Summary
주요 골반 신경절은 골반 기관을 속이 되는 부교감 및 교감 신경세포를 포함합니다. 여기에서 우리는 해부 방법을 설명하고 이 중추및 관련 신경의 확인을 위한 회로도를 제공합니다. 이들 방법은 추가 연구를 위해 생체 내 이러한 중추골의 실험적 조작 또는 제거 사후 처리에 적용될 수 있다.
Abstract
양측 주요 골반 신경절 (MPG; 동의어, 골반 신경절) 설치류의 골반 기관을 내면화 하는 후 신경 교감 및 부교감 뉴런의 주요 소스; 인간의 기능적으로 동등한 구조는 열등한 저위 신경총입니다. 주요 골반 신경절은 또한 요추와 천골 감각 축삭이 골반 기관에 도달하는 경로를 제공합니다. 이 복잡한, 혼합 된 중추는 정상 자율 메커니즘의 추가 실험 연구를 식별하고 해부하거나 질병, 부상 또는 내장 통증의 전임상 모델을 확립하는 데 어려움을 증명할 수 있습니다. 여기에서 우리는 이 신경절 및 그들의 관련한 신경 관에 접근하고 구상하는 프로토콜을 기술합니다. 우리는 남성과 여성 쥐 모두에 대한 회로도와이 프로토콜을 제공합니다, 식별을위한 신경절 크기와 랜드 마크는 남녀 간에 차이가 있기 때문에. 프로토콜은 시험관 내 연구를위한 신경절의 제거를 설명하지만,이 방법은 실험 적 개입 (예를 들어, 신경 호감, 신경 절제술) 또는 신경 회로 매핑 (예를 들어, 미세 주입에 의해)에 대한 수술 복구 프로토콜에 통합 될 수있다 신경 추적기)를 참조하십시오. 우리는 또한 해부 직후와 면역 조직 화학 염색 을 따르는 신경절및 관련 신경의 1 차적인 구조물을 보여줍니다.
Introduction
쥐는 골반 기관 생리학 및 해부학의 연구결과에 사용된 제일 특성이 있는 종의 한개입니다. 우수한 자원이 이들장기1,2의설명을 위해 존재하지만, 이들은 일반적으로 관련 신경 구조에 대한 정보를 제공하지 않거나 실험 연구를 안내하기에 부족한 해상도로 그렇게 하지 않는다. 아래에 자세히 설명하듯이, 골반 기관 기능을 조절하는 자율 신경절의 조직은 자율 신경계의 나머지 부분과 상당히 다르므로 다른 자율 신경절에 사용할 수있는 신경 해부학 정보에서 골반 내핵 기능을 정확하게 추론하기가 어렵습니다. 이 지역에 들어가는 연구원을 안내 하는 리소스에이 결핍 골반 장기의 신경 조절에 대 한 연구를 둔화 수 있습니다. 여기에서 우리는 추가 시험관 내 연구 또는 실험적인 내정간섭을 위한 신경계의 이 지구에 접근하기 위한 프로토콜을 기술합니다.
양측 주요 골반 중추 (MPG; 동의어: 골반 중추; 파라키비골 중추 [여성]; 프랑켄하우저의 신경절 [여성])은 설치류의 골반 장기를 내면화하는 후 신경교감 및 부교감 뉴런의 주요 공급원입니다. 열등한 위신경총은 인간3,4,5,6에서동등한 신경 구조를 포함한다. 요추와 성례 등대 근막에서 감각 투영은 또한 골반 기관에 도달하기 위하여 MPG를 통해서 여행합니다. 따라서, MPG의 신경 회로 및 생물학을 이해하는 것은 골반 기관의 발달 그리고 성인 기능에 관한 임상 조건의 무수한에 전임상 연구 결과를 위해 중요합니다. 설치류 MPG의 몇 가지 우수한 설명은7,8,출판되었지만, 우리의 경험은 일반적으로 이러한 설명이 동물의 회복이 필요할 때 이러한 구조의 실험 해부 또는 조작을 실질적으로 알리기에 충분한 지침을 제공하지 않는다는 것입니다. 더욱이, MPG 연구의 대다수는 남성 쥐에 집중합니다. 암컷 쥐에서, MPG는더 작고 뚜렷한 해부학적 랜드마크를 가지고 있으며, 따라서 시각화 및 해부에 대한 뚜렷하게 맞춤화된 가이드가 필요합니다.
