, 부상되지 않은 제어). 대안적으로, 동물은3rd 안테나 세그먼트 절제의 대상이 될 수 있고, 절단된 GFP 표지 축색및 그들의 시냅스는 시간 과정 동안 몇 시간에서 며칠에 걸쳐 관찰될 수 있다. 우리는 안테나 절제 후 7 일에 초점을 맞추었습니다.이 시점에서 축축한 축사와 시냅스가 축산 사망을 겪었고 그 결과로 생긴 파편이 주변 신경교에 의해 제거되기 때문입니다. 오른쪽 안테나의 일방적인 절제가 수행되면, 오른쪽 축색다 묶음이 절단되고 분해되고 그 결과 파편이 부상 후 7일 후에 완전히 지워진다(도5B,야생형, 일방적 절제, 7일 후 부상, 화살), 이전 의결과와 일치한다 13. 양자 택일로, 오른쪽 과 왼쪽 안테나 는 모두 축사 번들을 모두 절단 할 수 있으며, 부상 후 7 일, 축사 및 시냅스가 사라졌습니다(그림 5B,야생 유형, 양자 절제, 7 일 후 부상, 화살표). 대조적으로, 고선 돌연변이체에서 우측 안테나의 일방적 인 절제는 이전 연구 결과11,,14 (그림 5B,하이 와이어,일방적 절제, 7 일 후 부상, 화살표)와 일치하는 7 일 후 부상을 보존 된 절단 된 축사를 초래합니다. 이 결과는 절단된 야생 형 축슨이 축사 죽음을 겪고 그 결과 파편이 7 일 안에 삭제된다는 것을 보여줍니다, 축사 죽음 결핍 고와이어 돌연변이는 축사 죽음을 겪지 못하고 7 일 동안 형태학적으로 보존된 남아 있는 동안.
그림 5: 뇌에서 GFP 표지 감각 신경 축삭의 축삭 죽음을 연구하는 방법. (A)뇌에서 야생형 및 고와이어 클론을 생성하는 도식십자가(각각P0 및F1세대). 처녀 여성은 왼쪽에, 오른쪽에 남성. 유전자형 세부 사항은 재료 표를 참조하십시오. (B)GFP 라벨이 부착된 축색 의 제어 및 부상의 예. 왼쪽에서 오른쪽으로: 부상을 입지 않은 야생형 제어, 야생형 7일 포스트 일방적 안테나 절제, 야생형 7일 후 양측 안테나 절제, 고선 돌연변이 7일 후 일방적 안테나 절제. 화살표는 잘된 축슨 번들, 배율 표시줄 = 10 μm을 나타냅니다.
세 번째 방법은 CNS에서 절단 된 축색과 시냅스의 기능 보존을 관찰 할 수 있습니다. 그것은 안테나 그루밍을 유도하기에 충분한 2nd 안테나 세그먼트에 보관 된 JO 뉴런의 하위 집합의 조작에 의존한다. JO 뉴런에서 적색 이동 채널로도프신(CsChrimson)의 발현은 모든 망막의 식이 보충제와 결합되어, 적색광 노출 시 간단한 시냅스 후 그루밍 동작을 유도하기에 충분하다12,,30. 여기서, 야생형 JO 뉴런을 생성하기 위해 크로스를 수행하였고, JO 뉴런은 dnmnat(dnmnat OE)(dnmnatOE)(도6A)를과발하여 발현하였다.dnmnat 야생형은 축축액사망률(dnmnatOE)을가진 JO 뉴런을 함유한 파리 또는 파리로, 모두 부상 전에 강력한 그루밍 동작을 가지고 있다. 그러나, 7일 후 상해(예를 들어,2nd 안테나 세그먼트의 양측 절제), 그루밍은 부상으로 인한 축색 및 시냅스 변성으로 인해 야생형 파리의 광유전학에 의해 유도되지 못하고, 축축액 사망을 감쇠한 동물은 신랑을 계속한다(도 6B, Movie 1,2). 감쇠된 축색사 죽음은 그러므로 기능적으로 절단된 축색및 그들의 시냅스를 7 일 동안 보존할 수 있습니다.
그림 6 : 축축술 후 축축및 시냅스 기능을 시각화하는 방법. (A)개략적인 십자가는 야생형과 dnmnat과 과발현JO 감각 뉴런을 생성한다(P0 및F1 세대, 각각).0 처녀 여성은 왼쪽에, 오른쪽에 남성. 유전자형 세부 사항은 재료 표를 참조하십시오. (B)광유전학에 의해 유도된 그루밍 행동의 개별 정신. 상단 : 야생 형의 개별 정신은 부상 전과 부상 후 7 일 (파란색)을 날아갑니다. 바닥: 조 뉴런에서 dnmnat (dnmnatOE)를과도하게 발현하는 파리의 개별 정신에 대한 부상 전과 7일 후(적색). 각 저장소는 1s 내에서 최소 1개의 그루밍 동작을 나타냅니다. 검은색 선은 모든 저장소의 합계를 나타냅니다. (C)그루밍 동작의 정량화. 데이터는 평균 ± 표준 편차, p > 0.001(단방향 ANOVA, Tukey의 포스트 혹 검정과 다중 비교)으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1: 대표적인 야생형 그루밍 동작은 안테나 절제 전과 7일 후 광유전학에 의해 유도되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2: 조 뉴런에서 dnmnat를 과도하게 발현하는 파리의 광유전학에 의해 유도된 대표적인 그루밍 행동은 안테나 절제 후 7일 전과 7일 후에 나타났다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에서 기술된 프로토콜은 Drosophila에있는 그들의 세포체에서 분리된 축색및 그들의 시냅스의 기능 뿐만 아니라 형태학의 견고하고 재현가능한 관찰을 허용합니다. 날개 분석은 PNS14에서부상되지 않은 제어 축아의 축사 죽음을 나란히 관찰하는 것을 용이하게 하며, 안테나 분석기는 GFP 표지축액과 시냅스의 전체 신경 다발을 관찰하여 뇌(CNS)12의형태와 기능을 모두 평가한다. 실험을 설계할 때 고려해야 할 형태학을 연구하기 위한 각 접근 방식에는 중요한 단계와 특정 이점이 있습니다.
날개의 PNS에서 축세포 형태를 관찰하기 위해 날개의 투명성 때문에 실험을 쉽게 수행 할 수 있습니다 : 해부 및 면역 조직 화학을 우회 할 수 있습니다. 그러나 고정이 부족하기 때문에 날개는 장착 후 즉시 이미지화되어야합니다(14). 현재, 두 개의 별개의 Gal4 드라이버가 자주 사용된다, ok371Gal4 또는 dpr1Gal4,두 참조는 변성을 정량화하는 뚜렷한 접근 방식을 제공합니다14,,26. 몇 가지 뉴런의 희소 한 라벨링 하는 것이 좋습니다., 사용 하 여 "억제 세포 마커와 모자이크 분석 (MARCM)"14,,31,축 색 형태학의 해상도는 전례가. 대조적으로, 시냅스의 관찰은 날개에서 불가능하며, 그들은 파리의 흉부 내부의 복부 신경 코드에 있습니다. 게다가, 추가 축삭 마커는 면역 조직 화학에 의해 구상될 수 없습니다: 왁시 표피는 근본적인 조직으로 고정식 및 항체의 확산을 불가능하게 합니다.
CNS에서 축색과 시냅스 형태를 관찰하려면 뇌 해부를 수행해야합니다. 이들은 면역조직화학을 이용하여 추가적인 축색 및 시냅스 마커를 시각화하는 장점을 제공하며, 시냅스는 동일한 시야10,,13의동일한 분야에서 축산과 함께 관찰될 수 있다. 특징적인 후각 수용체 뉴런(ORN) Gal4 드라이버의 큰 컬렉션은32,및 자주, OR22aGal4가 선택의 드라이버이다. 안테나 절제의 경우, OR22a 뉴런의 세포체는3rd 세그먼트에 보관된다(그림2B). 형광 강도 기반 정량화는 축색 또는 시냅스13의변성을 정량화하는 데 사용된다. 반대로, 실험은 두뇌 해부 및 항체 염색 때문에 시간 소모적입니다.
축축술 후 축축및 시냅스 기능을 시각화하기 위해, 광유전학은 안테나 그루밍을 유발하는 데 사용됩니다: 절단된 축색및 시냅스의 기능보존을 위한판독제(12). 그루밍 회로 및 해당 감각, 인터-및 모터뉴런 Gal4 드라이버는29,,30을철저히 기술하였다. GMR60E02Gal4는 존스턴의 기관 (JO) 감각 뉴런의 하위 집합을 라벨, 필요한 및 그루밍에 대 한 충분 한29,,30. 안테나 절제의 경우, JO 뉴런의 세포체는2nd 안테나 세그먼트에 보관된다(그림2B). 광유전학 적 설정은 처음부터 쉽게 구축 하거나 기존 설정을 조정할 수 있습니다. 중요한 것은, 실험은 어두운 방에서 수행되어야하며, 따라서 적외선 (IR) LED 스포트 라이트로 시각화 파리. CsChrimson을 채널로 사용할 때, JO뉴런29를활성화하기 위해 모든 트랜스 망막과 적색 LED 스포트라이트를 식품에 공급하는 것이 중요합니다. 대안적으로, 청색 광에 민감한 채널 및 청색 LED 스포트라이트, 또는 TrpA1 채널 및 온도는 뉴런활성화(29,,33)에사용될 수 있다. 그루밍 동작의 정량화는 이미12,,29에설명되어 있다.