교감 및 부교감 통로는 그들의 해부학에 의해 구별됩니다, 특히 그들의 preganglionic 뉴런의 위치, 소강성 요추 척수에 있는 preganglionic 신경을 가진 교감 통로 및 뇌간 (두개골 신경 돌기) 및 sacral 척수에 있는 부교감 preganglionic 뉴런. 자율 시스템의 대부분의 다른 지역에서, 그들의 표적 신경절 뉴런은 명백한 교감 또는 부교감 신경절에 있습니다. 그러나 MPG는 교감-부교감 성 간절이 혼합되는 데 특이하며, 따라서 거시적 인 규모로 는 흉추 엽과 천골 척추 부위의 preganglionic 축삭에서 수렴되는 부위입니다. 따라서 우리는 우리의 프로토콜에 MPG와 각 척추 지역을 연결하는 이 1 차적인 신경 관의 위치 그리고 설명을, 실험적인 분석 또는 이 신경 분대의 개별적인 조작을 용이하게 하기 를 포함했습니다. 우리는 또한 특히 종에 걸쳐 이러한 신경절을 비교 독자에 대한 주의, 설치류에서 '기능적으로 천사'인 척추 preganglionic 뉴런, 예를 들어, 활성 및 유계 동안 필요한, 배변과 음경 발기, 척추 수준 L6-S1보다는 sacral 세그먼트에서 독점적으로10; 마찬가지로 L6및 S1 등쪽 뿌리 신경절은 골반 기관에 주요 '성례'감각 입력을 제공합니다. 설치류에서, 더 많은 로스트랄 신경 회로에서 감각 및 preganglionic 입력은 척추 수준 L1 및 L210에집중되어 있습니다.
여기에서 우리는 남성과 여성 쥐에 있는 MPG 그리고 그들의 관련되는 신경 관에 접근하는 프로토콜을 기술하고, 특정 랜드마크를 설명하기 위하여 회로도로 이것을 지원합니다. 이 프로토콜은 시험관 내 연구를 위한 조직을 제거하는 실험적인 맥락에서 이 구조물에 외과 접근을, 예를 들면, 분자 특성화 또는 1 차적인 문화를 위한 MPG 신경을 격리하는 것을 안내합니다. 그것은 또한 고정식으로 심장 내 관류 후에 MPG 제거에 적응될 수 있습니다, 신경 조직이 인접한 조직이 혈액이 결여될 때 가시화하기 가 더 어려워지기 때문에 이것은 더 어려운 해부이기 는 않지만. 이 프로토콜은 또한 이러한 신경 경로의 실험적 개입을 위한 수술 설정으로 통합될 수 있다(예를 들어, 신경 절제술, 신경 추적자의 미세 주사). 이러한 유형의 해부는 골반 내장의 임상 조건을 치료하기 위한 신경 변조에 대한 새로운 표적 및 접근법이 개발되고 있는 바이오전자 의학의 성장 분야에 점점 더 중요해지고있다 11. 우리는 수컷 쥐를 위해 먼저 완전한 프로토콜을 제시하고, 그 때 여성 쥐를 위해 특별히 맞춘 프로토콜의 복제.
Protocol
모든 절차는 동물 실험을위한 기관 및 자금 조달 신체 요구 사항에 따라 수행되어야한다. 이 해부에 대한 동물의 사용과 안락사에 대한 프로토콜은 멜버른 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (의정서 번호 1814639).
참고: 여기에 설명된 해부들은 성인(~10주) 수컷과 암컷 스프라그-도울리 쥐(생물의학 과학 동물 시설, 멜버른 대학)에서 280g(암컷) 및 350g(남성)의 무게를 측정하였다. 이러한 해부 에 앞서, 랫트는CO2 챔버에서 4-5분 동안 안락사시켰다. 고정제로 트랜스카얼 관류를 받은 동물의 조직을 해부하는 경우, 작업자가 고정식에 노출되지 않도록 예방 조치를 취하십시오( 즉, 연기 찬장 또는 하강 캐비닛에서 해부를 수행하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.) 심낭 관류에 대한 프로토콜은 자세히12에게시되었습니다.
1. 주요 골반 신경절 및 인접 신경 : 수컷 쥐의 접근 및 절제
참고: 그림 1은 수컷 쥐의 MPG 시각화에 대한 해부학적 랜드마크를 보여줍니다.
- 복강 과 골반에 대한 접근
- 쥐를 척추 위치에 놓고 복부 중간선 절개를 통해 복부와 골반에 접근하여 모피로 수술 장의 오염을 피하십시오.
- 포셉이나 면 팁 어플리케이터를 사용하여 복부 장기를 한쪽으로 부드럽게 움직입니다. 전립선과 요로 방광의 복부 엽의 위치를 기록하십시오.
- 정액 소포를 반대쪽으로 이동합니다.
- 회절을 통해 지역에 더 나은 액세스를 제공하기 위해 꽃병 연기를 잘라.
참고 : 해부시점에서 조직은 건조해서는 안됩니다. 생리식염수 (신선한 조직 해부) 또는 고정제 (관류 고정 동물의 경우)로 조직을 촉촉하게 유지하십시오. 식염수로 조직을 촉촉하게 유지하는 것은 조직 구조에 유익할 뿐만 아니라 건조한 신경이 취급하는 동안 더 깨지기 쉽고 찢어지기 때문에 해부를 더 쉽게 만듭니다. - 신경절의 위치인 등쪽 표면에 전립선의 등쪽 엽을 식별합니다. 이것은 아직 표시되지 않습니다.
- 신경절을 시각화하려면 신경절 근처와 겹치의 조직을 조심스럽게 치웁습니다. 필요한 경우 리트랙터를 사용하여 해부 필드를 명확하게 유지합니다.
- 지방 조직의 인근 골재를 제거하고 골반의 측면 근막을 엽니 다.
- MPG 및 관련 신경의 해부
- 해부의 다음 단계에 대한 랜드 마크를 제공하는 다음 위치를 식별 : 전립선의 등측 엽 (신경절은이 엽의 표면에 위치, 정액 소포 사이의 접합보다 약간 더 많은 석회및 전립선) 및 정액 소포 (중간선에서 수렴하는 곳)는 동물의 로스트로 카우달 축의 신경절 위치를 나타냅니다.
- 이 시점에서 필요에 따라, 신중 하 게 신경 구조의 전체 보기를 방해 하는 모든 조직을 제거, 전립선 또는 주요 혈관의 얇은 캡슐에 손상을 방지.
- 다음 의 랜드 마크와 기능을 시각화하여 골반 신경을 식별합니다.
- MPG와 방광을 향해 투영 내부 장골 정맥과 그 미세 한 지점을 찾을 수 있습니다. 이 혈관 분지는 평행하게 실행하고 때때로 골반 신경 안에 내재되고, 그 때 신경절을 통과합니다.
- 골반 신경 아래에 미세하게 기울어진 각진 집게를 부드럽게 놓고 집게를 밀어 주변 조직에서 풀어냅니다.
참고 : 그것은 또한 그것에 평행하게 달리는 작은 배에서 골반 신경을 격리하는 것이 가능할지도 모르지만, 대부분의 모형 실험을 위해 이것은 필수적이지 않습니다. 구조가 신경이 해부 현미경의 밑에 쉽게 구별되고 골반의 특징인 몇몇 느슨하게 응집된 fascicles를 포함하는다는 것을 결정하기 위하여 고배율의 밑에 보는 것에 의하여 골반 신경이다는 것을 확인합니다 신경절과 관련된 다른 주요 신경중 어느 것도이 명확한 근신을 보여주지 않기 때문에 신경.
- 다음 랜드마크와 기능을 시각화하여 동굴 신경을 식별합니다.
- 신경절과의 접합에 골반 신경을 따라 후, 그것은 전립선을 가로 질러 여행으로 동굴 신경을 따라 다음 음경의 동굴 시체를 향해 caudally.
- 현미경 확대가 허용하는 경우에, 골반과 동굴 신경 사이 신경절에서 나오는 섬세한 신경의 작은 단이 있다는 것을 주의하십시오; 이들은 더 낮은 창자에 여행하는 직장 신경입니다.
- 다음과 같은 랜드마크와 특징을 시각화하여 위신경을 식별합니다.
- 요관과 함께 여행 한 후 위 위 신경이 두개골 가장자리에서 신경절과 결합하는 위치를 식별합니다.