이 계산서가 축산 죽음을 구체적으로 공부하기 위하여 이용될 때, 형태학적 또는 기능적 보존의 표현형은 시간이 지남에 따라 견고해야 한다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 축사 죽음이 형태학적보존34,,35에서일관되지만 덜 뚜렷한 표현형으로 이어지는 경우가 있으며, 그러한 표현형이 기능보존으로 변환되는지 여부는 여전히 결정되어야 한다.
축사 사체형은 또한 신경이 다친 보다는 오히려11,,23의분쇄된 Drosophila 애벌레의 발달 도중 뉴런에서 관찰되었습니다. 여기에서, 우리는 특히 개발을 완료 성인 Drosophila 뉴런에 초점을 맞추고. 이러한 맥락에서, RNA간섭(36)또는 조직 특이적 CRISPR/Cas9(37)의 사용은 용이하게 구현될 수 있다.37 중요한 것은, 상기 기술은 축사 죽음 독립적인 맥락에서 사용될 수 있다: 그들은 신경 유지 인자38,축세포 수송39,연령 의존적 축색 미토콘드리아 의 특성화를 용이하게 하며, 축산 미토콘드리아(41)의 형태학적 변화이다.4041
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
Neukomm 연구소 전체에 기부해 주신 것에 감사드립니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (SNSF) 조교수 상 (보조금 176855), 하반신 마비 연구를위한 국제 재단 (IRP, 보조금 P180), SNSF 스파크 (보조금 190919) 및 로잔 대학의 지원에 의해 지원되었다 LJN에 기초 신경 과학학과 (에타 드 보) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tweezers (high precision, ultra fine) | EMS | 78520-5 | Antennal ablation |
| MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge) | EMS | 72933-04 | Wing injury |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086.0000 | |
| 35mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900 | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific™ | BB02400600A113MNT0 | |
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientific™ | AA00008032E00MNT10 | |
| High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter | Thorlabs | DCC1240M | Camera setup |
| SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
| 25mm 1/1.2" C mount Lens | Tamron | M112FM25 | |
| Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A36 | |
| Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
| Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm | Thorlabs | FELH0700 | |
| SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
| SM1 Lens Tube Without External Threads, 1" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M10 | |
| 850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M850L3 | IR LED spotlight |
| SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
| SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
| Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
| Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm | Thorlabs | FELH0850 | |
| SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
| 660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M660L4 | Red LED spotlight |
| Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
| SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
| SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube | Thorlabs | KPS101 | LED control |
| T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | Thorlabs | LEDD1B | |
| 150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps | Thorlabs | MB1530/M | Mount base |
| Ø12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm | Thorlabs | UPH75/M | Mount, 3x (IR LED, red LED, cam) |
| Ø1.20" Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap | Thorlabs | SM1RC/M | |
| Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm | Thorlabs | TR150/M | |
| Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm | Thorlabs | TR40/M | |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 5 mm Hex | Thorlabs | RA90/M | |
| M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25 | Thorlabs | SH6MS16 | screws for mount onto base |
| USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx | National Instruments | 782604-01 | Red LED spotlight controller |
| 20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer | TT Electronics/BI | P230-2EC22BR20K | fintuner for indicator |
| IR (860nm) emitter, 100 mA radial | Osram | 475-1365-ND | Red light indicator |
| cable | - | - | Misc |
| All-trans retinal | Sigma | R2625 | |
| Ethanol absolute | Vwr | 20821.296 | |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Mowiol | Merk | 81381 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning Corp | 4019862 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning Corp | 4019862 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Chicken anti-GFP antibodies | Rockland | 600-901-215 | Antibodies |
| Goat Dylight anti-Chicken | Abcam | ab96947 | |
| FM7a, B | BDSC | RRID:BDSC_785 | X chromosome |
| FRT19A[hs-neo] | BDSC | RRID:BDSC_1709 | |
| hiw[ΔN] | BDSC | RRID:BDSC_51637 | |
| hs-FLP[12] | BDSC | RRID:BDSC_1929 | |
| tub-Gal80[LL1] | BDSC | RRID:BDSC_5132 | |
| w[1118] | BDSC | RRID:BDSC_3605 | |
| 20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus | BDSC | RRID:BDSC_55135 | 2nd chromosome |
| 5xUAS-Gal4[12B] | Kyoto | RRID:Kyoto_108492 | |
| 5xUAS-HA::dnmnat | BDSC | RRID:BDSC_39702 | |
| 5xUAS-mCD8::GFP[LL5] | BDSC | RRID:BDSC_5134 | |
| ase-FLP[2d] | Freeman laboratory | Neukomm et al., 2014 (PNAS) | |
| CyO | BDSC | RRID:BDSC_2555 | |
| dpr1-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_25083 | |
| OR22a-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_9952 | |
| ey-FLP[6] | BDSC | RRID:BDSC_5577 | 3rd chromosome |
| GMR60E02-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_39250 | |
| TM3,Sb,e | BDSC | RRID:BDSC_3644 |
References
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