- 위 신경이 골반 또는 동굴 신경보다 훨씬 얇고 큰 혈관이 동반되지 않는지 확인하십시오.
- 다음 기능을 시각화하여 MPG를 식별합니다.
- 삼각형 모양을 형성, 신경절의 복부, 등쪽 및 두개골 가장자리를 시각화합니다.
- 각 주요 신경의 위치를 확인: 신경절의 등쪽 가장자리에서 나오는 골반 신경, 신경절의 가장 꼬리 구석에 동굴 신경, 그것의 두개골 가장자리에서 위 위 신경, 그리고 신경절의에서 나오는 액세서리 신경 복부 가장자리.
- 다음 랜드마크 및 기능을 시각화하여 액세서리 신경을 식별합니다.
- 신경절의 복부 가장자리의 시각화를 가능하게 하는 조직을 정리한 후에, 오줌과 생식 기관을 향해 투영하는 신경의 클러스터를 확인하십시오.
- 현미경 확대가 허용하는 경우에, 정액 소포와 방광 사이 전립선 엽 및 1개의 rostral 단 사이 입력하는 신경의 1개의 꼬리 단을 확인하십시오.
- 관련 신경을 가진 MPG의 제거
- 신경절과 기본 전립선 사이에 부드럽게 포셉을 밀어, 전립선의 얇은 캡슐을 뚫지 않도록주의. 신경절과 전립선 사이의 연결을 방해하십시오.
- 실험에 필요한 신경의 길이에 대 한 주변 조직과 어떤 최종 연결을 취소, 다음 각 신경을 잘라.
- 미세 집게를 사용하여 신경절을 신경절을 실험에 적합한 솔루션으로 옮기고 각 주요 신경이 손상되지 않는지 확인하십시오.
2. 주요 골반 신경절 및 인접 신경 : 여성 쥐의 접근 및 절제
참고: 그림 2는 암컷 쥐의 MPG 시각화에 대한 해부학적 랜드마크를 보여줍니다.
- 복강 과 골반에 대한 접근
- 쥐를 척추 위치에 놓고 복부 중간선 절개를 통해 복부와 골반에 접근하여 모피로 수술 장의 오염을 피하십시오.
참고 : 해부시점에서 조직은 건조해서는 안됩니다. 생리식염수 (신선한 조직 해부) 또는 고정제 (관류 고정 동물의 경우)로 조직을 촉촉하게 유지하십시오. - 포셉이나 면 팁 어플리케이터를 사용하여 복부 장기를 한쪽으로 부드럽게 움직입니다. 자궁 경적, 오줌 방광 및 직장의 위치를 기록하십시오.
- 난소와 자궁 혈관을 잘라 자궁 경적을 철회.
- 복막 공간을 입력하고 자궁 경부 근처에있는 지방 조직의 골재를 부드럽게 제거하십시오.
- 쥐를 척추 위치에 놓고 복부 중간선 절개를 통해 복부와 골반에 접근하여 모피로 수술 장의 오염을 피하십시오.
- MPG 및 관련 신경의 해부
- 자궁 경부의 측면 벽을 식별, 자궁 경적과의 접합에 그냥 꼬리; 이 지역은 동물의 rostrocaudal 축에 MPG 위치를 정의하기위한 주요 랜드 마크입니다.
- 이 시점에서 필요에 따라, 신중 하 게 신경 구조의 전체 보기를 방해 하는 모든 조직을 제거, 주요 혈관에 손상을 방지.
- 다음 의 랜드 마크와 기능을 시각화하여 골반 신경을 식별합니다.
- MPG와 방광을 향해 투영 내부 장골 정맥과 그 미세 한 지점을 찾을 수 있습니다. 이 가지는 평행하게 달리고 때때로 골반 신경 안에 내재되어, 그 때 신경절을 통과합니다.
- 구조가 신경이 해부 현미경의 밑에 쉽게 구별되고 골반의 특징인 몇몇 느슨하게 응집된 fascicles를 포함하는다는 것을 결정하기 위하여 고배율의 밑에 보는 것에 의하여 골반 신경이다는 것을 확인합니다 신경절과 관련된 다른 주요 신경중 어느 것도이 명확한 근신을 보여주지 않기 때문에 신경.
- 다음과 같은 랜드마크와 특징을 시각화하여 위신경을 식별합니다.
- 요관과 함께 여행 한 후 위 위 신경이 두개골 가장자리에서 신경절과 결합하는 위치를 식별합니다.
- 위 신경이 골반 또는 동굴 신경보다 훨씬 얇고 큰 혈관이 동반되지 않는지 확인하십시오.
- 다음 랜드마크와 기능을 시각화하여 동굴 신경을 식별합니다.
- 신경절과의 접합에 골반 신경을 따라 후, 그것은 질을 향해 자궁 경부의 측면 벽을 따라 caudally 여행으로 동굴 신경을 따라.
- 현미경 확대가 허용하는 경우에, 골반과 동굴 신경 사이 신경절에서 나오는 섬세한 신경의 작은 단이 있다는 것을 주의하십시오; 이들은 더 낮은 창자에 여행하는 직장 신경입니다.
- 다음 랜드마크 및 기능을 시각화하여 액세서리 신경을 식별합니다.
참고 : 액세서리 신경은 보기 어렵지만 MPG의 중간 측면에서 프로젝트됩니다. 신경절의 복부 가장자리의 시각화를 가능하게하는 조직을 정리 한 후, 요로 및 생식 기관으로 투영 매우 섬세한 신경의 클러스터를 식별합니다. - 다음 기능을 시각화하여 MPG를 식별합니다.
- 삼각형 모양을 형성하는 신경절의 복부, 등쪽 및 두개골 가장자리를 시각화합니다.
- 각 주요 신경의 위치를 확인: 신경절의 등쪽 가장자리에서 나오는 골반 신경, 신경절의 가장 꼬리 구석에 동굴 신경, 그것의 두개골 가장자리에서 위 위 신경, 그리고 신경절의에서 나오는 액세서리 신경 복부 가장자리.
- 관련 신경을 가진 MPG의 제거
- 골반 신경 의 밑에 미세하게 기울어진 각진 집게를 부드럽게 놓고 근본적인 자궁 경부 및 주변 조직에서 그것을 풀어 놓기 위하여 그(것)들의 밑에 포셉을 밀어냅니다.
참고 : 그것은 또한 그것에 평행하게 달리는 작은 배에서 골반 신경을 격리하는 것이 가능할지도 모르지만, 대부분의 모형 실험을 위해 이것은 필수적이지 않습니다. 해부를 보여주는 경우, 골반 신경 아래에 봉합사를 배치, 그것의 시각화를 용이하게하기 위해. - 동굴 신경, 다음 위 신경, 그리고 마지막으로 액세서리 신경에 대한 과정을 반복합니다.
- 신경절과 기본 자궁 경부 사이의 포인셉을 부드럽게 밀어 냅니다. 신경절과 자궁 경부 사이의 연결을 방해하십시오.
- 실험에 필요한 신경의 길이에 대 한 주변 조직과 어떤 최종 연결을 취소, 다음 각 신경을 잘라.
- 미세 집게를 사용하여 신경절을 신경절을 실험에 적합한 솔루션으로 옮기고 각 주요 신경이 손상되지 않는지 확인하십시오.
- 골반 신경 의 밑에 미세하게 기울어진 각진 집게를 부드럽게 놓고 근본적인 자궁 경부 및 주변 조직에서 그것을 풀어 놓기 위하여 그(것)들의 밑에 포셉을 밀어냅니다.
3. 신경절 성분 확인 (선택 사항)
- 신경절을 제거한 후, 앞서설명한바와 같이, 신경절을 종래의 조직학적 고정제(예를 들어, 4% 완충포르민)에 최소 1시간 동안 침지하고, 0.1 M 인산완충액으로 고정제를 씻어내고, 냉동절제 및 형광 면역조직화학을 위한 조직을 처리한다.
참고: 이 3개의 신경 마커를 구체적으로 인식하는 많은 고품질 항체는 상업적으로 유효합니다. 그림 3에표시된 라벨링에 사용되는 시약에 대한 재료 표를 참조하십시오. - 대안적으로, 상기와 유사한 방법을 사용하여 면역조직화학을 위한 중추절(wholemounts)을 그대로 처리하지만 항체에 대한 배양 시간을 4일(1차 항체)과 2일(이차 항체)으로 증가시키는 것이다.
- 감각 축삭의 주요 인구를 입증하기 위해, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP)에 대한 항체를 사용합니다.
참고: 본 연구에서 사용된 항체의 권장 희석은 1:5,000입니다. - noradrenergic 교감 뉴런을 입증하기 위해 티로신 하이드록실라제 (TH)에 대한 항체를 사용하십시오.
참고: 본 연구에서 사용된 항체의 권장 희석은 1:5,000입니다. - 콜린 성 뉴런의 주요 인구를 입증 하기 위해, 신경 산화 신 타 에 대 한 항 체를 사용 하 여 (NOS).
참고: 본 연구에서 사용된 항체의 권장 희석은 1:500입니다.
Representative Results
성공적인 해부는 MPG의 전체 몸을 그대로 제거 할뿐만 아니라 여전히 부착 된 각 주요 신경의 첫 번째 세그먼트를 유지합니다. 이러한 신경은 생체 내에서 신경절 방향의 귀중한 지표이며, 따라서 해부학 연구의 많은 유형에 대한 필수 정보를 제공합니다 (예를 들어, 실험 교란 후 표현 패턴 또는 세포 변화를 매핑). 일부 실험 유형(예: 신경절 해리)에 대해 관련 신경을 보존하는 것이 덜 중요할 수 있지만, 신경의 존재는 또한 신경절을 건드리지 않고 처리하는 방법을 제공합니다(그리고 잠재적으로 손상) 신경 세포 체.
실패한 해부는 불완전하거나 손상된 신경절을 가지거나 1 차 신경이 더 이상 부착되지 않은 곳에 있습니다. 또한 해부 중에 중추또는 신경이 무의식적으로 손상될 수 있는데, 이는 물리적 손상이 해부 현미경하에서 감지하기에는 너무 미묘하거나 특정 유형의 검사 기간 동안에만 손상이 명백해지기 때문일 수 있습니다. 예를 들어, 신경절 조직이 해부 중에 건조되면, 조직은 나중에 취급하는 동안 정상으로 나타날 수 있지만 표면에 비특이적 형광의 높은 수준을 보여줍니다.
해부된 MPG의 예는 도 3에도시되어, 전체 두께로 시각화된 전체 신경절(도3A)및 면역형광을 수행하기 위해 저온절로 절단된 MPG의 예는 더아드레날린성 및 콜린성 뉴런을 입증하는 것이다(도3B,C).
그림 1: 수컷 쥐의 MPG 시각화를 위한 해부학적 랜드마크. 1, 정액 소포; 2, 오줌 방광; 3, 응고 선; 4 & 5, 액세서리 신경; 6, 전립선 (복부 엽); 7, 동굴 신경; 8, 꽃병 연기; 9, 요도; 10, bulbocavernosus 근육; 11, 이시오카베르누스 근육; 12, 직장 신경; 13, 납치자 카우대 외인; 14, 주요 골반 신경절; 15, 골반 신경; 16, 납치자 카우다 인턴스; 17, 위 위 신경; 18, 내부 장골 정맥; 19, 굴곡 카우대 브리비스; 20, 굴곡 카우다 롱러스; 21, 요관; 22, psoas 전공; 23, 복부 대강; 24, 열등한 베나 카바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 암컷 쥐의 MPG 시각화를 위한 해부학적 랜드마크. 1, 원기 결장; 2, 오줌 방광; 3, 자궁 몸; 4, 위 위 신경; 5, 액세서리 신경; 6, 주요 골반 신경절; 7, 동굴 신경; 8, 질; 9, 요도; 10, 직장; 11, 납치자 카우다 외인; 12, 직장 신경; 13, 굴곡 카우대 brevis; 14, 골반 신경; 15, 내부 장골 정맥; 16, 납치자 카우다 인턴스; 17, 굴곡 카우다 롱러스; 18, 외부 장골 동맥; 19, 요관; 20, psoas 전공; 21, 자궁경적; 22, 복부 대강. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성인 남성 쥐로부터 MPG를 면역화학적으로 표시하였다. 모든 제제는 흑백 카메라가 장착 된 기존의 광시야 형광 현미경으로 시각화 된 다음 디지털 색을 칠했습니다. (A)전체 마운트 (완전한 두께), 관련 신경과 고정 MPG, 신경 히토화학적으로 칼시토닌 유전자 관련 펩티드를 발현 감각 신경에 대한 라벨링 (CGRP); 1, 골반 신경 (여러 fascicles를 보여주는); 2, 동굴 신경; 3, 위 위 신경; 4, 액세서리 신경; 5, 직장 신경; 6, 주요 골반 신경절 (MPG). (B, C) 고정 MPG의 저온절(14 μm)은, 신경절의 혼합 된 노르 아드레날린-콜린내성질을 입증하기 위해 면역조직화학적으로 표지된; (B)티로신 하이드록실라제및(C)뉴트리탈산화질소 신타제에 대한 항체에 의한 콜린성 뉴런의 주요 집단에 대해 항체에 의해 입증된 노르아드레날린성 뉴런. 보정 막대는(A)1,000 μm,(B,C)200 μm을 나타냅니다.
Discussion
골반 기관의 신경 조절은 체세포, 부교감, 교감 및 내장 감각 성분14,15,16,17을포함하는 복잡한 경로에 의해 매개된다. 이러한 경로의 대부분은 MPG에서 유래하거나 통과합니다. 여기에 설명 된 해부 프로토콜은 MPG 해부학, 관련 신경 및 인근 거시적 해부학 적 랜드 마크에 대한 소개를 제공합니다. 후자는 해부학 회로도에 의해 설명된다. MPG 해부에 그밖 접근은 또한 성공적일지도 모릅니다, 그러나 우리는 신경계의 이 지역에 새로운 연구원을 위해 강력하고 적당하다는 것을 여기에서 기술한 것을 찾아내십시오.
프로토콜의 가장 중요한 측면은 각 주요 신경의 정확한 식별과 MPG 조직의 완전한 제거입니다. 주의 깊게 보고 조직의 취급으로, MPG 조직은 해부학, 분자 및 생체 외 내 방사선 연구에서 제거 될 수있다18,19,20,21, 22. 프로토콜은 또한 생체 내 실험 조작23,24,25에적응될 수 있으며,이 경우 신경절과 관련된 1 차 신경과의 접촉을 최소화하거나 인근 혈관 구조에 손상을 입히기 위해 세심한 주의를 기울여야합니다. 실험이 하나 이상의 신경을 중단하여 선택적 변기를 필요로하는 경우, 분석의 재발과 혼란을 방지하기 위해 절단 된 신경을 분리하는 것이 좋습니다. 이 해부 프로토콜은 또한 유사한 함수26,27,28을가진 MPG가 있는 마우스를 위해 이용될 수 있었다.
신경 해부학 연구의 경우, 항원 및 조직 구조의 가장 좋은 보존은 실험29에적합한 조직학적 고정제로 심질적으로 관착된 마취된 동물로부터 MPG를 해부함으로써 수득된다. 그러나, 조직 착색이 손실되기 때문에, 이 프로세스 후에 신경절 및 신경 구조물의 확인은 더 어렵습니다. 관류 후이 해부를 시도하기 전에 perperfused 동물에서 신경절을 식별하고 해부하는 데 능숙해지는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 동등한 나이와 바디 크기의 동물을 위해, MPG 및 관련 신경이 여성에서 훨씬 작기 때문에 먼저 남성에 있는 해부에 능숙하게 하는 것이 좋습니다.
제거된 조직이 실제로 MPG인것을 확인하기 위하여는, 연구원은 각 1 차적인 신경의 위치 그리고 특징을 확인하는 것이 좋습니다. 많은 섹터는 골반 신경과 동굴 신경이 그 곳에서 식별하는 가장 쉬운 것을 발견합니다. 위와 부속 신경은 주변 조직과 구별하기가 더 섬세하고 어렵습니다. 이러한 신경은 해부 동안 의한 문제로 인해 더 이상 사용할 수 없거나 구조에 관한 불확실성이있는 경우, 초기 MPG 해부는 기존의 조직학 (신경 세포 체의 존재를 확인하기 위해8)및 면역 조직 화학 (두 번째로 면역 조직 화학을특징으로하는 것이 좋습니다30,31) 30, 31) 주요 신경의 정확한 확인을 검증하기 위해, 동굴 신경은 MPG에 가까운 그들의 초기 부분에서 신경 세포 체의 그들의 고밀도에 의해 쉽게 확인된다; 이러한 뉴런의 대부분은 콜린성, 니테르기뉴런32,33의마커를 발현한다. 골반, 위장관 및 부속 신경은 거의 신경 세포체가 34.
이 해부를 수행하는 데는 몇 가지 일반적인 함정이 있습니다. 초보자 의 디스섹터가 주요 신경 이나 MPG 중 어느 것을 찾는 데 문제가 있는 경우, 그들은 주요 랜드 마크를 설명 하는 단계로 돌아가는 것이 좋습니다. 그것은 매우 일반적인 하나는 거시적 맥락의 트랙을 잃는 미세 구조를 찾는 데 초점을 맞추고. 가장 일반적으로, 초보자 구역은 해부 부위에서 너무 멀리 rostral을 이동하거나 너무 '피상적 인'- 즉, 복부의 복부 개구부에 너무 가까이 남아, 오히려 깊은 검사보다 (즉, 더 등쪽) 구조. 해부 중 일반적인 문제는 해부 중 혈관 구조손상입니다. 출혈이 시작되면, 출혈이 멈출 때까지 면으로 기울어진 어플리케이터를 소스 위에 부드럽게 쥐고, 해부를 다시 시작하기 전에 식염수로 부위를 자유롭게 씻어냅니다. 너무 많은 혈액으로 오염되거나 출혈이 멈출 때까지 너무 오래 연기된 경우 MPG를 실험에 사용할 수 없습니다. 또 다른 일반적인 해부 오류는 MPG 시각화 및 제거를 크게 손상시키는 전립선의 캡슐손상입니다. 이 캡슐은 면으로 된 어플리케이터만 사용하더라도 전립선의 측면 벽에서 지방을 제거하면서 쉽게 구멍을 뚫는 매우 섬세한 구조입니다. 마지막으로, MPG와 관련된 주요 신경은 MPG를 제거하는 동안 각각을 식별하는 과정에서 쉽게 손상된다. 디스섹터는 각 신경이 차례로 고립되어 신경절 제거의 최종 단계에서 혼란을 줄 수있는 루틴을 개발하는 것이 좋습니다.
이러한 해부는 특정 장기에 대한 부속신경의 각각의 성분을 추적하거나, 골반 중추와 골반 장기 사이의 여러 지점에 놓여 있는 많은 미세갱글리아를 각각 식별하기 위해 노력하지 않았다8. 이들은 특정 얼룩을 사용 하지 않고 생체 내에서 시각화 하는 것은 매우 어렵다; 그러나, 그(것)들은 기관을 향해 신경 관의 각각을 따르고, 신경절 위치를 결정하기 위하여 특정 신경 얼룩 포스트 혹을 이용해서 제거될 수 있습니다. 이러한 미세갱글리아는 MPG에 비해 뉴런 집단의 극히 일부분만을 포함하더라도, 이들이 가장 밀접하게 위치한 장기에 대한 특정 유형의 입력을 제공할 수 있다. 우리는 여기에서 이 microganglia 또는 골반 기관에 여행하기 위하여 MPG를 나가는 작은 신경 관의 많은 이 필드에 있는 한계가 아직 광범위하게 이름을 받아들였다는 것을 주의합니다. 더욱이, microganglia의 유사하게 상세한 연구 결과는 아직 여성 쥐에서 실시되지 않았습니다.
요약하면, 여기에 제공된 프로토콜 및 회로도는 연구원에게 골반 기관에 자율 신경 공급을 제공하는 기본 구조를 연구하는 도구뿐만 아니라 요추 등쪽 뿌리에서 감각 신경의 주요 말초 도관을 제공합니다. MPG를 통해 골반 장기로 이동하는 중추.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 간행물에 보고된 연구는 이사, 건강의 국가 학회, 조건 완화를 위한 말초 활동을 자극하는 (SPARC) 프로그램, 수상 번호 OT2OD023872의 사무실에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. Keast 박사의 실험실에서 버트 랜드 박사의 펠로우십은 자금을 지원했습니다: 니메스 대학 병원, 몽펠리에 -Nîmes의 의학 학부, 협회 프랑수아즈 드 치루르기 (AFC), 소시에테 인터디플린 에르폰 d'' UroDynamique 에 드 Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) 및 유럽 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2007-2013)의 사람들 프로그램 (마리 퀴리 액션) REA 보조금 계약에 따라 No PCOFUND-GA-2013-609102, 캠퍼스에 의해 조정 프레스티지 프로그램을 통해 프랑스.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
| Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
| Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
| Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
| Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| LED light source | Schott | KL 1600 | |
| Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |
References
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